CN101472938A - 适用于药物配制品的稳定的依沙芦星盐 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了稳定的固体晶体形式的依沙芦星盐，其适用于制备抗肿瘤胃肠外配制品。还提供了使用胃肠外配制品在人中治疗肿瘤性疾病的方法，所述配制品包含至少一种稳定的依沙芦星盐。

Description

适用于药物配制品的稳定的依沙芦星盐
与相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年6月15日提交的美国专利申请No.11/424,387的优先权。该申请的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及稳定的依沙芦星(elsamitrucin)盐和相关的合成方法。特别地，本发明的稳定的固体依沙芦星盐适用于制备下述溶液，所述溶液适用于在肿瘤性疾病的治疗中肠胃外施用。
背景技术
如美国专利(USPN)4,518,589和4,572,895所述，依沙芦星是从放线菌(Actinomycete)菌株J907-21中分离的杂环抗肿瘤抗生素，上述文献中关于依沙芦星的自然历史、化学组成、制备方法和生物活性所公开的所有内容通过引用并入本文。依沙芦星在富含鸟嘌呤-胞嘧啶(G-C)的序列处嵌入DNA并抑制拓扑异构酶I和II，导致单链断裂和DNA复制的抑制。依沙芦星具有针对转移的乳腺癌、结肠和直肠癌、非小细胞肺癌和卵巢癌的显著溶癌活性，并在患有复发的或难治性非Hodgkin′s淋巴瘤的患者中具有显著的溶癌活性。
依沙芦星在化学上已知为苯并(h)(1)苯并吡喃并(5，4，3-cde)(1)苯并吡喃-5，12-二酮，10((2-O-(2-氨基-2，6-二脱氧-3-O-甲基-α-D-吡喃半乳糖基)-6-脱氧-3-C-甲基-β-D-吡喃半乳糖基)氧)-6-羟基-1-甲基，并且具有式I中一般描述的结构。依沙芦星也已知被称为10-O-elsaminosylelsarosylchartarin、BBM2478A、BMY-28090、SPI-28090、BRN 5214813、elsamicin A、elsamitrucina和elsamitrucine。
Figure A200780022340D00051
式I
依沙芦星通常被肠胃外(一般静脉内)施用给动物(包括人)，并作为冻干粉末提供，所述粉末在使用前即刻用无菌水重溶用于注射。现有技术的冻干依沙芦星粉末作为1:1的琥珀酸盐提供，其如下原位形成：将依沙芦星碱溶解在有机溶剂中，然后添加足量的水性琥珀酸，形成溶解的游离碱与酸的1:1溶液。然后将得到的依沙芦星-琥珀酸悬浮液调节至3.5和4.5之间的pH，并在冻干前与填充剂如甘露醇混合，以增强稳定性(参见例如USPN 5,508,268)。现在不能获得粉末形式(晶体或无定形的)的稳定依沙芦星盐，因此所有高度可溶的依沙芦星药物组合物必须使用游离碱原位制备。
因此，需要稳定的依沙芦星盐，其能够作为干粉被储存较长时间而不丧失生物活性。另外，还需要包含稳定的依沙芦星盐的药物制剂，其可以不使用游离碱和原位溶解游离碱所需的相应有机溶剂来制备。
发明内容
本发明提供了适用于制备下述稳定的肠胃外溶液的水溶性固体依沙芦星盐，所述肠胃外溶液旨在被用于抗肿瘤性治疗方案中。另外，还提供了本发明的稳定依沙芦星盐的制备方法。
在本发明的一个实施方案中，稳定的固体依沙芦星盐的反离子选自，但不限于乳酸根、富马酸根、马来酸根、琥珀酸根、酒石酸根、甲苯磺酸根、甲磺酸根、苯甲酸根、水杨酸根、盐酸根、硫酸根、磷酸根和其他。
在本发明的另一方面中，稳定的固体依沙芦星盐可以是晶体或无定形的。
在本发明的一个方面中，提供稳定的固体依沙芦星甲苯磺酸盐。
还在本发明的另一实施方案中，治疗肿瘤性疾病的方法包括对人静脉施用依沙芦星肠胃外配制品，其中所述依沙芦星肠胃外配制品包括至少一种选自乳酸盐、富马酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、盐酸盐、硫酸盐和磷酸盐的稳定的固体依沙芦星盐。
本发明的又一实施方案包括治疗人肿瘤性疾病的方法，所述方法包括提供基本上由依沙芦星甲苯磺酸盐、可药用运载体和任选的至少一种可药用赋形剂组成的胃肠外配制品。
在本发明的一个实施方案中，使用本发明的依沙芦星胃肠外配制品治疗的肿瘤性疾病是复发的或难治性非Hodgkin′s淋巴瘤。
通过参考说明书，将更全面地了解和理解本发明的这些及其他目的、优点和特征。
附图概述
图1：描述从根据本发明的教导制造的乙腈:水的1:1混合物中重结晶的依沙芦星甲苯磺酸盐。
术语的定义
在公开本发明之前，提供对下文将使用的某些术语的理解会是有帮助的。
类似物：本文使用的“类似物”包括与另一化合物具有结构相似性的化合物。例如，抗病毒化合物阿昔洛韦(acyclovir)是核苷类似物，并且与衍生自碱基鸟嘌呤的核苷鸟苷结构类似。因此，阿昔洛韦模拟鸟苷(生物上“与之类似”)并且通过替换(竞争)病毒核酸中的鸟苷残基干扰DNA合成和防止翻译/转录。因此，与另一化合物(亲本化合物)具有结构类似性并模拟亲本化合物的生物或化学活性的化合物就是类似物。被认定为本文使用的类似物的条件并不要求最小或最大数量的元素或官能团取代，只要该类似物能够以一些相关的方式(相同、互补或竞争性地)模拟亲本化合物的生物或化学特性即可。类似物可以并通常是亲本化合物的衍生物(见下文“衍生物”)。本文公开的化合物的类似物可具有比其亲本化合物相等、更小或更大的活性。
衍生物：本文使用的“衍生物”是天然或合成地从亲本化合物制造(衍生)的化合物。衍生物可以是类似物(见上文“类似物”)，并因此可具有类似的化学或生物活性。然而，本文中使用的衍生物不必须模拟亲本化合物的活性。被认定为衍生物的条件并不要求最小或最大数量的元素或官能团取代。例如，抗病毒化合物更昔洛韦(ganclovir)是阿昔洛韦的衍生物。更昔洛韦具有与阿昔洛韦不同的抗病毒活性谱以及不同的毒理学特性。本文公开的化合物的衍生物可具有与其亲本化合物相等、更小、更大或不相似的活性。
依沙芦星：本文使用的术语“依沙芦星”是指具有约825.83Da分子量的抗肿瘤组合物，其化学上已知为苯并(h)(1)苯并吡喃并(5，4，3-cde)(1)苯并吡喃-5，12-二酮，10((2-O-(2-氨基-2，6-二脱氧-3-O-甲基-α-D-吡喃半乳糖基)-6-脱氧-3-C-甲基-β-D-吡喃半乳糖基)氧)-6-羟基-1-甲基，并具有式I中一般描述的结构。依沙芦星也已知为10-O-elsaminosylelsarosylchartarin、BBM2478A、BMY-28090、SPI-28090、BRN 5214813、elsamicin A、elsamitrucina和elsamitrucine。从天然来源中分离和表征依沙芦星的方法参见USPNs 4,518,589和4,572,895。还参见Konishi M，Sugawara K，Kofu F，Nishiyama Y，Tomita K，Miyaki T，Kawaguchi H.1986.Elsamicins，newantitumor antibiotics related to chartreusin I.Production，isolation，characterization and antitumor activity.J.Antibiot.(Tokyo)Jun；39(6)：784-91。
药物配制品：本文使用的术语药物配制品是指可药用的制剂，其含有一种或多种本发明的依沙芦星盐和至少一种可药用运载体，所述运载体例如但不限于注射用水、盐水或磷酸盐缓冲的盐水。另外，本发明的药物配制品还可以包含稳定剂、防腐剂、缓冲液或另外的治疗剂。本发明的药物配制品可以通过本领域技术人员已知的任何手段施用，并且理想地适用于静脉内施用或注射进皮肤、肌肉或身体的其他组织。药物配制品可旨在用于口服施用。
盐：本文使用的“盐”包括用金属或类似金属作用的基团替换酸的部分酸性氢或所有酸性氢得到的任何化合物：离子晶体化合物。在该情况下，盐是游离碱和有机酸的产物，其能够作为稳定的固体存在，并且不包括假盐或仅在溶液中存在的原位制造的盐。
合适的盐形式：本文使用的术语“合适的盐形式”表示以稳定固体状态(无定形或晶体形式)制备的依沙芦星盐。
固体或固体盐：本文使用的术语固体或固体盐是指以固体状态存在的依沙芦星盐，其具有少于30％的残余水分，优选地少于10％的残余水分和更优选地少于5％的残余水分。本文使用的“水分”是指水或有机溶剂。术语“固体”在本文中也用于区分本发明的依沙芦星盐和原位形成并主要存在于水相中的盐。
稳定的：本文使用的“稳定的”是指含依沙芦星盐或含依沙芦星盐的肠胃外配制品(通过原位盐形成以外的方法制造)，其中依沙芦星盐在75℃的高温下干燥9小时或更优选地在98℃干燥过夜时保留下述NMR数据，所述数据显示接近完美的1:1盐比例(因此表明在固体状态下不分解)。另外，本文使用的“稳定的”是指在合适的储存温度下，胃肠外配制品中含有的依沙芦星盐对固体形式而言在至少24个月中和对液体形式而言在至少18个月中保留至少90％的抗肿瘤活性，所述活性通过体外生长抑制测试测定(见实施例4)。
发明详述
本发明提供了适用于制备稳定药物配制品的水溶性固体依沙芦星盐，所述药物配制品旨在被用于抗肿瘤治疗方案中。另外，还提供了制备稳定的依沙芦星盐的方法。
在本发明的一个实施方案中，本发明的稳定的依沙芦星盐选自，但不限于乳酸盐、富马酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐和其他。本发明的依沙芦星盐是稳定的固体并可以是晶体或无定形的。
依沙芦星和结构相关的抗生素与DNA中富含GC的区域结合，并明显偏好B-DNA超过Z-DNA。它们抑制RNA合成并通过形成自由基引起DNA的单链分裂。依沙芦星也可以被认为是迄今为止报道的最有效的拓扑异构酶II抑制剂，并且能够抑制若干种DNA-蛋白质复合物的形成。依沙芦星结合c-myc癌基因的P1和P2启动子区，抑制Sp1转录因子的结合，从而抑制转录。
依沙芦星已经显示在患有复发的或难治性非Hodgkin′s淋巴瘤的患者中的活性，和针对多种鼠肿瘤(包括白血病P388、白血病L1210和黑色素瘤B16及M5076)的体内活性，以及针对MX1和HCT116异种移植体的体内活性(见例如Raber MN，Newman RA，Newman BM，Gaver RC，Schacter LP1992 Phase I trial and clinical pharmacology of elsamitrucin.CancerRes.Mar 15；52(6)：1406-10)。
另外，难治性/复发的非Hodgkin′s淋巴瘤的实验治疗已经证明依沙芦星相关的毒性相对温和，主要由虚弱、恶心和呕吐组成，并且不包括骨髓抑制。依沙芦星的活性及其骨髓抑制的缺乏表明了其在该疾病中的实用性，特别是与其他验证过的试剂组合时。(见Allen SL，Schacter LP，Lichtman SM，Bukowski R，Fusco D，Hensley M，O′Dwyer P，Mittelman A，Rosenbloom B，Huybensz S.1996.Phase II study of elsamitrucin(BMY-28090)for the treatment of patients with refractory/relapsed non-Hodgkin′s lymphoma.Invest.New Drugs.14(2)：213-7)
还对多柔比星(DX)与依沙芦星进行了比较研究，研究了它们对两种敏感的乳腺癌细胞系和DX-抗性亚系(MCF7DX)的体外活性，所述两种敏感的乳腺癌细胞系中一种是雌激素受体-阳性的(ER+，MCF7)，一种是雌激素受体阴性的(ER-，MDA-MB-231)株系。还在来自未治疗的患者的19个临床乳腺癌标本上研究了这两种药物的活性。在药理学相关浓度和10-倍和100-倍浓度下测试药物，所述药理学相关浓度根据暴露于致死剂量中3小时的曲线下面积计算，所述致死剂量在小鼠中产生10％死亡率(LD10)。在DX-敏感株系中，依沙芦星引起比DX更大的RNA和DNA前体掺合和细胞增殖抑制。另外，ER+MCF7中抗增殖效应比ER-MDA-MB-231细胞系中高10倍(IC50：0.25微克/ml对0.21微克/ml)。在MCF7DX亚系中，依沙芦星对DX有交叉抗性。在临床标本中，在相同的药物浓度下，依沙芦星比DX更经常观察到对DNA前体嵌合的影响。ER+对依沙芦星的体外灵敏度比ER-肿瘤更加显著：两组中药物的最小抑制浓度分别为0.1和3.5微克/ml。这些体外结果表明依沙芦星在临床治疗中、主要是ER+乳腺癌患者的临床治疗中很有前途(见Silvestrini R，Sanfilippo O，Zaffaroni N，DeMarco C，Catania S.1992.Activity of a chartreusin analog，elsamitrucin，onbreast cancer cells.Anticancer Drugs.Dec；3(6)：677-81)。
于1996年4月16日授权给Nassar et al.并转让给Bristol-Myers Squibb的美国专利5,508,268(下文称作‘268专利)公开了包含依沙芦星碱、有机酸、稳定剂和缓冲液的肠胃外配制品。其中公开的依沙芦星组合物使用多种有机酸制备，包括盐酸、L(+)-乳酸、L-酒石酸、D-葡糖醛酸、甲烷-磺酸、己二酸和琥珀酸，优选琥珀酸。根据第4栏5-30行的实施例的教导制备依沙芦星组合物。在该实施例中，仅描述了琥珀酸盐。特别地，根据‘268专利中的公开内容，使用有机酸与至少一种还原剂(防腐剂)组合并将pH调节至约4来原位形成依沙芦星盐。过滤得到的溶液并保持液态用于稳定性测试。在‘268专利中公开的其他实施方案中，有机酸、依沙芦星碱、还原剂和其他合适的药物赋形剂(例如但不限于糖)在溶液中混合，并将得到的组合物冻干。
然而，‘268专利未公开、讨论或教导稳定的固体依沙芦星盐。与‘268专利的教导完全相反，本发明发现了提供稳定的固体依沙芦星盐的方法，所述依沙芦星盐使用依沙芦星碱和选择的有机酸制造。根据本发明的教导制造得到的组合物是固体的、干燥的或部分干燥的依沙芦星盐粉末，与‘268专利中所述的冻干物相反。因此，本发明的依沙芦星盐组合物是固体状态的真实盐，而不是含有溶解的碱和有机酸混合物的原位溶液。
本发明提供了相对于‘268专利中所述原文形成的混合物而言的大量优点。首先，根据本发明的教导制造的依沙芦星盐能够被仔细地分析杂质并根据需要精炼，以满足非常高的政府规则。另外，本发明的真实盐能够被精确地称重并溶解在合适的药物运载体如注射用水中。选择的盐自身以固体状态储存时是极端稳定的，并具有比其相应的溶解溶液延长的保质期。因此，可以使用本发明的依沙芦星盐制备肠胃外溶液并储存延长的时间段。
提供以下的实施例作为本发明的阐述性实施方案。应当理解稳定干燥的、或接近干燥的本发明的依沙芦星盐不受以下的实施例限制。以下实施例的教导可被具有常规技术的药剂师用作制造其他变体的指南，所述变体产生与本文公开的相同的组合物。
实施例
制造依沙芦星盐的方法
实施例1
本发明的稳定依沙芦星盐的初步准备
在进行优化和大规模生产之前制备小批量的依沙芦星盐。选择基于有机酸的八种反离子，包括乳酸、马来酸、琥珀酸、L-酒石酸、对-甲苯磺酸(本文也称作p-TSA或甲苯磺酸盐)、苯甲酸、水杨酸和硫酸。基于药剂化学领域技术人员已知的先前的筛选方法选择三种溶剂，选择的溶剂包括二噁烷、二甲基酰胺(DMF)和醋酸(AcOH)。包含额外的p-TSA/MeOH组合用于总共二十五种变化反应。
向每个反应试管中添加3.0 x 10-5摩尔依沙芦星碱。将依沙芦星碱溶于55℃下0.25mL DMF或AcOH、80℃下1.5mL二噁烷或70℃下12mLMeOH中并搅拌5分钟确保溶解。然后向每管中充入245-270μL上文所列有机酸之一的0.126M二噁烷溶液(见表1)，该溶液对应于1.05个当量的八种酸中的每一种(酒石酸分散在甲醇/水的1:1混合物中，因为其不溶于二噁烷)。
表1.
Figure A200780022340D00121
API＝依沙芦星碱。
最初温度保持10分钟，然后下降至室温，速率对DMF和AcOH而言为20℃/小时，对二噁烷而言是30℃/小时，对MeOH而言是25℃/小时。在管中用二噁烷/L-酒石酸、二噁烷/p-TSA、二噁烷/硫酸和AcOH/硫酸形成固体。通过过滤收集固体并在50℃下和30英寸汞柱(in.Hg.)下真空干燥。将其中未形成固体的管用氮气流浓缩至干燥，并在50℃和30英寸汞柱下干燥。在真空下去除甲醇并于室温下高真空中干燥得到的残余物。通过x-射线衍射(XPRD)、差示扫描量热法(DSC)和热重量分析(TGA)分析所有的样品，测定盐的结晶度。结晶固体得自二噁烷/硫酸和得自AcOH/硫酸；半结晶固体得自二噁烷/L-酒石酸、二噁烷/p-TSA、DMF/乳酸、DMF/马来酸、DMF/L-酒石酸、DMF/苯甲酸、DMF/硫酸、AcOH/乳酸、AcOH/p-TSA和AcOH/苯甲酸。通过XRPD发现所有其他固体是无定形的。
实施例2
依沙芦星盐制备的最优化
选择根据实施例1的教导制备的以下三种依沙芦星盐用于大规模生产的开发。所选择的盐是依沙芦星酒石酸盐、依沙芦星硫酸盐和依沙芦星甲苯磺酸盐。选择它们是因为其均提供晶体或半晶体固体，所述固体在冷却过程中沉淀，这允许更好地分离和纯化(如果需要的话)盐，并从而导致它们更加适合更大规模的制造技术。然而，它们针对实施例2的选择不应当被认为是一种限制。
将L-酒石酸、硫酸和p-TSA溶于二噁烷中。向每个合适的容器中充入1.7 x 10-4mol依沙芦星碱，所述依沙芦星碱在80℃中溶于7.5ml二噁烷中并搅拌5分钟确保溶解。然后向每管中充入350-380μL二噁烷中0.5M有机酸溶液，所述溶液对应于约1.05当量的三种酸中的每一种(表2)。
表2.
 
实验# 依沙芦星(mg) 溶剂 量(mL) 酸(0.5M) 量(mL)
1 118 二噁烷 9.0 硫酸 0.38
2 113 二噁烷 7.0 p-TSA 0.36
3 108 二噁烷 7.5 L-酒石酸 0.35
最初温度保持10分钟，然后下降至室温，速率对二噁烷而言是30℃/小时。通过向含有二噁烷/L-酒石酸和二噁烷/硫酸的管中添加酸形成固体，对二噁烷/p-TSA而言沉淀在冷却过程中发生。过滤后在50℃和30英寸汞柱下真空干燥固体。通过XPRD、DSC和TGA分析样品，测定结晶度(表3)和其他物理特性。
如表3所示，实施例2中的所有固体都是半晶体，含有多达约5％的剩余溶剂，并且是持续糊状的，这归因于由于快速沉淀而残余在固体中的高溶剂含量。
在另一实施方案中，使用比上文所述更缓慢的沉淀方法制备本发明的依沙芦星盐。在80℃下向反应容器中充入7.6 x 10-5mol的依沙芦星碱和5mL的二噁烷。将混合物搅拌5分钟以取保碱溶解后，向溶解的依沙芦星碱中添加400μL 0.2M酒石酸水溶液，该溶液对应于1.05的当量。将温度在80℃保持10分钟，然后以30℃/小时的速率将管冷却至室温。在冷却阶段发生沉淀。通过过滤收集固体并于50℃和30英寸汞柱下真空干燥。通过XRPD、DSC和TGA分析样品测定物理特性[表3，OVL-A-55(1)和OVL-A-55(2)]。通过XRDP确定第一个样品[(二噁烷/硫酸，OVL-A-55(1))]是晶体，但是根据TGA分析其含有3.6％的残余溶剂，在DSC曲线上有三个吸热的峰。第二个样品[二噁烷/L-酒石酸，OVL-A-55(2)]是半晶体。
接着如下在水性环境中制备依沙芦星盐。向反应管中充入100mg依沙芦星碱、1.05当量的相应酸(p-TSA、琥珀酸和L-酒石酸作为固体添加；硫酸溶于0.5mL水中)和水(对p-TSA、琥珀酸和L-酒石酸而言为10mL，对硫酸而言为9.5mL)。将悬浮液加热至80℃并搅拌10分钟形成澄清的溶液，然后以30℃/小时的速率降低至室温。在室温下搅拌过夜后，在任何实验中均没有形成沉淀。在柔和的氮流下于35℃去除水。去除三分之一的水后在p-TSA实验中观察到沉淀，过滤该固体并在50℃和30英寸汞柱下真空干燥。也对滤出液进行分析。将其他三管蒸发至干燥并在50℃和30英寸汞柱下真空干燥。结果显示产生的固体是具有高无定形含量的半晶体[表3，OVL-A-47(1)、OVL-A-47(2-1)、OVL-A-47(3)和OVL-A-65]。
表3
Figure A200780022340D00151
(×)-放热
实施例3
使用显微镜观察依沙芦星甲苯磺酸盐结晶
在显微镜载玻片上，借助于刮刀铺上1-2mg无定形依沙芦星并放上盖玻片。向盖玻片一侧放置数滴溶剂并允许溶剂吸入盖玻片下溶解药物。与溶剂接触的药物储存于室温下并用100x或400x放大率在显微镜下检查。使用的溶剂是异丙醇、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、丙二醇、四氢呋喃、二氯甲烷、以及异丙醇、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮与水的1:1混合物。在显微镜下于溶剂(乙醇、甲醇、丙二醇、异丙醇、丙酮和所有的水:溶剂混合物)中观察针状或棒状的结晶。样品的显微检查表明依沙芦星甲苯磺酸盐在至少一种溶剂中成为晶体。
实施例4
依沙芦星MSA、p-TSA和HCl盐的微晶化
将小量的盐(1-2mg)置于显微镜载玻片上并用盖玻片覆盖。向盖玻片边缘处添加数滴溶剂，从而毛细作用会将溶剂拖至载玻片和盖玻片之间。如果材料部分溶解，则在加热板上缓慢加热载玻片直到大部分固体溶解。将每个载玻片在室温下冷却，允许缓慢结晶。使用甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈在水中的1:1混合物用于结晶。所有四种不同的溶剂体系中的每种盐都产生依沙芦星晶体。如图1所示，依沙芦星甲苯磺酸盐晶体在偏振光下显示双折射。
实施例5
p-TSA盐重结晶的扩大规模
在Craig管中通过缓慢蒸发进行p-TSA盐的重结晶。在提高的温度下将p-TSA盐溶解在乙腈与水的1:1混合物中。在Craig管中热过滤后，缓慢蒸发来自反应的溶剂，这产生沉淀。在显微镜下，观察到晶癖(crystalhabit)为针状。通过过滤分离晶体并在真空下干燥。观察到材料对XRD是透明的，通过显微镜术证实其为晶体。在差示扫描量热法分析中，材料显示熔融后在183℃和183℃分别降解或结晶。1H NMR分析显示样品API对反离子(p-TSA)是1:1的比例。
在室温下将浆体搅拌6小时后，通过HPLC检验p-TSA在水中的溶解度。发现p-TSA盐在水中的溶解度为15.6mg/mL(表5，批号#OVL-A-137)。p-TSA盐在pH4(苯甲酸盐缓冲液)的溶解度为14.7mg/mL(表5，OVL-A-143)。
表4
 
试验室 笔记本               HPLC样品的             管浓度               浓度 批号        计数      浓度(M)      稀释因数     (M)           MW盐     (mg/mL)
OVL-A-137  1191856  9.45269E-05    200          0.018905385  825.83    15.612634OVL-A-143  1126074  8.9459E-05     200          0.017891806  825.83    14.77559
测试根据本发明的教导制造的依沙芦星盐的稳定性。将经分离的p-TSA盐的两个样品(每份40mg)置于75℃的真空烘箱中9个小时。在该暴露后取出样品#1，将温度提高至98℃并将第二样品干燥过夜。NMR数据显示完美的1:1盐比例，因此在提高的温度下干燥期间固体状态中没有分解。两个样品根据TGA的重量损耗均约为2.5％。Karl Fischer分析指出这两份中仍然存在水：样品#1具有4.0％的水含量，#2具有4.6％的水含量。将依沙芦星的p-TSA盐(16mg)溶于1.6mL苯甲酸盐缓冲液(pH4)中并在50℃搅拌10天。样品的HPLC和MS在第3、5和10天进行。通过MS(峰值在282)或HPLC均未发现分解产物的迹象。
实施例6
HCl盐形成的扩大规模
将依沙芦星(200mg)在1mL乙腈/水(1:1)中制成浆体并加热至75℃，得到非常粘稠的浆体。向浆体中添加1M的HCl水溶液(0.321mL，1.05当量)形成澄清溶液。然后将混合物以25℃/h的速率在非常柔和的搅拌下缓慢冷却至室温。在室温下搅拌约6个小时后，通过过滤分离获得的固体并在50℃和30英寸汞柱下真空干燥，得到187.5mg(88.86％产率)的HCl盐。DSC和XRD分析证实了盐的晶体特征。
实施例7
依沙芦星和依沙芦星甲苯磺酸盐的体外生长抑制活性
以下的实验证实了与依沙芦星碱相比，根据本发明的教导制造的依沙芦星盐保留了它们的体外抗肿瘤活性。使用B16F10(鼠肺)、HCT 116(人结肠)、HT29(人结肠)和SK-MES-1(人非小细胞肺癌)体外测试依沙芦星和依沙芦星甲苯磺酸盐。在96孔微量培养平板中用半自动化的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯溴化四唑)测定法评价细胞生长抑制。
将SK-MES-1人非小细胞肺癌、B16F10鼠黑色素瘤细胞、HCT 116和HT29结肠癌(总称“测试细胞培养物”)维持在补充有胎牛血清、抗生素和其他适当生长因子(如谷氨酰胺)的经缓冲的RPMI 1640中。将测试细胞(1,500-2,000细胞/孔)接种在96孔微量培养平板中，总体积为100μL/孔。在含5％ CO2和95％空气的潮湿培养箱中于37℃孵育过夜后，用RPMI 1640将依沙芦星溶液稀释至不同的浓度，以100μL的体积添加至每孔中。制备依沙芦星碱和依沙芦星甲苯磺酸盐溶液(依沙芦星溶液)并储存于-20℃冰箱中。在整个实验中溶液融化不超过10次。
将用测试细胞和不同浓度的依沙芦星接种的细胞培养平板置于37℃下含CO2和95％空气的潮湿培养箱中5-10天。然后将平板大致离心，去除100μL的生长培养基。用50μL MTT试剂(1mg/ml于DulbeccoTM磷酸盐缓冲的盐水中)将细胞培养物在37℃下孵育4小时。用200μL异丙醇中0.04N HCl溶解得到的紫色甲臜(formazan)沉淀。使用
Figure A200780022340D0018184011QIETU
 GENios酶标仪(microplate reader)在595nm的波长和650nm的参考波长处监测吸光度。在所有实验中，对每种试剂在两个重叠的浓度范围内获得吸光度。在大部分情况下，使用更宽的浓度范围重复研究。
将每个测试的结果储存并输入
Figure A200780022340D0018184025QIETU
 3.03中用于图像分析和IC50值的测定。所有的结果被图示为相对于药物浓度的对照吸光度的百分比。用
Figure A200780022340D0018184035QIETU
 3.03使用非线性回归分析评价IC50值，将数据用以下的四-对数等式描述的S形剂量-应答曲线拟合：
Figure A200780022340D00191
“顶部”是对照吸光度的最大百分比，“底部”是在最高试剂浓度下对照吸光度的最小百分比，Y是观察到的吸光度，X是试剂浓度，IC50是与对照细胞相比抑制50％细胞生长的试剂浓度，n是曲线的斜率。表4证明了依沙芦星和依沙芦星甲苯磺酸盐对测试的细胞系基本上具有相同的抗增殖作用。因此如表4中证明，能够预期根据本发明的教导制造的依沙芦星盐具有与单独使用依沙芦星碱制造的治疗组合物相比等效的，或更好的体内抗肿瘤活性。依沙芦星甲苯磺酸盐包含下述IC50，其值在类似量的依沙芦星碱的约20％、更优选地约15％、最优选地约10％之内。
表5：依沙芦星和依沙芦星p-TSA盐针对SK-MES-1人非小细胞肺癌、B16F10鼠黑色素瘤和HCT 116与HT29人结肠癌细胞的体外生长抑制活性。
 
细胞系 依沙芦星IC50(μm) 依沙芦星p-TSA盐IC50(μm)
SK-MES-1 0.042 0.045
B16F10 0.024 0.028
HCT116 0.074 0.079
HT29 0.095 0.105
除非另有说明，用于说明书和权利要求书中的表达成分数量、如分子量的性质、反应条件的所有数字等应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非指出反例，以下说明书和附加的权利要求书中公开的数量参数是近似值，其可根据本发明想要获得的所需性质而变化。至少，并且不企图限制将等同原则应用于权利要求书的范围，每个数量参数至少应按照经报导的有效数字的位数并通过应用常规约数技术解释。尽管公开于本发明的数量范围和参数为约数，但特定实施例中公开的数量值则是尽可能精确地报导的。然而，任何数量值固有地包含误差，这是从它们各自检测测量中发现的标准偏差必然地产生的。除非在本文另有说明或同上下文明显抵触，描述本发明的上下文中(特别是在所附的权利要求书上下文中)使用的术语“一个”(＂a＂，＂an＂)和“这个”或“所述”(＂the＂)和类似的指代被解释为包括单数和复数。对本文数值范围的叙述仅意图用作为引用落入该范围的每个单独的值的速记方法。除非本文另有说明，每个单独的值都被并入说明书，就像其被单独地公开于本文一样。除非在本文另有说明或与上下文明显抵触，本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文所提供的任何和所有实例或举例文字(例如“例如”)的使用仅意欲用来更好地阐述本发明，而非对本发明所要求保护的范围设定限制。说明书中任何文字都不应被解释为指代实施本发明必需的任何未要求保护的元素。
本文公开的备选元素或实施方案的分组不应解释为限制。各组成员可被单独提到或要求保护，或与本文发现的组的其它成员或其它元素任意组合。应当理解，由于便利和/或专利的原因，一组的一个或多个成员可以被包括进一组中或从该组删除。当任何这类包括或删除发生时，本申请文件被认为含有经改写的组，以满足对附加的权利要求书中所用的任何和所有马库什组的书面描述。
本文描述了本发明的优选的实施方案，包括本发明的发明人已知的实现本发明的最佳模式。当然，本领域常规技术人员阅读上述描述后会明白这些优选的实施方案的变更。本发明人预期熟练的技术人员能适当地采用这类变更，且本发明人意欲使得本发明以与本文特定描述不同的方式应用。因此，正如法律所允许的，本发明包括附加的权利要求书中所述的主体内容的所有修饰和等价物。另外，除非本文另有说明或与上下文明显抵触，在其所有可能变化中，上述元件的任何组合被本发明所包括。
另外，在本申请文件中，引用了专利和印刷出版物作为参考文献。上述各参考文献和印刷出版物通过引用其整体并入本文。
最后，应理解本文公开的本发明的实施方案仅用于阐述本发明的原则。其它可使用的修饰也在本发明的范围内。因此，通过示例而非限制的方式，可根据本文的教导利用本发明的备选形式。因此，本发明并非被限制为如精确地所示和所述的。

Claims (21)

1.稳定的固体依沙芦星盐。
2.权利要求1的稳定的固体依沙芦星盐，其中反离子选自乳酸根、富马酸根、马来酸根、琥珀酸根、酒石酸根、甲苯磺酸根、甲磺酸根、苯甲酸根、水杨酸根、盐酸根、硫酸根和磷酸根。
3.权利要求2的稳定固体依沙芦星盐，其中所述依沙芦星盐是依沙芦星琥珀酸盐。
4.权利要求2的稳定固体依沙芦星盐，其中所述依沙芦星盐是依沙芦星酒石酸盐。
5.权利要求2的稳定固体依沙芦星盐，其中所述依沙芦星盐是依沙芦星甲苯磺酸盐。
6.权利要求2的稳定固体依沙芦星盐，其中所述依沙芦星盐是依沙芦星水杨酸盐。
7.权利要求2的稳定固体依沙芦星盐，其中所述依沙芦星盐是依沙芦星硫酸盐。
8.包含至少一种下述稳定固体依沙芦星盐的肠胃外配制品，所述依沙芦星盐选自乳酸盐、富马酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、盐酸盐、硫酸盐和磷酸盐。
9.权利要求8的肠胃外配制品，其还包含选自注射用水、盐水和磷酸盐缓冲盐水的可药用运载体。
10.权利要求8的肠胃外配制品，其中依沙芦星盐为依沙芦星琥珀酸盐。
11.权利要求8的肠胃外配制品，其中依沙芦星盐为依沙芦星酒石酸盐。
12.权利要求8的肠胃外配制品，其中依沙芦星盐为依沙芦星甲苯磺酸盐。
13.权利要求8的肠胃外配制品，其中依沙芦星盐为依沙芦星水杨酸盐。
14.权利要求8的肠胃外配制品，其中依沙芦星盐为依沙芦星硫酸盐。
15.在哺乳动物中治疗肿瘤性疾病的方法，包括：
提供包含至少一种稳定固体依沙芦星盐的依沙芦星肠胃外配制品，所述依沙芦星盐选自乳酸盐、富马酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、盐酸盐、硫酸盐和磷酸盐；和
静脉内施用所述依沙芦星肠胃外配制品。
16.权利要求15的方法，其中所述步骤包括提供肠胃外配制品，其基本上由依沙芦星甲苯磺酸盐、可药用的运载体和任选的至少一种可药用的赋形剂组成。
17.权利要求15的方法，其中所述肿瘤性疾病为复发的或难治性非Hodgkin′s淋巴瘤。
18.肠胃外配制品，其包含依沙芦星甲苯磺酸盐和可药用运载体和任选的至少一种可药用赋形剂。
19.稳定的固体晶体依沙芦星甲苯磺酸盐。
20.稳定的固体晶体依沙芦星甲磺酸盐。
21.稳定的固体晶体依沙芦星盐酸盐。
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