CN104520309B - 抗真菌抗生素两性霉素b的n-取代第二代衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

抗真菌抗生素两性霉素b的n-取代第二代衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗真菌抗生素两性霉素B的半合成N‑取代衍生物，以及水溶性盐和复合物、药物组合物，以及包含该衍生物的植物和机体治疗产品和它们作为抗真菌抗生素的用途。

Description

抗真菌抗生素两性霉素B的N-取代第二代衍生物及其制备方 法和应用
技术领域
本发明的主题涉及多烯大环内酯抗真菌抗生素两性霉素B的新的N- 取代衍生物，称为第二代改性产品。它们的特征在于在连接至抗生素的氨基基团的取代基处存在大型部分(本体部分，大体积部分，大体积基团， bulky moiety)，其诱导空间位阻效应，以及这类衍生物的酯和酰胺以及它们与酸或碱的盐或者包含复合化合物的产物，作为水溶性形式。还提出了用于获得根据本发明的化合物的方法，以及它们在用于医学和兽医学需求以及用于植物保护的抗真菌药物的制备中的用途，以及用于其他应用，如防止建筑物(building)受到真菌感染。
背景技术
真菌感染的化学疗法是现代医学中最难而且仍未成功解决的问题之一。这是这样的事实的结果，即致病真菌有机体以及人两者都是真核生物，并且这是设计对于患者具有低毒性的选择性作用药物的必要困难的原因。只有在局部和肠道真菌感染的治疗中才能忽略该困难。这包括作为妇科医学、皮肤医学、肠胃病学、肺脏学、泌尿学和眼科学的临床真菌学的这类领域，其中，化合物毒性的问题不太会急性发作(C.P.Schaffner,in Macrolideantibiotics,S.Omura(red.),Academic Press.Inc.,Orlando,p.457, 1984))。这类情况下，最常使用的多烯大环内酯药物是两性霉素B、制霉菌素和匹马霉素，其由于不进行局部和口腔给药再吸收实际上是无毒的。然而，涉及内部器官感染和真菌血症的侵袭性真菌病仍然是远未成功解决的问题。关于这类疾病的死亡率的现有流行病学统计并不是令人满意的 (M.A.Pfaller,D.J.Diekem,Clin.Microbiol.Rev.20,133,2007；T.F. Patterson,Lancet 366,1013,2005；S.K Fridkin,Clin.Infect.Dis.41,240, 2005)。侵袭性念珠菌和曲霉菌以及由某些其他真菌病原体引起的感染是特别危险的。在侵袭性念珠菌的案例中，死亡率在30％至70％的范围内，曲真菌病大于50％，在肿瘤学/血液学中的侵袭性真菌病的频率为大约 50％，在患有白血病的儿童的真菌病案例中是29％至39％(S.E.Soloviera etal.,Rus.Chem.Rev.80,103,2011:A.L.Demain,S.Sanchez,J.Antibiot., 62,5,2009；G.O.Bronin et al.,Pediatryia 4,31,2004)。超过90％的HIV阳性患者患有真菌病以及由卡氏费孢子虫(Pneumocystis carinii)引起的肺炎，这是患有AIDS的患者死亡的主要原因。系统性真菌病是患有白血病的成年患者死亡的常见原因。关于发病频率，念珠菌(Candida spp.)是医院感染的第4致病因素并且是8％至11％的所有系统性感染具有高达40％的死亡率的原因。器官移植后，取决于移植器官的类型，患者中真菌感染的频率在5％至40％的范围内。肺部侵袭性曲霉病是骨髓移植后患者死亡的主要原因。芽生菌病、组织胞浆菌病和球霉菌症是在世界的许多区域高频率出现的地方性曲霉病。
在临床真菌学中持续超过20年的不利情况因为几种原因正在持续恶化。这些原因的其中之一是之前其为非病原体的真菌菌种导致的感染的稳定增加(D.A.Enoch et al.,J.Med.Microbiol.55,809,2006；N.Nucii,K.A. Marr,Clin.Infect Dis.41,521,2005)。通过使用广谱抗菌化学治疗剂以及通过使用类固醇也导致真菌感染增加，并且最重要的是，因为要求使用免疫抑制药物的移植学的发展，以及随着癌症案例增加由此使用免疫抑制性细胞抑制剂，结果增加数量的患者产生降低的免疫系统活性(N.Siugh,Med. Mycol.43,suppl.1,267,2005；A.L.Demain,S.Sanchez,J.Antibiot.62,5, 2009)。
在系统感染的治疗中使用的目前临床上可用的抗真菌化学治疗剂效用的稳定减少是特别令人担心的。这是病原真菌菌株耐药性快速发展的结果，尤其是多耐药性(MDR)的情况。后一种现象是从微生物细胞输出的膜转运蛋白ABC和MFS超家族的过度表达的结果，异生物质作为抗真菌化学治疗剂(D.Sanglard,Curr.Opinion Microbiol.5,378,2002；M.B. Frosco,J.F.Barrett,Exp.Opin.Invest.Drugs 7,175,1998；D.P.Kontoyiannis,R.E.Lewis,Lancet 359,1135,2002)。
通常与两性霉素B结合使用以增加其通过膜渗透性的吸收的5-氟胞嘧啶作为抗代谢药避免MDR转运蛋白的输出能力，但是主要通过损失胞嘧啶透性酶和在细胞内产生活性代谢物—5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶，增强特定类型的耐药性发展。具体地，“唑类”基团的临床有价值的杀菌剂，最常见的三唑类，如咪康唑、伏立康唑、泊沙康唑等对于通过MDR输出蛋白从细胞中除去是部分敏感的(R.Franz et al.,Antimicrob.Ag. Chemother.,42,3065,1998；R.Wakiec et al.,Mycoses,50,109,2007)。然而，作为羊毛甾醇脱甲基酶的抑制剂，与酶相互作用，诱导酶蛋白结构的变化，致使这些化合物失去抑制活性。非常有价值以及非常有希望的杀真菌剂卡泊芬净，虽然具有窄的抗真菌谱，但是具有优异的选择性，作为β-D-葡聚糖合酶的抑制剂与酶相互作用，非常遗憾，这导致诱导酶蛋白结构的变化并且因此失去化合物的抑制活性。即将出版对该药的作用的耐受性报道。因此，来自多烯大环内酯基团的两性霉素B(二性霉素B)实际上仍然是仅有的一种系统性杀真菌剂，它并不诱导耐受性菌株的发展，并且不是 MDR输出蛋白的底物，保留了对抗多耐药性菌株的充分活性(M.i in., J Antibiot.60,436,2007)。虽然由于细胞质膜的脂组分的某些改变，导致存在对该抗生素敏感性减弱的菌株出现的数据，但是在与药物不连续接触后，这些改变是表型的并且逐渐退化(regressing)。此外，两性霉素B也满足优良抗真菌化学治疗剂的其他重要要求，如高活性、宽的抗真菌谱以及杀真菌作用。
临床真菌学的目前情况指向对进一步寻找抗真菌药物的必要性。集中发展的研究计划之一涉及两性霉素B的改变的研究，目的是去除它的高毒性以及缺乏水溶性的缺点。然而，至今仍没有抗生素改变产品引入临床实践。该领域仅有的实际进展是将两性霉素B复合物与脂质或脂质体制剂如，和引入临床使用。然而，相比原始抗生素，两性霉素B制剂的毒性仅仅是稍低的。
之前已知的两性霉素B的衍生物是主要在海藻糖胺部分的氨基基团以及糖苷配基的羧基基团改变的化合物。已经进行了通过生产抗生素的生物体的基因操作以改变化合物的尝试。这些改变旨在改善化合物的溶解性并且降低毒性。由于引入亲水取代基，或通过引入至限定允许形成可溶性盐的化合物离子特性的部分的分子，一些获得的衍生物具有较好的水溶性。然而，改善两性霉素B衍生物的选择性毒性并未取得重要的进展，因为没有提出合理修改的令人信服的分子背景。衍生物的合成具有偶然的特性并且更多是基于随机筛选。
两性霉素B衍生物的现有技术包括：1)在氨基基团的衍生物，2) 在羧基基团的衍生物，3)包括氨基和羧基基团两者的改变的双衍生物(double derivative)，4)具有基因改变的糖苷配基片段的衍生物。对于该主题的现有技术的概述出现在已出版的科学综述(A.A.Volmer et al.,Nat. Prod.Rep 27,1329,2010；S.E.Solovieva et al.,RussianChemical Reviews 80,103,2011)中。在下面提及的现有技术的研究中，也给出了专利文献。
首先获得的是在氨基基团的两性霉素B衍生物。这些是N-酰基衍生物(美国专利3,244,590)。该化合物基团的重要改进涉及高生物抗真菌活性的N-氨酰基衍生物(J.K.Wright et al.,J.Antibiol.35,911,1982)。当涉及它们合成方法(PL 14847)时，存在的也已知的N,N-二烷基氨酰基类似物更有利。在氨基和羧基官能团的衍生物的组中获得了无数另外的化合物。在抗生素改变中的主要进步是N-烷基化反应的使用。已经获得N,N,N- 三甲基铵衍生物(美国专利4,144,328；波兰专利122884)，作为麦克尔加成反应(Michael’s addition)的产物的N-烷基衍生物(A.Czerwinski et al., J.Antibiot.44,979,1991)，作为阿马多里(Amadori)重排产物的衍生物(波兰专利82224；美国专利4,195,172)以及糖基部分的其他改变(美国专利 5,314,999；L.Saint-Julien et al.,Antimicrob.Agents Chemother.36,2722, 1992)。作为同时在氨基和羧基基团的衍生物，进一步修改该类型的衍生物。两性霉素B N-烷基衍生物的合成中的主要进展是应用还原性胺化反应以及使用合适的醛(V.Paquet,E.M.Carreira,Organic Letters 8,1807,2006；欧洲专利申请EP 1987049A1；国际专利申请WO 2007096137A1、美国专利申请2009/0186838A1)。也已经获得对于它们的性质不太感兴趣的其他衍生物，如胍衍生物(美国专利4396619)和脒和烯胺衍生物(波兰专利 120111)。
已经获得在羧基基团的更少衍生物。引起极大兴趣的该类型的第一种化合物是两性霉素B的甲基酯(美国专利4,035,567)及大量其水溶性盐 (美国专利3,914,409；美国专利6,613,889B2；美国专利4,041,232；PCT 专利申请WO 2007/06335A2)。也获得了抗生素的其他酯和它们的盐(美国专利5,981,729；S.Stefanska et al.,Acta Polon.Pharm.40,1,1983)，在羧基基团的其他衍生物包括肼(K.Grzybowska,E.Borowski,J.Antibiot.43,907,1990)，(PL 122086；PL 199213)和它们的水溶性盐(波兰专利138831)。
两性霉素B衍生物的大组是以下化合物，其中，大量上面提到的位于氨基和羧基基团的取代基结合至一种化合物。存在N,N-二烷基衍生物的酰胺和酯(WO 2009/0186838A1；WO 2007/096137A1)，糖基衍生物的酯和酰胺以及它们的N-烷基衍生物(US 6,562,796B2；US 6,664,241B2)， N-烷基和N-氨酰基衍生物的酰胺和酯(PL 199213)，N-烷基N-糖基衍生物的甲基酯(PL 180253)，胍衍生物的酯(US 4,396,610)，N-氨基和脒衍生物的甲基酯(PL120035)，二烷基氨酰基衍生物的酯和酰胺(PL 142848)。
两性霉素B改变产物的分离基团组成具有抗生素分子改变的大环内酯部分的化合物以及其不同的衍生物。这些化合物与本发明的主题不相关，其涉及具有未改变的大环内酯环的两性霉素B衍生物，但为了使现有技术的信息完整，提及了相关专利和专利申请。必成集团(Beecham group) 的文献包括：(US 6,284,736；US 5,116,960；US 5,066,646；US5,100,876； EP 0350164；WO 91/09047；EP 0431870；EP 0375222；EP 0431870。史克必成集团(Smith-Kline Beecham group)的文献包括：WO 93/16090；WO 93/14100；WO 93/17034。
上面呈现的现有技术能够得到以下结论。虽然获得大量的实验数据以及非常大量的两性霉素B，但这些化合物中没有一个已经进入了高级临床试验和工业开发的阶段，因为其性质并未达到相对于原始抗生素的必要改善。
本发明的背景是以下新的想法，使得两性霉素B改变，旨在获得最期望的效果，即抗生素衍生物的选择性毒性的必要增加。我们的研究表明，两性霉素B衍生物的选择性毒性仅在有限的程度上是由于衍生物对它们在真菌(麦角固醇)以及哺乳动物(胆固醇)细胞中为产生致死通道所必不可少的分子靶标的不同亲和性(M.Baginski et al.,Bichim.Biophys.Acta 1567,223,2002)。通过抗生素的化学改变并不能必然增加亲和性的差别并且因此对两种分子靶标的亲和性的一些改变可以给予改变化合物的选择性毒性作用非常有限的增加。我们建议，对胆固醇和麦角固醇具有些许改变差别亲和性的两性霉素B的衍生物应称为第一代衍生物。根据我们的观察，对两性霉素B衍生物的选择性毒性的必要增加的更多可能性表明，在真菌和哺乳动物细胞中产生致死通道的不同能力的现象，不仅因为对两种类型的生物体中的分子靶标的化合物亲和性差异，更重要的是因为形成的抗生素-分子靶标复合物聚集(团聚，aggregate)致使致死膜通道形成的不同能力。这发生在包含可以诱导空间位阻效应的大体积(voluminous)或大型部分的N-取代的抗生素衍生物的情况下(J.Szlinder-Rychert et al., Biochem.Biophys.Acta 1528,15,2001；J.Szlinder-Rychert et al.,Il Farmaco 59,289,2004)。在氨基基团具有大型取代基的两性霉素B衍生物可以形成具有改变几何形状的抗生素-固醇复合物，并且从而产生聚集成具有包含麦角固醇和胆固醇的膜的致死膜通道的不同能力。空间位阻化合物保留它们对具有多种药物耐受性的真菌菌株的高活性也是重要的(M.Slisz et al., J.Antibiot.60,436,2007)。这种类型的抗生素衍生物，我们称为第二代衍生物。对比在氨基基团的衍生物，在羧基基团的空间位阻衍生物并不导致选择性效应的必要改善。碱性衍生物，如酯和酰胺仅可以扩大空间位阻 N-衍生物的有利性能，促进与酸的可溶性盐的形成。两性衍生物可以形成与碱的可溶性盐，因为大型N-取代基破坏原始抗生素的两性离子结构。
达到了在抗生素分子的海藻糖胺部分的氨基基团引入空间位阻的选择性毒性增加的有益效果，前提是保留氨基基团的碱性特征(N-烷基衍生物)，或作为新的氨基基团存在于取代基中(N-氨酰基衍生物)。已证明了在与固醇分子靶标的相互作用中该基团的特别重要的作用(M.Baginski et al.,Biophys.Chem.49,241,1994)。上面讨论的关于空间位阻N-取代的两性霉素B衍生物的正面效应的想法不能够确定应具有最佳性质的化合物的确切分子结构。最有利的化合物的合成和选择仍然是经验问题。获得了第一组这类衍生物(PL210774)。然而，对于最有利的化合物的确定需要其他的实验性研究。由于具有最有利的选择性的空间位阻衍生物的未预期确定，本发明的目的已经达到。
根据本发明，新的半合成两性霉素B衍生物的优点是它们对念珠菌菌种以及丝状真菌的广谱微生物，以及对具有过表达的转运蛋白Cdr1p和 Cdr2p的多种药物耐受性(MDR)菌株表现出高的抗真菌活性。这些衍生物还表现出低的血液毒性，其是多烯大环内酯的毒性的必要因子，并且形成水溶性盐。
根据本发明，允许获得血液毒性降低的有利效果的未预期的新颖性是向两性霉素B在氨基基团的取代基引入新的合适的大型部分，其可以诱导空间位阻效应。看起来这类空间位阻因子对哺乳动物比真菌细胞在更大的程度上降低两性霉素B的致死渗透活性，由此增加它们作用的选择性并且必要地降低这些化合物的血液毒性。可以产生空间位阻的最佳效果的大型部分包括环系统碳-，以及杂环、脂环和芳环、大型取代基如叔丁基、硝基、溴原子以及脂族部分，由于其柔性，可以形成大体积构象结构。
发明内容
因此，在第一方面，本发明提供了根据式1a的抗真菌抗生素两性霉素B的空间位阻N-取代衍生物：
或它们的盐、水合物或复合物(配合物，complex)；
其中，R1选自氢原子、可选取代的烷基、琥珀酰亚胺基衍生物、糖基残基、可选取代的氨酰基残基或可选取代的硫脲基(thioureidyl)残基；
R2是氢原子或如对R1限定的取代基；
R3是羟基基团、烷氧基基团或烷基氨基或氨基烷基衍生物。
在某些实施方式中，R1和R2不都是氢。本文进一步描述了式1a的 N-取代衍生物化合物的类别和亚类(子类，subclass)。
定义
本文使用的术语“卤素”或“卤代”是指氟、氯、溴或碘。
如本文所用的术语“杂原子”是指一个或多个氧、硫、氮、磷或硅。
如本文所用的术语“脂族基(aliphatic)”是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元的直链或支链烃。因此，脂族基可以是烷基、烯基或炔基，优选具有至多达20个碳原子、至多达12个碳原子或至多达6个碳原子。
如本文使用的术语“大型”、“空间延展(扩展，延伸，expanded)”、“空间位阻”或“大体积”可以互换使用，是指可以产生空间位阻效应的基团或部分并且包括环系统碳-，以及杂环、脂环和芳族，大型取代基诸如叔丁基、硝基、溴或碘原子，以及脂族片段，由于它们的柔性，其可以形成大体积构象结构。在本发明的上下文中，大型烷基可以是，例如可选取代的4个或更多个碳原子的支链烷基或可选取代的烷基或包含烷基的部分，还包括可选取代的碳环或杂环，氨酰基，硫脲基或琥珀酰亚胺基部分。
如本文使用的术语“烷基”是指直链或支链烷基基团。优选地，本文所指的烷基基团是C1-C20烷基基团，优选为C1-C12烷基基团。更优选地，如本文中所提到的烷基是具有1至6个碳原子的低级烷基。
如本文所用的术语“非支链”与“简单”交互使用，是指直链烷基基团。优选地，如本文中提到的简单烷基是具有1至6个碳原子的低级烷基。
如本文使用的术语“碳环”或“碳环部分”是指具有3至14个，优选3 至8个，以及更优选为3至6个环碳原子的饱和或部分不饱和的单环、二环或三环，或具有6至14个，优选6至10个碳原子的单环、二环或三环。碳环是脂环族或“芳基”，优选如本文使用的“环烷基”是指完全饱和的烃环基。优选地，环烷基是C3-C6环烷基基团并且优选地，芳基是苯基或萘基。二环或三环基团可以包括稠合芳环、饱和和/或部分不饱和的环。
如本文使用的术语“杂环”或“杂环部分”是指具有3至14个，优选为3 至10个环原子的饱和或部分不饱和单环、二环或三环或具有6到14个，优选6至10个环原子，并且除了碳环原子还具有选自O、N、P和S(优选O、N和S)的一个或多个环杂原子的单环、二环或三环芳环。杂环是杂脂环，优选如本文使用的“杂环烷基”，其是指饱和杂环基，或“杂芳基”，其指的是单环或双环芳族环系统。杂环优选具有3至7个环原子，或者如果是芳族，具有5至10个环原子并且可以包含稠合芳族、饱和和/或部分不饱和的环。优选的杂环是哌啶、吗啉、哌嗪、吡咯烷、吡啶或咪唑。
关于本文描述的任何化学部分所指代的脂族基、烷基、碳环、杂环、环烷基、芳基、杂芳基或氨酰基，可以是未取代的，或者可以由独立地选自由以下组成的组中的一个或多个取代基取代：卤素、脂族基、-OR°、-R°、 -SR°、NHR°、-NR°2、-COR°、-COOR°、-NH2、-NO2、-OH、-COOH、-CN、羟基烷基、烷基羰基氧基、烷氧基羰基、烷基羰基或烷基磺酰基氨基，其中R°是可选取代的脂族基(优选烷基)、碳环(优选芳基或环烷基)或杂环(优选杂芳基或杂环烷基)，可选取代或被独立地选自以下的任一个或多个取代基可选取代：卤素、脂族基、-OR、-R、-SR、NHR、-NR2、-COR、 -COOOR、-NH2、-NO2、-OH、-COOH、-CN、羟基烷基、烷基羰基氧基、烷氧基羰基、烷基羰基或烷基磺酰基氨基，其中，R如对于取代的或未取代的R°所限定的。优选的取代基包括卤素、低级烷基、烷基氨基、-NH2、 NO2、-OH、-CN、烷氧基或烷氧基羰基。最优选的取代基包括叔丁基、-NO2和溴。
烷基氨基或氨基烷基衍生物是包含烷基氨基或氨基烷基部分的部分，其烷基部分可以可选地被如上面对烷基描述的任何取代基取代。
如本文使用的术语“烷基氨基”包括“单烷基氨基”以及“二烷基氨基”即，-NH(烷基)以及-N(烷基)2。
如本文使用的术语“琥珀酰亚胺基衍生物”是指包含结构的琥珀酰亚胺残基的部分。优选地，琥珀酰亚胺基衍生物的结构为其中，R”是可选地取代的脂族基或可选取代的碳或杂环部分。
如本文使用的术语“糖基”是指环状单糖或寡糖。优选糖基是果糖基。
如本文使用的术语“硫脲基残基”是指取代基键合至氮原子以形成–N-C(S)-NR’2基团，其中，每个R’独立地选自氢原子或如上面限定的R”。优选地，R’是氢原子或可选取代的脂族基，并且更优选一个R’是氢原子且另一个R’是可选取代的脂族基。
术语“酯”是指–C(O)O-R基团，其中，R是例如可选取代的脂族基、碳环或杂环。
如本文使用的术语“烷氧基”是指–O-R形式的基团，其中R是烷基，优选低级烷基。
如本文使用的术语“烷基硫基部分”指的是-S-R形式的基团，其中R 是烷基，优选低级烷基。
术语“氨酰基残基”是指包含可选取代的氨酰基基团的部分，其中，如本文使用的氨酰基基团是指被相对于羰基处于α-或β-位的氨基、单烷基氨基或二烷基氨基取代的酰基基团。氨酰基可以被如上面描述的一个或多个取代基取代。在一些实施方式中，氨酰基可以被独立地选自由以下组成的组中的一个或多个取代基取代：可选取代的脂族基、烷氧基、芳烷基、杂芳烷基、碳环、杂环、烷基羰基氧基、烷氧基羰基或烷基羰基。优选的取代基包括可选取代的低级烷基、烷基氨基(单烷基氨基或二烷基氨基)、芳烷基、杂芳烷基、碳环和杂环。
如本文使用的术语“芳烷基”以及“杂芳烷基”是指被上面限定的芳基或杂芳基基团取代的上面限定的烷基基团。“芳烷基”或“杂芳烷基”基团的烷基组分可以被上面列出的用于脂族基团的任一种或多种取代基取代并且“芳烷基”或“杂芳烷基”基团的芳基或杂芳基组分可以被上面列出的用于芳基、杂芳基、碳环或杂环基团的任一种或多种取代基取代。优选芳烷基是苯甲基。
在本发明的化合物中，可以存在一个或多个不对称碳原子。对于这类化合物，应理解本发明包括化合物的所有异构形式(例如，对映异构体和非对映异构体)以及它们的混合物，例如外消旋混合物。
在一些实施方式中，本发明的化合物，包括其盐、水合物和复合物，可以以水溶性的形式提供。例如，如果其在室温(20℃)将溶解于水中，可选地，利用加热、搅拌或超声，则可以认为化合物是水溶性的。在一些实施方式中，如果其在室温以至少10mg/ml、优选以20mg/ml的浓度可溶于水，则可以认为本发明的化合物(以盐的形式)是水溶性的。如本文描述的，可以以与复合试剂(配合试剂，compelxing agent)的复合物的形式提供本发明的化合物。在本发明的上下文中，例如在上面提及的条件下，如果其在水中形成透明的胶体悬浮液，则可以认为复合物是水溶性的。
如本文使用的术语“复合化合物(配合化合物，complexing compound)”是指本发明的化合物与其可以形成非共价复合物的化合物。复合化合物可以包括，例如，钙盐、琥珀酸、脱氧胆酸钠或固醇。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了两性霉素B的空间位阻N-取代衍生物。因此，本发明提供了根据式1a的化合物：
或它们的盐、水合物或复合物；
其中，R1选自氢原子、可选取代的烷基(优选非支链烷基或取代的烷基)、琥珀酰亚胺基衍生物、糖基残基、可选取代的氨酰基残基或可选取代的硫脲基残基；
R2是氢原子或如对R1限定的取代基；
R3是羟基基团、烷氧基基团或烷基氨基或氨基烷基衍生物；
其中，R1和R2不都是氢原子。
在一些实施方式中，如上面限定的式1a的化合物可以是根据式1b 的化合物：
其中，R1、R2和R3是如对式1a所限定的。
X不存在或存在，并且当存在时，X是一个或多个分子的碱或酸，或复合化合物。
在一些实施方式中，本发明的化合物是根据式1的化合物：
其中，R1选自氢原子、具有1至15个碳原子的非支链烷基、具有1 至15个碳原子的空间延展的烷基，包括琥珀酰亚胺基衍生物、包括具有5 至8个原子的环碳或杂环部分的烷基衍生物、糖基残基、可选取代或空间支化的氨酰基残基、在烷基取代基中具有1至5个碳原子的二烷基氨酰基残基、用包含至少一个碱性氮原子的大型脂族基或环取代基可选取代的硫脲基残基。
R2是氢原子或如对R1限定的取代基；
R3是羟基基团、烷氧基、或氨基烷基衍生物；以及其水溶性盐和复合物，其中，X是碱、酸或复合化合物的一个或多个分子。
在进一步的实施方式中，本发明提供了式1a、1b或1的化合物，其中，R1或R2中的一个或两个(优选一个)是大型取代基，由可选取代的硫脲基残基、取代的烷基、琥珀酰亚胺基衍生物、糖基残基、或可选取代的氨酰基残基表示，例如，为相对于以下任何亚类(a)至(f)中限定的结构：
(a)在一些实施方式中，本发明提供了以下化合物，其中，R1或R2中的一个或两个(优选一个)是结构的硫脲基残基；并且，其中，R5是-W-Z，其中，W是可选取代的烷基连接基(linker)或单键；并且Z是可选取代的碳环或杂环(优选芳基、杂芳基或含氮杂脂环族(优选 N-连接的杂环烷基))或NR*2、NH2、NHR*，其中，R*是可选取代的脂族基(优选，低级烷基)，可选取代的碳部分或杂环部分，或2个R*与它们连接的氮原子一起形成可选取代的杂环。W可以是单键、支链或非支链烷基，例如低级烷基。在一些实施方式中，Z是未取代的或者被一个或多个烷基或卤素取代。优选Z是苯基、哌啶基、吗啉基、吡咯烷基、吡啶基或烷基氨基，其全部可以被取代。
(b)在一些实施方式中，本发明提供了以下化合物，其中，R1和 R2中的一个或两个是被可选取代的烷基氨基或可选取代的碳部分或杂环部分取代的烷基(例如，C1-6烷基、C2-6烷基或C3-6烷基)。在一些实施方式中，R1和R2中的一个或两个独立地是用二烷基氨基或可选取代的含N 杂环(优选杂环烷基和更优选哌啶基或哌嗪基)取代的烷基(例如，C1-6烷基，优选C2-6烷基，更优选C3-6烷基、C3烷基或C4烷基)。在一些实施方式中，杂环是N-连接的并且是未取代的或用烷基取代的。在一些其它实施方式中，R1或R2中的一个或两个(优选一个)是用可选取代的碳环 (优选芳基)取代的烷基(例如，C1-6烷基，优选C1-3烷基，更优选C1烷基)，其中，当取代时，碳环优选用一个或更多选自以下的取代基取代：可选取代的碳环或杂环、脂族基(优选支链C3-6烷基)、烷基氨基、烷氧基硝基、卤素(优选溴)，或烷氧基羰基。在一些实施方式中，R1或R2中的一个是可选取代的苯甲基基团。可选取代的苯甲基优选可以用一个或多个选自可选取代的碳环或杂环、脂族基(优选支链的C3-6烷基)、烷基氨基、烷氧基硝基、卤素(优选溴)或烷氧基羰基的取代基取代。在一些实施方式中，苯甲基用烷基氨基(优选二烷基氨基)、碳环(例如芳基) 或支链C3-6烷基(优选叔丁基)(全部这些可以被可选取代)取代。
(c)在一些实施方式中，本发明提供了以下化合物，其中，R1或R2中的一个或两个(优选一个)是结构的琥珀酰亚胺基衍生物；其中，R4是-X-Y，其中，X是可选取代的烷基连接基或单键；并且Y是可选取代的碳部分或杂环部分或–OH、-OR*、-NR*2、-NH2、-NHR*，其中，R*是可选取代的脂族基、可选取代的碳部分或杂环部分或者2个R* 与它们连接的氮原子一起形成可选取代的杂环。X可以是单键或支链或非支链烷基，例如，低级烷基。优选地，Y是可选取代的碳部分或杂环部分、羟基或二烷基氨基。在一些实施方式中，R4是可选取代的芳基(优选苯基)、用可选取代的芳基(优选苯甲基)取代的烷基、用可选取代的N-连接的杂环或羟基取代的烷基，或用烷基氨基(优选二烷基氨基)取代的烷基(优选支链烷基)。在任何上面的实施方式中，其中，Y是碳部分或杂环部分， Y是未取代的或取代的，并且在一些实施方式中，Y可以用一个或多个烷基(优选非支链低级烷基，如甲基或乙基或支链3-6烷基，如叔丁基)、硝基或卤素(优选溴)取代。
(d)在一些实施方式中，本发明提供了以下化合物，其中，R1或 R2中的一个或两个(优选一个)是结构的氨酰基残基；其中， R6和R7独立地选自氢原子或可选取代的烷基(优选低级烷基)，或R6和 R7与它们连接的原子可以一起以形成可选取代的含氮环部分；R8和R9独立地是氢或–U-V，其中，U是可选取代的烷基连接基(优选低级烷基以及优选未取代的)或单键，并且V是可选取代的脂族基、碳环(优选芳基或萘基)、杂环(优选杂芳基或杂环烷基)、烷氧基、烷硫基部分或酯部分，其中任一个可以是可选取代的。在一些实施方式中，R8和R9中的一个是氢。在一些实施方式中，R8和R9中的一个是氢且R8和R9中的另一个是 -U-V，其中，U是可选取代的烷基连接基(优选低级烷基)或单键，并且 V是可选取代的碳环或杂环(优选芳基，例如苯基或萘基、杂芳基或杂环烷基)、-OR9a、-SR9a或–C(O)OR9a，其中，R9a是可选取代的支链烷基(优选C3-6烷基，例如叔丁基)，或可选取代的碳环或杂环，并且R6和R7是如上面限定的，优选低级烷基或氢。在任何上面的实施方式中，其中，V是碳部分或杂环部分，V可以是未取代的或用例如一个或多个烷基、硝基或卤素取代的。
(e)在一些实施方式中，本发明提供了以下化合物，其中，R1或R2中的一个或两个(优选一个)是结构的氨酰基；其中， R10和R11独立地选自氢原子或可选取代的烷基，或者R10和R11与它们连接的原子可以一起以形成可选取代的含氮环部分；R12和R13独立地是氢或 -U-V，其中，U是可选取代的烷基连接基或单键，以及V是氢原子或可选取代的脂族基、碳环、杂环、烷氧基、烷硫基部分或酯部分，其中任一个可以是可选取代的；并且R12’和R13’独立地是氢或烷基(优选低级烷基)。优选V是碳环(优选芳基或萘基)、杂环(优选杂芳基或杂环烷基)、烷氧基、烷硫基部分或酯部分，其中任一个可以是可选取代的。在一些实施方式中，R10和R11中的一个是氢以及R10和R11中的另一个是–U-V，其中， U是可选取代的烷基连接基(优选低级烷基)或单键，并且V是可选取代的碳环或杂环(优选芳基，例如苯基或萘基，杂芳基或杂环烷基)、-OR9a、 -SR9a或–C(O)OR9a，其中，R9a是可选取代的支链烷基(优选C3-6烷基，例如叔丁基)或可选取代的碳环或杂环并且R12、R12’、R13和R13’是如上面限定的，优选低级烷基或氢。在任何上面的实施方式中，其中，V是碳部分或杂环部分，V可以是未取代或用例如一个或多个烷基、硝基或卤素取代的。
(f)在一些实施方式中，本发明提供了以下化合物，其中，R1或R2中的一个或两个(优选一个)是糖基残基，优选果糖基残基(更优选结构的吡喃果糖残基)。在一些实施方式中，其中，R1或R2中的一个是糖基残基以及R1或R2中的另一个是未取代的烷基或氢，R3是羟基。在另一些实施方式中，R1或R2中的一个是糖基残基以及R1或R2中的另一个是如亚类(b)中限定的取代的烷基，优选用可选取代的烷基氨基(优选二烷基氨基)取代的烷基或可选取代的杂环(优选含氮杂环，以及更优选N-连接的杂环烷基)。
在一些实施方式中，R1或R2中的一个如相对于亚类(a)至(f)、优选(a)至(d)以及(f)中任一项限定的，以及R1或R2中的另一个是氢、未取代的烷基(优选非支链)、取代的烷基或相对于亚类(a)至(f)中的任一项限定的取代基。
在一些实施方式中，本发明提供了以下化合物，其中，R1和R2中的一个是氢原子或未取代的烷基(优选非支链)或取代的烷基(例如，如相对于亚类(b)限定的)；以及R1和R2中的另一个是未取代的非支链烷基、取代的烷基或琥珀酰亚胺基衍生物、羰基残基、可选取代的氨酰基残基或可选取代的硫脲基残基，优选如相对于亚类(a)至(f)中任一项限定的。在一些优选的实施方式中，R1或R2中的一个是氢原子、非支链烷基或用烷基氨基(优选二烷基氨基)或可选取代的碳部分或杂环部分(优选N- 连接的杂环烷基，用烷基可选取代)取代的烷基；以及R1和R2中的另一个是取代的烷基(优选用可选取代的碳部分或杂环部分取代)、琥珀酰亚胺基衍生物、羰基残基、可选取代的氨酰基残基或如相对于任何亚类(a) 至(f)、优选(a)至(d)描述的可选取代的硫脲基残基。
在一些实施方式中，本发明提供了以下化合物，其中，R1或R2中的一个是可选取代的糖基(优选如相对于亚类(f)限定的)，以及R1和R2中的另一个是取代的烷基、琥珀酰亚胺基衍生物、可选取代的氨酰基残基或可选取代的硫脲基残基，优选如相对于任何亚类(a)至(e)描述的。优选地R1或R2中的一个是用可选取代的烷基氨基(优选二烷基氨基)或碳部分或杂环部分(优选用烷基可选取代的N-连接的杂环烷基)取代的烷基。
在一些实施方式中，本发明提供了以下化合物，其中，R1或R2中的一个是氢原子；R1和R2中的另一个是琥珀酰亚胺基衍生物、可选取代的苯甲基、可选取代的硫脲基残基、可选取代的氨酰基残基，优选如相对于亚类(a)至(e)、优选(a)至(d)描述的。
在一些实施方式中，本发明提供了以下化合物，其中，R1或R2中的一个是氢原子、未取代的烷基或用碳部分或杂环部分(优选用烷基可选取代的N-连接的杂环烷基)取代的烷基；以及R1和R2中的另一个是用碳部分或杂环部分(优选用烷基可选取代的N-连接的杂环烷基)取代的烷基，优选如相对于亚类(b)限定的。
在如本文描述的任何化合物中，R3是羟基基团、烷氧基基团或烷基氨基或氨基烷基衍生物。在一些实施方式中，本发明提供了如相对于任何以上实施方式限定的化合物，其中，R3是羟基、甲氧基或–NR14-(C1-C6烷基)-NR15R16，其中，R14是氢原子或甲基。R15和R16独立地选自可选取代的脂族基，优选低级烷基。
在一些实施方式中，本发明的化合物不是以下化合物，其中：
(i)R3是甲氧基，R1和R2中的一个是氢，以及R1和R2中的另一个是：
(ii)R1或R2中的一个是氢，R1和R2中的另一个是以及R3是
(iii)R1或R2中的一个是氢或未取代的烷基，R1和R2中的另一个是糖基；
(iv)R3是OH并且R1和R2都是2-氨基乙基、3-氨基丙基、3-(Fmoc- 氨基)丙基、3-羟基丙基、2,6-二氨基己基、3-羧基丙基、3-(甲氧基羰基) 丙基或2-胍基乙基。
(v)R1和R2都是3-氨基丙基或3-(Fmoc-氨基)丙基并且R3是甲氧基、 2-氨基乙基氨基、2-(二甲基氨基)乙基氨基或3-(4-吗啉)丙基氨基；或
(vi)R3是羟基，R1和R2中的一个是氢或2-氨基乙基，并且R1和 R2中的另一个是3-氨基丙基或3(Fmoc-氨基)丙基；
或它们的盐、水合物或复合物。
在一些实施方式中，本发明的化合物不是N-琥珀酰基两性霉素B或它们的盐、水合物或复合物。
在一些实施方式中，本发明的化合物不是以下化合物，其中，R1或 R2中的一个是：
或它们的盐、水合物或复合物。
在一些实施方式中，本发明提供了任何上面描述的亚类的化合物，其中，R1是表1中对R1列出的任何基团。
在一些实施方式中，本发明提供了任何上面描述的亚类的化合物，其中，R2是表1中对R2列出的任何基团。
在一些实施方式中，本发明提供了任何上面描述的亚类的化合物，其中，R3是表1中对R3列出的任何基团。
在另一个实施方式中，可以以与无机或有机碱的盐的形式提供如本文描述的化合物，优选与N-甲基葡糖胺的盐。
在另一个实施方式中，可以以与无机或有机复合化合物的复合物的形式提供如本文描述的化合物，优选作为与钙盐、琥珀酸、脱氧胆酸钠或固醇(最优选与脱氧胆酸钠)的复合物。
在另一个实施方式中，可以以与无机或有机酸、优选与天冬氨酸的盐的形式提供如本文描述的化合物。
如上面描述的任何盐或复合物可以是水溶性的。
在另一个实施方式中，本发明提供了式1的化合物。
式1
其中，R1是氢原子或用1至15个碳原子在链上简单或空间上延展的烷基取代基，有利地，作为琥珀酰亚胺基衍生物或包含具有5-8个原子的环大小的碳环或杂环部分的烷基、糖基残基，或空间支化氨酰基残基或在烷基取代基中具有1至5个碳原子的二烷基氨酰基残基、含碱性氮原子和空间支化的脂族基或环状取代基的硫脲基残基；
R2是氢原子或如对R1指定的取代基；
R3是羟基基团或烷氧基或烷基氨基或氨基烷基衍生物；
以及它们的水溶性盐或复合物，其中，X是碱或酸或复合化合物的一个或多个分子。
根据本发明，有利的式1、1a或1b的N-取代的衍生物的特征在于存在能够诱导空间位阻效应的在海藻糖胺部分的氨基基团处的大型取代基，其以多个示例性形式获得，这些全部是本发明的示例性实施方式：
两性霉素B的琥珀酰亚胺衍生物，示例包括：N-[N-(2,4,6-三甲基苯基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B、N-(N-苯甲基琥珀酰亚胺基)两性霉素B、 N-[N-(4-溴苯基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B、N-[N-(2-叔丁基苯基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B、N-[N-(4-硝基苯基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B、N-[N-(2- 哌啶-2-基乙基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B、N-{N-[3-(N,N-二甲基氨基)-2,2- 二甲基丙基]琥珀酰亚胺基}两性霉素B、N-[N-(2-羟基-乙基)琥珀酰亚胺基] 两性霉素B。
在本发明的另一个形式中，N-取代的衍生物可以是两性霉素B的N- 硫脲基衍生物，实例包括：N-[3-(2-哌啶-1-基)乙基硫脲基]两性霉素B、N-[(3-苯基)-硫脲基]两性霉素B、N-[3-(2-吗啉-1-基)乙基硫脲基]两性霉素 B、N-{3-[2-(N,N-二乙基氨基)乙基]硫脲基}两性霉素B、N-[3-(吡啶-3-基) 硫脲基]两性霉素B、N-[3-(2-吡咯烷-1-基乙基)硫脲基]两性霉素B、 N-{3-[2-(N,N-二甲基氨基)乙基]硫脲基}两性霉素B、N-[(3-(吡啶-4-基甲基) 硫脲基]两性霉素B。
在根据本发明的另一个形式中，N-取代的衍生物可以是包含碳环的两性霉素B的N,N-二烷基衍生物，实例包括：(N,N-二烷基氨基苯甲基) 两性霉素B，或者不包含环系统的N-烷基衍生物，选自包括以下的组： N,N-二甲基两性霉素B、N,N-二乙基两性霉素B、N,N-二-正丙基两性霉素 B、N,N-二[3-(N-哌啶-1-基)丙基]两性霉素B、N,N-二[3-(4-乙基哌嗪-1-基) 丙基]两性霉素B、N-(4-N,N-二乙基氨基苯甲基)两性霉素B、N-[(4-二苯基)-甲基]两性霉素B、N-(4-叔丁基苯甲基)两性霉素B。
根据本发明的另一个形式，N-取代的衍生物可以是N-果糖基两性霉素B的N-烷基衍生物，实例包括：N-果糖基-N-甲基两性霉素B、N-果糖基-N-乙基两性霉素B、N-果糖基-N-正丙基两性霉素B、N-果糖基-N-(N,N- 二甲基-3-氨基丙基)两性霉素B、N-果糖基-N-[3-(哌啶-1-基)氨基丙基]两性霉素B。
根据本发明的N-取代的衍生物也可以是两性霉素B的N-氨酰基或 N,N-二烷基氨酰基衍生物，实例包括：N-L-苯丙氨酰两性霉素B、N-L-对 -碘代苯丙氨酰两性霉素B、N-D-β-萘丙氨酰两性霉素B、N-L-对硝基苯丙氨酰两性霉素B、N-甲基-L-(Oγ-叔丁基)谷氨酰两性霉素B、N-D-(Oβ-叔丁基)天冬氨酰两性霉素B、N-D-β-(3-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B、N-L-(S- 叔丁基)胱氨酰两性霉素B、N-邻氟代苯丙氨酰两性霉素B、N-D-(Oγ-叔丁基)谷氨酰两性霉素B、N-D-(O-叔丁基)-丝氨酰两性霉素B、N-D-苯基-甘氨酰两性霉素B、N-(L-N,N-二乙基苯丙氨酰)两性霉素B、N-(L-N,N-二甲基苯基-丙氨酰)两性霉素B。
根据本发明，两性霉素B的N-取代的衍生物可以是它们的酯，实例包括：N-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B甲酯、N-[3-(2-哌啶-1-基乙基) 硫脲基]两性霉素B甲酯、N-(4-N,N-二乙基氨基苯甲基)两性霉素B甲酯。
在本发明的另一个形式中，N-取代的衍生物也可以是两性霉素B的酰胺衍生物，实例包括：N-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B 3-(N,N-二甲基氨基)丙酰胺、N-[3-(2-哌啶-1-基乙基)硫脲基]两性霉素B 3-(N,N-二甲基氨基)丙酰胺、N-(4-N,N-二乙基氨基苯甲基)两性霉素B 3-(N,N-二甲基氨基) 丙酰胺。
在根据本发明的另一个形式中，N-取代的衍生物可以是与无机或有机碱的水溶性盐，有利地与N-甲基葡糖胺的盐。在根据本发明的另一种有利的溶液中，N-取代的衍生物可以是与无机或有机复合化合物的水溶性复合物。
根据本发明的N-取代的衍生物也可以是与无机或有机酸、有利地与天冬氨酸的水溶性盐。
根据本发明，上面描述的N-取代的衍生物的应用涉及用于治疗由真菌微生物如病原体酵母或丝状真菌或念珠菌属的菌株、特别是由具有过表达的转运蛋白MDR1p如Cdr1p和Cdr2p的多耐药性(MDR)菌株引起的疾病的药物的制备。
根据本发明的N-取代的衍生物的应用也涉及用于控制在兽医学中的真菌感染、植物保护以及用于保护建筑物防止真菌侵袭的样品的制备。
以下在实施例中证明了本发明的主题。在根据本发明的有利的实施例中，其结构示出于式1中的化合物的特征在于大型部分的存在，所述大型部分连接至海藻糖胺残基的氨基，其可以诱导空间位阻效应，这以大量以下呈现的形式示例性获得。
本发明的N-琥珀酰亚胺基衍生物为A1至A8，实例包括：N-[N-(2,4,6- 三甲基苯基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A1)、N-(N-苯甲基琥珀酰亚胺基) 两性霉素B(A2)、N-[N-(4-溴苯基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A3)、 N-[N-(2-叔丁基苯基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A4)、N-[N-(4-硝基苯基) 琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A5)、N-[N-(2-哌啶-1-基乙基)琥珀酰亚胺基] 两性霉素B(A6)、N-{N-[3-(N,N-二甲基氨基)-2,2-二甲基丙基]琥珀酰亚胺基}两性霉素B(A7)、N-[N-(2-羟基乙基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A8)；
N,N-二烷基衍生物为A9至A13，并且实例包括：N,N-二甲基两性霉素B(A9)、N,N-二乙基两性霉素B(A10)、N,N-二-正丙基两性霉素B (A11)、N,N-二[3-(N-哌啶-1-基)丙基]两性霉素B(A12)、N,N-二[3-(4- 乙基哌嗪-1-基)丙基]两性霉素B(A13)；
N-果糖基两性霉素B的N-烷基衍生物是A14至A18，并且实例包括： N-果糖基-N-甲基两性霉素B(A14)、N-乙基-N-果糖基两性霉素B(A15)、 N-果糖基-N-正丙基两性霉素B(A16)、N-果糖基-N-(N,N-二甲基-3-氨基丙基)两性霉素B(A17)、N-果糖基-N-[3-(哌啶-1-基)氨基丙基]两性霉素B (A18)；
N-苯甲基衍生物为A19至A21，并且示例包括：N-(4-N,N-二乙基氨基苯甲基)两性霉素B(A19)、N-[(4-二苯基)甲基]两性霉素(A20)、N-(4- 叔丁基苯甲基)两性霉素B(A21)；
N-硫脲基衍生物为A22至A29，并且实例包括：N-{[3-(2-哌啶-1-基) 乙基]硫脲基}两性霉素B(A22)、N-[(3-苯基)-硫脲基]两性霉素B(A23)、 N-{[3-(2-吗啉-1-基)乙基]硫脲基}两性霉素B(A24)、N-{3-[2-(N,N-二乙基氨基)乙基]硫脲基}两性霉素B(A25)、N-[3-(吡啶-3-基)硫脲基]两性霉素 B(A26)、N-{[3-(2-吡咯烷-1-基)乙基]硫脲基}两性霉素B(A27)、 N-{3-[2-(N,N-二甲基氨基)乙基]硫脲基}两性霉素B(A28)、N-{[3-(吡啶-4-基)甲基]硫脲基}两性霉素B(A29)；
N-氨酰基衍生物为A30至A41，并且实例包括：N-L-苯丙氨酰两性霉素B(A30)、N-L-对-碘代苯丙氨酰两性霉素B(A31)、N-D-β-萘丙氨酰两性霉素B(A32)、N-L-对-硝基苯丙氨酰两性霉素B(A33)、N-甲基 -L-(Oγ-叔丁基)谷氨酰两性霉素B(A34)、N-D-(Oβ-叔丁基)天冬酰胺两性霉素B(A35)、N-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B(A36)、N-L-(S-叔丁基)胱氨酰两性霉素B(A37)、N-邻氟代苯丙氨酰两性霉素B(A38)、 N-D-(Oγ-叔丁基)谷氨酰两性霉素B(A39)、N-D-(O-叔丁基)丝氨酰两性霉素B(A40)、N-D-苯基谷氨酰两性霉素B(A41)；
两性霉素B的N,N-二烷基氨酰基衍生物为A42至A43，并且实例包括：N-(L-N,N-二乙基苯丙氨酰)两性霉素B(A42)、N-(L-N,N-二甲基苯丙氨酰)两性霉素B(A43)；
两性霉素B的N取代的衍生物的酯为A44至A46，并且实例包括： N-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B甲酯(A44)、N-{[3-(2-哌啶-1-基)乙基]硫脲基}两性霉素B甲酯(A45)、N-(4-N,N-二乙基氨基苯甲基)两性霉素B甲酯(A46)。
两性霉素B的N-取代的衍生物的酰胺为A47至A49，并且实例包括： N-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B 3-(N,N-二甲基氨基)丙酰胺(A47)、 N-{[3-(2-哌啶-1-基)乙基]硫脲基}两性霉素B 3-(N,N-二甲基氨基)丙酰胺 (A48)、N-(4-N,N-二乙基氨基苯甲基)两性霉素B 3-(N,N-二甲基氨基)丙酰胺(A49)。
根据本发明，两性霉素B衍生物的结构呈现在下表1中，出于参考的目的提供两性霉素B的结构。
表1两性霉素B衍生物的结构
本发明的主题还涉及其为式1、1a或1b的抗真菌抗生素两性霉素B 的空间位阻衍生物的化合物的应用，其中，R1是氢原子或者简单或大型烷基取代基，有利地作为琥珀酰亚胺衍生物的残基、或包含环部分碳环或杂环的烷基、或糖基残基、或大型硫脲残基(优选包含碱性氮原子以及大型脂族基或环取代基)，R2是氢原子或如对R1限定的取代基，而R3是羟基基团、或烷氧基、或烷基氨基、或氨基烷基衍生物，以及水溶形式的它们的盐和复合物，其中，X是碱或酸或复合化合物的一个或多个分子，直接或作为多种抗真菌药物的制剂的活性成分用于抵抗真菌，优选多耐药性真菌。
在第二方面中，本发明提供了包含如本文限定的根据本发明的化合物的药物组合物。如全文引用的，根据本发明的化合物包括其盐、水合物和复合物。
在第三方面中，本发明提供了如本文限定的化合物用于治疗真菌感染。该化合物也可以用于治疗由真菌感染引起的疾病。治疗可以是以人或兽医学药物的形式。
在第四方面中，本发明提供了化合物在制备用于治疗真菌感染、由真菌感染引起的疾病、包括在人和兽医学中治疗的药物中的用途。
在第五方面中，本发明提供了治疗在患者中由真菌引起的疾病的方法，包括将治疗有效量的如本文限定的本发明的化合物给予该患者，其中该患者是人或动物。
在第六方面中，本发明提供了如本文限定的本发明的化合物用于治疗植物中的真菌感染的用途。
在第七方面中，本发明提供了包括如本文限定的本发明的化合物的植物保护产品。
在第八方面中，本发明提供了治疗建筑物中的真菌感染的方法，包括将如本文限定的本发明的化合物给予该建筑物。本发明的化合物可以以溶液的形式(优选水性溶液)给予该建筑物。在一些实施方式中，例如，可以通过将本发明的化合物(优选以粉末或颗粒的形式)溶解于溶剂(优选水或水互溶性溶剂)中制备溶液。在一些实施方式中，在建筑物中处理真菌感染的方法包括通过喷雾或刷涂将该溶液施涂至感染区域。
在第九方面中，本发明提供了抗真菌建筑物处理产品，包括如本文限定的本发明的化合物。该产品可以是本发明的化合物的粉末或颗粒形式，或包含本发明的化合物的溶液(优选水性溶液)。
涉及本发明的第一方面的本文描述的实施方式(即本发明的化合物) 适用于本发明的第二至第九方面。
在一些实施方式中，本文所指的治疗涉及治疗由来自酵母和丝状真菌或念珠菌属的菌株的组的病原真菌引起的真菌感染，可选地其中，酵母和真菌具有多耐药性(MDR)，可选地具有转运蛋白MDR1p如Cdr1p和Cdr2p 的过表达。
本发明的化合物当用于预防或治疗疾病时，可以以“有效量”给予。“有效量”是指“治疗有效量”，也就是在单一剂量或多剂量给予后足以引起该疾病严重性的可检测的下降、足以防止疾病发展或缓解疾病症状超过在不进行治疗中所预期的化合物的量。
本发明的化合物可用于降低待治疗的任何以上疾病症状的严重性。本发明的化合物也可用于给予易患任何以上疾病、处于患有以上疾病的风险或患有以上疾病的患者。可用于预防以上疾病的化合物不要求在任何情况下完全防止疾病的发生，但是当给予易患疾病或处于患病风险的患者时，可以预防或延缓疾病的发作。
可以提供本发明的化合物作为游离化合物或作为其合适的盐或水合物。盐应当是药用盐，并且盐和水合物可以通过常规方法制备，如将本发明的化合物与酸或碱接触，其对应离子(counterpart ion)不干扰化合物的期望用途。药用盐的实例包括氢卤化物、无机酸盐、有机羧酸盐、有机磺酸盐、氨基酸盐、季铵盐、碱金属盐、碱土金属盐等。
可以提供本发明的化合物作为药物组合物。该药物组合物可以另外地包括药用赋形剂，例如药用载体和/或药用稀释剂。合适的载体和/或稀释剂是在本领域熟知的并且包括药用级淀粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖(或其它糖)、碳酸镁、明胶油、醇、洗涤剂、乳化剂或水(优选无菌)。
可以以单位剂型的形式提供药物组合物，通常以密封的容器提供并且可以作为试剂盒的部分提供。这类试剂盒通常(虽然不必然)包括使用说明书。它可以包括多个所述单位剂型。
可以调节药物组合物用于通过任何合适途径给予，例如通过口服(包括经口或舌下)、直肠或局部(包括经口、舌下或透皮)途径。可以通过制药领域已知的任何方法制备这类组合物，例如在无菌条件下，通过将活性组分与载体或赋形剂混合。
调节用于口服给予的药物组合物可以作为离散单元存在，如作为胶囊剂或片剂；作为粉剂或颗粒剂，作为溶液剂、糖浆剂或混悬剂(以水性或非水性液体，或作为可食用泡沫或搅打剂(whip)，或作为乳剂)。用于片剂或硬胶质胶囊剂的合适赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐。用于与软胶质胶囊剂一起使用的合适赋形剂包括，例如植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。对于溶液剂和糖浆剂的制备，可以使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。对于混悬剂的制备，可以使用油(例如植物油)以提供水包油或油包水混悬剂。
适于局部给予的药物组合物可以配制为软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。对于眼睛或其它外部组织的感染，例如口和皮肤，组合物优选作为局部软膏剂或乳膏剂施用。当配制成软膏剂时，活性成分可以与石蜡或水互溶性软膏剂基质一起使用。可替代地，活性成分可以与水包油乳膏剂基质或油包水基质配制成乳膏剂。适于局部给予眼部的药物组合物包括滴眼剂，其中，活性成分溶解或悬浮在合适的载体中，尤其是水性溶剂中。适于口中局部给予的药物组合物包括锭剂、软锭剂和漱口剂。适于直肠给予的药物组合物可以作为栓剂或灌肠剂存在。
适于经鼻给予的药物组合物，其中载体是固体，其包括具有例如20 至500微米范围内的粒径的粗粉末，采取鼻吸的方式给予，即通过从靠近鼻部的粉末容器中快速吸入通过鼻腔。合适的组合物，其中载体是液体，用于作为经鼻喷雾剂或作为鼻滴剂给予，其包括活性成分的水性或油溶液。
适于通过吸入给予的药物组合物包括细颗粒粉剂或喷雾，其可通过各种类型的经计量的剂量加压气雾剂、喷雾器或吹入器产生。适于阴道给予的药物组合物可以作为阴道栓剂(pessary)、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂存在。
适于肠胃外给予的药物组合物包括可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使制剂与预期接受者的血液基本上等渗的溶质的水性和非水性无菌注射溶液；以及可以包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。可以用于可注射溶液剂的赋形剂包括，例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。该组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立即加入运载的无菌液体，例如注射用水。即用性注射溶液剂和混悬剂可以由无菌粉末剂、颗粒剂和片剂制备。
该药物组合物可含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、除臭剂、盐、缓冲液、包衣剂或抗氧化剂。它们还可以含有除了本发明的物质之外的佐剂和/或治疗活性剂。
本发明的物质的剂量可以在宽限量之间变化，这取决于多种因素，包括待治疗的疾病或病症，患者的年龄、体重和身体状况，给药途径等，并且医生将最终确定将使用的合适剂量。
适于处理患有霉菌感染的建筑物的组合物可以是在使用前待溶解于水中的粉末或颗粒的形式并且可以通过喷涂或刷涂施加到感染区域。
以下描述了用于获得其为通式1的多烯大环内酯基团两性霉素B的抗真菌抗生素的大型、空间位阻的两性或碱性N-烷基或N-氨酰基衍生物的化合物的方法，其中，R1是氢原子或简单或大型烷基取代基，最后一个有利地作为琥珀酰亚胺衍生物的残基、或作为支链烷基、或含有碳环或杂环的部分、或糖基残基、或空间延展的氨酰基残基、或含碱性氮原子和大型脂族基或环状取代基的硫脲残基；R2是氢原子或如对R1限定的取代基，而R3是羟基或烷氧基或氨基烷基衍生物，以及作为其水溶性形式的它们的盐和复合物，其中，X是一个或多个碱性分子，有利地N-甲基-D-葡糖胺，一个或多个酸分子，优选天冬氨酸或复合剂。
为获得N-琥珀酰亚胺基衍生物，迈克尔加成反应是如下进行的：在三乙胺存在下，在二甲基甲酰胺中两性霉素B的溶液与马来酰亚胺的合适的衍生物反应。用乙醚将获得的产物沉淀、离心、干燥并通过柱层析(硅胶)纯化。
以与N-琥珀酰亚胺基衍生物相似的方式得到N-氨基琥珀酰亚胺基衍生物，但使用两倍过量的马来酰亚胺衍生物。在二甲基甲酰胺溶液中和在三乙胺存在下，两性霉素B与适当的异硫氰酸酯衍生物反应得到N-硫脲衍生物。所获得的产物通过柱层析(硅胶)纯化。
使用氰基硼氢化钠作为还原剂和催化量的乙酸，在两性霉素B的二甲基甲酰胺和甲醇的溶液中，利用苯甲醛或其衍生物的还原性烷基化反应得到N-苯甲基衍生物。用甲胺的四氢呋喃溶液中和反应混合物，然后用乙醚将终产物沉淀，并且通过柱层析(硅胶)纯化。
在二甲基甲酰胺的溶液中，使用氰基硼氢化钠作为还原剂和催化量的乙酸，以两性霉素B与脂肪族醛的还原性烷基化反应获得两性霉素B的N-烷基衍生物。用甲胺的四氢呋喃溶液中和反应混合物，用乙醚将反应产物沉淀，然后用柱层析(硅胶)纯化。
N-果糖基两性霉素B的N-烷基衍生物的获得是基于在二甲基甲酰胺的溶液中，使用氰基硼氢化钠作为还原剂和催化量的乙酸，N-果糖基两性霉素B与合适的脂族醛的还原性烷基化方法。用甲胺的四氢呋喃溶液中和反应混合物，用乙醚沉淀产物，以及用柱层析(硅胶)纯化。通过适当的 N-保护的氨基酸，在抗生素的N-酰基化的反应中获得两性霉素B的N-氨酰基和N-(N'-二烷基氨基)酰基衍生物。首先，在N,N'-二环己基碳二亚胺存在下，在二甲基甲酰胺的溶液中进行N-(芴基甲氧基羰基)-氨基酸与N- 羟基琥珀酰亚胺的反应。除去沉淀的N,N'-二环己基脲，然后向反应混合物中加入两性霉素B和三乙胺。反应进程通过薄层色谱监测。用乙醚沉淀最终产物，并且接着用柱层析(硅胶)纯化。
通过由N-羟基琥珀酰亚胺与N,N-二环己基碳二亚胺的二甲基甲酰胺溶液的氨基酸的活化进行两性霉素B的N-(N,N-二烷基氨基)氨酰基衍生物的合成。除去N,N-二环己基脲的沉淀的固体，并且将两性霉素B加入反应混合物。用过量的乙醚沉淀反应粗产物，并通过柱层析(硅胶)纯化。
在二甲基甲酰胺溶液中的抗生素与加入至乙醚溶液的反应混合物中的重氮甲烷的反应中进行N-取代的两性霉素B的衍生物的甲基酯的合成。然后，用乙酸除去过量的重氮甲烷，用过量的乙醚沉淀所形成的产物并通过柱层析(硅胶)纯化。
在叠氮磷酸二苯基酯和三乙胺存在下，通过在二甲基甲酰胺溶液中的 N-取代的抗生素衍生物与相应的胺的反应进行N-取代的两性霉素B衍生物的酰胺，例如N-果糖基-N-丙基两性霉素B 3-(N,N-二甲氨基)丙酰胺的合成。该反应的产物通过过量的乙醚沉淀并通过柱层析(硅胶)纯化。
有利地用N-甲基-D-葡糖胺得到两性霉素B衍生物的盐，由将稀释于水中的稍微过量的N-甲基-D-葡糖胺加入两性霉素B衍生物的水性悬浮液以及通过加入过量丙酮沉淀产物组成。
根据常规方法获得两亲性两性霉素B衍生物的水溶性复合物。
通过将稍摩尔过量的L-天冬氨酸加入抗生素的水悬浮液，有利地与天冬氨酸合成碱性两性霉素B的衍生物的水溶性盐，然后通过过量的丙酮沉淀获得的盐。根据本发明，用于获得空间位阻两性霉素B的衍生物的方法，仅导致获得所需产物。所有获得的化合物已经表征为它们的化学结构和生物特性。化合物的识别包括它们的光谱数据λmax测定值、的消光值，通过质谱法MS-ESI测定的分子量，薄层色谱指示的RF值。根据本发明，使用的强制性标准测定化合物的生物性质。存在化合物在体外针对大量真菌菌株、主要是念珠菌属和丝状真菌测定的活性，针对具有ABC和 MFS型转运蛋白过表达的多耐药性真菌菌株的活性。并且化合物的血液毒性通过它们对人红细胞的溶血活性测量，以及在组织培养中对多种哺乳动物细胞系测定其细胞毒性来确定。所获得的结果表明，根据引入到两性霉素B分子的空间位阻部分的类型，相对于原始抗生素，该化合物表现出降低至不同程度的血毒素活性，并且特征在于低细胞毒性、良好的抗真菌活性，并且针对多耐药性菌株(MDR)是有活性的。
根据本发明的化合物，即迄今未知的两性霉素B的空间位阻衍生物，它们满足抗真菌化学疗法的基本要求。它们的特征在于非常低的血液毒性，对哺乳动物体细胞表现出低毒性，针对多耐药性真菌菌株(MDR)是有活性的。此外，它们与酸或碱形成水溶性盐以及与复合化合物形成可溶性复合物。根据本发明的化合物的优点也是制备其的简单且有效的方法。
本发明的主题示于以下实施例，其中，示出了根据本发明的化合物和它们的水溶性盐和复合物的制备方法和特性。
实施例
实施例1：两性霉素B的N-琥珀酰亚胺衍生物的合成。
在配有磁力搅拌器的25ml圆底烧瓶中，将200mg(0.22mmol)的两性霉素B的溶解于4ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。将溶液冷却至0℃，并缓慢加入0.029ml(0.21mmol)的三乙胺(TEA)。10分钟后，加入0.25 mmol合适的马来酰亚胺并且将反应混合物温热至室温。反应进程通过氯仿:甲醇:水(20:8:1v/v)溶剂体系中的硅胶上(60F254，Merck)的薄层色谱(TLC)监测。在此之后，将反应混合物滴加至150ml的二乙醚中。将所得的浅黄色沉淀物在减压下在Millipore漏斗上过滤。用二乙醚(2×50 ml)将粗产物洗涤两次，并且随后在真空干燥器中干燥。将残余物通过正相柱层析纯化，其中，固相是硅胶以及溶剂系统是氯仿:甲醇:水(25:8:1 v/v)。收集并合并含有纯产物的部分，然后在不超过35℃的温度在减压下蒸发。在反应中使用下面指明的马来酰亚胺，得到两性霉素B的以下衍生物：
a)在与N-(2,4,6-三甲基苯基)马来酰亚胺的反应中得到30mg的 N-[N-(2,4,6-三甲基苯基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A1)
TLC Rf＝0.32；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C60H86N2O19为1300)；MS-ESI确定值 m/z：1137.4[M-H+]-；C60H86N2O19[M-H]-的计算值1137.6。
b)在与N-苯甲基马来酰亚胺的反应中得到60mg的N-(N-苯甲基- 琥珀酰亚胺基)两性霉素B(A2)
TLC Rf＝0.27；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C58H82N2O19为1330)；MS-ESI确定值 m/z：1109.3[M-H+]-；C58H82N2O19[M-H]-的计算值1109.6。
c)在与N-(4-溴苯基)马来酰亚胺的反应中，得到52mg的N-[N-(4- 溴苯基)-琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A3)
TLC Rf＝0.21；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C57H79BrN2O19为1260)；MS-ESI确定值m/z：1207.2[M+CH3OH]-；C57H79BrN2O19[M]+的计算值1174.5。
d)与N-(2-叔丁基苯基)马来酰亚胺的反应中得到36mg的N-[N-(2- 叔丁基苯基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A4)
TLC Rf＝0.22；紫外-可见:λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C61H88N2O19为1283)；MS-ESI确定值 m/z：1151.4[M-H+]-；C1H88N2O19[M]+的计算值152.6。
e)与N-(4-硝基苯基)马来酰亚胺的反应得到40mg的N-[N(4-硝基苯基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A5)
TLC Rf＝0.42；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C57H79N3O21为1295)；MS-ESI确定值 m/z：1172.3[M+CH3OH]-；C57H79N3O21[M]+的计算值1141.5。
f)与N-(2-羟乙基)马来酰亚胺的反应中得到56mg的N-[N-(2-羟基- 乙基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A8)
TLC Rf＝0.56；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C53H80N2O20是1390)；MS-ESI确定值 m/z 1047.5[M-H2O]+；C53H80N2O20[M]+的计算值1064.5。
实施例2.两性霉素B的N-氨基琥珀酰亚胺衍生物的合成
在配有磁力搅拌器的25ml圆底烧瓶中，将200mg(0.22mmol)的两性霉素B溶解于4ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。将溶液冷却至0℃，缓慢加入0.030ml(0.22mmol)的三乙胺(TEA)。10分钟后，加入0.44 mmol的合适的碱性马来酰亚胺，并将反应混合物温热至室温。反应进程通过氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v)溶剂体系中的硅胶(60F254，Merck)上的薄层色谱(TLC)监测。在此之后，将反应混合物滴加至150ml的二乙醚中。将所得的浅黄色沉淀物在减压下在Millipore漏斗上过滤。用二乙醚 (2×50ml)将粗产物洗涤两次，然后在真空干燥器中干燥。残余物通过正相柱层析纯化，其中，固相是硅胶以及溶剂系统是氯仿:甲醇(20％至80％梯度的甲醇)或氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v)。收集并合并含有纯产物的部分，然后在不超过35℃的温度在减压下蒸发。在反应中使用以下指出的碱性马来酰亚胺，得到两性霉素B的以下衍生物：
g)在与N-(2-哌啶-1-基乙基)马来酰亚胺的反应中得到48mg的 N-[N-(2-哌啶-1-基乙基)琥珀酰亚胺基]两性霉素B(A6)
TLC Rf＝0.18；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C58H90N4O19为1290)；MS-ESI确定值 m/z：1147.6[M+H]+；C58H90N4O19[M]+的计算值1146.6。
h)在与N-[3-(N,N-二甲基氨基)-2,2-二甲基丙基]马来酰亚胺的反应中得到65mg的N-[N-[3-(N,N-二甲基氨基)-2,2-二甲基丙基]琥珀酰亚胺基}- 两性霉素B(A7)
TLC Rf＝0.23；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C58H91N3O19为1304)；MS-ESI确定值 m/z：1134.6[M+H]+；C58H91N3O19[M]+的计算值1133.6。
实施例3.两性霉素B的N,N-二烷基衍生物的合成
在25ml配有磁力搅拌器的圆底烧瓶中将200mg(0.22mmol)两性霉素B溶解于3ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。接着，加入0.63mmol 的适宜的脂族醛，并将溶液在室温搅拌1小时。1小时后，加入3ml的无水甲醇、0.63mmol的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)和催化量的乙酸(0.015ml)。反应进程通过氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v)溶剂体系中的硅胶(60F254， Merck)上的薄层色谱(TLC)监测。将反应混合物冷却至-5℃，然后加入0.015ml甲胺的四氢呋喃溶液。将反应混合物放置10分钟，然后逐滴加入到150ml的二乙醚中。将所得浅黄色的沉淀物在减压下在Millpore 漏斗上过滤。用二乙醚(2×50ml)将粗产物洗涤两次，然后在真空干燥器中干燥。残余物通过正相柱层析纯化，其中，固相是硅胶以及溶剂系统是氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v)或氯仿:甲醇(梯度为20％至60％的甲醇)。收集并合并含有纯产物的部分，然后在不超过35℃的温度在减压下蒸发。得到以下两性霉素B的衍生物：
a)在与甲醛的反应中得到40mg的N,N-二甲基两性霉素B(A9)
TLC Rf＝0.22；紫外-可见：(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C49H77NO17为1554)；MS-ESI确定值m/z： 950.5[M-H]-；C49H77NO17[M]+的计算值951.5。
b)在与乙醛的反应中得到37mg的N,N-二乙基两性霉素B(A10)
TLC Rf＝0.31；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C51H81NO17为1514)；MS-ESI确定值m/z： 978.5[M-H+]-；C51H81NO17[M]+的计算值979.3。
c)在与丙醛的反应中是42mg的N,N-二-正丙基两性霉素B(A11)
TLC Rf＝0.27；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C53H87NO17为1468)；MS-ESI确定值m/z： 1106.6[M-H+]-；C53H85NO17[M]+的计算值1007.6。
d)在与3-(N-哌啶-1-基)丙醛的反应中得到20mg N,N-二[3-(N-哌啶-1- 基)丙基]两性霉素B(A12)。
TLC Rf＝0.31；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C63H103N3O17为1258)；MS-ESI确定值m/z： 1175.5[M+H]+；C63H103N3O17[M+H]+的计算值1175.4。
e)在与3-(4-乙基哌嗪-1-基)丙醛的反应中得到31mg的N,N-二[3-(4- 乙基哌嗪-1-基)丙基]两性霉素B(A13)
TLC Rf＝0.26；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C63H105N5O17为1226)；MS-ESI确定值 m/z：1205.8[M+H]+；C63H105N5O17[M+H]+的计算值1205.5。
实施例4.N-果糖基两性霉素B的N-烷基衍生物的合成
在配有磁力搅拌器的25ml的圆底烧瓶中，将200mg(0.18mmol) N-果糖基两性霉素B溶解于3ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。接着，加入0.63mmol的适宜的脂族醛，并将溶液在室温搅拌1小时。1小时后，加入3ml无水甲醇、0.63mmol的氰基硼氢化钠和催化量的乙酸(0.015 ml)。反应进程通过氯仿:甲醇:水(7:6:1v/v)或正丁醇:乙酸:水(4:1:1v/v) 溶剂系统中的硅胶(60F254，Merck)上的薄层色谱(TLC)监测。将反应混合物冷却至-5℃，并且然后加入0.015ml(2M)甲胺的四氢呋喃溶液。将反应混合物放置10分钟，然后逐滴加入到150ml的二乙醚中。将所得浅黄色的沉淀物在减压下在Millipore漏斗上过滤。用二乙醚(2×50ml) 将粗产物洗涤两次，然后在真空干燥器中干燥。残留物通过正相柱层析纯化，其中，固相是硅胶以及溶剂系统是氯仿:甲醇:水(7:6:1v/v)。收集并合并含有纯产物的部分，然后在不超过35℃的温度在减压下蒸发。得到以下N-果糖基两性霉素B的衍生物：
a)在与甲醛的反应中得到32mg的N-果糖基-N-甲基两性霉素的B (A14)
TLC Rf＝0.13；紫外-可见λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C54H87NO22为1345)；MS-ESI确定值m/z： 1098.3[M-H]-；C54H85NO22[M]+的计算值1099.6。
b)在与乙醛的反应中得到21mg的N-乙基-N-果糖基两性霉素B (A15)
TLC Rf＝0.11；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C55H89NO22为1328)；MS-ESI确定值m/z： 1112.5[M-H]-；C55H87NO22[M]+的计算值1113.4。
c)在与丙醛的反应中得到28mg的N-果糖基-N-正丙基两性霉素B (A16)
TLC Rf＝0.14；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C56H91NO22为1311)；MS-ESI确定值m/z： 1126.4[M-H]-；C56H89NO22[M]+的计算值1127.6。
d)在与N,N-二甲基-3-氨基丙醛的反应中得到15mg的N-果糖基 -N-(N,N-二甲基-3-氨基丙基)两性霉素B(A17)
TLC Rf＝0.11；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C58H94N2O22为1261)；MS-ESI确定值m/z： 1172.7[M+H]+；C58H94N2O22[M+H]+的计算值1172.5。
e)在与3-(哌啶-1-基)丙醛的反应中得到28mg N-果糖基-N-[3-(哌啶 -1-基)氨基丙基]两性霉素B(A18)
TLC Rf＝0.15；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C61H98N2O22为1221)；MS-EI确定值m/z： 1211.9[M+H]+；C61H98N2O22[M+H]+的计算值1211.5。
实施例5.两性霉素B的N-苯甲基衍生物的合成
在配有磁力搅拌器的25ml圆底烧瓶中，将200mg(0.22mmol)两性霉素B溶解于3ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。接着，加入0.3mmol 的芳族醛，并在室温搅拌1小时。1小时后加入3ml无水甲醇、0.3mmol 氰基硼氢化钠(NaBH3CN)和催化量(0.015ml)的乙酸。反应进程通过氯仿:甲醇:水(20:6:1v/v)溶剂体系中的硅胶(60F254，Merck)上的薄层色谱(TLC)监测。将反应混合物冷却至-5℃，然后加入0.015ml甲胺的四氢呋喃溶液。将反应混合物放置10分钟，然后逐滴加入到150ml的二乙醚中。将所得浅黄色的沉淀物在减压下在Millipore漏斗上过滤。用二乙醚(2×50ml)将粗产物洗涤两次，然后在真空干燥器中干燥。将残余物通过正相柱层析纯化，其中固相是硅胶以及溶胶系统是氯仿:甲醇:水 (20:6:1v/v)。收集并合并含有纯产物的部分，然后在不超过35℃的温度在减压下蒸发。得到以下两性霉素B的衍生物：
a)在与4-(N,N-二乙基氨基)苯甲醛的反应中得到15mg的N-(4-N,N 二乙基氨基苯甲基)两性霉素B(A19)
TLC Rf＝0.75；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C58H88N2O17为1363)；MS-ESI确定值 m/z：1083.3[M-H]-；C58H88N2O17[M]+的计算值1084.6。
b)在与4-苯基苯甲醛的反应中得到45mg的N-[(4-联苯基)-甲基]两性霉素B(A20)
TLC Rf＝0.86；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C60H83NO17为1357)；MS-ESI确定值m/z： 1088.8[MH]-；C60H83NO17[M]+的计算值1089.6。
c)在与4-叔丁基苯甲醛的反应中得到47mg的N-(4-叔丁基苯甲基) 两性霉素B(A21)
TLC Rf＝0.87；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C54H81NO17是1382)；MS-ESI确定值m/z： 1068.5[M-H]-；C58H87NO17[M]+的计算值1069.6。
实施例6.两性霉素B的N-硫脲基衍生物的合成
在配有磁力搅拌器的100ml圆底烧瓶中，将200mg(0.22mmol)的两性霉素B溶解于4ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。将溶液冷却至0℃，缓慢加入0.029ml(0.21mmol)的三乙胺(TEA)。10分钟后，加入0.25 mmol相应的异硫氰酸酯，并将该反应混合物温热至室温。反应进程通过在氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v)溶剂体系中的硅胶(60F254，Merck)上的薄层色谱(TLC)监测。在此之后，将反应混合物滴加至150ml的二乙醚中。将所得的浅黄色沉淀物在减压下在Millipore漏斗上过滤。用二乙醚 (2×50ml)将粗产物洗涤两次，然后在真空干燥器中干燥。残余物通过正相柱层析纯化，其中，固相是硅胶以及溶剂系统是氯仿:甲醇(梯度为20％到55％的甲醇)。收集并合并含有纯产物的部分，然后，在不超过35℃的温度在减压下蒸发。得到以下两性霉素B的衍生物：
a)在与2-哌啶-1-基-乙基异硫氰酸酯的反应中得到35mg的N-{[3-(2- 哌啶-1-基)乙基]硫脲基}两性霉素B(A22)
TLC Rf＝0.4；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C55H87N3O17S为1352)；MS-ESI确定值 m/z：1094.5[M+H]+；C55H87N3O17S[M]+的计算值1093.6。
b)在与异硫氰酸苯基酯的反应中得到10mg的N-[(3-苯基)-硫脲基] 两性霉素B(A23)
TLC Rf＝0.85；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C54H78N2O17S为1397)；ESI-MS确定值 m/z：1057.5[M-H]-；C54H78N2O17S[M]+的计算值1058.5。
c)在与2-(1-吗啉-1-基)乙基异硫氰酸酯的反应中得到23mg的 N-{[3-(2-吗啉-1-基)乙基]硫脲基}两性霉素B(A24)
TLC Rf＝0.5；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C54H87N3O18S为1348)；MS-ESI确定值 m/z：1096.4[M+H]+；C54H87N3O18S[M]+的计算值1095.6。
d)在与N,N-二乙基-2-氨基乙基异硫氰酸酯的反应中得到44mg的 N-{3-[2-(N,N-二乙基氨基)乙基]硫脲基}两性霉素B(A25)
TLC Rf＝0.32；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C55H89N3O17S是1350)；MS-ESI确定值 m/z：1096.5[M+H]+；C55H89N3O17S[M]+的计算值1095.6。
e)在与(吡啶-3-基)异硫氰酸酯的反应中是130mg的N-[3-(吡啶-3- 基)硫脲基]两性霉素B(A26)
TLC Rf＝0.83；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C53H77N3O17S为1396)；MS-ESI确定值 m/z：1060.5[M+H]+；C53H77N3O17S[M]+的计算值1059.5。
f)在与2-(吡咯烷-1-基)乙基异硫氰酸酯的反应中得到25mg的 N-{[3-(2-吡咯烷-1-基)乙基)硫脲基]两性霉素B(A27)
TLC Rf＝0.38；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C54H85N3O17S为1370)；MS-ESI确定值 m/z：1080.1[M+H]+；C54H85N3O17S[M]+的计算值1079.6。
g)在与2-(N,N-二甲基氨基)乙基异硫氰酸酯的反应中得到38mg的 N-{3-[2-(N,N-二甲基氨基)乙基]硫脲基}两性霉素B(A28)
TLC Rf＝0.33；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C52H83N3O17S为1400)；MS-ESI确定值 m/z：1054.4[M+H]+；C52H83N3O17S[M]+的计算值1053.5。
h)在与(吡啶-4-基)甲基异硫氰酸酯的反应中得到40mg N-{[3-(吡啶 -4-基)甲基)硫脲基]两性霉素B(A29)
TLC Rf＝0.73；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C53H77N3O17S为1377)；MS-ESI确定值 m/z：1074.6[M+H]+；C54H79N3O17S[M]+的计算值1073.5。
实施例7.两性霉素B的N-氨酰基和N-(N'-烷基氨基)酰基衍生物的合成
在配有磁力搅拌器的25ml圆底烧瓶中将0.26mmol的N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基酸(Fmoc-氨基酸)、0.26mmol的N-羟基琥珀酰亚胺 (HONSu)、53mg(0.26mmol)的二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于3ml 的二甲基甲酰胺(DMF)中。将反应混合物在37℃搅拌1小时。反应进程通过乙酸乙酯:己烷(7:3v/v)溶剂体系中的硅胶(60F254，Merck)上的薄层色谱(TLC)监测。在反应过程中，过滤沉淀的N,N'-二环己基脲，并用1ml的DMF清洗。向滤液中加入200mg(0.22mmol)两性霉素B 和0.04ml(0.22mmol)的三乙胺(TEA)。在37℃持续搅拌3小时。反应后，加入0.04ml(0.22mmol)TEA的另一部分，并将该反应混合物在室温放置2小时，然后滴加至150ml的二乙醚中。将所得的浅黄色沉淀物在减压下在Millipore漏斗上过滤。粗产物用二乙醚(2×50ml)清洗两次，然后在真空干燥器中干燥。残余物通过正相柱层析纯化，其中，固相是硅胶以及溶剂系统是氯仿:甲醇:水(15:8:1v/v)。收集并合并含有纯产物的部分，然后在不超过35℃的温度在减压下蒸发。在与相应的受保护的氨基酸的反应中获得以下两性霉素B的衍生物：
a)在与N-Fmoc-L-苯丙氨酸的反应中得到56mg的N-L-苯丙氨酰两性霉素B(A30)
TLC Rf＝0.41；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C56H84N2O18为1380)；MS-ESI确定值 m/z：1073.9[M+H]+、1096[M+Na]+；C56H84N2O18[M]+的计算值1072.6。
b)在与N-Fmoc-L-对碘代苯丙氨酸的反应中得到35mg的N-L-对碘代苯丙氨酰两性霉素B(A31)
TLC Rf＝0.53；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm， (理论上对于C56H84N2O18为1233)；MS-ESI确定值 m/z：1199.9[M+H]+；C56H83IN2O18[M]+的计算值1198.5。
c)在与N-Fmoc-D-β-萘基甘氨酸反应中得到30mg N-D-β-萘基甘氨酰两性霉素B(A32)
TLC Rf＝0.40；紫外-可见λmax(MeOH)406、382、363nm， (理论上对于C60H86N2O18为1317)；MS-ESI确定值 m/z：1124.9[M+H]+、1189.9[M+2MeOH]+；C60H86N2O18[M]+的计算值1122.6。
d)在与N-Fmoc-L-对硝基苯丙氨酸的反应中得到23mg的N-L-对硝基苯丙氨酰两性霉素B(A33)
TLC Rf＝0.41；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm， (理论上对于C56H83N3O20为1323)；MS-ESI确定值 m/z：1119.9[M+H]+；C56H83N3O20[M]+的计算值1117.6。
e)在与N-Fmoc-N-甲基-L-(Oγ-叔丁基)谷氨酸的反应中得到20mg的 N-甲基-L-(Oγ-叔丁基)谷氨酰两性霉素B(A34)
TLC Rf＝0.24；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C57H92N2O20为1315)；MS-ESI确定值m/z： 1126[M+H]+、1158[M+MeOH]+；C57H92N2O20[M]+的计算值1124.6。
f)在与N-Fmoc-D-(Oβ-叔丁基)天冬酰胺的反应中获得30mg的 N-D-(Oβ-叔丁基)天冬氨酰两性霉素的B(A35)
TLC Rf＝0.35；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C55H88N2O20为1348)；MS-ESI确定值m/z： 1098[M+H]+、1164[M+MeOH]+；C55H88N2O20[M]+的计算值1096.6。
g)在与N-Fmoc-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酸的反应中获得的70mg的 N-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B(A36)
TLC Rf＝0.37；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C55H81N3O18为1380)；MS-ESI确定值m/z： 1070.3[M-H]-；C55H81N3O18[M]+的计算值1071.6。
h)在与N-Fmoc-L-(S-叔丁基)半胱氨酸的反应得到80mg N-L-(S-叔丁基)半胱氨酰两性霉素B(A37)
TLC Rf＝0.34；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm， (理论上对于C54H86N2O18为1366)；MS-ESI确定值 m/z：1081.5[M-H]-；C54H86N2O18[M]+的计算值1082.5。
i)在与消旋-N-Fmoc-邻氟代苯丙氨酸的反应中得到23mg N-邻氟代苯丙氨酰两性霉素B(A38)
TLC Rf＝0.41；紫外-可见λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C56H81FN2O18为1360)；MS-ESI确定值 m/z：1087.2[M-H]-；C56H81FN2O18[M]+的计算值1188.5。
j)在与N-Fmoc-D-(Oγ-叔丁基)谷氨酸的反应中得到56mg的N-D-(Oγ- 叔丁基)谷氨酰两性霉素B(A39)
TLC Rf＝0.26；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C56H88N2O20为1334)；MS-ESI确定值 m/z：1107.4[M-H]-；C56H88N2O20[M]+的计算值1108.6。
k)在与N-Fmoc-D-(O-叔丁基)丝氨酸的反应中得到106mg N-D-(O- 叔丁基)丝氨酰两性霉素B(A40)
TLC Rf＝0.35；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm， (理论上对于C54H86N2O19为1386)；MS-ESI确定值 m/z：1065.7[M-H]-；C54H86N2O19[M]+的计算值1066.6。
l)在与N-Fmoc-D-苯基甘氨酸的反应中得到82mg N-D-苯基甘氨酰两性霉素B(A41)
TLC Rf＝0.35；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm， (理论上对于C55H82N2O18为1400)；MS-ESI确定值 m/z：1081.3[M+Na]+；C55H80N2O18[M]+的计算值1056.5。
实施例8.两性霉素B的N-(N',N'-二烷基)氨酰基衍生物的合成
在配有磁力搅拌器的25ml的圆底烧瓶中将0.44mmol的氨基酸、0.44 mmol的N-羟基琥珀酰亚胺(HONSu)、0.44mmol(0.26mmol)的二环己基碳二亚胺(DCC)溶于3ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。将反应混合物在37℃搅拌1小时。反应进程通过乙酸乙酯:己烷(7:3v/v)溶剂体系中的硅胶(60F254，Merck)上的薄层色谱(TLC)监测。在反应过程中过滤沉淀的N,N'-二环己基脲，并用1ml DMF清洗。将200mg(0.22mmol) 的两性霉素B和0.04ml(0.22mmol)的三乙胺加入滤液。反应进程通过氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v)溶剂体系上的硅胶(60F254，Merck)上的薄层色谱(TLC)监测。在37℃持续搅拌6-16小时。在此之后，将反应混合物逐滴加至150ml的二乙醚中。将所得浅黄色的沉淀物在减压下在 Millipore漏斗上过滤。用二乙醚(2×50ml)将粗产物洗涤两次，然后在真空干燥器中干燥。残余物通过正相柱层析纯化，其中，固相是硅胶以及溶剂系统是氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v)。收集并合并含有纯产物的部分，然后在不超过35℃的温度在减压下蒸发。在与相应的氨基酸的反应中获得以下两性霉素B的衍生物：
a)在与N,N-二乙基-L-苯基丙氨酸的反应中得到48mg的N-(L-N,N- 二乙基苯丙氨酰)两性霉素B(A42)
TLC Rf＝0.49；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm， (理论上对于C60H90N2O18为1312)；MS-ESI确定值 m/z：1125.4[M-H]-；C60H90N2O18[M]+的计算值1126.6。
b)在与N,N-二甲基-L-苯丙氨酸的反应中得到155mg的N-(L-N,N- 二甲基苯丙氨酰)两性霉素B(A43)
TLC Rf＝0.42；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm， (理论上对于C58H86N2O18为1346)；MS-ESI确定值 m/z：1097.6[M-H]-；C58H86N2O18[M]+的计算值1098.6。
实施例9.两性霉素B的N-取代的衍生物的甲基酯的合成
将0.1mmol的两性霉素B衍生物溶解于二甲基甲酰胺/甲醇 (3ml/1ml)的混合物中，接着将混合物冷却至5C并且以1:2.5的摩尔比加入过量的重氮甲烷(醚溶液)。将反应混合物在0℃静置2小时。反应进程通过氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v)溶剂系统中的硅胶(60F254，Merck 公司)上的薄层色谱(TLC)监测。此后，用乙酸分解过量的重氮甲烷，并将反应混合物滴加至150ml的二乙醚中。将所得浅黄色的沉淀物在减压下在Millipore漏斗上过滤。用二乙醚(2×50ml)将粗产物洗涤两次，然后在真空干燥器中干燥。残余物通过正相柱层析纯化，其中，固相是硅胶以及溶剂系统是氯仿:甲醇:水(15:6:1v/v)。收集并合并含有产物的部分，然后在不超过35℃的温度在减压下蒸发。在具有受保护氨基基团的两性霉素B的酯衍生物的情况下，将纯化的产物溶解于DMF中并用等摩尔量的DBN(1,5-二氮杂双环[4.2.0]壬-5-烯)处理以除去保护的基团。反应进程通过氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v)溶剂体系中的硅胶(60F254，Merck) 上的薄层色谱(TLC)监测。反应后加入过量的二乙醚，所得的浅黄色沉淀在减压下在Millipore漏斗上过滤。以上面描述的方式，得到示例性40mg 的N-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B甲酯(A44)
TLC Rf＝0.57；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm； (理论上对于C56H83N3O18是1362)；MS-ESI确定值 m/z：1084.3[M-H]-；C56H83N3O18[M]+的计算值1085.6。
实施例10.两性霉素B的N-取代衍生物的酰胺的合成
在配有磁力搅拌器的圆底烧瓶中将0.1mmol的两性霉素B衍生物溶于5ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。将混合物冷却至0℃，并加入102mg (1mmol)的3-N,N-二甲基丙基二胺、275(1mmol)的二苯基叠氮磷酸酯(DPPA)和14mL(1mmol)的三乙胺(TEA)。将反应混合物放置24小时。反应进程通过氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v)溶剂体系中的硅胶(60F254， Merck)上的薄层色谱(TLC)监测。将反应混合物滴加至100ml的二乙醚中。将所得浅黄色的沉淀物在减压下在Millipore漏斗上过滤。用二乙醚 (2×50ml)将粗产物洗涤两次，然后在真空干燥器中干燥。残余物通过正相柱层析纯化。其中，固相是硅胶以及溶胶系统是氯仿:甲醇:水(15:6:1 v/v)。收集并合并含有产物的部分，然后在不超过35℃的温度在减压下蒸发。在具有受保护氨基基团的两性霉素B的酰胺衍生物的情况下，将纯化的产物溶解于DMF并用等摩尔量的DBN(1,5-二氮杂双环[4.2.0]壬-5- 烯)处理以除去受保护的基团。反应进程通过氯仿:甲醇:水(10:6:1v/v) 溶剂体系中的硅胶(60F254，Merck)上的薄层色谱(TLC)监测。反应后加入过量的二乙醚，将得到的浅黄色沉淀在减压下在Millipore漏斗上过滤。以上面描述的方式，得到示例性21mg的N-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B 3-(N,N-二甲基氨基)丙酰胺(A47)。
TLC Rf＝0.52；紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm， (理论上对于C59H91N5O17为1220)；MS-ESI确定值 m/z：1210.3[M-H]-；C59H91N5O17[M]+的计算值1211.6。
实施例11.制备两亲性两性霉素B衍生物与N-甲基-D-葡糖胺的盐
在配有磁力搅拌器的圆底烧瓶中将0.1mmol两性霉素B的衍生物悬浮于2ml去离子水中以及随后加入0.11mmol的溶于1ml水的N-甲基-D- 葡糖胺。接着，将过量的丙酮加入该溶液。将所得的浅黄色沉淀物在减压下在Millipore漏斗上过滤。用二乙醚(2×50ml)将粗产物洗涤两次，然后在真空干燥器中干燥。以上面描述的方式，获得示例性89mg的 N-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B的N-甲基-D-葡糖胺盐(A50)
紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm， (理论上对于C62H100N4O23是1267.9)。
实施例12.制备两性霉素B的碱性或两亲性衍生物与L-天冬氨酸的盐
在配有磁力搅拌器的圆底烧瓶中，将0.1mmol的两性霉素B的衍生物(A47)悬浮于2ml去离子水中。接着，将0.3mmol的溶于2ml水中的L-天冬氨酸加入反应混合物。过滤该溶液并且向澄清滤液中加入过量的丙酮以沉淀。将所得的浅黄色沉淀物在减压下在Millipore漏斗上过滤。用二乙醚(2×50ml)将粗产物洗涤两次，然后在真空干燥器中干燥。以上面描述的方式，获得示例性89mg的3-二甲基氨基丙酰胺N-D-β-(吡啶-3- 基)丙氨酰两性霉素B L-天冬氨酸(A51)
紫外-可见：λmax(MeOH)406、382、363nm；(MeOH,λ＝406nm)＝ 1060(理论上对于C64H100N6O21为1148)。
下面示出了两性霉素B衍生物的体外抗真菌活性和血液毒性的结果。
根据标准程序(国家委员会的临床实验室标准(National Committe forClinical Laboratory Standards)；用于酵母的肉汤稀释抗真菌敏感性试验的参考方法(Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing ofyeast)，认可标准，第二版.M27-A2vol.22Wayne,PA,2002)，在96孔微孔板中，在缓冲介质RPMI 1640pH 7.0中，我们使用了连续稀释的方法以体外测定抗真菌活性。在波长λ＝531nm(A531)处，使用微孔板读数器 (Victor3，Perkin-Elmer)测定细胞悬浮液的光密度。在获得的结果的基础上，制作A531值和检测化合物的浓度之间的关系图。从这些图表中，读取 IC50值，这是测试化合物的内插浓度，在该值处，A531值恰好是对照样品的A531值的50％。此外，MIC值，其是测试化合物的最低浓度，在该值处，A531值是对照样品的测得A531值的最多20％。
按前面所述的程序(Slisz,M.,et al.,E.,J Antibiot 57:669-678(2004)) 通过连续稀释法进行血液毒性测定。将人红细胞悬浮于盐水溶液中以获得 2×107/ml的悬浮细胞密度。将合适量的化合物稀释液加入到试管内的细胞悬浮液中并在37℃孵育30分钟，然后离心(1700×g，10分钟，4℃)。在红细胞悬浮液离心后，通过测量在波长λ＝540nm(A540)处的吸光度，测定上清液中的血红蛋白浓度。在0.1％Tritone X-100(对照样品)存在下，细胞悬液孵育后得到最大水平的溶血。在获得的结果的基础上，制作 A540值与检测化合物的浓度之间的关系图。从这些图表中，读出化合物的内插浓度EH50值，其A540值正好是对照样品的测得A540值的50％。测试衍生物的最大浓度不能超过100μg/ml，以保持在实验条件下的充分溶解度。在化合物的最大浓度下，其表现出特别低的血液毒性，不可能测定 EH50值，在这种情况下，血液毒性指定为EH50>100μg/ml。
得到的结果示于下表2A和2B中。表2A示出了较大系列的两性霉素B衍生物的抗真菌和溶血活性，另外引入描述两性霉素B衍生物的选择性相对于原始抗生素的提高的因子。WS因子确定衍生物的选择性数据，以及WE因子示出相对于相同的原始两性霉素B的上述选择性数据。表 2B示出了涉及检测化合物的较宽的抗真菌谱的数据。
表2A
WS—选择性系数
WE—有效性因子
WS(Z)—对衍生物的选择性系数
WS(AmB)—对原始抗生素的选择性系数。
表2B
也检测了两性霉素B衍生物针对多耐药性(MDR)真菌菌株的体外抗真菌活性。该结果示于表3。
表3
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在组织培养物中测定两性霉素B衍生物对哺乳动物细胞的细胞毒性活性。
使用选定的细胞系用于检测：CCRF-CEM-人急性淋巴细胞白血病； HepG2-人恶性肝癌、LLC-PK1一猪肾脏的上皮细胞；所有系均来自ATCC 保藏中心(collection)。
使用下面描述的培养以及测定细胞毒活性的方法进行这项研究。
在RPMI 1640+10％胎牛血清(FBS)培养基中培养CCRF-CEM细胞，在培养基199(Medium 199)+3％FBS培养基中培养LLC-PK1细胞，在 MEM+10％FBS培养基中培养HepG2细胞。所有培养基包含100μg/ml 的青霉素G和链霉素。将1.2×104细胞/孔的量的细胞接种在含有适当的培养基的24-孔微孔板中，并静置过夜。接着，以10μl的体积(系列2x 稀释)加入测试化合物，其作为二甲基亚砜(DMSO)中的溶液。向对照孔中加入10μl的DMSO。在95％/5％CO2的气氛，在37℃的温度孵育具有细胞悬浮液的微孔板120小时。孵育后，向所有孔中加入200μl的3-(4，5- 二甲基三唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)的PBS溶液(4mg/m1)，并将板在37℃再培养4h。接着，加入1ml DMSO以溶解甲月替晶体并且使用微板读数器(Victor3，Perkin-Wallac)在波长λ＝540nm(A540)处测定溶液的吸收。在获得的结果的基础上，制作A540值与检测化合物的浓度之间的关系图。从这些图表，读取IC50值，即存在的测试化合物的A540值是对照样品中测得的A540值的一半时的浓度。
所得到的结果列于表4中。
表4

Claims (27)

1.一种以下式1a的化合物，或者其盐：
其中，R1是：
a)结构的硫脲基残基；其中，R5是-W-Z，其中，W是可选取代的烷基连接基或键；以及Z是可选取代的芳基、杂芳基或含氮杂环脂族基或者NR*2、NH2、NHR*，其中，R*是可选取代的脂族基、可选取代的碳环或杂环部分，或者两个R*与它们连接的氮原子一起形成可选取代的杂环，其中，Z是未取代的或者被一个或多个烷基或卤素取代的；或
b)用选自可选取代的碳环或杂环、支链C3-6烷基或二乙基氨基中的一个或多个取代基取代的苯甲基；
R2是氢原子、未取代的非支链烷基或取代的烷基，或如对R1限定的取代基；以及
R3是羟基基团、烷氧基基团或者-NR14-(C1-C6烷基)-NR15R16，其中，R14是氢原子或甲基，R15和R16独立地选自氢或可选取代的脂族基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，R2是氢原子、非支链烷基或者用烷基氨基或可选取代的碳环或含N杂环部分取代的烷基。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，R2是可选取代的N-连接的杂环烷基取代的烷基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中，R3是羟基、甲氧基或-NR14-(C1-C6烷基)-NR15R16，其中，R14是氢原子或甲基，R15和R16独立地选自氢或可选取代的脂族基。
5.根据权利要求1所述的化合物，选自包括以下各项的组：N-[3-(2-哌啶-1-基乙基)-硫脲基]两性霉素B、N-[(3-苯基)硫脲基]两性霉素B、N-[3-(2-吗啉-1-基乙基)硫脲基]两性霉素B、N-{3-[2-(N,N-二乙基氨基)乙基]硫脲基}两性霉素B、N-[3-(吡啶-3-基)硫脲基]两性霉素B、N-[3-(2-吡咯烷-1-基乙基)硫脲基]两性霉素B、N-{3-[2-(N,N-二甲基氨基)乙基]硫脲基}-两性霉素B、N-[3-(吡啶-4-基甲基)硫脲基]两性霉素B、N-(4-N,N-二乙基氨基苯甲基)两性霉素B、N-[(4-联苯基)-甲基]两性霉素B、N-(4-叔丁基苯甲基)两性霉素B、N-(4-N,N-二乙基氨基苯甲基)两性霉素B甲酯，或者它们的盐。
6.一种化合物，选自包括以下各项的组：N-L-苯丙氨酰两性霉素B、N-L-对碘代苯丙氨酰两性霉素B、N-D-β-萘基丙氨酰两性霉素B、N-L-对硝基苯丙氨酰两性霉素B、N-甲基-L-(Oγ-叔丁基)谷氨酰两性霉素B、N-D-(Oβ-叔丁基)天冬氨酰两性霉素B、N-D-β-(吡啶-3-基)丙氨酰两性霉素B、N-L-(S-叔丁基)胱氨酰两性霉素B、N-邻氟代苯丙氨酰两性霉素B、N-D-(Oγ-叔丁基)谷氨酰两性霉素B、N-D-(O-叔丁基)丝氨酰两性霉素B、N-D-苯基甘氨酰两性霉素B和N-(L-N,N-二乙基苯丙氨酰)两性霉素B，或它们的盐。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其特征在于以下事实：其为与无机或有机碱的盐的形式。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其特征在于以下事实：其为与无机或有机碱的水溶性盐的形式。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其特征在于以下事实：其为与N-甲基葡糖胺的盐的形式。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其特征在于以下事实：其为与无机或有机酸的盐的形式。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其特征在于以下事实：其为与无机或有机酸的水溶性盐的形式。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其特征在于以下事实：其为与天冬氨酸的盐的形式。
13.一种药物组合物，包括权利要求1至12中任一项所述的化合物。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物在制备用于控制或治疗真菌感染或治疗由真菌感染引起的疾病的药物中的用途。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物用于治疗植物中的真菌感染的用途。
16.根据权利要求14或15所述的用途，其中，所述真菌感染由来自酵母和丝状真菌或念珠菌属的菌株的组的病原真菌引起。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述酵母或丝状真菌或所述念珠菌属的菌株具有多耐药性。
18.根据权利要求16所述的用途，其中，所述酵母或丝状真菌或所述念珠菌属的菌株具有多耐药性，具有转运蛋白MDR1p的过表达。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述转运蛋白MDR1p是Cdr1p和Cdr2p。
20.一种植物保护产品，包括根据权利要求1至12中任一项所述的化合物。
21.一种治疗植物中的真菌感染的方法，包括将根据权利要求1至12中任一项所述的化合物给予植物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述真菌感染由来自酵母和丝状真菌或念珠菌属的菌株的组的病原真菌引起。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述酵母或丝状真菌或所述念珠菌属的菌株具有多耐药性。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述酵母或丝状真菌或所述念珠菌属的菌株具有多耐药性，具有转运蛋白MDR1p的过表达。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述转运蛋白MDR1p是Cdr1p和Cdr2p。
26.一种抗真菌建筑物处理产品，包括根据权利要求1至12中任一项所述的化合物。
27.一种对建筑物提供抗真菌处理的方法，包括将根据权利要求1至12中任一项所述的化合物或根据权利要求26所述的产品给予建筑物。
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