DE3586381T2

DE3586381T2 - Stoff, stoffzusammensetzung und deren anwendungsverfahren.

Info

Publication number: DE3586381T2
Application number: DE8585901227T
Authority: DE
Inventors: R Pettit
Original assignee: University of Arizona
Current assignee: University of Arizona
Priority date: 1984-02-17
Filing date: 1985-02-19
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2005-02-20
Also published as: WO1985003708A1; ATE78481T1; AU3997885A; CA1297108C; AU571948B2; EP0175709A4; JPH0699436B2; US4985436A; US4866071A; KR900004003B1; IT1221760B; DE3586381D1; IT8521938A0; EP0175709A1; EP0175709B1; JPS61501986A; NO854112L

Description

1. Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine neue, als "Pancratistatin" bezeichnete antineoplastische Substanz und deren pharmazeutisch akzeptable Derivate. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Gewinnung von Pancratistatin und 7-Desoxynarciclasin sowie Verfahren zur Schaffung einer Arzneimittelzubereitung zur Behandlung eines an einem neoplastischen Wachstum leidenden Wirts mit dieser.

Stand der Technik

Bereits seit dem 4. Jahrhundert v. Chr. wurde bestimmten medizinisch wirksamen und/oder giftigen Pflanzenarten Beachtung geschenkt. Zur Ermittlung des Vorhandenseins von Alkaloidbestandteilen in solchen Arten vergleiche R.D. Gibbs "Chemotaxonomy of Flowering Plants", Band III, McGills- Queens University Press., Montreal, 1974, S. 1924. Über die Zeit hinweg fanden mehr als 30 Arten der relativ großen Familie von Amaryllidaceae Verwendung bei der einfachen Behandlung von Krebs (vgl. J.L. Hartwell "Lloydia", 1967, 30, 391).
Bei weiteren Versuchen zur Auffindung und Bestimmung verschiedener natürlicher und synthetisierbarer Substanzen zur Behandlung einer oder mehrerer Krebsarten durchforschen Chemiker weiterhin die natürliche Flora und Fauna mit dem Ziel, Substanzen mit antineoplastischer Aktivität zu isolieren und zu identifizieren und dabei gleichzeitig einige der schweren Nebenwirkungen bekannter Chemotherapeutika weitestgehend, wenn nicht sogar vollständig auszuschalten.
Bei der weiteren Verfolgung dieser Ziele werden bislang ignorierte Pflanzenarten nunmehr daraufhin geprüft, ob sie Bestandteile enthalten, die nach ihrer Isolierung antineoplastische Aktivität aufweisen.

Erläuterung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfaßt die Bereitstellung neuer und brauchbarer Chemotherapeutika, die in der noch im einzelnen beschriebener Weise aus der Wurzel der hawaiianischen (oder afrikanischen) Pflanzen Pancratium littorale Jacq. und Zephranthes grandiflora extrahiert werden können und die danach in wertvolle Arzneimittelzubereitungen mit belegbaren und bestätigten Graden an Antikrebsaktivität (bestimmt nach den allgemein akzeptierten und am nationalen Krebsinstitut der Vereinigten Staaten in Gebrauch befindlichen Protokollen) überführt werden. Die Hauptsubstanz (auf die zuvor hingewiesen wurde), wird hierin als "Pancratistatin" bezeichnet. Die Erfindung umfaßt weiterhin nicht-toxische, pharmakologisch aktive Derivate des Pancratistatins (vgl. Anspruch 1) und deren Verwendung in Arzneimittelzubereitungen.
Die vorliegende Erfindung liefert Verbindungen der Formel (I):
worin R bis R&sub4; jeweils H bedeuten, oder ein antineoplastisches Derivat derselben, wobei jede -OH-Gruppe mit einer Acylgruppe verestert ist, oder R = CH&sub3; und R&sub1; = R&sub2; = R&sub3; = R&sub4; = H.
Solche Verbindungen können mit einer Substanz der Struktur (II)
worin R&sub1; bis R&sub3; jeweils die angegebene Bedeutung besitzen, insbesondere der Verbindung 7-Desoxynarciclasin (II: R&sub1; = R&sub2; = R&sub3; = H), kombiniert werden.
Mondon & Krohn ("Chem. Ber." 108, (2) (1975), 445-463) beschreiben eine Anzahl von Verbindungen mit einem tricyclischen Kern ähnlich der Formel (I), denen jedoch ein Substituent in 1-Stellung fehlt. Einige derselben (beispielsweise die Verbindung 15a) besitzen eine cytostatische Aktivität. Die genannte Veröffentlichung berichtet auch über 7-Desoxynarciclasin und seine cytostatische Aktivität.
Keck & Mitarbeiter ("Tet. Lett." 22(28) (1981), 2615-2618) beschreiben Lycoricidin (=7-Desoxynarciclasin) und Narciclasin sowie deren in vitro Antitumoraktivität.
Die Strukturen 11 und 12 zeigen einen ähnlichen Kern wie obige Formel (I), ihnen fehlen jedoch Substituenten in 1- und 7-Stellungen. In jedem Falle werden sie lediglich als Zwischenprodukte bezeichnet. Ein Hinweis auf ihre biologische Aktivität fehlt.
Ohta & Kimoto ("Tet. Lett." 27 (1975), 2279-2282) beschreiben Lycoricidin und Narciclasin als antimitotisch. Es ist zwar (für die Verbindungen 11, 16 und 18 bis 28) ein tricyclischer Kern entsprechend der Formel (I) dargestellt, es fehlt aber wiederum ein 1-Substituent. Darüber hinaus wird diesen Verbindungen keine biologische Aktivität zugeschrieben.
Piozzi & Mitarbeiter ("Tetrahedron" 24 (1968), 1119-1131) berichten über Narciclasin (welches antimitotisch sein soll) und Narciprimin. Die für Narciclasin (VIII) vorgeschlagene Struktur hat sich am Prioritätstag der vorliegenden Erfindung (vgl. Keck & Mitarbeiter aaO) als falsch erwiesen. Narciprimin soll keine antimitotische Aktivität aufweisen.
Baez & Vasguez ("Biochim. Biophys. Acta" 518 (1978), 95-103) untersuchten die Ribosombindungseigenschaften von Narciclasin und einer Reihe verwandter Verbindungen, z.B. aus Mondon & Krohn aaO. Einige dieser Verbindungen zeigten einen Kern ähnlich obiger Formel (I), ihnen fehlt jedoch sämtlich der 1-Substituent.

Beste Art und Weise einer Realisierung der Erfindung

Der Knollenabschnitt (45 kg) von P. littorale wurde mit Methylenchlorid/Methanol/Wasser extrahiert, worauf Pancratistatin in einem n-Butanolextrakt der wäßrigen Phase konzentriert wurde (die Abtrennung wurde vornehmlich über einen Bioassay unter Verwendung des Ps in-vivo-Systems geführt). Die Reinigung der Hälfte des Rohprodukts unter Ausnutzung selektiver Löslichkeitseigenschaften und Anwendung einer Geldurchdringungschromatographie (SEPHADEX LH-20) lieferte 6,5 g (0,028% Ausbeute) Pancratistatin. Dieses wurde aus einem Dimethylformamid/Methanol/Ether- Gemisch als farbloses Feststoff abgetrennt. Zersetzung bei 320-321º; EI-Massenspektrum m/e 325 M&spplus;, C&sub1;&sub4;H1&sub1;&sub5;NO&sub8;)[α]³² +44º (c, 1,0, Dimethylsulfoxid);
(log Σ) 229 (4.29), 239 (4.26) und 281 (4.0) nm; IR-Spektrum (KBr) max 3500-3200, 1675, 1615, 1600, 1500, 1465, 1445, 1420, 1375, 1350, 1300, 1230, 1200, 1160, 1118, 1085, 1070, 1040, 1030, 930, 912, 880, 840, 720, 655, 640 und 610 cm&supmin;¹ und ¹H-NMR-Spektrum (100 MHz, Dimethylsulfoxid-d&sub6;) δ 3.6-4.4 (6H), 4.72-5.70 (5H, entfernt durch D&sub2;O, 6.11 (2H, breites s), 6.56 (1H, s) und 13.15 (1H, entfernt durch D&sub2;O). Die Umsetzung von Pancratistatin mit Essigsäureanhydrid/Pyridin lieferte sein Pentaacetat (Fp: 162-166º). Die Umsetzung von Pancratistatin mit Diazomethan in Methanol lieferte den 7-Monomethylether, Fp: 294-298º. Dieselbe Maßnahme liefert Pancratistatin aus Zephranthes grandiflora, obwohl P. littorale J. im vorliegenden Falle als Beispiel dient.
Die bemerkenswerte Unlöslichkeit von Pancratistatin in den verschiedensten organischen Lösungsmitteln, sein hoher Zersetzungspunkt, sein nicht-basischer Charakter und sein Infrarotspektrum legen ein Carbostyril- oder Isocarbostyrilsystem nahe. Die plausibelste Interpretation der Elementaranalysen und Spektraldaten für Pancratistatin, dessen Pentaacetat und dessen Methylether deuten auf ein neues Phenanthridon hin. Eine Röntgenstrahlenkristallstrukturbestimmung diente dazu, die stereochemischen Zuordnungen zu machen und die Gesamtstruktur des Pancratistatins wie folgt
mit R = R&sub1; = R&sub2; = R&sub3; = R&sub4; = H zu bestätigen.
Es hat sich gezeigt, daß ein aus 95%igem Ethanol umkristallisierter einzelner Kristall (0,125 x 0,25 x 0,37 mm) von Pancratistatinmonomethylether mit C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub7;NO&sub8;.H&sub2;O korrespondiert, fω357.32; monoclin β = 99.78 (2)º, a = 9.040(1), b = 8.317(1) und c = 10.187(2) Å; V = 754.8 Å; F (000) = 376; Po = 1.565 g/cm³; Z = 2 und Pc = 1.572 g/cm³ (25ºC; CuK, = 1.54184 Å).
Systematische Extinktionen (OkO abwesend wenn k = 2n+1) und die Chiralität stimmten mit der Raumgruppe P2&sub1; überein. Die beobachtete Dichte von 1,56 g/cm³ deutete auf jeweils ein Molekül C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub7;NO&sub8; und Wasser pro äquivalente Stellung (2 Moleküle Pancratistatin/Zelle) hin. Die Zellenparameter wurden durch die Methode der kleinsten Quadrate der reziproken Gitterlagen von 25 mittels eines Diffraktometers gemessenen Reflexionen mit 2-Thetawerten im Bereich von 5- 35º ermittelt. Die Intensitäten sämtlicher einmaliger Reflexionen mit 2Θ > 75º wurden bei 25ºC mittels einer Omega/2-Thetaabtasttechnik mit variabler Geschwindigkeit auf einem Enraf-Nonius (Delft) CAD4-Diffraktometer mittels Graphit-monochromatisch gemachter CuK-Strahlung gemessen. Der Abtastwinkel wurde für jede Reflexion als (0,90 + 0,15 tan Θ)º berechnet. Die Detektoröffnung mit einer variablen Breite von (4.0 + 0,5 tan Θ) mm und einer konstanten vertikalen Höhe von 4 mm wurde in einem Abstand von 173 mm vom Kristall positioniert. Die maximale Abtastdauer für jede Reflexion betrug 1 min. Zwei Drittel dieser Zeit dienten dazu, den Peak abzutasten, ein Sechstel zur Bestimmung von jeder der beiden Hintergrundintensitäten. Die Intensitäten der drei Monitorreflexionen wurden alle 250 min ebenfalls aufgezeichnet. Es hat sich gezeigt, daß sie während der gesamten Datensammlung weniger als 0,5% variierten. Insgesamt 1647 einmalige Reflexionen wurden für die Weiterverarbeitung aufbewahrt [I < 1,0 (1)]. Sämtliche Intensitätsdaten wurden auf einen anisotropen Abfall unter Benutzung der Monitorintensitäten der Standards korrigiert. Die Daten wurden auf eine Lorentz-Polarisation und anomale Dispersionseffekte korrigiert. Die Atomstreufaktorkoeffizienten wurden aus geeigneten Tabellen entnommen. (D. T. Cromer und J. T. Waber, "International Tables for X-ray Crystallography", Band IV, The Kynoch Press, Birmingham, England, 1974, Tabelle 2.2B; Tabellen für anomale Dispersionskoeffizienten, D. T. Cramer, aaO, Tabelle 2.3.1.). Extinktions- oder Absorptionsanpassungen wurden weder durchgeführt noch für notwendig erachtet. (u = 10.038 cm&supmin;¹).
Die Strukturbestimmung von Pancratistatinmonomethylether erfolgte nach direkten Verfahren unter Benutzung einer mehrlösungsgewichteten Tangenten-Näherungsformel, d. h. nach dem Programm MULTAN. Sämtliche kristallographischen Berechnungen wurden mit einem PDP 11/23-Computer unter Verwendung des von B. A. Frenz and Associates, Inc., College Station, Texas, 1982 entwickelten Enraf-Nonius (Delft) Strukturbestimmungspaket (SDP-PLUS)-Softwaresystems durchgeführt. Die benutzten Hauptprogramme waren START, PAINTER, REJECT, CHORT, Datenverminderungsprogramme, LSB, ein volles Matrixverfeinerungsprogramm "kleinste Quadrate", SEARCH, ein Zusammenhangs-Peaksuchprogramm; ORTEP-II, die kristallographischen Illustrationsprogramme; MULTAN 11/82 "Ein System von Computerprogrammen zur automatischen Lösung von Kristallstrukturen aus Röntgenstrahlenbeugungsdaten", ein Direktmethodenprogramm von P. Main und Kollegen, University of York, York, England. Zur Beschreibung von MULTAN siehe G. Germain, P. Main, M. M. Woolfson "Acta Crystallogr. Sect. B.", 1970, 26, 274-285, und M. M. Woolfson "Acta Crystallogr. Sect. B.", 1975, 33, 219-225. Nach der korrekten Zuordnung von Koordinaten für sämtliche Nicht-Wasserstoffatome wurde eine Verfeinerung (der Berechnung) mittels einer Vollmatrix kleinster Quadrate mit Nicht-Poisson-Verteilung des Gewichtsschemas bei den kleinsten Quadraten herangezogen, wobei W =1/ (F²) =4 x F²/( F2)² und (F2) = [ I² + (P x F²)² gelten und P ein Einstellfaktor für abwärtsgestufte intensive Reflexionen und W das Gewicht für die Reflexion bedeuten. Ein Wert von 0,05 wurde für P auf allen Koordinaten genommen, wobei ein Maßstabfaktor und isotrope Temperaturfaktoren zu einer raschen Verminderung in dem üblichen ungewichteten kristallographischen Diskrepanzindex R(Σ Fo-Fc /Σ Fo ) bis 0,1795 [für beobachtete Reflexionen, I > 3 (I)] führten. Eine anschließende Differenz-Elektronendichte-Synthese zeigte alle Wasserstoffatome sowie das Vorhandensein von einem Wassermolekül, das mit einem der Hydroxy-Wasserstoffatome bei C-4 eine Wasserstoffbindung (1,83 Å) zu haben schien. Schließlich führten verschiedene zusätzliche Zyklen der Rechenverfeinerung mit einer Vollmatrix kleinster Quadrate von allen Variablen (anisotrope Nicht-Wasserstoffatome und isotrope Nicht-Wasserstoffatome und isotrope Wasserstoffatome, wobei die thermischen B-Werte der letzteren bei einem Nennwert von 5,0 festgelegt sind) zu einer Konvergenz auf R = 0,405 (R = 0,0438). Die Verfeinerung wurde unterbrochen, als Parameterveischiebungen unbedeutend wurden (maximale Verschiebung/Fehler-Verhältnis betrug 0,84, wobei der Hauptanteil im Bereich von 0,1 - 0,2 liegt), und eine abschließende Differenzkartierung führte zu vernachlässigbaren Elektronendichten (> 0,22 e Å&supmin;³). Alle Bindungslängen und -winkel stimmten mit den erwarteten Werten überein.
Eine Berechnung der Diskrepanzindizes für das Gegenspiegelbildisomere zu dem für das Pancratistatinderivat dargestellte Isomere (vgl. Tab. I) mit R = CH&sub3; und R&sub1; = R&sub2; = R&sub3; = R&sub4; = H aus den Daten (1632 Beobachtungen und 301 Variable) lieferte Werte von R' = 0.0425, und R'ω entspricht der absoluten stereochemischen Konfiguration mit über 99,9%iger Wahrscheinlichkeit. Eine zusätzliche Stütze für die absolute Konfigurationszuordnung ergibt sich aus einer Kombination biosynthetischer Röntgenstrahlenkristallstrukturuntersuchungen von Narciclasin, einem 1- Dehydrophenanthridonderivat von Pancratistatin.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden die Knollen von P. littorale nach einem Methylenchlorid/Methanol-Verfahren mit anschließender Zugabe von Wasser extrahiert. Die Methylenchloridphase wurde unter Einsatz der Lösungsmittelsequenz 9:1 T 4:1 T 3:2 Methanol/Wasser mit Hexan T Tetrachlorkohlenstoff T Methylenchlorid verteilt. Die wäßrige Phase wurde mit n-Butanol extrahiert. Darin erfolgte eher eine Konzentration des Pancratistatins als in dem Methylenchloridrest, in welchem Lycorin zu erwarten war.
Die n-Butanolfraktion wurde mittels Geldurchdringungschromatographie auf SEPHADEX LH-20 unter Verwendung von Methanol als Eluiermittel weiter aufgetrennt. Die Fraktionssammlung wurde über eine Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von 3:1 Chloroform/Methanol geführt. Die beiden antineoplastischen Hauptkomponenten entsprachen Rf- Werten von 0,37 bzw. 0,46. Beide erwiesen als sich sehr hochschmelzende, relativ unlösliche stickstoffhaltige nichtbasische Feststoffe, die an Carbostyrile oder Isocarbostyrile erinnern.
Die Reinigung des einen Rf-Wert von 0,37 aufweisenden Produkts durch Umkristallisieren aus Essigsäure/Methanol lieferte ein Lactam, das ohne weiteres ein Triacetatderivat ergab. Die Spektraldaten zeigten, daß es sich bei diesem Antikrebsbestandteil (PS, T/C 161 bei 12,5 mg/kg, ED&sub5;&sub0; = 0,02 ug/ml) um ein 7-Desoxyderivat von Narciclasin handelte. Die für das später in Lycoricidin umbenannte Margetin berichteten physikalischen Konstanten deuteten jedoch auf etwas anderes hin. Aus diesen Gründen, und weil anfängliche Versuche zur Gewinnung einer authentischen Probe von 7- Desoxynarciclasin nicht erfolgreich waren, wurde nach röntgenkristallographischem Verfahren eine vollständige Strukturaufklärung durchgeführt. Das Ergebnis war eine endgültige Zuordnung der Struktur
zu der Substanz mit dem Rf-Wert von 0,37. Die absolute Konfiguration des Triols wurde aus seiner vermuteten Biosynthese aus Vittatin abgeleitet. Später wurden aus den natürlichen und (±) synthetischen Produkten authentische Proben des Triacetats
gewonnen. Ein Vergleich der Infrarotspektren in Kaliumbromid mit der Substanz mit einem Rf-Wert von 0,37 P. littorale zeigt merkliche Unterschiede, wenn jedoch in einer Chloroformlösung verglichen, waren die Spektren identisch. Auf dieser Basis scheint die Zuordnung der zuvor dargestellten Struktur zu 7-Desoxynarciclasin korrekt zu sein.
Ein Umkristallisieren der einen Rf-Wert von 0,46 aufweisenden Antikrebskomponente (T/C 138 T 165 bei 0,75 T 6,0 mg/kg Dosierung und 206 bei 12,5 mg/kg in dem PS-System mit ED50 von 0,01 ug/ml) aus Dimethylformamid/Methanol/Ether lieferte eine reine Probe; die Elementaranalyse- und Spektraldaten entsprechen der Struktur:
Dieses neue Phenanathridon wurde als "Pancratistatin" bezeichnet. Seine Strukturaufklärung erfolgte durch Röntgenstrahlenkristallstrukturbestimmung. Die für Pancratistatin ermittelte Struktur stimmte vollständig mit den entsprechenden Spektralergebnissen überein.
Zum weiteren Verständnis der vorliegenden Erfindung sei die Aufmerksamkeit nunmehr auf diese Isolierung von Pancratistatin und 7-Desoxynarciclasin aus hawaiianischem (afrikanischem) Pancratium littorale Jacq. gelenkt.

Allgemeines Verfahren:

Sämtliche zum Chromatographieren verwendeten Lösungsmittel wurden umdestilliert. Die Dünnschichtchromatographie wurde auf Silikagel-GHLF-Einmalplatten (0,25 mm Schichtdicke) der Firma Analtech Inc. durchgeführt. Entwickelt wurde mit Chloroform/Methanol-(3:1)-Lösungsmittel. Das Sichtbarmachen erfolgte mit Cer(IV)sulfatspray-Reagens. SEPHADEX LH-20 (Teilchengröße: 25-100 um) wurde von der Firma Sigma Chemical Co. geliefert. Zum Sammeln der Fraktion wurde ein Gilson FC-200K-Fraktionssammlermodell verwendet.
Die Fließpunkte wurden auf einer Kofler'schen Heizbank bestimmt und blieben unkorrigiert. Die optischen Drehwerte wurden mit Hilfe eines automatischen Polarimeters, Modell 241, Perkin-Elmer gemessen. Die UV-Spektren wurden mit Hilfe eines Spektralphotometers, Modell 8450A UV/VIS, Hewlett- Packard aufgenommen. Die IR-Spektren wurden mit Hilfe von Spektralphotometern, Modell 200, Perkin-Elmer, und MX-1 FTIR, Nicolet bestimmt. Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren wurden unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard mit Hilfe von Varian XL-100- und Bruker HXE-90 (22.63 MHz)- Spektrometern aufgenommen. Die Massenspektren wurden mit Hilfe eines Varian MAT 312-Spektrometers bestimmt.

Sammeln der Pflanzen:

Die Knollen von hawaiianischem P. littorale J. wurden im Rahmen eines gemeinsamen Forschungsprogramms des National Cancer Institute und der University of Hawaii gewonnen.

Extraktion:

Die Knollen von hawaiianischem P. littorale Jacq wurden geschnitzelt, worauf die geschnitzelten Knollen (45 kg) bei Raumtemperatur 20 d lang mit Methanol/Methylenchlorid (1/1, 320 Liter) extrahiert wurden. Der Extrakt wurde danach dekantiert, während die Methylenchloridphase durch Zusatz von 20 Vol.-% Wasser getrennt wurde. Die wäßrige Phase wurde durch Zusatz von weiterem Methanol und Methylenchlorid im Verhältnis wäßrige Phase/Methanol/Methylenchlorid von 2/1/1 eingestellt, worauf die Knollen nochmals 20 d extrahiert wurden. Durch anschließendes Dekantieren und Zugießen von 20 Vol.-% Wasser wurde die Methylenchloridphase abgetrennt. Diese wurde mit der ersten Methylenchloridfraktion vereinigt, worauf das Ganze zu einem inaktiven Extrakt (812 g) eingedampft wurde.

Lösungsmittelverteilung:

Die wäßrige Phase aus der geschilderten Extraktion wurde auf etwa 16 Liter eingeengt und danach zur Entfernung von unlöslichem Material zentrifugiert. Die klare Lösung wurde dann mit n-Butanol (3 x 10 Liter) extrahiert. Der Butanolextrakt wurde eingeengt, wobei die butanollösliche Fraktion (705 g) erhalten wurde. Ein aliquoter Teil (355 g) wurde in Methanol (1,5 Liter) gelöst, worauf Aceton (3,5 Liter) zugegeben wurde. Das unlösliche Material (105 g) wurde abfiltriert, worauf das Filtrat zu einem Verdampfungsrückstand (250 g) eingeengt wurde.

Isolierung von 7-Desoxynarciclasin und Pancratistatin:

Der bei der geschilderten Lösungsmittelverteilung erhaltene Rückstand wurde mit Methanol (1,5 Liter) behandelt und danach filtriert, wobei ein aus Pancratistatin bestehender Feststoff (2 g) anfiel. Das Filtrat wurde unter Verwendung von Methanol als Eluiermittel auf Sephadex LH-20 (2 kg; 105 x 10 cm) chromatographiert. Die Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie überwacht. Die Fraktionen der Komponente Rf = 0,37 wurden miteinander vereinigt, eingeengt und filtriert, wobei 7-Desoxynarciclasin (10 g) erhalten wurde. Dieses wurde aus Essigsäure/Methanol in Form feiner Nadeln eines Fp von 251-252º (Literatur: 214,5 - 215,5º (9); Zersetzungspunkt: 230º (12)) zur Kristallisation gebracht. [α]³³ + 157.3º (c 0.96, DMSO); ei ms: m/e 291 (M&spplus;, C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub3;NO&sub6;);λCH&sub3;OH (log Σ) 233(4.14), 248 4.15) und 302 (3.75)nm; IRmax(KBr)γmax 3450, 3250, 1672, 1632, 1620, 1602, 1505, 1473, 1415, 1400, 1340, 1320, 1270, 1250, 1080, 1045, 1015, 976, 940, 890, 860, 785, 700, 670 und 623 cm&supmin;¹; ¹H NMR (Pyridin-d5)δ , 4.81-4.92 (2H), 5.0-5.35 (2H), 6.05 (2H, d, J=a3 Hz), 6.72 (1H, breites s), 7.33 (1H, s), 8.06 (1H, s), 8.57 (1H, breites s, entfernt durch D&sub2;-Austausch) und 7.0-8.6 (breiter Höcker, entfernt durch D&sub2;O) ppm; 13C NMR (DMSO-d6) δ 163.12, 150,58, 147.72, 131.70, 130.01, 123.61, 121.95, 106.19, 103.24, 101.81, 72.56, 69.21 und 52.74 ppm (1 Kohlenstoff durch DMSO maskiert: 42.77-36.72).
Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub3;NO&sub6;: C 57.53; H 4.47; N 4.81. Gefunden: C 57.79; H 4.49; N 4.79.
Beim weiteren Eluieren fielen Fraktionen an, die hauptsächlich die Komponente mit dem Rf-Wert = 0,46 enthielten. Diese lieferten beim Einengen und Filtrieren Pancratistatin (4,5 g). Bei einer Kristallisation aus Dimethylformamid/Methanol/Ether fiel ein farbloser Feststoff eines Fp von 320-321º (Zersetzung) an.[α]³² + 44º (c 1.0, DMSO) eims m/e 325 (M&spplus;,C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub5;NO&sub8;);
(log Σ) 209(sh), 219(sh), 233(4.32), 278(3.91) und 308 (breite Schulter) nm; IR (KBr) max 3500-3200, 1675, 1615, 1600, 1500, 1465, 1445, 1420, 1375, 1350, 1300, 1230, 1200, 1160, 1118, 1085, 1070, 1040, 1030, 930, 912, 880, 840, 720, 655, 640 und 610 cm&supmin;¹; ¹H NMR (MDSO-d6) δ 3.6-4.4 (6H), 4.72-5.70 (5H, entfernt durch D&sub2;O), 6.11 (2H, breites s), 6.56 (1H, s) und 13.15 (1H, entfernt durch D&sub2;O) ppm; ¹³C NMR (DMSO-d&sub6;) δ 169.49, 152.04, 145.38, 135.63, 131.70, 107.49, 101.70, 97.62, 73.28, 70.19, 69.99, 68.50 und 50.46 ppm (1 Kohlenstoff durch DMSO maskiert: 42.27-36.72).
Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub5;NO&sub8;: C 51.69, H 4.61; N 4.31. Gefunden: C 51.65; H 4.55; N 4.24.
Biologisch aktive Glykosidderivate von Pancratistatin und 7-Desoxynarciclasin wurden durch Kuppeln der Hauptverbindung mit geeignet geschützten Zuckern oder sonstigen hydroxylierten Verbindungen nach bekannten Verfahren hergestellt (vgl. "Methods in Chemistry" von R. L. Whistler und J. N. Bemiller (Herausgeber), Academic Press, N.Y., 1972, Band 6, oder "The Carbohydrates: Chemistry and Biochemistry" von W. Pigman, Academic Press, N.Y., 1981).
Derivate von Pancratistatin werden zum selben Zweck eingesetzt wie Pancratistatin.
Pancratistatin und 7-Desoxynarciclasin besitzen beide, wie gezeigt, für eine Derivatbildung verfügbare freie Hydroxylgruppen. Somit können also auch nach dem Fachmann bekannten Verfahren Acylester dieser Verbindungen hergestellt werden. Acylderivate der Pancratistatine und 7- Desoxynarciclasine können zum selben biologischen Zweck eingesetzt werden wie die Mutterverbindungen.
Säuren, die zur Acylisierung des Pancratistatins verwendet werden können, sind beispielsweise:
(a) gesättigte oder ungesättigte, gerad- oder verzweigtkettige aliphatische Carbonsäuren, beispielsweise Essig-, Propion-, Butter-, Isobutter-, tert.-Butylessig-, Valerian-, Isovalerian-, Capron-, Capryl-, Decan-, Dodecan-, Laurin-, Tridecan-, Myristin-, Pentadecan-, Palmitin-, Margarine-, Stearin-, Acryl-, Croton-, Undecylen-, Öl-, Hexyn-, Heptyn- und Octynsäuren; (b) gesättigte oder ungesättigte alicyclische Carbonsäuren, beispielsweise Cyclobutan-, Cyclopentan-, Cyclopenten-, Methylcyclopenten-, Cyclohexan-, Dimethylcyclohexan- und Dipropylcyclohexancarbonsäuren; (c) gesättigte oder ungesättigte alizyklische aliphatische Carbonsäuren, beispielsweise Cyclopentanessig-, Cyclopentanpropion-, Cyclohexanessig-, Cyclohexanbutter- und Methylcyclohexanessigsäuren; (d) aromatische Carbonsäuren, beispielsweise Benzoe-, Toluol-, Naphthol-, Ethylbenzoe-, Isobutylbenzoe- und Methylbutylbenzoesäuren; und (e) aromatisch-aliphatische Carbonsäuren, beispielsweise Phenylessig-, Phenylpropion-, Phenylvalerian-, Zimt-, Phenylpropion- und Naphthylessigsäuren. Geeignete Halogen-, Nitro-, Hydroxy-, Keto-, Amino-, Cyano-, Thiocyano- und niedrige Alkoxykohlenwasserstoffcarbonsäuren sind Kohlenwasserstoffcarbonsäuren der angegebenen Art, die ein- oder mehrfach halogen-, nitro-, hydroxy-, keto-, amino-, cyano- oder thiocyano- oder niedrigalkoxy-, zweckmäßigerweise niedrigalkoxy- (mit nicht mehr als 6 Kohlenstoffatomen), beispielsweise methoxy-, ethoxy-, propoxy-, butoxy-, amyloxy- oder hexyloxy- (oder durch deren isomere Formen) substituiert sind. Beispiele für solche substituierte Kohlenwasserstoffcarbonsäuren sind: Mono-, Diund Trichloressigsäure, α- und β-Chlorpropionsäure, α- und γ -Brombuttersäure, α- und δ-Iodvaleriansäure, Mevalonsäure, 2- und 4-Chlorcyclohexancarbonsäure, Shikimsäure, 2-Nitro-1- methylcyclobutancarbonsäure, 1, 2, 3, 4, 5, 6- Hexachlorcyclohexancarbonsäure, 3-Brom-2-methylcyclohexancarbonsäure, 4- und 5-Brom-2-methylcyclohexancarbonsäure, 5- und 6-Brom-2-methylcyclohexancarbonsäure, 2,3-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure, 2,5-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure, 4 5-Dibrom-2- methylcyclohexancarbonsäure, 5,6-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure, 3-Brom-3-methylcyclohexancarbonsäure, 6- Brom-3-methylcyclohexancarbonsäure, 1,6-Dibrom-3- methylcyclohexancarbonsäure, 2-Dibrom-4-methylcyclohexancarbonsäure, 1,2-Dibrom-4-methylcyclohexancarbonsäure, 3-Dibrom-2,2,3-trimethylcyclopentancarbonsäure, 1-Brom-3,5- dimethylcyclohexancarbonsäure, Homogentinsinsäure, o-, m- und p-Chlorbenzoesäure, Anisinsäure, Salicylsäure, p- Hydroxybenzoesäure, b-Resorcinsäure, Gallussäure, Veratrinsäure, Trimethoxybenzoesäure, Trimethoxyzimtsäure, 4,4'-Dichlorbenzilsäure, o-, m- und p-Nitrobenzoesäure, Cyanoessigsäure, 3,4- und 3,5-Dinitrobenzoesäure, 2,4,6- Trinitrobenzoesäure, Thiocyanessigsäure, Cyanopropionsäure, Milchsäure, Ethoxyameisensäure (Ethylwasserstoffcarbonat); Äpfelsäure, Zitronensäure, Isozitronensäure, 6-Methyl- salicylsäure, Mandelsäure, Levulinsäure, Brenztraubensäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin, Hydroxyprolin, Ornithin, Lysin, Arginin, Histidin, Hydroxylysin, Phenylglycin, p- Aminobenzoesäure, m-Aminobenzoesäure, Anthranilsäure, Aspartinsäure, Glutaminsäure, Aminoadipinsäure, Glutamin und Asparagin.
7-Desoxynarciclasintriacetat erhält man durch Umsetzen von 7-Desoxynarciclasin (0,5 g) mit Essigsäureanhydrid (2 ml) und Pyridin (2 ml) bei Raumtemperatur während 48 h. Bei Zugabe von Eiswasser und nach dem Filtrieren erhält man ein Produkt (0,5 g), das auf Silicagel-60 (Merck; 70-230 Mesh) chromatographiert wurde. Beim Eluieren mit Methylenchlorid/Methanol (99/1) erhielt man das Triacetat (0,35 g), das aus Methylenchlorid/Methanol in Form farbloser Nadeln eines Fp von 244-246º (Literatur: 201º (9,11), 233-235º (12)) kristallisierte. [α]²&sup7; + 219º (c 1.0, CHCl&sub3;) [lit. [α]²&sup0; + 195º (c 0.45, CHCl&sub3;)(11)]; eims m/e 4.17 (M&spplus;C&sub2;&sub0;H&sub1;&sub9;NO&sub9;); (log Σ), 231(4.20), 251(4.21) und 305(3.93) nm; IR (KBr)\ max3392, 1760, 1748, 1733, 1663, 1640, 1615, 1500, 1485, 1470, 1400, 1373, 1364, 1263, 1245, 1225, 1076, 1040, 1015, 966, 940, 828 und 663 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 2.12 (3H, s), 2.14 (3H, s), 2.19 (3H, s), 4.71 (1H, dd, J=9 und 2Hz), 5.32 (1H, dd, J=9 und 2Hz), 5.38 (1H, m), 5.55 (1H, m), 6.12 (1H, m), 6.12 (2H, s) 7.06 (1H, s), 7.24 (1H, breites s, entfernt durch D&sub2;O) und 7.59 (1H, s) ppm; ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 170.4, 169.79, 169.53, 164.52, 151.79, 149.25, 134.24, 130.43, 122.56, 117.12, 107.52, 103.43, 102.07, 71.23, 68.59, 68.30, 50.27, 21.02, 20.86 und 20.73 ppm.
Elementaranalyse: berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub1;&sub9;NO&sub9;: C 57.55; H 4.55. Gefunden: C 57.37; H 4.63.
Die Struktur wurde durch direkte Methoden und Atomkoordinaten nach Bereinigung durch vollständige Matrixkleinste Fehlerquadrat-Programme in einem Strukturlösungspaket ermittelt. Die Wasserstoffatomkoordinaten wurden entweder berechnet und/oder über Unterschiedskarten lokalisiert und in die endgültige Verbesserung eingebracht. Die endgültigen standardkristallographischen Rückstände (gewogene und ungewogene R-Faktoren) für das Modell, die anisotrope Temperaturfaktoren für sämtliche schweren Atome und fixierte (B = 4,0) isotrope Faktoren für sämtliche Wasserstoffe enthielten, betrugen 0,063 bzw. 0,044. Das maximale Verschiebungsfehlerverhältnis beim letzten Zyklus der Verbesserung betrug 0,55, wobei sämtliche Bindungsabstände und -winkel Nominalwerte aufweisen.
Kristalldaten: C&sub2;&sub0;H&sub1;&sub9;NO&sub9;, monoclin, Raumgruppe P2&sub1; mit a = 8.325(2), b = 8.013(2), c = 14.551(2)Å, V = 946.4Å, Dm = 1,45, Dc = 1,46 g cm&supmin;³ für Z = 2. Ein Datenquadrant auf einem Kristall der ungefähren Abmessungen 0,10 x 0,15 x 0,75 mm wurde auf ein Maximum von 2 von 150º unter Verwendung der w/2 Abtasttechnik und graphit-monochromatischer Cu K α- Strahlung (λ = 1.5418Å) ermittelt. Nach Lorentz- und Polarisationskorrekturen wurden 1581 der Reflexionen mit /F/≥ 3 (F) bei der Strukturaufklärung benutzt. Absorptionskorrekturen wurden für nicht erforderlich erachtet (u = 9.5 cm&supmin;¹).
Pancratistatinpentaacetat wurde hergestellt, indem Pancratistatin (0,5 g) in entsprechender Weise wie zuvor 7- Desoxynarciclasin behandelt wurde. Das Produkt (0,5 g) wurde auf Sephadex LH-20 (100 g) unter Verwendung von Methanol/Methylenchlorid (3/2) als Eluiermittel chromotographiert, wobei das amorphe Pentaacetat eines Fp von 162-166º erhalten wurde. [α]²&sup9; + 85º (c 1.0, CHCl&sub3;); eims m/e 535 (M&spplus;,C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub5;NO&sub1;&sub3;); (log Σ) 227(4.31), 247(sh), 271(sh) und 299(3.75 nm);IR (KBr) max3370, 1760, 1680, 1635, 1510, 1490, 1375, 1340, 295, 1250, 1220, 1180, 1080, 1045, 950, 930, 860, 815, 758 und 640 cm&supmin;¹; ¹H NMR (90 MHz; CDCl&sub3;) δ 2.06 (6H, s), 2.08 (3H, s), 2.17 (3H, s), 2.37 (3H, s), 3.43 (1H, dd, J=12.3 und 2.5 Hz), 4.26 (1H, dd, J=12.5 und 11.7 Hz), 5.14 (1H, dd, J=11.7 und 3.3 Hz), 5.22 (1H, dd, J=2.9 und 2.9 Hz), 5.45 (1H, m), 5.56 (1H, m), 5.76 (1H, breites s, entfernt durch D&sub2;O), 6.08 (2H, breites s) und 6.48 (1H, s) ppm; ¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 170.08, 169.69, 169.07, 169.01, 168.29, 162.96, 152.60, 139.86, 134.53, 132.90, 116.20, 102.94, 101.84, 71.68, 67.69, 66.84, 66.42, 47.86, 40.00, 20.86 und 20.70 (die letzten beiden Signale 5C) ppm.
Elementaranalyse: berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub5;NO&sub1;&sub3;: C 53.83; H 4.67; N 2.62. Gefunden: C 53.75; H 4.68; N 2.61.
Pancratistatinmethylether erhielt man durch Umsetzen von Pancratistatin (0,33 g) in Methanol (100 ml) mit überschüssigem Diazomethan in Ether. Nach 8-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde weiteres Diazomethan zugegeben,worauf 8 h lang weitergerührt wurde. Beim Verdampfen des Lösungsmittels erhielt man ein Produkt (0,34 g), das auf Sephadex LH-20 unter Verwendung von Methanol als Eluiermittel chromotographiert wurde. Hierbei wurde der Methylether (0,1 g) erhalten. Beim Umkristallisieren aus Methanol erhielt man farblose Plättchen eines Fp von 294- 298º C (Zersetzung); [α]²&sup5; + 289.9º (c 0.69, DMSO); IR (KBr) max3500, 3400, 3300, 1635, 1600, 1485, 1450, 1390, 1343, 1298, 1226, 1207, 1152, 1122, 1090, 1060, 1035, 967, 937, 920, 880, 840, 795, 724, 660 und 620 cm&supmin;¹; ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) 3.58-4.44 (6H), 3.88 (3H, s), 4.70-5.50 (4H, entfernt durch D&sub2;O), 6.13 (2H, d, J=5 Hz), 6.74 (1H, s) und 6.92 (1H, entfernt durch D&sub2;O) ppm.
Elementaranalyse: berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub7;NO&sub8;: C 53.10; H 5.01; N 4.13; Gefunden: C 53.44; H 5.06; N 4.08.
Die Verabreichung von Pancratistatin und seiner pharmakologisch aktiven und physiologisch verträglichen Derivate eignet sich zur Behandlung von Tieren oder Menschen, die an neoplastischen Erkrankungen, beispielsweise akuter myelocytischer Leukämie, akuter lymphozytischer Leukämie, malignem Melanom, Adenokarzinom der Lunge, Neuroblastom, kleinzelligem Lungenkarzinom, Brustkarzinom, Darmkarzinom, Eierstockkarzinom, Blasenkarzinom und dgl., leiden.
Die zu verabreichende Dosis hängt von der Art der neoplastischen Erkrankung, der Art des befallenen Patienten einschließlich seines Alters, seiner Gesundheit und seinem Gewicht, der Art der gegebenenfalls durchgeführten begleitenden Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung und dem therapeutischen Verhältnis ab. Dosierungen für die aktiven Bestandteile sind beispielsweise: Intravenös 0,1 bis etwa 200 mg/kg; intramuskulär 1 bis etwa 500 mg/kg; oral 5 bis etwa 1000 mg/k; intranasales Einträufeln 5 bis etwa 1000 mg/kg und Aerosol 5 bis etwa 1000 mg/kg Patientenkörpergewicht.
Ausgedrückt als Konzentration kann der aktive Bestandteil in den erfindungsgemäßen Zubereitungen zum lokalen Gebrauch auf der Haut, zum intranasalen Gebrauch, zum Gebrauch im Hals/Nasen-Bereich, zum bronchialen, broncholialen, intravaginalen oder rektalen Einsatz oder zum Einsatz im Augenbereich in einer Menge von 0,01 bis etwa 50 Gew.-% der Zubereitung, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20 Gew.-% der Zubereitung, und zum parenteralen Gebrauch in einer Menge von etwa 0,05 bis etwa 50% g/v der Zubereitung, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 20% g/v vorhanden sein.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen werden vorzugsweise zur Verabreichung an Menschen und Tiere in Dosiereinheiten, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulvern, Granulaten, Suppositorien, sterilen parenteralen Lösungen oder Suspensionen, sterilen nicht-parenteralen Lösungen oder Suspensionen und oralen Lösungen oder Suspensionen und dgl. mit geeigneten Mengen an aktivem Bestandteil bereitgestellt.
Zur oralen Verabreichung können entweder feste oder fließfähige Dosiereinheiten hergestellt werden.
Pulver erhält man auf höchst einfache Weise durch Vermahlen des aktiven Bestandteils auf eine geeignete feine Größe und Vermischen mit einem in ähnlicher Weise zerkleinerten Verdünnungsmittel. Das Verdünnungsmittel kann aus einem eßbaren Kohlenhydratmaterial, z.B. Lactose oder Stärke, bestehen. Zweckmäßigerweise wird ein Süßungsmittel oder Zucker sowie ein Geschmacksöl verwendet.
Kapseln erhält man durch Zubereiten eines Pulvergemischs in der geschilderten Weise und Abfüllen desselben in ausgeformte Gelatinehüllen. Zweckmäßigerweise wird dem Pulvergemisch vor dem Abfüllen als Hilfsmittel für den Füllvorgang ein Gleitmittel, wie Talkum, Magnesiumstearat, Calciumstearat und dgl. zugesetzt.
Weichgelatinekapseln erhält man durch maschinelles Einkapseln einer Aufschlämmung der aktiven Bestandteile mit einem akzeptablen Pflanzenöl, heller flüssiger Vaseline oder einem sonstigen inerten Öl oder Triglycerid.
Tabletten erhält man durch Bereitstellen eines Pulvergemisches, Granulieren oder Zerkleinern desselben, Zugabe eines Gleitmittels und Verpressen des Ganzen zu Tabletten. Das Pulvergemisch erhält man durch Vermischen des aktiven Bestandteils, der in geeigneter Weise vermahlen wurde, mit einem Verdünnungsmittel oder einer Grundlage, wie Stärke, Lactose, Kaolin, Dicalciumphosphat und dgl.. Das Pulvergemisch kann durch Befeuchten mit einem Bindemittel, wie Maissirup, Gelatinelösung, Methylcelluloselösung oder Akazienschleim und Hindurchpressen durch ein Sieb granuliert werden. Als Alternative zum Granulieren kann das Pulvergemisch auch zerkleinert, beispielsweise durch die Tablettiervorrichtung laufengelassen werden, worauf die erhaltenen unvollständig ausgebildeten Tabletten zu Stücken (Rohlingen) gebrochen werden. Die Rohlinge können dann durch Zugabe von Stearinsäure, eines Stearinsäuresalzes von Talkum oder eines Mineralöls "geschmiert" werden, um ein Haftenbleiben an den Tablettierwerkzeugen zu verhindern. Das gleitfähig gemachte Gemisch wird dann zu Tabletten verpreßt.
Zweckmäßigerweise wird die Tablette mit einem Schutzüberzug in Form eines Versiegelungsüberzugs, oder mit einem enterischen Überzug aus Schellack, einem Überzug aus Zucker und Methylcellulose oder einem Polierüberzug aus Carnaubawachs versehen.
Es können fließfähige Dosiereinheiten zur oralen Verabreichung, wie Sirupe, Elixiere und Suspensionen, derart zubereitet werden, daß jeder Teelöffelvoll Zubereitung eine gegebene Menge an aktivem Bestandteil zur Verabreichung enthält. Die wasserlöslichen Formen lassen sich zusammen mit Zucker, Geschmackstoffen und Konservierungsmitteln zur Bildung eines Sirups in einem wäßrigen Träger lösen. Ein Elixier erhält man unter Verwendung eines wäßrigalkoholischen Trägers mit geeigneten Süßungsmitteln zusammen mit einem Geschmackstoff. Suspensionen erhält man aus den unlöslichen Formen mit einem geeigneten Träger mit Hilfe eines Suspendiermittels, wie Akaziengummi, Traganth, Methylcelullose und dgl..
Zur parenteralen Verabreichung lassen sich unter Verwendung eines aktiven Bestandteils und eines sterilen Trägers, vorzugsweise von Wasser, fließfähige Dosiereinheiten zubereiten. Der aktive Bestandteil kann je nach der benutzten Form und Konzentration in dem Träger entweder suspendiert oder gelöst werden. Bei der Zubereitung von Lösungen kann der wasserlösliche aktive Bestandteil in Wasser zu Injektionszwecken gelöst und vor dem Abfüllen in eine geeignete Phiole oder Ampulle und vor dem Versiegeln derselben filtrationssterilisiert werden. Zweckmäßigerweise können in dem Träger Hilfsmittel, wie Lokalanästhetika, Konservierungsmittel und Puffer gelöst werden. Parenterale Suspensionen erhält man im wesentlichen in derselben Weise, wobei ein aktiver Bestandteil, anstatt in dem Träger gelöst zu werden, in diesem suspendiert wird. In diesem Falle kann die Sterilisation nicht durch Filtrieren erfolgen. Der aktive Bestandteil läßt sich durch Einwirkenlassen von Ethylenoxid vor dem Suspendieren in dem sterilen Träger sterilisieren. Zweckmäßigerweise wird der Zubereitung ein oberflächenaktives Mittel oder Netzmittel einverleibt, um eine gleichmäßige Verteilung des aktiven Bestandteils zu erleichtern.
Neben einer oralen und parenteralen Verabreichung kann man sich auch rektaler und vaginaler Verabreichungswege bedienen. Ein aktiver Bestandteil kann mit Hilfe eines Suppositoriums verabreicht werden. Als Träger eignet sich ein solcher mit einem Fließpunkt bei etwa Körpertemperatur oder einer, der ohne weiteres löslich ist. Beispiele für geeignete Träger sind Kakaobutter und die verschiedensten Polyethylenglykole (Carbowachse).
Zum intranasalen Einträufeln werden fließfähige Dosiereinheiten mit einem aktiven Bestandteil und einem geeigneten pharmazeutischen Träger, vorzugsweise P.F. Wasser zubereitet. Wenn das Einblasen der Verabreichungsweg der Wahl ist, kann auch ein trockenes Pulver formuliert werden.
Zur Verwendung als Aerosol kann der aktive Bestandteil zusammen mit einem gasförmigen oder flüssigen Treibmittel, beispielsweise Dichlordifluormethan, Kohlendioxid, Stickstoff, Propan und dgl., (je nach Bedarf oder Wunsch) mit üblichen Hilfsmitteln, wie Colösungsmitteln und Netzmitteln, in einem unter Druck stehenden Aerosolbehälter untergebracht sein.
Der Ausdruck "Einheitsdosis" bezeichnet in der Beschreibung und den Ansprüchen physikalisch abgegrenzte Einheiten, die als Einheitsdosen an Mensch und Tier verabreicht werden können. Jede Einheit enthält eine gegebene Menge an aktivem Material in einer zur Herbeiführung dar gewünschten therapeutischen Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel berechnet wurde. Die Vorschriften für die neuen erfindungsgemäßen Dosiereinheiten werden diktiert und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Eigenschaften des aktiven Materials und der angestrebten speziellen therapeutischen Wirkung und (b) den dem mit der Formulierung eines aktiven Materials zu dem in dieser Beschreibung erläuterten therapeutischen Gebrauch bei Menschen befaßten Fachmann bekannten Beschränkungen. Beispiele für geeignete Dosiereinheiten gemäß der Erfindung sind Tabletten, Kapseln, Pastillen, Suppositorien, Pulverpäckchen, Waffeln, Oblatenkapseln, Teelöffelvoll, Eßlöffelvoll, Tropfervoll, Ampullen, Phiolen, unterteilte Mehrfache irgendeiner der genannten Darreichungsformen und sonstige beschriebene Darreichungsformen.
Die als antineoplastische Mittel zu verwendenden aktiven Bestandteile können unter Zuhilfenahme verfügbarer oder nach anerkannten Verfahren herstellbarer pharmazeutischer Mittel in derartigen Dosiereinheiten bereitgestellt werden. Die folgenden Zubereitungen veranschaulichen die Herstellung von Dosiereinheiten gemäß der Erfindung, ohne daß sie als Beschränkung angesehen werden sollen.

Beispiel 1

Unter Benutzung der vorliegenden Erfindung wurden verschiedene Dosiereinheiten hergestellt. Sie werden in den folgenden Beispielen erläutert. Der Ausdruck "aktiver Bestandteil" umfaßt Pancratistatin und 7-Desoxynarciclasin und deren nicht-toxische, pharmazeutisch aktive Derivate.

Zubereitung "A" Hartgelatinekapseln

Aus folgenden Arten und Mengen von Bestandteilen:
aktiver Bestandteil, mikronisiert 200 g
Maisstärke 20 g
Talkum 20 g
Magnesium Stearat 2g
werden 1000 doppelstückige Hartgelatinekapseln zur oralen Einnahme mit jeweils 200 mg an aktivem Bestandteil hergestellt.
Zu diesem Zweck wird der aktive Bestandteil nach feiner Zerteilung mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung zu den sonstigen feinpulverisierten Bestandteilen zugegeben, worauf das Ganze gründlich gemischt und dann in üblicher bekannter Weise eingekapselt wird.
Die erhaltenen Kapseln eignen sich zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung durch orale Einnahme einer oder von zwei Kapsel(n) ein- bis viermal pro Tag.
Nach den geschilderten Maßnahmen lassen sich in ähnlicher Weise auch Kapseln mit jeweils 50, 250 bzw. 500 mg an aktivem Bestandteil herstellen, indem man die Ausgangsmenge von 200 g an aktivem Bestandteil durch 50 g, 250 g bzw. 500 g an aktivem Bestandteil ersetzt.

Zubereitung "B" Weichgelatinekapseln

Es werden einstückige Weichgelatinekapseln zur oralen Einnahme mit jeweils 200 mg an aktivem Bestandteil hergestellt. Um den mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung fein zerteilten aktiven Bestandteil einkapselbar zu machen, wird er in 0,5 ml Maisöl suspendiert.
Die erhaltenen Kapseln eignen sich zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung durch orale Einnahme einer oder von zwei Kapsel(n) ein- bis viermal pro Tag.

Zubereitung "C" Tabletten

Aus folgenden Arten und Mengen von Bestandteilen:
aktiver Bestandteil, mikronisiert 200 g
Lactose 300 g
Maisstärke 50 g
Magnesiumstearat 4g
helle flüssige Vaseline 5g
werden 1000 Tabletten mit jeweils 200 mg an aktivem Bestandteil hergestellt.
Zu diesem Zweck wird der mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung fein zerteilte aktive Bestandteil zu den sonstigen Betandteilen zugegeben, worauf das Ganze gründlich gemischt und gebrochen wird. Die (hierbei erhaltenen) Rohlinge werden durch Hindurchpressen durch ein Sieb Nr. 16 noch weiter zerkleinert. Das hierbei erhaltene Granulat wird dann zu Tabletten mit jeweils 200 mg an aktivem Bestandteil verpreßt.
Die erhaltenen Tabletten eignen sich zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung durch orale Einnahme einer oder von zwei Tablette(n) ein- bis viermal pro Tag.
In der geschilderten Weise lassen sich auch bei Ersatz der 200 g an aktivem Bestandteil durch 250 g bzw. 100 g an aktivem Bestandteil Tabletten mit jeweils 250 mg bzw. 100 mg an aktivem Bestandteil herstellen.

Zubereitung "D" Orale Suspension

Aus folgenden Arten und Mengen von Bestandteilen:
aktiver Bestandteil, mikronisiert 10 g
Zitronensäure 2g
Benzoesäure 1g
Saccharose 790 g
Traganth 5g
Limonenöl 2g
mit entionisiertem Wasser aufgefüllt auf 1000 ml
werden 1000 ml einer wäßrigen Suspension zur oralen Einnahme mit jeweils 50 mg an aktivem Bestandteil pro Teelöffelvoll (5 ml) zubereitet.
Zu diesem Zweck werden die Zitronensäure, die Benzoesäure, die Saccharose, der Traganth und das Limonenöl in so viel Wasser suspendiert, daß 850 ml Suspension erhalten werden. Nun wird der mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung fein zerteilte aktive Bestandteil bis zur gleichmäßigen Verteilung in den Sirup eingerührt. Schließlich wird mit einer ausreichenden Menge Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.
Die Zubereitung eignet sich zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung in einer Dosis von 1 Eßlöffelvoll (15 ml) dreimal pro Tag.

Zubereitung "E" Parenterales Produkt

Aus folgenden Arten und Mengen an Bestandteilen:
aktiver Bestandteil, mikronisiert 30 g
Polysorbat 80 5g
Methylparaben 2,5 g
Propylparaben 0,17 g
mit Wasser zu Injektionszwecken aufgefüllt auf 1000 ml
wird eine sterile wäßrige Suspension zur parenteralen Injektion mit 300 mg an aktivem Bestandteil pro 1 ml zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung zubereitet.
Zu diesem Zweck werden sämtliche Bestandteile mit Ausnahme des aktiven Bestandteils in Wasser gelöst, worauf die Lösung filtrationssterilisiert wird. Der sterilen Lösung wird der sterilisierte, mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung fein zerteilte aktive Bestandteil zugegeben, worauf die fertige Suspension in sterile Phiolen abgefüllt und diesen versiegelt wird.
Die Zubereitung eignet sich zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung in einer Dosis von 1 ml (1 M) dreimal pro Tag.

Zubereitung "F" Suppositorien zum rektalen und vaginalen Gebrauch

Aus folgenden Arten und Mengen von Bestandteilen:
aktiver Bestandteil, mikronisiert 15 g
Propylenglycol 150 g
Polyethylenglycol 4000, aufgefüllt auf 2500 g
werden 1000 Suppositorien eines Gewichts von jeweils 2,5 g mit jeweils 200 mg an aktivem Bestandteil zubereitet.
Zu diesem Zweck wird zunächst der aktive Bestandteil mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung fein zerteilt, dann dem Propylenglykol zugesetzt und schließlich die erhaltene Mischung zur gleichmäßigen Dispersion durch eine Kolloidmühle laufengelassen. Nach dem Aufschmelzen des Polyethylenglykols wird diesem langsam unter Rühren die Propylenglycoldispersion einverleibt. Die Suspension wird in nichtgekühlte Formen bei 40ºC gefüllt. Nach dem Abkühlenlassen und Verfestigen der Zubereitung wird diese in Suppositorienform aus der Form entnommen. Jedes Suppositorium wird mit einer Folie umwickelt.
Die erhaltenen Suppositorien werden zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung rektal oder vaginal eingeführt.

Zubereitung "G" Intranasale Suspension

Aus folgenden Arten und Mengen von Bestandteilen:
aktiver Bestandteil, mikronisiert 15 g
Polysorbat 80 5g
Methylparaben 2,5 g
Propylparaben 0,17 g
mit entionisiertem Wasser aufgefüllt auf 1000 ml
werden 1000 ml einer sterilen wäßrigen Suspension zum internasalen Einträufeln mit jeweils 200 mg an aktivem Bestandteil pro ml zubereitet.
Zu diesem Zweck werden sämtliche Bestandteile mit Ausnahme des aktiven Bestandteils in Wasser gelöst, worauf die erhaltene Lösung filtrationssterilisiert wird. Der sterilen Lösung wird dann der mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung fein zerteilte und sterilisierte aktive Bestandteil einverleibt, worauf die fertige Suspension aseptisch in sterile Behälter abgefüllt wird.
Die erhaltene Zubereitung eignet sich zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung durch intranasales Einträufeln von 0,2 bis 0,5 ml ein- bis viermal pro Tag.
Ein aktiver Bestandteil kann auch, wie in den Beispielen 2 bis 4 gezeigt, in unverdünnter reiner Form zum lokalen Gebrauch auf der Cutis, zum intranasalen Gebrauch, zum Einsatz im Hals/Nasen/Rachen-Bereich oder zum bronchialen, broncholialen oder oralen Gebrauch vorhanden sein.

Zubereitung "H" Pulver

Fünf Gramm an aktivem Bestandteil in Form einer Masse werden mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung fein zerteilt. Das mikronisierte Pulver wird in einen Schüttelbehälter abgefüllt.
Diese Zubereitung eignet sich zur lokalen Behandlung einer neoplastischen Erkrankung durch ein- bis viermalige Applikation des Pulvers pro Tag.

Zubereitung "I" Orales Pulver

100 g an aktivem Bestandteil in Form einer Masse werden mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung fein zerteilt. Das mikronisierte Pulver wird in Einzeldosen von 200 mg unterteilt und abgepackt.
Die erhaltenen Pulver eignen sich zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung durch orale Einnahme einer Suspension von einer oder zwei Pulvermenge(n) in einem Glas Wasser ein- bis viermal pro Tag.

Zubereitung "J" Einblasen

100 g eines aktiven Bestandteils in Form einer Masse werden mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung fein zerteilt.
Die erhaltene Zubereitung eignet sich zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung durch Inhalieren von 300 mg einbis viermal pro Tag.

Zubereitung "H" Hartgelatinekapseln

Es werden 100 doppelstückige Hartgelatinekapseln zur oralen Einnahme mit jeweils 200 mg an aktivem Bestandteil zubereitet.
Zu diesem Zweck wird der aktive Bestandteil mit Hilfe einer Luftmikronisiervorrichtung fein zerteilt und in üblicher bekannter Weise eingekapselt.
Die erhaltenen Kapseln eignen sich zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung durch orale Einnahme einer oder von zwei Kapsel(n) ein- bis viermal pro Tag.
In der geschilderten Weise lassen sich unter Ersatz der 200 g an aktivem Bestandteil durch 50 g, 250 g bzw. 500 g an aktivem Bestandteil Kapseln mit 50, 250 bzw. 500 mg an aktivem Bestandteil herstellen.

Beispiel 2

Nach dem Protokoll 1 200 in "Cancer Chemotherapy Reports", Teil 3, Band 3, No. 2, September 1972, Seiten 9 ff werden in der jeweils gewählten Zubereitungsform bereitgestellte Dosiereinheiten von Pancratistatin auf lymphozytische Leukämie P388 getestet. Pancratistatin sorgte bei der lymphozytischen Mäuseleukämie P388 für eine 38-106%ige Lebensverlängerung bei 0,75-12,5 mg/kg Wirtkörpergewicht. Pancratistatin sorgte ferner für eine deutliche Hemmung des Wachstums der P388 in-vitro-Zellinie (ED&sub5;&sub0; = 0,001 ug/ml).

Beispiel 3

Nach akzeptierten Protokollen des National Cancer Institute wurden gemäß Beispiel 1 zubereitete Dosiereinheiten von 7- Desoxynarciclasin getestet. Die Zubereitung sorgte bei lymphozytischer Mäuseleukämie P388 für eine bis zu 61%ige Lebensverlängerung bei 12 mg/kg Wirtkörpergewicht. Die ED 50 gegen die P388-Zellinie betrug 0,02 ug/ml.

Beispiel 4

Eine gemäß Beispiel 1 zubereitete Dosiereinheit von Pancratistatin wurde gegen M5074 Mäuseeierstocksarcom eingesetzt. Im Rahmen des für eine Lebensverlängerung ausgearbeiteten National Cancer Institute-Protokolls wurde bei 0,38-3,0 mg an aktivem Bestandteil/kg Wirtkörpergewicht eine 53-84%ige Lebensver1ängerung erreicht.

Beispiel 5

Nach dem vom National Cancer Institute akzeptierten Protokoll für eine Heilungsrate wurde eine gemäß Beispiel 1 zubereitete Dosiereinheit von Pancratistatin gegen M5074 Mäuseeierstocksarcom getestet. Es wurde bei 6 mg/kg Wirtkörpergewicht eine 50%ige Heilungsrate erreicht.
Die vorherigen Ausführungen erhellen ohne weiteres, daß ein neuer und wertvoller antineoplastischer Faktor und neue und wertvolle antineoplastische Zubereitungen beschrieben und veranschaulicht wurden. Auf diese Weise erhält man neue Mittel zur Hemmung oder Remission einer oder mehrerer Art(en) von Krebs. Ferner werden Verfahren und Maßnahmen zur Isolierung antineoplastischer Substanzen aus Pflanzenleben in einer Form, in der sie ohne weiteres in höchst brauchbarer Weise bei der therapeutischen Behandlung und Beherrschung einer oder mehrerer bei Menschen vorkommenden Krebsart(en) eingesetzt werden können, geschaffen. Schließlich werden auch Mittel und Verfahren zur Zubereitung wertvoller Arzneimittel bzw. Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen zur Behandlung und Beherrschung von Krebs geschaffen. Diese Arzeimittel bzw. Zubereitungen enthalten als ihren wesentlichen aktiven Bestandteil einen aus Pancratium littorale Jacq. und Zephrantes grandiflora extrahierten Faktor oder ein nicht-toxisches pharmakologisch aktives Derivat desselben.

Claims

1. Verbindung der Strukturformel (I)

worin R bis R&sub4; jeweils H bedeuten, oder ein antineoplastisches Derivat derselben, bei dem jede -OH-Gruppe mit einer Acylgruppe verestert ist, oder worin R = -CH&sub3; und R&sub1; bis R&sub4; Wasserstoff darstellen.

2. Pharmazeutische Zubereitung mit einer wirksamen Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 und einem Verdünnungsmittel.

3. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2, zusätzlich enthaltend eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel (II):

worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; jeweils unabhängig voneinander für H oder COCH&sub3; stehen, oder ein antineoplastisches Derivat hiervon, bei welchem jede -OH-Gruppe mit einer Acylgruppe verestert ist.

4. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Verbindung der Formel (II) R&sub1; = R&sub2; = R&sub3; = H.

5. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament.

6. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach einem der Ansprüche 2 bis 4 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines an einer neoplastischen Erkrankung leidenden Wirts.

7. Verwendung nach Anspruch 6, bei welcher das Medikament zur intravenösen Verabreichung in einer Dosis von 0,1 bis etwa 200 mg/kg Wirtkörpergewicht vorgesehen ist.

8. Verwendung nach Anspruch 6, bei welcher das Medikament zur subkutanen Verabreichung in einer Dosis von etwa 1 bis etwa 500 mg/kg Wirtkörpergewicht vorgesehen ist.

9. Verwendung nach Anspruch 6, bei welcher das Medikament zur oralen Verabreichung in einer Dosis von etwa 5 bis etwa 1000 mg/kg Wirtkörpergewicht vorgesehen ist.