DE69012384T2

DE69012384T2 - BMY-41950-Antitumor-Antibiotikum.

Info

Publication number: DE69012384T2
Application number: DE69012384T
Authority: DE
Inventors: Grace A Hesler; Kin Sing Lam; Jacqueline Mattei; Daniel Schroeder
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1989-03-23
Filing date: 1990-03-22
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2010-03-23
Also published as: ES2058645T3; SG163194G; CY1816A; EP0388962B1; JPH03215428A; EP0388962A3; EP0388962A2; HK23695A; DK0388962T3; JPH07624B2; US5015578A; ATE111476T1; DE69012384D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Antitumor- Antibiotikum sowie dessen Herstellung und Gewinnung.
Das US-Patent 4,107,297 offenbart die Herstellung des Antibiotikums AM-2282 durch Fermentation von Streptomyces staurosporeus nov. sp. ATCC 55006. Dieses Antibiotikum soll antiinfektive und hypotonische Aktivität besitzen. AM-2282 erhielt später die Bezeichnung Staurosporin und seine Struktur wird in J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1978: 800 - 801, 1978 folgendermaßen dargestellt:
Die EP-A-238 011 offenbart ein Antitumor-Antibiotikum mit der Bezeichnung UCN-01, das durch Fermentation von Streptomyces sp. UCN-01 (FERM BP-990) hergestellt wird und folgende Struktur besitzt:
Die Verbindung UCN-01 wird auch in J. Antibiotics, S. 1782, Dezember 1987, beschrieben.
Das Antitumor-Antibiotikum mit der Bezeichnung Rebeccamycin wird in dem US-Patent 4,522,842 als Fermentationsprodukt von Nocardia aerocolonigenes ATCC 39243 offenbart. Rebeccamycin besitzt die Strukturformel
Der Organismus zu seiner Herstellung wurde kürzlich in Saccharothrix aerocolonigenes (J. Antibiot. 40:668-678, 1987) umbenannt.
Das US-Patent 4,524,145 offenbart ein Antitumor-Antibiotikum mit der Bezeichnung 4'-Dechlorrebeccamycin, das durch Fermentation von Saccharothrix aerocolonigenes ATCC 39243 hergestellt wird. Diese Verbindung besitzt die Strukturformel
Die US-Patentanmeldung Nr. 933,428 vom 21. November 1986 offenbart eine Reihe von Antitumor-Antibiotika der Formel
worin
n für eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht;
A&sup6; und A¹³ ausgewählt sind unter H und -(CH&sub2;)nNR¹R² und wobei wenigstens einer der Reste A&sup6; und A¹³ für -(CH&sub2;)nNR¹R² steht;
R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt sind unter Wasserstoff, unsubstituiertem oder substituiertem C&sub1;-C&sub6;-Alkyl, Aralkyl, dessen Alkylrest 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweist und dessen Arylrest unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl, das mit 1 bis 3 Alkyl-, Akoxy-, Hydroxy-, Halogen-, Carboxyl-, Alkoxycarbonyl- und Amino- und Mono- und Di-Niedrigalkylaminogruppen substituiert ist, aufweist, und Aryl, das ausgewählt ist unter unsubstituiertem Phenyl und Phenyl, das mit 1 bis 3 Alkyl-, Alkoxy-, Hydroxy-, Halogen-, Amino-, Mono- und Dialkylamino, Nitro-, Carboxyl-, Alkoxycarbonyl- und Cyanogruppen substituiert ist, vorausgesetzt, daß R¹ und R² nicht beide für Aryl stehen, und R¹ und R² zusammen genommen ausgewählt sein können unter -(CH&sub2;)&sub4;- und (CH&sub2;)&sub2;-R³-(CH&sub2;)&sub2;-, um zusammen mit dem N-Atom einen 5- bis 6-gliedrigen Ring zu bilden, wobei R³ ausgewählt ist unter CH&sub2;, NH, O und S;
X ausgewählt ist unter H, F, Cl, Br, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, OH, Carboxyl, Alkoxycarbonyl und Alkoxy, wobei es sich bei der Alkyleinheit um C&sub1;-C&sub3;-Alkyl handelt, Benzyloxy, Amino und Mono- bzw. Dialkylamino; und
R&sup4; ausgewählt ist unter H und CH&sub3;; und pharmazeutisch verträgliche Säureadditions- und Basensalze davon.
Die EP-A-175 284 offenbart vier Antitumor-Antibiotika mit den Bezeichnungen AT2433A1, AT2433A2, AT2433B1 und AT2433B2, die durch Fermentation von Actinomadura melliaura ATCC 39691 hergestellt werden. Diese Verbindungen besitzen die Strukturformel
worin X für H oder Cl steht und R für H oder CH&sub3; steht.
Die PCT-Anmeldung WO88/07045 offenbart Derivate der Verbindung K252, die in vitro-Antitumor-Aktivität gegen bestimmte Zellinien besitzen sollen. Zu den offenbarten Verbindungen gehören bestimmte 7-Oxo-Derivate von K252, die als Verbindungen 65-76 auf Seite 44 aufgeführt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Antitumor- Antibiotikum mit der Bezeichnung BMY-41950 der Strukturformel
und ein Verfahren zur Herstellung, Isolation und Reinigung von BMY-41950 in im wesentlichen reiner Form.
Das Antibiotikum BMY-41950 kann man durch Fermentation eines BMY-41950-produzierenden Streptomyces staurosporeus nov. sp.-Stammes, vorzugsweise Streptomyces staurosporeus ATCC 55006 oder einer Mutante oder einer Variante, oder eines BMY-41950- produzierenden Streptomyces hygroscopicus-Stammes, vorzugsweise Streptomyces hygroscopicus-Stamm C39280-450-9 (ATCC 53730) oder einer Mutante oder einer Variante davon, in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen, solange bis der Mikroorganismus in dem Kulturmedium eine bedeutende Menge an BMY-41950 produziert hat, und durch Gewinnung von BMY-41950, im wesentlichen frei von co-produzierten Substanzen, aus dem Kulturmedium erhalten.
BMY-41950 besitzt antimikrobielle Aktivität und auch Aktivität gegenüber Tumorsystemen in Versuchstieren.
Das erfindungsgemäße Antibiotikum BMY-41950 kann durch Fermentation eines BMY-41950-produzierenden Streptomyces staurosporeus- oder Streptomyces hygroscopicus-Stammes hergestellt werden.
Ein besonders bevorzugter BMY-41950-produzierender Stamm wurde vom Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, ARS Patent Culture Collection, erhalten, der dort als NRRL 11,184 Streptomyces sp. bezeichnet wird. Eine biologisch reine Kultur des Stammes NRRL 11,184 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und in deren permanente Sammlung von Mikroorganismen als ATCC 55006 aufgenommen. Kulturen dieses Stammes werden auch als Lyophilisate in der Bristol-Myers Squibb Company PRDD Actinomycete Culture Collection, Wallingford, Connecticut, aufbewahrt.
Taxonomieuntersuchungen mit NRRL 11,184 wurden in dem US- Patent 4,107,297 und in J. Antibiotics 30(4):272-282, 1977, detailliert beschrieben. Dieser Stamm wurde als neue Streptomyces-Spezies mit der Bezeichnung Streptomyces staurosporeus nov. sp. klassifiziert.
Ein weiterer besonders bevorzugter, BMY-41950-produzierender Organismus ist ein neuer Streptomyces hygroscopicus-Stamm, der hier als Streptomyces hygroscopicus-Stamm C39280-450-9 bezeichnet wird. Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die im Verwaltungsbezirk Numazu, Japan, entnommen wurde. Eine biologisch reine Kultur des Stammes C39280-450-9 ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und in deren permanente Sammlung von Mikroorganismen als ATCC 53730 aufgenommen worden. Diese Kultur mit der Bezeichnung C39280 wird auch als ruhende Kultur in Lyophilisiergefäßen und Gefriertrocknungsvials in der Bristol-Myers Squibb Company Pharmaceutical Research and Development Division Culture Collection, Wallingford, Connecticut, aufbewahrt.
Die Ergebnisse der Taxonomie-Studien, die mit dem Stamm C39280-450-9 durchgeführt wurden, zeigen, daß es sich bei diesem Stamm um einen neuen Streptomyces hygroscopicus-Stamm handelt. Der Stamm C39280-450-9 besitzt die folgenden Eigenschaften, die mit den von Shirling & Gottlieb (Int. J. Sept. Bacteriology 16: 313-340, 1966; a.a.O. 18:69-189, 1968; a.a.O. 22: 265-394, 1972), Staneck & Roberts (Appl. Microbiol. 28: 226-31, 1974), K.P. Schaal (Hrsg.: M. Goodfellow und D.E. Minnikin, Chemical Methods in Bacterial Systematics, Academic Press Inc., S. 359-381, 1985) beschriebenen Materialien und Verfahren bestimmt wurden.

MORPHOLOGIE

Die morphologischen Merkmale des Stammes C39280-450-9 beinhalten:
1) die Bildung von nicht-fragmentierendem Substrat und Luftmyzelen, 2) Spiralketten von Arthrosporen, die von verzweigten Sporophoren auf dem Luftmyzel getragen werden, wobei die Sporenketten 2 bis 6 Windungen aufweisen, 3) glatte Sporenornamentierung.

KULTURMERKMALE UND PHYSIOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN

Die in descriptiven Medien beobachteten Kulturmerkmale sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Eine hygroskopische Veränderung wird in ISP-Medium Nr. 4 und in Modifiziertem Bennet's Medium deutlich. Für das Wachstum werden lösliche Kartoffelstärke und Glucose verwendet. Die Verwertung von Inositol ist fraglich. Die physiologischen Eigenschaften sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

ZELLWANDCHEMIE

Die Analyse von Ganzzellhydrolysaten des Stammes C39280- 450-9 ergab LL-Diaminopimelinsäure, Galactose, Ribose und Mannose als Zellwandkomponenten, daher die Zellwandzuordnung des Organismus zur Kategorie I. Durch Phospholipid-Analyse wurde die Gegenwart von Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylglycerol festgestellt, wodurch das Phospholipidmuster dem PII-Typus zuzuordnen ist. Tabelle 1. Kulturmerkmale des Stammes C39280-450-9 Agarmedium Wachstum Umkehrfarbe Luftmyzel Pigment ISP 2 ISP 3 ISP 4 ISP 5 ISP 6 ISP 7 Glucose-Asparagin Czapek's Sucrose-Nitrat Nährmedium Modifiziertes Bennett's-Medium Dünne Kartoffel Karotte mäßig gut schlecht gering farblos cremefarben gelblich-weiß, 3A2 mittel viel, hellgrau kaum, hygroskopisch graubraun, 6F2 mittel, hygroskopisch mittel grau und weiß oxidgelb 5C7 Tabelle 1 (Fortsetzung) ATCC 5 ATCC 172 Kartoffel-Dextrose Tomatensaft Trypton-Soja Xanthin mäßig schlecht gut kaum farblos gräulich-orange, 5B4 gelblich-weiß, 3A2 mittel, grau mittel, weiß und grau, 2B1 viel; weiß und grau
Farbbezeichnungen und -zahlen entnommen aus A. Kornerup und J.H. Wanscher, Reinhold Farbatlas, Reinhold Publishing Corporation, Kopenhagen, Dänemark, 1961. Tabelle 2. Physiologische Eigenschaften des Stammes C39280-450-9 Wachstumstemperatur pH-Toleranz NaCl-Toleranz Gelatineverflüssigung Stärkehydrolyse Urease Milchkoagulation Milchpeptonisierung Nitratreduktion Lysozym
Die morphologischen Merkmale und die Zellchemie des Stammes C39280-450-9 kennzeichnen diesen als Streptomyces-Spezies. Die weitere Klassifizierung als Streptomyces hygroscopicus- Spezies wird durch die Cluster aus spiralförmigen Sporenketten des Organismus und durch die sich daraus ergebenden hygroskopischen Eigenschaften bestätigt.
Es ist zu beachten, daß sich die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung der besonders bevorzugten Stämme ATCC 53730 oder ATCC 55006 oder auf Organismen, die ihrer Beschreibung voll entsprechen, beschränkt. Insbesondere soll sie auch andere BMY-41950-produzierende Stämme oder Mutanten der beschriebenen Organismen, die mit herkömmlichen Mitteln, wie Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung, Behandlung mit Stickstoffsenfgasen, Phagenexposition und dergleichen produziert werden können, beinhalten.

Herstellung des Antibiotikums

BMY-41950 kann durch Kultivierung eines BMY-41950-produzierenden Streptomyces staurosporeus-Stammes, vorzugsweise Streptomyces staurosporeus ATCC 55006 oder einer Mutante oder einer Variante davon, oder eines BMY-41950-produzierenden Streptomyces hygroscopicus-Stammes, vorzugsweise Streptomyces hygroscopicus-Stamm C39280-450-9 (ATCC 53730) oder einer Mutante oder einer Variante davon, unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium hergestellt werden. Der Organismus wird in einem Nährmedium kultiviert, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, z. B. Sucrose, Lactose, Glucose, Rhamnose, Fructose, Mannose, Melibiose, Glycerol oder lösliche Stärke, enthält. Das Nährmedium sollte außerdem eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Fischmehl, Pepton, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser, Hefeextrakt oder Ammoniumsalze, enthalten. Anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Phosphate, usw. werden, falls erforderlich, zugegeben. Spurenelemente, wie Kupfer, Mangan, Eisen, Zink, usw. werden dem Medium gewünschtenfalls zugegeben, sie können aber auch als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums bereitgestellt werden.
Die Herstellung von BMY-41950 kann bei jeder Temperatur, die zum zufriedenstellenden Wachstum des produzierenden Organismus beiträgt, z. B. 20ºC bis 40ºC, erfolgen, die Fermentation wird jedoch vorzugsweise bei 25 bis 35ºC, insbesondere bei 27 bis 32ºC, durchgeführt. Das Medium weist vorzugsweise einen neutralen pH auf, und die Herstellung des Antibiotikums erfolgt im allgemeinen über einen Zeitraum von 7 bis 12 Tagen.
Die Fermentation kann in Kolben oder in Labor- bzw. Industrie-Fermentatoren verschiedener Größen durchgeführt werden. Bei Tankfermentation ist es wünschenswert, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe durch Inokulierung eines kleinen Volumens des Kulturmediums mit einer Schräg- oder Bodenkultur oder einer lyophylisierten Kultur des Organismus herzustellen. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inokulum erhalten hat, transferiert man es aseptisch in das Fermentationstank-Medium zur Herstellung von BMY-41950 in großen Mengen. Das Medium, in dem das vegetative Inokulum hergestellt wurde, kann dasselbe oder ein anderes sein, wie dasjenige, das im Tank verwendet wird, solange man dadurch ein gutes Wachstum des produzierenden Organismus erhält. Das Rühren während der Fermentation kann durch einen mechanischen Impeller-Rührer erfolgen, und herkömmliche Antischaummittel wie Specköl oder Silikonöl können, falls erforderlich, zugegeben werden.
Die Isolierung des gewünschten Antibiotikums BMY-41950 aus dem Fermentationsmedium und die Reinigung des BMY-41950 können durch herkömmliche Lösungsmittelextraktions- und Chromatographieverfahren erreicht werden. Ein bevorzugtes Isolierungs- und Reinigungsverfahren wird im nachfolgenden Beispiel 2 dargestellt.
Nachdem man das BMY-41950 durch das oben beschriebene Verfahren erhalten hatte, stellte man fest, daß BMY-41950 (7-Oxostaurosporin) durch Oxidation des Staurosporins auch chemisch synthetisiert werden kann. Im folgenden wird eine repräsentative Oxidation beschrieben:
Zu 200 mg Staurosporin in einem 20 ml Vial gab man 5 ml wasserfreies Methylenchlorid und Manganoxid (MnO&sub2;-aktiviert (Aldrich)) in hohem Überschuß (0,25 g). Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 23ºC beschallt. Man gab bei weiterer Schallbehandlung (20 Minuten) erneut MnO&sub2; (0,25 g) zu. Dieses Verfahren wiederholte man über einen Zeitraum von 2 Stunden noch viermal, und man ließ das Reaktionsgemisch über Nacht (weitere 14 Stunden) bei 23ºC durchrühren. Man gab Dicalit zu dem Reaktionsgemisch, das dann filtriert, mit Aceton-Methanol (9:1) gewaschen und eingeengt wurde. Das gewünschte 7-Oxostaurosporin wurde mittels Vakuumflüssigkeitschromatographie und anschließender Reversed-Phase-(C&sub1;&sub8;)-HPLC gereinigt, was eine Ausbeute von 5 mg gereinigtem Material ergab.

Physikalisch-chemische Eigenschaften von BMY-41950

BMY-41950 besitzt die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
Beschreibung: gelber, amorpher Feststoff
Summenformel: C&sub2;&sub8;H&sub2;&sub4;N&sub4;O&sub4;
Molekulargewicht: 480
Massenspektrum: (M+H)&spplus; Ion 481 (Finnigan 4500 Single Quadrapole Massen-Spektrometer)
UV-Spektrum: Hewlett-Packard (HP) 8452 Spektrophotometer mit Diodenanordnung (Konzentration 0,2 mg/20 ml Methanol)
Neutral: 420 nm (65) 372 nm(81), 337 nm sh, 318 nm (807), 308 nm sh, 288 nm (447), 260 nm (374), 240 nm (671)
360 MHz ¹H-NMR: Bruker-Spektrometer Modell AM-3000 Duale Kohlenstoff-Protonensonde, 5 mm. Lösungsmittel: d&sub6;-DMSO. Beobachtete chemische Verschiebungen (ppm):
11.01 (s, 1H), 9.19 (d, 1H) 9.06 (d, 1H), 6.01 (d, 1H), 7.70 (d, 1H), 7.56 (m, 1H), 7.47 (m, 1H), 7.39 (m, 1H), 7.31 (m, 1H), 6.74 (m, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.22 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 1.96 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.40 (s, 3H).
Löslichkeit: löslich in Dimethylsulfoxid (DMSO), Tetrahydrofuran (THF), CHCl&sub3;-CH&sub3;OH (2:1 v/v).
Farbreaktionen: Violett-positiv auf Iodplatinsäure Rf-Werte: Silikagel 60 TLC (Merck);
CHCl&sub3;-CH&sub3;OH (9:1 v/v): 0.42. THF: 0.20. Whatman MKC&sub1;&sub8;;
0,1 M NH&sub4;OAc-THF (1:1 v/v): 0.25.
Ausgehend von den charakteristischen Eigenschaften von BMY-41950 wurde festgestellt, daß es sich bei dem Antibiotikum um 7-Oxostaurosporin, eine neue Verbindung der Strukturformel
handelt.

Biologische Aktivität

In Standard-in vitro-Screening-Tests stellte man fest, daß BMY-41950 antimikrobielle Aktivität besitzt. Beispielsweise besitzt BMY-41950 eine MIC (Minimale inhibierende Konzentration) von 6,25 ug/ml gegen Staphylococcus aureus A9537 und von 12,5 ug/ml gegen Enterococcus faecalis A20688.
Außerdem weist BMY-41950 bei Versuchen in konventionellen in vitro-Systemen und in in vivo-Tumorsystemen bei Versuchstieren Antitumoraktivität auf.
Eine detailliertere Beschreibung der Antitumorversuche mit BMY-41950 wird nachfolgend gegeben.
BMY-41950 wurde auf cytotoxische Aktivität gegenüber einer Mäuse- und einer Humantumorzellinie in vitro getestet. In vivo wurde seine Aktivität gegenüber einem experimentellen Mäuseleukämietumor getestet. In vitro wurden Mitomycin C und Cisplatin als Vergleichsverbindungen verwendet, während Etoposid (VP-16) als Vergleichsverbindung in vivo verwendet wurde.
KB16-F10- (Murinmelanom) und HCT-116- (menschlicher Dickdarmkrebszellklon)-Zellen wurden in Komplettem McCoy-Medium kultiviert. Dieses Medium besteht aus 420 ml McCoy-5A-Medium und 500 mg Natriumbicarbonat in 6 ml Wasser, 6,56 mg L-Serin, 1,5 mg L-Asparagin und 82,4 mg Natriumpyruvat in 2 ml Wasser, 6,25 ml essentieller Aminosäuren (50X, Gibco), 3,0 ml nicht- essentieller Aminosäuren (100X, Gibco), 3 ml L-Glutamin (200MM), 3 ml MEM-Vitaminen (Gibco), 6,25 ml Penicillin/Streptomycin (Gibco) und 50 ml wärme-inaktiviertem definiertem fötalem Kälberserum.
Die beiden Zellinien werden während der logarithmischen Phase des Zellwachstums geerntet und 3600 Zellen eines 150 Mikroliter-Mediums wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37ºC in einem mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator, um den Zellen die Haftung an der Platte zu ermöglichen, gibt man 50 Mikroliter Test-/Vergleichs-wirkstoff in 11 der 12 Vertiefungen der oberen Reihe, während man in die zwölfte 50 Mikroliter des Mediums gibt. Man nimmt eine Reihenverdünnung von Wirkstoff/Medium in 8 Vertiefungen der Platte vor (4-fache Verdünnung). Die Zellen, die Wirkstoff/Medium enthalten, werden dann 72 Stunden inkubiert. Nach Fixierung mit 10 % Formalin werden die durch den Wirkstoff abgetöteten Zellen aus der Platte ausgewaschen, während die überlebenden Zellen mit 0,0075 % Kristallviolett gefärbt werden. Nach dem Trocknen wird die Färbung mit 10 % Ethanol und 1 % Essigsäure solubilisiert, die entwickelte Platte wird mit einem Dynatech MR 600 Plattenlesegerät quantifiziert, und die IC&sub5;&sub0;-Werte (Konzentration des Wirkstoffs, bei der 50 % der Zellen absterben oder das Wachstum zu 50 % inhibiert wird) werden berechnet. Die nachfolgende Tabelle zeigt die für BMY-41950 und für die Standardarzneimittel Mitomycin C und Cisplatin ermittelten Daten. Antitumoraktivität in vitro (IC&sub5;&sub0; in ug/ml oder Verdünnung) Arzneistoff B16-F10 HCT-116 BMY-41950 Cisplatin Mitomycin C
Die Aktivität von BMY-41950 in vivo wurde in einem Murinleukämietumor-System bestimmt. Weibliche CDF&sub1;-Mäuse inokulierte man intraperitoneal mit 0,5 ml verdünnter Ascites-Flüssigkeit, die 10&sup6; lymphocytische Leukämie-P388-Zellen enthielt. Zehn Mäuse blieben unbehandelt und die durchschnittliche Überlebensdauer dieser Gruppe betrug 10 Tage. Drei Gruppen von jeweils 4 Mäusen wurden an den Tagen 1, 2, 4, 4 und 5 nach Implantierung des Tumors mit BMY-41950 behandelt. Der Wirkstoff wurde, nachdem man ihn zunächst in DMSO, Tween 80 und gepufferter Kochsalzlösung gelöst hatte, intraperitoneal verabreicht. Die mit 18 und 6 mg/kg/Tag behandelten Gruppen litten an durch den Wirkstoff induzierter Toxizität und alle Mäuse starben vor Tag 7. Bei der dritten Gruppe, die 2mg/kg/Tag erhielt, betrug die durchschnittliche Überlebensdauer 13 Tage. Somit betrug die % T/C (Überlebensdauer der mit dem Wirkstoff behandelten/Überlebensdauer der unbehandelten Kontrolltiere x 100) 130 %. Der Maßstab für die Antitumoraktivität ist bei diesem Murintumorversuch eine % T/C von 125 oder mehr. Somit erfüllte BMY-41950 das Kriterium der Antitumoraktivität im P388-Mausleukämie-Antitumor-Versuch.

Therapeutische Anwendung

Wie oben erwähnt, besitzt BMY-41950 antimikrobielle Aktivität, z. B. Aktivität gegen Bakterien wie Staphylococcus aureus und Enterococcus faecalis.
Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Behandlung mikrobieller Infektionen, die auf BMY-41950 ansprechen, zur Verfügung gestellt, das die Verabreichung von BMY-41950 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon in einer zur Behandlung solcher Infektionen ausreichenden Menge an einen Wirt, z. B. ein warmblütiges Säugetier, der einer solchen Behandlung bedarf, umfaßt.
BMY-41950 besitzt auch Antitumoraktivität gegenüber malignen Tumoren bei Säugern.
Gemäß einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Behandlung eines Wirtssäugers, der an einem auf BMY- 41950 ansprechenden Tumor leidet, zur Verfügung gestellt, das die Verabreichung einer Tumor-inhibierenden Dosis von BMY-41950 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung davon umfaßt.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt werden pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die eine wirksame antimikrobielle oder Tumor-inhibierende Menge an BMY- 41950 zusammen mit einem inerten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfassen. Solche Zusammensetzungen können andere antimikrobielle oder Antitumor-Mittel enthalten und jede für den gewünschten Verabreichungsweg geeignete Form aufweisen. Beispiele für solche Zusammensetzungen sind feste Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granulate, flüssige Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung, wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixiere und Präparate zur parenteralen Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in Form von festen, sterilen Zusammensetzungen, die unmittelbar vor der Anwendung in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einem anderen injizierbaren, sterilen Medium gelöst werden können, hergestellt werden.
Bei der Anwendung als antimikrobielles Mittel wird das BMY-41950 oder eine pharmazeutische Zusammensetzung davon so verabreicht, daß die Konzentration des aktiven Wirkstoffes höher ist, als die minimale Hemmkonzentration für den jeweils behandelten Mikroorganismus.
Bei der Anwendung als Antitumor-Mittel kann BMY-41950 oder eine pharmazeutische Zusammensetzung davon im wesentlichen auf dieselbe Weise verabreicht werden wie die in der EP 238 011 beschriebene Verbindung UCN-O1. Optimale Dosierungen und Einteilungen von BMY-41950 bei einem beliebigen Wirtssäuger sind für den Fachmann ohne weiteres zu bestimmen. Natürlich ist zu beachten, daß die tatsächlich angewandte Dosis BMY-41950 je nach individuell formulierter Zusammensetzung, Art der Anwendung und jeweiligem Sitz, Wirt und zu behandelnder Krankheit variiert. Viele Faktoren, welche die Wirkungsweise des Wirkstoffes modifizieren, sind zu berücksichtigen, z. B. Alter, Geschlecht, Gewicht, Ernährungsweise, Verabreichungsdauer, Verabreichungsweg, Ausscheidungsrate, Zustand des Patienten, Arzneimittelkombinationen, Überempfindlichkeitsreaktionen und Schwere der Krankheit.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich zur Veranschaulichung und sollen den Erfindungsgegenstand in keiner Weise einschränken. Nutrisoy ist ein von Archers Daniels Midland Co. Decatur, Illinois, vertriebenes Sojamehl. Pharmamedia ist ein Endosperm-Baumwollsamenmehl, das von Buckeye Oil Seed Products Co., Fort Worth, Texas, vertrieben wird. S.J. Starch (Staclipse J-UB-Stärke) ist von A.E. Staley Manufacturing Co., Decatur, Illinois, vertriebene Maisstärke.

Beispiel 1

Fermentation von BMY-41950

Der Streptomyces staurosporeus-Stamm KR10069 (ATCC 55006) wurde in Reagenzgläsern aufbewahrt und auf Hefeextrakt-Malzextrakt- Agarschrägnährboden, die mit CaCO&sub3; ergänzt waren, übertragen. Dieses Medium besteht aus 4,0 g Dextrose, 4,0 g Hefextrakt, 10 g Malzextrakt, 1,5 g Calciumcarbonat und 20 g Agar, aufgefüllt auf einen Liter mit destilliertem Wasser. Bei jedem Transfer wurde der Schrägagar 5 bis 7 Tage bei 28ºC inkubiert. Zur Herstellung eines Inokulums für die Produktionsphase wurde der Oberflächenbewuchs der Schrägkultur in einen 500 ml Erlenmeyer- Kolben transferiert, der 100 ml steriles Medium enthielt, das aus 30 g Cerelose, 10 g Pharmamedia (Endosperm-Baumwollsamenmehl), 10 g Nutrisoy (Sojamehl) und 3,0 g Calciumcarbonat bestand und in einem Liter destilliertem Wasser bereitet wurde. Diese vegetative Kultur wurde 48 Stunden auf einem Rotationsschüttelgerät, das auf 250 UpM eingestellt war, bei 28ºC inkubiert. 5 ml dieser vegetativen Kultur wurden in 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert, die jeweils 100 ml Produktionsmedium enthielten, das aus 60 g S.J. Starch (Maisstärke), 10 g Cerelose, 10 g Nutrisoy, 5 g ungesäuerter Bierhefe, 1 g Eisen-II-sulfatheptahydrat, 1 g Ammoniumsulfat, 1 g monobasischem Ammoniumphosphat und 10 g Calciumcarbonat, mit destilliertem Wasser auf 1 l aufgefüllt, bestand. Die Produktionskultur wurde bei 28ºC auf einer Rotationsschüttelvorrichtung inkubiert und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 250 UpM eingestellt. Im allgemeinen erfolgte die optimale Produktion nach 216 bis 264 Stunden.

Beispiel 2

Isolation und Reinigung von BMY-41950

Allgemeine Verfahren: Lösungsmittel und Reagenzien

Die Lösungsmittel wurden vor der Anwendung nicht mehr destilliert. Methanol, Ethylacetat, Chloroform, Aceton und Ethylether waren als ACS-Reagens geeignet. Mit Wasser ist im Haus entionisiertes Wasser, das man durch eine Barnstead Nanopure II-Anlage laufen ließ, gemeint. Das Tetrahydrofuran war als ein B & J Brand-Lösungsmittel für die HPLC geeignet. Das Ammoniumacetat war für Fisher-HPLC geeignet.

Filtration der Brühe

Die komplette Fermentationsbrühe wurde mit einer 12" Tolhurst Laboratory Centerslung Centrifugal Filter Unit (Modell 1B15, Ametek, Inc.), die mit einem genähten Filtrierbeutel ausgekleidet war, der eine Dicalit(speedplus)-Filtrierhilfe enthielt, filtriert.

Dünnschichtchromatographie (TLC)

Man führte eine Normalphasen-TLC an Silikagel-60 F-254- Platten (EM-Reagenzien, Kat. Nr. 5765, 5 cm x 10 cm x 0,25 Dicke) durch. Die Umkehrphasen-TLC erfolgte mittels Whatman MKC&sub1;&sub8;-Platten (Kat. Nr. 4803-110, 0,2 mm Dicke). Die Platten wurden in zylindrischen Whatman-Behältern mit Deckeln und 10 ml Eluens entwickelt. Die entwickelten, luftgetrockneten Platten wurden mit UV-Licht der Wellenlängen 254 und 266 nm sichtbar gemacht. Die Normalphasen-TLC-Platten wurden ebenfalls sichtbar gemacht, und zwar mit einem Iodplatinsäure-Sprühreagens für Alkaloide.

Vakuumflüssigkeitschromatographie (VLC)

Eine VLC-Anordnung besteht aus einem Büchner-Trichter (Kontes, Art. K-954100), der eine eingelassene Glasscheibe (M-Porosität, 10 - 15 u), einen Schlauchanschluß an der Seite für das Vakuum und einen unteren 24/40-Anschluß für die Befestigung des Aufnahmekolbens aufweist.
Der Trichter wird trocken mit einem Adsorptionsmittel gefüllt, und ein ausreichendes Volumen des Eluierungs-Lösungsmittel mit der geringsten Polarität wird unter Vakuum hindurchgesaugt, um ein dicht gepacktes Bett des Adsorptionsmittels mit einer Höhe von 5 cm zu bilden.
Die Probe kann vorab adsorbiert und dann in den Trichter gegeben werden oder sie wird in eine Lösung des am wenigsten polaren Eluierungs-Lösungsmittels gegeben.
Eine isokratische Eluierung kann durchgeführt werden, wenn vorbestimmte Volumina die Fraktionen bilden oder die Polarität der Eluens-Volumina zunimmt und somit zu einem Stufengradienten führt. Der Trichter wird nach jedem Volumen an Elutions- Lösungsmittel trockengesaugt.

Semi-präparative HPLC

Die folgenden Komponenten wurden verwendet, um eine HPLC- Anordnung zu konstruieren: eine Waters Associates Model 590 Solvent Delivery System-Pumpe; ein variabler Wellenlängendetektor, Modell 87, Knaver, der auf 320 nm eingestellt war; ein Waters Associates-Injektor, Modell U6K; ein Bandschreiber von Heath, Modell SR-204; eine Whatman Partisil 16 ODS-3-Säule (10 mm x 50 cm). Diese Komponenten wurden mit Rohren (1,6 mm Außendurchmesser - 0,23 mm Innendurchmesser) aus rostfreiem 316er Stahl verbunden. Das Eluens wurde mit einer Rate von 4 ml/min durchgepumpt.

Isolation:

Extraktion

Die gesamte Brühe (10 ml) wurde unter Verwendung von 800 g Dicalite-Filtrierhilfsmittel zentrifugal filtriert. Die Myzelschicht wurde 3 Stunden in Tetrahydrofuran (8 l) suspendiert, durch einen 24 cm-Büchner-Trichter (Coors Nr. 11) filtriert und die Feststoffanteile wurden mit zusätzlichen 2 l Aceton ausgewaschen. Man verdampfte das vereinigte organische Volumen wurde reduziertem Druck und erhielt einen Rückstand von 33 g.
Das Filtrat wurde einmal mit einem Gemisch von THF (3 l) und Ethylether (6 l) in einem Scheidetrichter extrahiert. Die organische Schicht ergab nach Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck einen Rückstand von 400 mg. Eine zweite Extraktion des Filtrates mit Ethylacetat (2 l) ergab nach Einengung 266 mg Rückstand.
Die drei rohen Rückstände des Extraktionsverfahrens wurden zur weiteren Reinigung kombiniert.

Säure-Base-Extraktion

Die rohen Feststoffe (33,76 g) wurden in 250 ml 0,5 M HCl (pH 1,5) gelöst. Die saure, wäßrige Schicht wurde mit drei 150 ml Volumina Chloroform in einem Scheidetrichter extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten ergaben nach Einengung im Vakuum einen Rückstand von 4,04 g.
Die wäßrige Schicht wurde mit wäßrigem Ammoniak auf einen pH von 9,5 - 10 eingestellt. Drei weitere Waschungen mit 150 ml Volumina Chloroform ergaben nach Einengung der vereinigten organischen Schichten 1,11 g Rückstand.

Erste VLC - Stufengradient

Ein 30 ml-Kontes-Sinterglastrichter wurde auf übliche Weise mit 16 g Lichroprep Si 60, 15-25 u (EM Science, Art. 9336) gepackt. Der Chlorofom-Extrakt mit basischem pH (1,11 g) wurde vorab auf weiteren 3 g Adsorptionsmittel adsorbiert und als Chloroformaufschlämmung in den Trichter gegeben. Neun Fraktionen wurden mit den im folgenden angegebenen Volumina und Zusammensetzungungen des Eluans hergestellt: Fraktion Nr. Eluens-Volumen Eluens-Zusammensetzung Gewicht des Rückstandes
Eine TLC-Analyse zeigte, daß die Fraktionen 3 und 4 das für BMY-41950 charakteristische gelbe, fluoreszierende Material enthielten, weshalb sie vereinigt wurden.

Zweite VLC

Ein 15 ml-Kontes-Sinterglastrichter wurde mit 7,5 g Lichroprep Si 60, 15-25 u (EM Science, Art. 9336) bepackt. Die Fraktionen, die den gelben Fluoreszenzstoff (67 mg) enthielten, wurden in 5 ml Ethylacetat gelöst und in den oberen Teil des Trichters gegeben. Der gewünschte gelbe Streifen wurde durch Elution sichtbar gemacht und die Fraktionen wurden dementsprechend wie folgt geschnitten: Fraktion Nummer Eluensvolumen Eluenszusammensetzung Gewicht des Rückstandes
Wie durch TLC gezeigt wurde, wies die zweite Fraktion den gelben Fluoreszenzstoff auf.

HPLC-Reinigung

Die fortgeschrittene Fraktion, die das BMY-41950 (20 mg) enthielt, wurde in 0,3 ml THF gelöst und auf eine Whatman Partisil 10 ODS-3-Säule (50 cm x 10 mm) injiziert, die mit 0,2 M NH&sub4;OAc - THF (1:1) bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min equilibriert wurde. Nachdem zwei blaue, fluoreszierende Substanzen nach 8,7 und 13 Minuten eluierten, eluierte BMY- 41950 nach 17 Minuten über zwei Fraktionen. Diese Fraktionen wurden zusammengefaßt und mit zwei 25 ml Volumina Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformschichten wurden im Vakuum zur Trockene eingeengt und ergaben BMY-41950 (1,8 mg).

Claims

1. Verbindung mit der Bezeichnung BMY-41950 der Formel

2. Verfahren zur Herstellung von BMY-41950 der Formel

wobei man einen BMY-41950-produzierenden Stamm von Streptomyces staurosporeus in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert, bis eine wesentliche Menge BMY-41950 von dem Organismus in dem Kulturmedium hergestellt worden ist, und man BMY-41950 aus dem Kulturmedium im wesentlichen frei von mitproduzierten Verbindungen gewinnt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Organismus Streptomyces staurosporeus ATCC 55006 oder eine BMY-41950-produzierende Mutante oder Variante davon ist.

4. Pharmazeutisches Mittel, umfassend eine wirksame antimikrobielle Menge an BMY-41950 in Kombination mit einem inerten pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.

5. Pharmazeutisches Mittel, umfassend eine wirksame tumorinhibierende Menge an BMY-41950 in Kombination mit einem inerten pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.

6. Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Mittel der Ansprüche 4 oder 5, wobei man eine wirksame antimikrobielle oder tumor-inhibierende Menge an BMY-41950 in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel aufnimmt.

7. Verwendung von BMY-41950 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung einer mikrobiellen Infektion.

8. Verwendung von BMY-41950 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung eines malignen Tumors.

9. Biologisch reine Kultur des Streptomyces hygroscopicus-Stammes C39280-450-9 (ATCC 53730), wobei die Kultur in der Lage ist, das Antibiotikum BMY-41950 in einer isolierbaren Menge durch Kultivierung in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, zu produzieren.