DE69306102T2 - Makrocyclische lactone und ein stamm zu seiner herstellung - Google Patents
Makrocyclische lactone und ein stamm zu seiner herstellungInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft neue makrocyclische Lactone, den erzeugenden Stamm dafür, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung. Insbesondere betrifft die Erfindung neue makrocyclische Lactone, hergestellt durch Fermentation der Kultur, die als FERM BP-3688, FERM BP-3832 oder American Type Culture Collection, ATCC 39471, hinterlegt wurde. Die Erfindung betrifft auch immunosuppressive, antimycotische und Antitumormittel, die die makrocyclischen Lactone als Wirkstoffe enthalten. Die Erfindung betrifft ebenfalls das Verfahren zur Herstellung der makrocyclischen Lactone durch Fermentieren der vorstehend genannten hinterlegten Kulturen.
- 1983 lizenzierte die Behörde United States Food and Drug Administration Cyclosporin, einen Arzneistoff gegen Abstoßung, der das Gebiet der Organtransplantationschirurgie revolutionierte. Der Arzneistoff wirkt durch Inhibieren des Immunsystems des Körpers durch die Freisetzung des großen Arsenals natürlicher, schützender Mittel das Fremdprotein des Transplantats abzustoßen. Obwohl Cyclosporin bei der Bekämpfung von Transplantationsabstoßung wirksam ist, weist es Nachteile auf, die sich als Nierenversagen, Leberschädigung und Geschwüre äußern, welche in vielen Fällen sehr schwerwiegend verlaufen können. Neuere, sicherere Arzneistoffe, die weniger Nebenwirkungen zeigen, werden fortlaufend gesucht. Kürzlich wurde gezeigt, daß das immunosuppressive Macrolid FK-506, FK-520 (EP-A-0 184 162, JP-KOKAI-Sho-61-148181) und dessen verwandte Verbindungen und Rapamycin (US-A-3 929 992 und 3 993 749) starke immunosuppressive Wirkung sowohl in vitro als auch in vivo zeigen. FK506 zeigt bekanntlich ernsthafte Nebenwirkungen, wie Nierenschädigung, jedoch ist nichts über ernsthafte Nebenwirkungen von Rapamycin bein Menschen bekannt (R.L. Simmons und S.C. Wang, Transplant. Proc., 23, 2152-2156, 1991). Hinsichtlich Rapamycinderivaten ist 27-Desmethoxyrapamycin das einzige natürliche Produkt (J.A. Findlay et al., Can. J. Chem., 60, 2046-2047, 1982), wohingegen 21,22-Dihydrorapamycin; 19,20,21,22-Tetrahydrorapamycin (US- A-5 023 262) , 42-Oxorapamycin (US-A-5 023 263); Acylderivate von Rapamycin (US-A-5 100 283) und Aninoacylderivate von Rapamycin (EP-A-467 606) chemisch-synthetische Produkte sind. Außerdem wurden nach dem Tag der Japanischen Prioritätsanmeldung des Anmelders 27-Desmethylrapamycin (US-A-5 091 389) und 16,27-Didesmethylrapamycin (US-A-5 093 338) veröffentlicht. Allgemein gesagt ist es in vielen Fällen schwierig, eine bestimmte funktionelle Gruppe von natürlichen Produkten sowie von makrocyclischen Lactonen selektiv zu modifizieren. Beispielsweise ist die Denethylierung der 16- oder 27-Stellung von Rapamycin, insbesondere der Letzteren, vielleicht nicht durchführbar. Andererseits liefert die vorliegende Erfindung derartige natürliche makrocyclische Lactone, die bislang nicht bekannt waren.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Kultur, die neue makrocyclische Lactone erzeugt und die Bereitstellung neuer makrocyclischer Lactone mit ausgezeichneter immunosuppressiver Wirkung, antimycotischer Wirkung und Antitumorwirkung. Es ist ebenfalls die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung im wesentlichen reiner neuer makrocyclischer Lactone aus dem Fermentationsgernisch von Streptomyces hygroscopicus (FERM BP-3688), Actinoplanes sp. (FERM BP-3832) oder Streptomyces toyocaensis subsp. humicola (ATCC 39471) bereitzustellen.
- Die Erfinder prüften verschiedene Kulturen, um neue Immunosuppressiva zu finden. Im Ergebnis fanden sie, daß die Kultur N929-89 (FERM BP-3688), die aus einer Bodenprobe, gesammelt in der Japanischen Präfektur Yamaguchi, gewonnen wurde, neue makrocyclische Lactone mit ausgezeichneter immunosuppressiver Wirkung, antimycotischer Wirkung und Antitumorwirkung erzeugt. Außerdem werden neue makrocyclische Lactone mit immunosuppressiver Wirkung, antimycotischer Wirkung und Antitumorwirkung hergestellt, wenn N902-109 (FERM BP- 3832) und N969-34 (ATCC 39471) in Gegenwart eines P-450-Inhibitors, wie 2-Methyl-1,2-di(3-pyridyl)-1-propanon beziehungsweise Rapamycin, gezüchtet werden.
- Die erfindungsgemäßen makrocyclischen Lactone wurden durch aerobe Fermentation von N929-89, N902-109 oder N469-34 in einem Nährmedium erzeugt. Es gibt mindestens sechs stark verwandte, neue makrocyclische Lactone, die von N929-89 erzeugt wurden. Sie werden hier als N929-89A, N929-89B, N929- 89Ca, N929-89Cb, N929-89Cg und N929-89M bezeichnet und weisen ausgezeichnete immunosuppressive Wirkung, antimycotische Wirkung und Antitumorwirkung auf. Mindestens 15 Verbindungen werden von N902-109 erzeugt. Sie werden hier als N902-109A, N902-1098&sub1;, N902-109B&sub2;, N902-109C, N902-109D, N902-109E&sub1;, N902-109E&sub2;, N902-109F, N902-109G, N902-109H, N902-1091, N902- 109J, N902-109K, N902-109L und N902-109M bezeichnet. In ähnlicher Weise werden mindestens sechs makrocyclische Lactone von N469-34 erzeugt. Sie werden hier als N469-34A, N469-348, N469-34C, N469-34D, N469-34E und N469-34F bezeichnet.
- Diese Verbindungen werden durch Fermentation von N929-89, N902-109 oder N469-34 erhalten und werden in wesentlich reiner Form gewonnen.
- Die Kultur N902-109 wird in einer Anmeldung, eingereicht bein Japanischen Patentamt im Namen derselben Anmelder für diese Patentanmeldung unter dem Titel "Neue Rapamycin-erzeugende Kultur" (Anmeldung Nr. Hei 4-107612), beschrieben und ihre taxonomischen Eigenschaften sind in dieser Anmeldung dargelegt. Außerdem werden die taxonomischen Eigenschaften von N469-34 in US-A-4 543 334 beschrieben.
- Andererseits wird N929-89 zuerst in dieser Erfindung vorgeschlagen. Die Kultur N929-89 wurde von einer Schrägkultur in ATCC Nr. 172-Brühe geimpft und 4 Tage bei 28ºC auf einen Schüttler gezüchtet. Sie wurde dann 20 Minuten zentrifugiert, dreimal mit sterilem Wasser gewaschen und üblicherweise zur Identifizierung von Mitgliedern von Actinomycetalen verwendeten Medien geimpft. Die Kultur wurde bei 28º0 inkubiert und die Ergebnisse wurden bei verschiedenen Zeiten, meist wurden gewöhnlich 14 Tage-Abstände herangezogen, abgelesen. Die Farben wurden in üblicher Terminologie beschrieben, jedoch wurden genaue Farbtöne durch Vergleich mit Farbplättchen von Color Harmony Manual, 4. Ausgabe, bestimmt. Die Verfahren von Ganzzellen-Aminosäure- und Zuckeranalyse sind jene, die bei Becker B. et al., Appl. Microbiol., 12, 421- 423, 1964 und von Lechevalier M.P., J. Lab. Clin. Med., 71, 934-944, 1968, beschrieben wurden. Die Medien zur Identifizierung für die Charakterisierung der Kultur waren wie nachstehend:
- 1. Trypton-Hefeextraktbrühe (ISP Nr.1 Medium von Difco).
- 2. Hefeextrakt-Malzextrakt Agar (ISP Nr.2 Medium von Difco).
- 3. Hafermehlagar (ISP Nr.3 Medium von Difco).
- 4. Stärkeagar mit anorganischen Salzen (ISP Nr.4 Medium von Difco).
- 5. Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr.5 Medium von Difco).
- 6. Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar (ISP Nr.6 Medium von Difco).
- 7. Czapek-Saccharoseagar (S.A. Waksman, The Actinomycetes, Band 2, Medium Nr.1, Seite 328, 1961).
- 8. Glucose-Asparaginagar (ibid, Medium Nr.2, Seite 328).
- 9. Bennett's Agar (ibid, Medium Nr.30, Seite 331)
- 10. Emerson's Agar (ibid, Medium Nr.28, Seite 33)
- 11. Nähragar (ibid, Medium Nr.14, Seite 330).
- 12. Gordon und Smith's Tyrosin-Agar (R.E. Gordon und MM. Smith, J. Bacteriol., 69, 147-150, 1955).
- 13. Caseinagar (ibid).
- 14. Calcium-Malat-Agar (S.A. Waksman, Bacteriol. Rev., 21, 1-29, 1957).
- 15. Gelatine (R.E. Gordon und J.M. Mihm, J.Bacteriol. 73, 15-27, 1957).
- 16. Stärke (ibid).
- 17. organische Nitratbrühe (ibid).
- 18. Dextrosenitratbrühe (S.A. Waksman, The Actinomycetes, Band 2, Medium Nr.1, Seite 328, 1961, mit 3 g Glucose statt 30 g Saccharose und Agar wurde fortgelassen).
- 19. Kartoffel-Karotten-Agar (M.P. Lechevalier, J. Lab. and Clinical Med., 71, 934-944, 1968, jedoch unter Verwendung von nur 30 g Kartoffeln, 2,5 g Karotten und 20 g Agar).
- 20. 2 % Leitungswasseragar.
- 21. Rahmmilch (Difco).
- 22. Cellulosenutzung (H.L. Jensen, Proc. Linn. Soc., N.S.W. 55, 231-248, 1930. M. Levine und H.W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, Medium Nr.2511, 1930).
- 23. Kohlenhydratnutzung (ISP Nr.9 Medium von Difco).
- 24. Temperaturbereich (ISP Nr.2 plus 50 ml Kokosnußöl pro Liter Medium).
- - Guter Wuchs, schwach grau bis grau (in der Nähe der Grauserien 3 cb, 3 dc, 3 fe), mäßig erhaben, glatt bis wellig, flächiges Mycel wie auf der Oberfläche; umgekehrt gelblich braun, braun, grau bis schwarz (3 gc, 3 ie, 3 le, nahe der Grauserien 3 fe, 3 ml); lösliches Pigment schwach gelblich braun (3 gc).
- - Guter Wuchs, grau (nahe Grauserien 3 dc, 3 fe, 5 fe), mäßig erhaben, glatt bis körnig, flächiges Mycel wie auf der Oberfläche; umgekehrt grau (nahe der Grauserien 3 fe); lösliches Pigment schwach gelblich (1 ½ ca).
- - Guter Wuchs; weiß, schwach grau bis grau (nahe den Grauserien 3 cb, 3 bc, 3 fe), erhaben, glatt bis leicht gekräuselt, flächiges Mycel wie auf der Oberfläche; umgekehrt schwach grau bis grau (nahe den Grauserien 3 dc, 3 fe); kein lösliches Pigment.
- - Wuchs mangelhaft bis mäßig, cremig mit einigen weißen bis schwach grauen Punkten (nahe den Grauserien 3 cb, 3 dc), wenig erhaben, glatt bis körnig, flächiges Mycel weiß bis schwach grau (nahe den Grauserien 3 cb, 3 dc); umgekehrt cremefarben mit etwas schwach grauen bis grauen Punkten (nahe den Grauserien 3 dc, 3 fe); lösliches Pigment cremefarben (2 ca).
- - Wuchs mäßig bis gut, cremig bis schwach grau (2 ca, nahe den Grauserien 3 cb), wenig erhaben, glatt bis körnig, flächiges Mycel schwach grau (nahe den Grauserien 3 cb, 3 bc); umgekehrt farblos bis schwach grau (nahe den Grauserien 3 bc); kein lösliches Pigment.
- - Wuchs mäßig bis gut, gelblich (1 ½ ea, 1 ½ ga, 2 ea), wenig erhaben, glatt bis körnig, flächiges Mycel weiß bis schwach grau (nahe den Grauserien 3 cb); umgekehrt gelblich (2 ga, 2 ea); lösliches Pigment gelblich (2 ga).
- - Wuchs mäßig, bräunlich (nahe 3 gc), dünn bis wenig erhaben, glatt, flächiges Mycel weiß bis schwach grau (nahe den Grauserien 3 cb); umgekehrt bräunlich (3 gc); lösliches Pigment gelblichbraun (3 nc).
- - Wuchs gut, weiß mit einigen grauen Punkten (nahe den Grauserien 3 dc, 3 fe), mäßig erhaben, glatt bis etwas körnig, flächiges Mycel weiß, schwach grau bis grau (nahe den Grauserien 3 dc, 3 fe); umgekehrt gelblich (2 ea); lösliches Pigment dunkelgelblich (2 pe)
- - Wuchs gut; weiß, schwach grau bis grau (nahe den Grauserien 3 dc, 3 fe); erhaben, glatt, jedoch etwas gekräuselt am Ende des Strichs, flächiges Mycel wie auf der Oberfläche; umgekehrt weiß, schwach grau bis grau (nahe den Grauserien 3 dc, 3 fe); lösliches Pigment schwach gelblich (2 ea).
- - Wachstum mäßig bis gut, weiß bis schwach grau (nahe den Grauserien 3 cb), mäßig erhaben, glatt bis kräuselig, flächiges Mycel wie auf der Oberfläche; umgekehrt gelblich (2 ea); lösliches Pigment gelblich braun (3 nc).
- - Wachstum mangelhaft bis mäßig, schwach gelblich (zwischen 2 ca und 2 ea), dünn bis wenig erhaben, glatt, kein flächiges Mycel; umgekehrt cremefarben (2 ca); kein lösliches Pigment.
- - Kein Wachstum, von einigen kleinen cremigen Flecken (2 ca) abgesehen, kein flächiges Mycel; umgekehrt cremefarben; kein lösliches Pigment.
- - Wachstum mäßig, weiß bis dunkelgelblich (2 gc), mäßig erhaben, glatt bis körnig oder zu den Kanten etwas gekräuselt, flächiges Mycel weiß; umgekehrt cremefarben bis gelb (2 ca, 2 ea); kein lösliches Pigment.
- - Wachstum mäßig, weiß bis dunkelgelb (2 gc), mäßig erhaben, glatt bis körnig oder zu den Kanten gekräuselt, flächiges Mycel weiß; umgekehrt cremefarben bis gelb (2 ca, 2 ea); kein lösliches Pigment.
- - Wachstum mäßig, schwach grau bis grau (nahe den Grauserien 3 cb, 3 dc, 5 fe), wenig bis mäßig erhaben, glatt bis körnig, flächiges Mycel wie auf der Oberfläche; umgekehrt grau (nahe den Grauserien 5 fe); kein lösliches Pigment.
- - Wachstum mangelhaft bis mäßig, grau (nahe den Grauserien 3 fe, 5 fe), dünn bis wenig erhaben, glatt, flächiges Mycel grau (nahe den Grauserien 3 fe, 5 fe); umgekehrt grau (nahe den Grauserien 5 fe, 5 ih); kein lösliches Pigment.
- Die morphologischen Beobachtungen wurden auf Hafermehlagar nach 14 Tagen der Inkubation ausgeführt: die Sporennasse in den Graufarbserien; Sporenketten in den Spiralabschnitten, eng gewunden oder zu einer unregelmäßigen Masse verbunden, gelegentlich verhakt oder etwas offen, mit bis zu 7 Windungen, mit geringen Durchmesser (3-4 mm); 10 bis 30 Sporen pro Sporenkette, häufig aggregiert zu großen Massen; Sporenmassen, die nach 24 Tagen Inkubation schwarze hygroskopische Rasenflächen bilden; Sporophoren monopodial verzweigt, gelegentlich quirlständig verzweigt; Sporen oval, elliptisch, kurzstäbig oder stabförmig, häufig an beiden Enden nicht zueinander parallel, 1-1,6 (-1,8) x 0,8 - 1,1 (-1,2) mm; Sporenoberfläche runzlig, wie durch Rasterelektronenmikroskopie ersichtlich.
- Melanin wurde nicht erzeugt; Schwefelwasserstoff wurde erzeugt; Gelatine verflüssigt; Stärke hydrolysiert; Nitrat zu Nitrit reduziert; schwacher Wuchs und keine Zersetzung auf beiden Cellulosebrühen; Koagulation und Peptonisierung auf Milch; Caseinabbau positiv; Tyrosinabbau negativ. Kohlenwasserstoffnutzung: Glucose, Arabinose, Fructose, Inosit, Mannit, Raffinose, Saccharose und Xylose wurden genutzt; Rhamnose wurde nicht genutzt.
- Die Kultur zeigte einen mäßigen bis guten Wuchs bei 21ºC; guten bis ausgezeichneten Wuchs bei 28ºC; mäßigen Wuchs bei 37ºC und keinen Wuchs bei 45ºC.
- Die Ganzzellenhydrolysate enthielten LL-Diaminopimelinsäure, Glucose, Mannose und Ribose.
- Zusammenfassend sind die vorstehend genannten mycologischen Eigenschaften der Kultur N929-89 durch die grauen Sporen in der Masse, die negative Melaninreaktion und die runzligen Sporen, die in spiralförmig gewundenen Ketten angeordnet sind, gekennzeichnet. Nach 24 Tagen Inkubation wurden einige hygroskopische Rasenflächen von Sporen auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar, Hafermehlagar, Stärkeagar mit anorganischen Salzen und Kartoffel-Karotten-Agar erzeugt. Die Farben des Substratmycels bewegten sich von cremefarben, gelb, schwach grau bis grau. Mit Ausnahme einiger Tönungen von cremefarben, schwach gelb, gelb und gelbbraun wurden keine deutlich löslichen Pigmente erzeugt. Die Kultur nutzte Glucose, Arabinose, Fructose, Inosit, Mannit, Raffinose, Saccharose und Xylose, nutzte jedoch Rhamnose nicht. Die Ganzzellenhydrolysate wiesen die Anwesenheit von LL-Diaminopimelinsäure und die Abwesenheit von diagnostischen Zuckern auf.
- Auf der Basis der vorstehend genannten Eigenschaften ist die Kultur N929-89 in den Eigenschaften Streptomyces hygroscopicus der Streptomycesarten sehr ähnlich. Mit Ausnahme der positiven Nutzung von Saccharose und Raffinose und der Nichtnutzung von Rhamnose paßt die Kultur N929-89 in die Beschreibung des neotypischen Stamms S. hygroscopicus, veröffentlicht in Int. J. Syst. Bacteriol. 22, 265-394, 1972. Gemäß Tresmer und Backus, die ein breiteres Konzept dieser Arten vorschlugen, veröffentlicht in Appl. Microbiol. 4, 243-250, 1956, unterscheidet sich die Nutzung von Kohlenstoffquellen unter den Stämmen. Somit wird N929-89 als neuer Stamm von Streptomyces hygroscopicus (Jensen) Waksman und Henrici angesehen. Die Kultur N929-89 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, und als Streptomyces hygroscopicus F.D. 29009 mit der Zugangsnummer FERM BP-3688 gemäß Budapester Vertrag am 19. Dezember 1991 hinterlegt.
- Wenn die Kultur N929-89 mit der Rapamycin-erzeugenden Kultur Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253, beschrieben von Vezina et al. in J. Antibiotics; 28, 721-726, 1975, verglichen wird, unterscheidet sie sich in der Erzeugung von Schwefelwasserstoff, der positiven Nutzung von Saccharose und der Nichtnutzung von Rhamnose. Außerdem ist die umgekehrte Kolonie der Kultur N929-89 auf Glycerin-Asparagin-Agar und Bennett's Agar cremefarben und schwach grau bis grau, anstatt schwach gelblich bis rosafarben bzw. schwach gelb bis grünlich. Auf Glycerin-Asparagin-Agar ist das lösliche Pigment der Kultur N929-89 cremefarben, wohingegen jenes der Kultur ATCC 29253 schwach rosafarben ist.
- Für die Fermentation der Kultur wird nachstehende Bedingung bevorzugt. Bei Fermentationen im kleinen Maßstab werden nach Verschließen eines Kolbens mit einen Wattestopfen die Sporen oder die Nährzellen von Streptomyces hygroscopicus FERM BP-3688 in sterilisiertes Medium inokuliert. Der Kolben wurde bei 2800 3-10 Tage stehenlassen. Fermentationen in größerem Maßstab können durch Herstellen von Schütteltanks mit Rührer, Belüftungsvorrichtung und Sterilisierungsvorrichtung ausgeführt werden.
- Die Sporen- oder die Nährzellen von Streptomyces hygroscopicus FERM BP-3688 werden in sterilisiertes Medium in einen Tank inokuliert. Der pH-Wert des Mediums ist 5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 7,5. Die Fermentation wird bei einer Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 40ºC unter submersen Bedingungen mit Rühren und/oder Belüften im Medium ausgeführt. Der Belüftungsgrad kann um einige Faktoren geändert werden, wie Größe des Fermenters und Rührgeschwindigkeit. Im allgemeinen wird Rühren mit 0 bis 2000 U/min, bevorzugter 100 bis 360 U/min, ausgeführt und Belüftung wird mit 0 bis 500, bevorzugter 80 bis 120, Volumen-% Medium ausgeführt.
- Die erfindungsgemäße Kultur N469-34 kann in ähnlicher Weise zu vorstehend genannter Kultur N929-89 fermentiert werden, mit der Abweichung der Zugabe von Rapamycin zum Fermentationsgemisch und die Kultur N902-109 kann ebenfalls in ähnlicher Weise wie N929-89 fermentiert werden, mit der Abweichung, daß 2-Methyl-1,2-di(3-pyridyl)-1-propanon, ein Inhibitor für das metabolische Enzym P-450, zu der Fermentationsbrühe gegeben wurden.
- Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen können aus der Fermentationsbrühe durch Züchten von Streptomyces hygroscopicus FERM BP-3688 erhalten werden. Die neuen makrocyclischen Lactone der vorliegenden Erfindung können durch Extraktion und verschiedene chronatographische Verfahren gewonnen werden.
- Das Vorliegen der makrocyclischen Lactone kann durch Messen einer Humanmischlymphozytenreaktion (MLR) und verschiedener Arten von Spektren (beispielsweise zeigt das UV- Spektrum das inhärente Spektrum von makrocyclischen Lactonen) bestätigt werden. So werden zumindest sechs makrocyclische Lactone, N929-89A, N929-89B, N929-89Ca, N929-89Cb, N929-89Cg und N929-89M durch Fermentation der Kultur N929-89 gewonnen. Mindestens 15 makrocyclische Lactone, N902-109A, N902-109B&sub1;, N902-109B&sub2;, N902-109C, N902-109D, N902-109E&sub1;, N902-109E&sub2;, N902-109F, N902-109G, N902-109H, N902-109I, N902-109J, N902- 109K, N902-109L und N902-109M werden durch Fermentation der Kultur N902-109 gewonnen. Zusätzlich werden mindestens sechs makrocyclische Lactone, N469-34A, N469-34B, N469-34C, N469- 34D, N469-34E und N469-34F, durch Fermentation der Kultur N469-34 gewonnen.
- Die physikochemischen Eigenschaften der makrocyclischen Lactone, deren Struktur bestimmt wurde, sind in nachstehendem Schema dargestellt.
- In den ebenen Strukturen werden die Substituenten der nakrocyclischen Lactone in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1
- Die makrocyclischen Lactone, die in dieser Erfindung isoliert werden, werden als ebene chemische Strukturen in dieser Beschreibung beschrieben. Da die makrocyclischen Lactone mindestens 11 asymmetrische Kohlenstoffatome besitzen, können sie in verschiedenen stereoisomeren Formen oder Konfigurationen auftreten. Wenn der Fachmann die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet, kann er folglich beliebige gewünschte Isomere, wie optische Isomere und Diastereomere, unter den Zielverbindungen der vorliegenden Erfindung gemäß ihrem Anwendungszweck auswählen.
- Die Messung der Human-MLR-Aktivität von erfindungsgemäßen makrocyclischen Lactonen wird durch übliche Verfahren ausgeführt, die in der Literatur beschrieben sind (D.P. Dubey et al., in Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3. Ausgabe, Seiten 847-858, 1986). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die Cytotoxizität der makrocyclischen Lactone wurde durch das Standardverfahren gemessen (T. Mosmann, J., J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983). Die Konzentration ihrer Cytotoxizitäten ist einige zehnmal höher als jene ihrer MLR-Aktivitäten. Die Daten zeigen, daß diese neuen makrocydischen Lactone eine ausgezeichnete immunosuppressive Wirkung aufweisen. Tabelle 2
- Die Aktivitäten von erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber Candida albicans wurden durch Agarplattenverdünnung bestimmt und zeigten sich durch den Durchmesser der Inhibierungszone. Papierscheiben (8 mm, Advantic) und Agarmedium für Neomycinassay (Difco) wurden in den Tests eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Da die neuen makrocyclischen Lactone das Wachstum von Candida albicans inhibieren, weisen sie fungizide Wirkung auf. Tabelle 3
- Alle erfindungsgemäßen neuen makrocyclischen Lactone weisen eine immunosuppressive Wirkung, eine antinycotische Wirkung und eine Antitumorwirkung auf. Als Immunosuppressiva können die erfindungsgemäßen makrocyclischen Lactone in gleicher Weise wie Rapamycin verwendet werden. Die bevorzugten Verbindungen sind N902-109C, N902-109D und N469-34A.
- Die erfindungsgemäßen neuen makrocyclischen Lactone können einem Säuger, beispielsweise einem Menschen, als Immunosuppressivum entweder einzeln oder in Kombination mit einen inerten Verdünnungsmittel in einen Arzneimittel verabreicht werden. In vielen Fällen können die Verbindungen, in Form von Zusammensetzungen, die die makrocyclischen Lactone als Wirkstoffe und pharmazeutisch verträgliche Träger oder Exzipienten enthalten, parenteral oder oral verabreicht werden. Der Wirkstoff kann beispielsweise mit üblichen nichttoxischen, pharmazeutisch verträglichen Trägern für Tabletten, Pellets, Kapseln, Suppositorien, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen und andere geeignete Verwendungsformen vermischt werden. Die verwendbaren Träger sind Wasser, Glucose, Lactose, Akaziengummi, Gelatine, Mannit, Särkepaste, Magnesiumtrisilicat, Talkum, Maisstärke, Keratin, kolbidales Siliciumdioxid, Kartoffelstärke, Harnstoff und andere zur Verwendung bei der Herstellung von Präparaten geeignete Träger. Falls erforderlich, können zusätzlich Stabilisierungs- und Färbemittel und Parfüms verwendet werden.
- Obwohl die Dosierung einer immunosuppressiv wirksamen Menge der makrocyclischen Lactone von dem jeweiligen zu behandelnden Patienten abhängt, kann eine tägliche Dosis von etwa 1,0 bis etwa 1000 mg gegeben werden. Zur Behandlung von Transplantationsabstoßung sind tägliche Dosen von 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg oder 500 mg im allgemeinen bevorzugt. Dieselben Dosierungen können gegeben werden, wenn die Verbindungen als antimycotische oder Antitumormittel verwendet werden.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Es sollte jedoch selbstverständlich sein, daß die Erfindung in keiner Weise durch die speziellen Einzelheiten dieser Beispiele eingeschränkt wird.
- UV-Spektren wurden in Methanol mit einen UV/VIS-Spektrometer von JASCO Ubest-30 aufgezeichnet. Alle NMR-Spektren wurden in CDCl&sub3; mit einem NMR-Spektrometer (AM-500) von Bruker gemessen, sofern nicht anders ausgewiesen und die Peaklagen wurden in parts per million (ppm) feldabwärts von Tetramethylsilan ausgedrückt. Die Peakformen werden wie folgt bezeichnet: s, Singulett; d, Doublett; t, Triplett; q, Quartett; m, Multiplett; br, breit. LSI (Liquid Secondary Ion) Massenspektren wurden mit einem Massenspektrometer von Kratos (Modell 1S) unter Verwendung einer NaI-Matrix von Dithiothreitol:Dithioerythritol (3:1) gemessen.
- Einhundert Milliliter Medium-1 (Glucose 2 %, Polypepton 0,5 %. Fleischextrakt 0,3 %, Weizengluten 0,5 %, Hefeextrakt 0,5 %, Blutmehl 0,3 % und CaCO&sub3; 0,4 %, pH 7,0-7,2) in einem 500 ml-Kolben wurden mit einer vegetativen Zellsuspension aus einer Schrägkultur von Streptomyces hygroscopicus FERM BP-3688 inokuliert. Der Kolben wurde bei 28ºC 4 Tage auf einem Rotationsschüttler mit 7-cn-Auslenkung bei 220 U/min geschüttelt.
- Fünf Schüttelkolben, die Medium 1 (150 ml) enthielten, wurden mit 7,5 ml Züchtungskultur inokuliert. Diese Kolben wurden bei 28ºC 4 Tage auf dem Rotationsschüttler geschüttelt und zweite Saatkultur genannt.
- Die zweite Saatkultur in den 5 Schüttelkolben wurde zum Inokulieren eines Fermentationsgefäßes mit einem Fassungsvermögen von 3 Liter (L), enthaltend 3 Liter steriles Medium (Medium-2: Glucose 1 %, Maisstärke 2 %, NZ Amintyp A 0,5 %, Weizenembryo 0,5 %, Hefeextrakt 0,5 %, CoCl&sub2; 6H&sub2;O 0,0001 %, CaCO&sub3; 0,4 %, pH 7,2-7,4) verwendet. Lüftung wurde bei 2800 für 3 Tage mit 1700 U/min bei 3 Liter pro Minute ausgeführt.
- Die Fermentationsbrühe (15 Liter) wurde gefriergetrocknet und dreimal mit 5 Liter von 15 Liter Essigsäureethylester extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und verdampft, unter Hinterlassen eines öligen Rückstands (10,4 g), der makrocyclische Lactone einschließt. Der ölige Rückstand (10 g) wurde auf eine Kieselgelsäule (250 g) gegeben und mit einem Stufengradienten-Lösungsmittel von n-Hexan (1000 ml)/Essigsäureethylester/n- Hexan = 1:1 (1000 ml)/n-Hexan:Essigsäureethylester = 1:2 (1500 ml)/Essigsäureethylester (1000 ml)/und Essigsäureethylester:Aceton = 2:1 (750 ml) eluiert. Die Fraktion, die die Aktivität zeigte, wurde auf eine Sephadex LH-20-Säule (eingetragene Handelsmarke) gegeben und mit Methanol eluiert. Die makrocyclische Lactone enthaltenden Fraktionen wurden zusätzlich auf eine Säule Chemcosorb (eingetragene Handelsmarke) 5ODS-UH (20x250 mm) gegeben und mit Methanol/Wasser = 4:1 bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min eluiert. Detektion erfolgte mit UV-Absorption bei 305 nm. Die eluierten Peaks wurden gesammelt zu der Verbindung N929-89A (6,4 mg), Verbindung B (1,0 mg), Verbindung N929-89Ca (1,0 mg), Verbindung N929-89Cb (1,0 mg), Verbindung N929-89Cg (2,1 mg) und Verbindung N929-89M (0,5 mg), die Candida albicans-Aktivität und MLR-Aktivität zeigten. Die sechs Verbindungen wurden durch HPLC unter Verwendung der Chemcosorb (eingetragene Handelsmarke) 5ODS-UH-Säule (4,6 mm x 150 mm) durch Elution mit Methanol/Wasser 7:3 bis 10:0 bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,7 ml/min bei 4000 getrennt. Die Retentionszeiten der Verbindungen sind nachstehend angeführt. Die Detektion wurde mit UV bei 280 nm ausgeführt. Tabelle 4
- Die physikochemischen Eigenschaften der hier erhaltenen sechs makrocyclischen Lactone N929-89A, N929-89B, N929- 89Ca, N929-890Cb, N929-89Cg und N929-89M sind wie nachstehend.
- Das Vorliegen von N929-89C und N929-89M wird durch ihre LSI-Massenspektren gestützt. In diesem Fall zeigen die Ionenpeaks der Verbindungen N929-89C und N929-89M Masseneinheiten 28 und 44 kleiner als jene von Verbindung B. Die ¹H NMR-Spektren der Verbindungen Cg und M stützen ebenfalls das Vorliegen der makrocyclischen Lactone.
- Eine Saatkultur (5 ml), wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in 100 ml des Mediums 2 in einen 500 ml-Schüttelkolben inokuliert. Der Kolben wurde bei 2800 3 Tage auf einem Rotationsschüttler mit einer Auslenkung von 7 cm bei 220 U/min geschüttelt. Es ist ersichtlich, daß die Fermentationsbrühe die makrocyclischen Lactone einschließt, da die Fermentationsbrühe (100 ml), welche vorstehend erhalten wurde, die anti-Candida albicans-Aktivität und die MLR-Aktivität zeigte. Die Verbindungen N929-89A, N929-89B, N929-89Ca, N929-89Cb, N929-89Cg und N929-89M können in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 gewonnen werden.
- Eine Saatkultur von Streptomyces hygroscopicus FERM BP-3688, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in 1 1 Medium 1 in drei Dreiliterkolben inokuliert. Die zweite Saatkultur wurde durch Schütteln des Kolbens bei 2800 für 4 Tage auf einem Rotationsschüttler mit 7 cm Auslenkung bei 220 U/min hergestellt.
- Die zweite Saatkultur (3 1) wurde in 70 1 des Mediums 2, wie in Beispiel 1 beschrieben, in einem 100 Liter-Fermen ter aus rostfreiem Stahl inokuliert. Der Fermenter wurde bei 28ºC 3 Tage bei 360 U/min geschüttelt.
- Die Fermentationsbrühe (70 1) des gesamten Gefäßes wurde mit 70 1 Essigsäureethylester extrahiert. Die Essigsäureethylesterschicht wurde über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der ölige Rückstand enthielt die makrocyclischen Lactone und zeigte die anti-Candida albicans- Aktivität und MLR-Aktivität. Die Verbindungen N929-89A, N929-89B, N929-89Ca, N929-89Cb, N929-89CG und N929-89M können in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 gewonnen werden.
- 100 ml Medium 1 in Beispiel 1 in einem 500 ml-Kolben wurden mit einer vegetativen Zellsuspension aus einer Schrägkultur von Actinoplanes sp. FERM BP-3832 inokuliert. Der Kolben wurde bei 2600 4 Tage auf einen Rotationsschüttler mit einer Auslenkung von 7 cm bei 220 U/min geschüttelt und wurde erste Saatkultur genannt.
- 5 Schüttelkolben, die Medium 1 (150 ml) enthielten, wurden mit 7,5 ml der ersten Saatkultur 1 inokuliert. Diese Kolben wurden bei 2600 3 Tage auf dem Rotationsschüttler geschüttelt und wurden zweite Saatkultur genannt.
- Die zweite Saatkultur in Beispiel 1 in den 5 Schüttelkolben wurde zum Inokulieren von 4 Fermentationsgefäßen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 6 1 (L), die 3 1 steriles Medium enthielten, verwendet. Belüftung wurde bei 26ºC 24 Stunden mit 1700 U/min bei 3 1 pro Minute ausgeführt. Danach wurde 2-Methyl-1,2-di(3-pyridyl)-1-propanon in Wasser dazugegeben, woraus sich eine Konzentration der Verbindung von 5 mM ergab und das Gemisch wurde 72 Stunden gerührt.
- Die Fermentationsbrühe (30 Liter) wurde gefriergetrocknet und zweimal mit 30 Liter Essigsäureethylester extrahiert. Nach Filtrieren des Essigsäureethylesterextrakts durch Supercell wurde der Extrakt über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und verdampft, unter Hinterlassen eines öligen Rückstands (42 g), der die makrocyclischen Lactone einschließt. Der ölige Rückstand wurde auf eine Kieselgelsäule (200 g) gegeben und mit einem Stufengradienten-Lösungsmittel von n-Hexan:Essigsäureethylester = 2:1 (2000 ml), anschließend mit n- Hexan:Essigsäureethylester 2:1 (3000 ml) und Essigsäureethylester (3000 ml) eluiert. Das Elutionsmittel wurde in 500 ml-Fraktionen (Nr.1 - Nr.12) gesammelt. Außerdem wurde die Säule mit Essigsäureethylester:MeOH = 9:1 (2000 ml) zu 3 Fraktionen mit jeweils 1667 ml gewaschen. Die Hexan: Essigsäureethylester = 1:1-Fraktion wurde eingeengt und der Rückstand auf eine Sephadex-Säule (eingetragene Handelsmarke) LH- 20 gegeben und mit Methanol zu 27 Fraktionen von jeweils 8 ml eluiert. Die eingeengte 23. Fraktion wurde durch HPLC an Chemcosorb (eingetragene Handelsmarke) 5ODS-UH-Säule (20x250 mm) durch Elution mit Methanol/Wasser = 85:15 bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min unter Verfolgen der UV-Absorption bei 305 nm getrennt. Die fünf makrocyclischen Lactone N902-109B&sub2; (8,1 mg), N902-109D (9,8 mg), N902-109H (0,5 mg), N902-1090 (9,1 mg) und N902-109B&sub1; (4,5 mg) wurden nach Retentionszeiten von 40,4 min, 47,6 min, 63,9 min, 82,6 min bzw. 86,8 min erhalten. Außerdem wurden 9 Peaks nach Retentionszeiten von 17,7 min, 21,4 min, 23,1 min, 25,1 min, 26,7 min, 28,4 min, 29,6 min, 33,2 min bzw. 69,2 min beobachtet und hatten dasselbe UV-Spektrum der zwei vorstehend genannten 5 makrocyclischen Lactone. Die fünf vorstehend genannten Verbindungen wurden durch HPLC an Chemcosorb (eingetragene Handelsmarke) 5ODS-UH-Säule (4,6 mm x 150 mm) durch Elution mit einen linearen Lösungsmittelgradienten Methanol/Wasser = 7:3 bis 10:0 für 30 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,7 ml/min bei 4000 getrennt. Die Retentionszeiten der Verbindungen sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6
- 100 ml Medium 1 in Beispiel 1 in einem 500 ml-Kolben wurden mit einer vegetativen Zellsuspension aus einer Schrägkultur von Streptomyces toyocaensis subsp. fumicola ATCC 39471 geimpft. Der Kolben wurde bei 26ºC 4 Tage auf einem Rotationsschüttler mit einer 7 cm Auslenkung bei 220 U/min geschüttelt.
- 3 Schüttelkolben, die Medium 1 (150 ml) enthielten, wurden mit 7,5 ml der gezüchteten Kultur inokuliert. Diese Kolben wurden bei 26ºC 3 Tage auf dem Rotationsschüttler geschüttelt und wurden zweite Saatkultur genannt.
- 150 ml der zweiten Saatkultur wurden zum Inokulieren zu 4 Fermentationsgefäßen mit einem Fassungsvermögen von 6 1 (L), die 3 1 steriles Medium enthielten (Medium 3: Glucose 3 %, Maisstärke 1 %, Maisquellpulver 0,75 %, Hanfschrot (Sungross) 0,5 %, Baumwollpulver 0,5 %, CaCO&sub3; 0,4 %, CoCl&sub2; 6H&sub2;O 0,0001 %, pH 7,0) gegeben. Nachdem Belüftung bei 2600 für 1 Tag mit 1700 U/min bei 3 1/min ausgeführt wurde, wurden 30 ml einer sterilen wässerigen Lösung von Rapamycin (5 mg/ml) zu jeder Fermentationsbrühe gegeben. Die Belüftung wurde dann zusätzlich 2 Tage bei 26ºC ausgeführt.
- Die Fermentationsbrühe (15 1) wurde gefriergetrocknet und dreimal mit 15 1 Essigsäureethylester extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Bereitstellung eines öligen Rückstands eingedampft, der makrocyclische Lactone einschloß. Der ölige Rückstand wurde auf eine Kieselgelsäule (100 g) gegeben und mit einem Stufengradienten-Lösungsmittel von Choroform (1000 ml)/Chloroform: Methanol = 100:1 (1000 ml)/Chloroform:Methanol = 100:4 und Methanol (1000 ml) eluiert. Die Fraktion mit Aktivität wurde auf eine Sephadex LH-20-(Handelsname)-Säule gegeben und mit Methanol eluiert. Die makrocyclische Lactone enthaltende Fraktion wurde außerdem auf eine Chemcosorb- (eingetragene Handelsmarke) 30018-Säule (220 ml, 20x250 mm) gegeben und mit Methanol:Wasser = 4:1 eluiert. Dann wurde die Fraktion, die nakrocyclische Lactone enthielt, auf eine Cupsell-Puck-Vorrichtung 5G120 018 (Handelsname von Shiseido, 20 mm x 250 mm) gegeben und mit Methanol:Wasser = 4:1 bei einer Fließgeschwindigkeit von 7,5 ml/min eluiert. Detektion wurde durch UV-Absorption bei 310 nm ausgeführt. Die eluierten Peaks wurden zu einem Gemisch (43,5 mg) gesammelt, das Candida albicans-Aktivität und MLR-Aktivität zeigte. Die sechs Verbindungen wurden durch HPLC unter Verwendung der Chemcosorb(eingetragene Handelsmarke) 5ODS-UH-Säule (4,6 mm x 150 mm) durch Elution mit Methanol:Wasser = 7:3 bis 10:0 bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,7 ml/min bei 40ºC getrennt. Die Retentionszeiten der Verbindungen sind in Tabelle 7 dargestellt. Die Detektion wurde mit UV bei 280 nm ausgeführt. Tabelle 7
- Die Erfindung stellt die neue Kultur Streptomyces hygroscopicus FERM BP-3688 vor. Die makrocyclischen Lactone, die durch die Kultur Streptomyces hygroscopicus (FERM BP-3688), Actinoplanes sp. (FERM BP-3832) oder Streptomyces toyocaensis subsp. humicola (ATCC 394871) erzeugt werden, sind als Immunosuppressivum, als antimycotisches Mittel und als Antitumormittel geeignet.
Claims (9)
1. Biologisch reine Kultur von Streptomyces
hygroscopicus, FERM BP-3688.
2. Makrocyclische Lactonverbindungen mit
immunosuppressiver, antimycotischer oder Antitumorwirkung, hergestellt
durch aerobe Fermentation von Streptomyces hygroscopicus
(FERM BP-3688); oder durch aerobe Fermentation von
Actinoplanes sp. (FERM BP-3832) in Gegenwart des Enzyminhibitors
2-Methyl-1,2-di(3-pyridyl)-1-propanon; oder durch aerobe
Fermentation von Streptomyces toyocaensis subsp. humicola (ATCC
39471) in Gegenwart von Rapamycin.
3. Verbindungen der allgemeinen chemischen Formel:
worin R¹ Sauerstoff, zwei Wasserstoffatome oder ein
Wasserstoffatom und eine Hydroxygruppe bedeutet;
R², R³ und R&sup5; jeweils unabhängig voneinander
Wasserstoff, Hydroxy oder Methoxy bedeuten; und
R&sup4; Hydroxy oder Wasserstoff bedeutet; mit der
Maßgabe, daß wenn R¹ Sauerstoff ist, R&sup4; Hydroxy bedeutet und R²
und R&sup5; Methoxy sind, R³ weder Wasserstoff noch Methoxy ist.
4. Verbindung nach Anspruch 3, worin entweder:
R¹ Sauerstoff bedeutet, R², R³ und R&sup4; Hydroxy sind
und R&sup5; Methoxy ist;
R¹ Sauerstoff ist, R² und R&sup4; Hydroxy sind und R³ und
R&sup5; Methoxy sind;
R¹ Sauerstoff ist, R² Methoxy ist, R³ Wasserstoff ist
und R&sup4; und R&sup5; Hydroxy sind;
R¹ Sauerstoff ist, R² und R&sup5; Methoxy sind und R³ und
R&sup4; Hydroxy sind;
R¹ Sauerstoff ist, R², R³ und R&sup5; Methoxy sind und R&sup4;
Wasserstoff ist;
R¹ zwei Wasserstoffatome bedeutet, R², R³ und R&sup5;
Methoxy sind und R&sup4; Wasserstoff ist;
R¹ zwei Wasserstoffatome bedeutet, R², R³ und R&sup5;
Methoxy sind und R&sup4; Hydroxy ist;
R¹ zwei Wasserstoffatone bedeutet, R² und R&sup5; Methoxy
sind, R³ Wasserstoff ist und R&sup4; Hydroxy ist;
R¹ zwei Wasserstoffatome bedeutet, R² Methoxy ist, R³
Wasserstoff ist und R&sup4; und R&sup5; Hydroxy sind; oder
R¹ Sauerstoff ist, R² und R³ Methoxy sind und R&sup4; und
R&sup5; Hydroxy sind.
5. Verbindung nach Anspruch 2 mit einem
charakteristischen m/z-Wert von 878,5 [M+Na]&spplus; im LSI-Massenspektrum.
6. Immunosuppressives Mittel, dadurch gekennzeichnet,
daß es mindestens eine Verbindung nach Anspruch 2 zusammen
mit einen inerten Träger umfaßt.
7. Antimycotisches Mittel, dadurch gekennzeichnet,
daß es mindestens eine Verbindung nach Anspruch 2 zusammen
mit einem inerten Träger umfaßt.
8. Antitumormittel, dadurch gekennzeichnet, daß es
mindestens eine Verbindung nach Anspruch 2 zusammen mit einem
inerten Träger umfaßt.
9. Verfahren zur Herstellung der makrocyclischen
Lactonverbindung, umfassend Züchten von Streptomyces
hygroscopicus (FERM BP-3688); oder Züchten von Actinoplanes sp. (FERM
BP-3832) in Gegenwart des Enzyminhibitors 2-Methyl-1,2-di(3-
pyridyl)-1-propanon; oder Züchten von Streptomyces
toyocaensis subsp. humicola (ATCC 39471) in Gegenwart von Rapamycin;
in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare
Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter aeroben
Bedingungen; und wobei die makrocyclische Lactonverbindung
die Formel aufweist:
worin R¹ Sauerstoff, zwei Wasserstoffatome oder ein
Wasserstoffatom und eine Hydroxygruppe bedeutet;
R², R³ und R&sup5; jeweils unabhängig voneinander
Wasserstoff, Hydroxy oder Methoxy bedeuten; und
R&sup4; Hydroxy oder Wasserstoff bedeutet; mit der
Maßgabe, daß wenn R¹ Sauerstoff ist, R&sup4; Hydroxy bedeutet und R²
und R&sup5; Methoxy sind, R³ weder Wasserstoff noch Methoxy ist.
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