JP2018513848A - 生物学的組成物の精製方法及びそのための物品 - Google Patents

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Abstract

生物学的組成物の精製方法は、容器の混合体積内に、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバー及び生物学的組成物を配置するステップと、生物学的組成物及びカチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーを、それらが混合体積内で互いに緊密に接触して、改質されたファイバー及び精製された生物学的組成物が提供されるまでの間、撹拌するステップと、改質されたファイバー、及び接触している、カチオン性リガンドで官能化した任意のルーズ・ステープル・ファイバーから、精製された生物学的組成物の少なくとも一部を分離するステップと、を含む。カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、カチオン化可能なモノマー単位を１０〜１００重量％含むグラフト化アクリル系ポリマーを含む改質表面層を有する。生物学的組成物を精製するための物品は、内部に配置された混合体積を有する容器と、混合体積内に配置された、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーと、を含む。【選択図】図１

Description

発明の詳細な説明
［技術分野］
本開示は、官能化したルーズ・ステープル・ファイバーを使用して生物学的組成物を精製するための方法及び物品を広く記載する。
［背景］
ウイルス及び生体高分子（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質及び核酸といった生体細胞の構成成分又は生成物を含む）などの標的生体物質の検出、定量、単離及び精製は、長年にわたり研究者の課題となっている。検出及び定量は、診断上、例えば、様々な生理的条件（例えば、疾患）の指標として重要である。生体高分子の単離及び精製は、治療及び生物医学研究に重要である。例えば、化学反応を触媒することができる特殊な種類のタンパク質である酵素などの生体高分子も産業上有用である。酵素は、単離され、精製された後、甘味料、抗生物質及び様々な有機化合物、例えば、エタノール、酢酸、リジン、アスパラギン酸及び生物学的に有用な生成物（例えば、抗体及びステロイド）の製造に利用されてきた。
天然状態（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ）において、これらの生体高分子の構造及び対応する生物活性は、一般的にｐＨ及びイオン強度のかなり狭い範囲内で維持される。したがって、あらゆる分離及び精製操作は、処理した生体高分子に最終的に効能をもたせるよう、このような因子を考慮する必要がある。
クロマトグラフ分離及び精製操作は、気体又は液体であり得る移動相と、固定相との間の溶質の交換に基づいて生体生成物混合物に対して行うことができる。各溶質と固定相との結合相互作用は様々であることから、溶液混合物の様々な溶質の分離が達成され、すなわち、一般的に、移動相の解離又は置換の効果を受けたときに、結合相互作用が強いものほど、相互作用強度の弱い溶質と比べて保持時間が長くなり、このような方法で分離及び精製が達成され得る。生物学的組成物の精製にはカラムクロマトグラフィーが使用されてきたが、この手法は、通常、低スループット率、カラム充填におけるチャネリング、及び／又は高コストが課題となっている。
高分子樹脂は、様々な目的化合物の分離及び精製に関して知られている。例えば、高分子樹脂は、イオン基の存在に基づいて、目的化合物の大きさに基づいて、疎水性相互作用に基づいて、親和性相互作用に基づいて又は共有結合の形成に基づいて、目的化合物を精製又は分離するために用いられる。近年では、生物学的組成物を精製する際の補助として、基材上にかかるポリマーコーティングを有するリガンド官能化基材が開発されており、例えば、米国特許第８，３７７，６７２（Ｂ２）号（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）及び同第８，４３５，７７６（Ｂ２）号（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。
［概要］
上記のＲａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．の２件の特許は、濾過プロセスを介して生物学的組成物を精製するための、リガンドで官能化した布を使用し得るものであり、このプロセスは、布の細孔に細胞片などが堆積し、目詰まりを起こすことにより速度が低下する場合がある。
有利に、本発明者らは、リガンドで官能化した布の代わりに、リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーを使用する、簡単で高速な精製方法を発見した。
一態様では、本開示は、生物学的組成物の精製方法を提供し、方法は：
ａ）容器の混合体積内に、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバー及び生物学的組成物を配置するステップであって、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーが、カチオン化可能なモノマー単位を１０〜１００重量％含むグラフト化アクリル系ポリマーを含む改質表面層を有する、ステップと、
ｂ）生物学的組成物及びカチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーを、それらが混合体積内で互いに緊密に接触して、改質されたファイバー及び精製された生物学的組成物が提供されるまでの間、撹拌するステップと、
ｃ）改質されたファイバー、及び接触している、カチオン性リガンドで官能化した任意のルーズ・ステープル・ファイバーから、精製された生物学的組成物の少なくとも一部を分離するステップと、を含む。
別の態様では、本開示は、生物学的組成物を精製するための物品を提供する。
物品は、内部に配置された混合体積を有する標本採取容器と、混合体積内に配置された、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーと、を含み、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、少なくとも１種のカチオン化可能なモノマー単位を１０〜１００重量％含むグラフト化アクリル系ポリマーを含む改質表面層を有する。
有利に、及び予想外なことに、本開示によるカチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーを使用して生物学的組成物を精製する方法、及びかかる方法を利用する物品は、類似した官能化基材を包含する従来法と比較して、生物学的組成物の構成成分を除去／単離する精製時間を劇的に短縮することができる。
以下の定義は、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて適用される。
用語「アクリル系ポリマー」は、次式により独立して表されるモノマー単位を少なくとも１０重量％（好ましくは少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、又は更には少なくとも８０重量％）含有するポリマーを指す。
Figure 2018513848
［式中、Ｒは、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有する、好ましくは１個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
Ｘは、アルコール残基又はアミン残基を表す。］
用語「生物学的組成物」は、生体由来の巨大分子を含有する任意の組成物を指す。組成物は、生体由来のものだけである必要はない。例としては、抗体、細胞、炭水化物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びウイルスが挙げられる。
用語「カチオン性リガンドで官能化した」は、それに結合した（例えば、間接的又は直接的に共有結合した）官能基を有することを意味し、ここで、官能基は、例えば、第四級アンモニウム基の場合のように永続的にカチオン性であるか、あるいは基は、ｐＨ５．０〜８．０を有する水中で実質的にプロトン化されるに足るような塩基性である。例えば、好適なこのような塩基性基としては、水中、プロトン化されたカチオン形態で、少なくとも９、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１２．５のｐＫａを有する基が挙げられる。
用語「カチオン化可能」は、水中で電離（例えば、オニウム塩の場合）により、及び／又は水によるプロトン化（例えば、アミン又はグアニジンの場合のように）により有機カチオンを形成することができることを意味する。
用語「イオン性」は、水中で（例えば、標準温度及び標準圧力にて）自然にプロトンを結合してカチオン種を形成可能であることを意味する。
用語「（メタ）アクリル」は、「アクリル及び／又はメタクリル」を意味する。そのため、メチル（メタ）アクリレートは、メチルアクリレート及び／又はメチルメタクリレートを意味する。
用語「非イオン性」は、水中で（例えば、標準温度及び標準圧力にて）ブレンステッド酸又は塩基として自然に機能することが実質的に不可能であること、あるいはイオン種に解離することが実質的に不可能であることを意味する（不可能であることを含む）。
用語「精製」は、純度を高めることを意味するが、別途記載のない限り、必ずしも純粋な状態での単離を意味するものではない。
本開示の特徴及び利点は、「詳細な説明」及び添付された「特許請求の範囲」を考慮することで、更に理解される。
本開示による例示的な物品１００の概略断面図である。 本開示による方法の例示的な実施形態の模式的プロセス・フローチャートである。 本開示の原理の範囲及び趣旨に含まれる他の多くの改変形態及び実施形態が当業者によって考案され得ることは理解されるべきである。図面は、縮尺どおりに描かれていない場合がある。
［詳細な説明］
本開示は、容器の混合体積内で、生物学的組成物と緊密に接触させて配置された、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーを利用する、生物学的組成物の精製方法に関する。本開示による方法及び物品は、中性付近又は陰性に帯電した、例えば、生物学的組成物に由来する宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、及びその他の微生物などといった生体材料を、除去及び／又は単離するための、特に高イオン強度の媒体への使用に好適である。カチオン性リガンドで官能化したステープル・ファイバーに一旦結合すれば、生物学的組成物の負に帯電している構成成分は、例えば、多孔質スクリム又は他の基材上でファイバーを回収するなどといった、簡単な分離法により除去できる。
カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、第一にステープル・ファイバーであり、すなわち、それらは連続的なファイバーではない。好ましくは、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、０．１ｍｍ〜２ｃｍ、好ましくは０．３ｍｍ〜５ｍｍ、より好ましくは０．５ｍｍ〜３ｍｍの長さを有するものであるが、他の長さを用いることもできる。カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、例えば、捲縮されていてよく、あるいは捲縮及び／又はフィブリル化されていなくてもよい。
本明細書において、ステープル・ファイバーを指して使用するとき、用語「ルーズ」は、ファイバーが、紙、布、又は撚りをかけたフィラメント束（例えば、縫い糸（thread）、編み糸（yarn）、又は紐）に成形されていないことを意味する。しかしながら、ファイバーは、一緒に集塊化（clumped）されてもよいが、これは典型的には好ましさに劣る。
カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、既知の方法によりファイバーにアクリル系ポリマーをグラフト化することにより調製できる。アクリル系ポリマーは、少なくとも１種のアクリル系モノマーの、任意選択的には、アクリル系モノマーではない少なくとも１種のフリーラジカル重合性モノマーとの重合により作製され得る。フリーラジカル重合性多官能性（例えば、フリーラジカル重合性基を２つ以上有する）モノマーも含めることができる。多官能性モノマーは、フリーラジカル重合性基を少なくとも２つ有するモノマーであってよく、あるいはフリーラジカル重合性基を１つと、重合以降のステップで反応し得る別の重合性基（例えば、エポキシ基）とを有するものであってよい。
フリーラジカル重合性アクリル系モノマーの例としては、ヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、イソノニル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、オクタデシル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、並びにＮ−ビニル化合物、例えば、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、及びＮ−ビニルカプロラクタムが挙げられる。アクリル酸、メタクリル酸、及び（メタ）アクリルアミドプロピルスルホン酸などの酸性モノマーも使用できるが、これらのモノマーはカチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーの性能に干渉する傾向をもつ恐れがあり、及び／又はファイバーを集塊化させる恐れがあるので、使用する場合、典型的には注意深く使用する必要があるが、この使用は必須ではない。より親水性又は水溶性であるモノマーは、カチオン化可能な基を含有するアクリル系モノマーに適合性又は溶解性であることから、いくつかの実施形態では好ましい場合がある。
アクリル系モノマーではないフリーラジカル重合性モノマーの例としては、例えば、エチレン、プロピレン、イソブチレン、ヘキセン、イソオクテン、スチレン、フルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、テトラフルオロエチレン、ビニリデンジフルオリド、クロロフルオロエチレン、クロロトリフルオロエチレン、及びジクロロエチレンといったハロゲン化アルケンなどのアルケンが挙げられる。アリルモノマーも使用され得る。例としては、アリルエーテル（例えば、アリルエチルエーテル及びアリルブチルエーテル）、Ｎ−アリルアミド（例えば、Ｎ−アリルアセトアミド及びＮ−アリルホルムアミド）、及びアリルエステル（例えば、酢酸アリル、安息香酸アリル、及びプロピオン酸アリル）が挙げられる。
一実施形態では、有用なフリーラジカル重合性非アクリル系モノマーは、カチオン化可能な基を含有し得る。このような場合、グラフト化アクリル系ポリマーの形成には、カチオン化可能な基を有するアクリル系モノマーが必要とされない。
このようなフリーラジカル重合性非アクリル系モノマーの例としては、次式により表されるものが挙げられる。
Figure 2018513848
［式中、Ｒ１は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル）であり、及びＺ−は、非干渉性アニオン（例えば、カチオン性リガンドで官能化したステープル・ファイバーの凝集を生じないアニオン、あるいは生物学的組成物を酸化させる第四級窒素原子に強く結合するアニオン）であり、好ましくは−１、−２、又は−３、より好ましくは−１の電荷を有する。］好ましい非干渉性アニオンとしては、塩化物及び臭化物が挙げられる。
フリーラジカル重合性多官能性モノマーの例としては、グリシジル（メタ）アクリレート、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ビス（メタ）アクリロイルピペラジン、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、アルコキシル化脂肪族ジ（メタ）アクリレート、アルコキシル化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート、アルコキシル化ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、アルコキシル化ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、カプロラクトン変性ネオペンチルグリコールヒドロキシピバレートジ（メタ）アクリレート、カプロラクトン変性ネオペンチルグリコールヒドロキシピバレートジ（メタ）アクリレート、シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、エトキシル化（１０）ビスフェノールＡジ（メタ）アクリレート、エトキシル化（３）ビスフェノールＡジ（メタ）アクリレート、エトキシル化（３０）ビスフェノールＡジ（メタ）アクリレート、エトキシル化（４）ビスフェノールＡジ（メタ）アクリレート、ヒドロキシピバルアルデヒド変性トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（２００）ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（４００）ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（６００）ジ（メタ）アクリレート、プロポキシル化ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート；トリ（メタ）（メタ）アクリレート、例えば、グリセロールトリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エトキシル化トリ（メタ）アクリレート（例えば、エトキシル化（３）トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エトキシル化（６）トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エトキシル化（９）トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エトキシル化（２０）トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート）、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、プロポキシル化トリ（メタ）アクリレート（例えば、プロポキシル化（３）グリセロールトリ（メタ）アクリレート、プロポキシル化（５．５）グリセロールトリ（メタ）アクリレート、プロポキシル化（３）トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、プロポキシル化（６）トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート）、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、トリス（２−ヒドロキシエチル）イソシアヌレートトリ（メタ）アクリレート；及び高官能性（メタ）アクリル含有化合物、例えば、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、エトキシル化（４）ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、カプロラクトン変性ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート、並びにこれらの組み合わせなどが挙げられる。先と同様、適合性又は相溶性の理由から、親水性又は水溶性多官能性モノマーが好ましい。
含める場合、多官能性モノマーの量は、典型的には、グラフト化アクリル系ポリマーの作製に使用されるフリーラジカル重合性モノマーの５重量％未満、好ましくは２重量％未満、より好ましくは１重量％未満である。しかしながら、これは必須ではない。
好適なファイバーとしては、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、スチレン−ブタジエンコポリマー、ポリスチレン、及びポリイソブチレン、並びにこれらの組み合わせ）などの合成ポリマー；フルオロ化ポリマー（例えば、ビニリデンジフルオリド、ビニルフルオリド、テトラフルオロエチレン、クロロトリフルオロエチレン、これらの組み合わせのホモポリマー及びコポリマー、並びに前述のものとポリエチレン及び／又はポリプロピレンとのコポリマー）；塩素化ポリマー（例えば、ポリ二塩化ビニリデン、ポリクロロプレン、及びポリ塩化ビニル）；ポリエステル（例えば、ポリカプロラクトン及びポリエチレンテレフタレート）；ポリアミド（例えば、ナイロン−６，６及びナイロン６）；酢酸ビニルホモポリマー及びコポリマー（例えば、エチレンとの）、及びそれらの加水分解された誘導体（例えば、ポリ（ビニルアルコール））；ポリエーテルスルホン；並びにポリイミドを含むファイバーが挙げられる。好ましい合成ファイバーの１つは、フィブリル化した高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）；例えば、ＭｉｎｉＦｉｂｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｉｔｙ，Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）からＳＨＯＲＴ ＳＴＵＦＦ ＦＩＢＲＩＬＬＡＴＥＤ ＨＤＰＥとして市販されているフィブリル化ＨＤＰＥファイバー（例えば、グレードＥＳＳ２Ｆ、ＥＳＳ５Ｆ、ＥＳＳ５０Ｆ、Ｅ３８０Ｆ、Ｅ５０５Ｆ、Ｅ７８０Ｆ、Ｅ９９０Ｆ）である。有用な中性ファイバーとしては、レーヨン、セルロース、綿、リネン、キトサン、及びスターチが挙げられる。
ファイバーは、カチオン化可能なモノマー単位を１０〜１００重量％含むアクリル系ポリマーをその表面にグラフト化することにより表面改質される。アクリル系ポリマーをグラフト化する手法は、ファイバーにイオン化放射線（例えば、ガンマ線又は電子ビーム線）を当てるステップと、次いでファイバーを、アクリル系モノマーを含むフリーラジカル重合性モノマーと接触させるステップと、を含み得るものであり、ここで全プロセスは、無酸素環境で実施される。かかるプロセスの実施方法の詳細は、数多くの特許に記載されている。例としては、米国特許第８，３７７，６７２号（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）、同第８，６５２，５８２号（Ｂｏｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．）、同第８，５５１，８９４号（Ｓｅｓｈａｄｒｉ ｅｔ ａｌ．）、同第８，３２８，０２３号（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．）、及び同第８，３２９，０３４号（Ｗａｌｌｅｒ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．）が挙げられる。アクリル系モノマーのグラフト化は、国際公開第２０１３／１８４３６６（Ａ１）号（Ｂｏｔｈｏｆ，ｅｔ ａｌ．）に記載のものなどのＩＩ型の光開始剤の存在下での紫外線照射を包含し得る。
カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、グラフト化アクリル系ポリマーを含む、改質表面層を有する。グラフト化アクリル系ポリマーは、カチオン化可能なモノマー単位を１０〜１００重量％含む。例えば、グラフト化アクリル系ポリマーは、カチオン化可能なモノマー単位を、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、又は少なくとも５０重量％〜６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、又は更には１００重量％含有し得る。任意のカチオン化可能なモノマー単位を使用できる。好ましい例としては、次式（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかにより表される二価のモノマー単位が挙げられる。
Figure 2018513848
Figure 2018513848
Figure 2018513848
Ｒ１は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル）を表す。好ましくは、Ｒ１は、Ｈ又はメチルである。
Ｒ２は、カテナリーカルボニルオキシ、カルボニルアミノ、オキシカルボニルアミノ、又はウレイレン二価結合基で任意に置換された二価のアルキレン基を表す。好ましくは、Ｒ２は、２〜１２個の炭素原子、より好ましくは２〜６個の炭素原子、より好ましくは２〜４個の炭素原子を有する。
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル）を表す。好ましくは、Ｒ３は、Ｈ、メチル、又はエチルである。
Ｒ４は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル）、又は−Ｎ（Ｒ３）２を表し、Ｒ３は上記に定義のとおりのものである。好ましくは、Ｒ４は、Ｈ、メチル、又はエチルである。
Ｘ１は、−Ｏ−又は−ＮＲ３−を表し、Ｒ３は上記に定義のとおりのものである。
好ましい例としては、次式（Ｄ）又は（Ｅ）により表される二価のモノマー単位も挙げられる。
Figure 2018513848
Figure 2018513848
［式中、Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、又はＣ５〜Ｃ１２（ヘテロ）アリールであり；
Ｒ６は、共有結合、Ｃ２〜Ｃ１２アルキレン、Ｃ５〜Ｃ１２（ヘテロ）アリーレン、
Figure 2018513848
であり；
各Ｒ７は、独立して、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、又はＣ５〜Ｃ１２（ヘテロ）アリールであり、好ましくはＨ又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ５〜Ｃ１２（ヘテロ）アリール、又は−Ｎ（Ｒ７）２であり、好ましくはＨ又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ９は、Ｃ２〜Ｃ１２アルキレン又はＣ５〜Ｃ１２（ヘテロ）アリーレンであり；
Ｘ２は、−Ｏ−又は−ＮＲ７−であり；
Ｒ１０は、Ｃ２〜Ｃ１２アルキレンであり；
Ｒ１１は、Ｈ又はメチルである。］
二価モノマー単位及びその調製方法についての更なる詳細は、米国特許第８，３７７，６７２号（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）に見出すことができる。
モノマー単位（Ａ）及び（Ｂ）は、相当するモノマーの重合により、あるいは前駆ポリマー（例えば、アルケニルアズラクトンを含むモノマーから作製されたポリマー）のアズラクトン基などといったペンダント反応基と、例えば、一級又は二級アミノアルキル官能性グアニジン又はアグマチン化合物との反応により簡便に生成され得る。モノマー単位（Ａ）及び（Ｂ）の生成に適したモノマー及び方法は、例えば、米国特許第８，３７７，６７２号（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）、同第８，６５２，５８２号（Ｂｏｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．）、及び国際公開第２０１４／２０４７６３（Ａ１）号（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．）に記載されている。
モノマー単位（Ｃ）の生成に好適なモノマーの例としては、Ｎ−（３−トリメチルアンモニオプロピル）アクリルアミド；２−トリメチルアンモニオエチルメタクリレート；２−トリメチルアンモニオエチルアクリレート；Ｎ−（３−トリメチルアンモニオプロピル）メタクリルアミド；Ｎ−（６−トリメチルアンモニオヘキシル）アクリルアミド；及びＮ−（３−トリメチルアンモニオプロピル）アクリルアミドの塩類（例えば、塩化物塩又は臭化物塩）が挙げられる。モノマー単位（Ｃ）の生成に適したモノマー及び方法は、例えば、米国特許第６，００７，８０３号（Ｍａｎｄｅｖｉｌｌｅ，ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．）及び２０１４年９月２５日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５７３８８に見出すことができる。カチオン性モノマー単位（Ｃ）は、好ましくは前述に定義されたとおり、非干渉性アニオンＺ−と対になっている。
カチオン化可能なモノマー単位は、例えば、カチオン化可能な基を有する、対応するモノマーのフリーラジカル重合（例えば、単独重合又は共重合）の結果として、あるいは以降の反応においてカチオン化可能な基で官能化されている前駆モノマーの重合（例えば、単独重合又は共重合）により、生成され得る。
グラフト化アクリル系ポリマーは、少なくとも１種の非イオン性親水性モノマー単位を、０．１〜９０重量％更に含んでよく、あるいは全く含有しなくてもよい。例えば、グラフト化アクリル系ポリマーは、少なくとも１種の非イオン性親水性モノマー単位を、少なくとも１重量％、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、又は少なくとも２５重量％〜３０重量％、４０重量％、５０重量％、７５重量％、又は９０重量％含有し得る。いくつかの実施形態では、非イオン性親水性モノマー単位は、以下に示すとおり炭素原子を５〜７個有するＮ−ビニルラクタムの二価の残基を含む［式中、ｎは、１、２、又は３である。］。
Figure 2018513848
このようなモノマー単位は、グラフト化アクリル系ポリマーを調製するために重合されるモノマーに、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルバレロラクタム、及び／又はＮ−ビニルカプロラクタムを含めることによって、容易に導入され得る。
いくつかの実施形態では、非イオン性親水性モノマー単位は、以下に示すとおりのポリエーテル（メタ）アクリレートの二価の残基を含み、式中、Ｒ１及びＲ３は、上記に定義されたとおりのものであり、ｗは２以上の整数である。
Figure 2018513848
このようなモノマー単位は、グラフト化アクリル系ポリマーを調製するために重合されるモノマーに、ポリエーテル（メタ）アクリレートを含めることによって、容易に導入され得る。このようなモノマーの作製方法は当該技術分野で周知であり、多くのものは市販されている。例としては、全てＳａｒｔｏｍｅｒ Ｃｏ．（Ｅｘｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から市販の２−（２−エトキシエトキシ）エチルアクリレート、メトキシポリエチレングリコール（３５０）モノアクリレート、メトキシポリエチレングリコール（３５０）モノメタクリレート、メトキシポリエチレングリコール（５５０）モノアクリレート、及びメトキシポリエチレングリコール（５５０）モノメタクリレートが挙げられる。
任意選択的に、生物学的組成物は、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーと組み合わせる前に（又は組み合わせるのと同時に）、生物学的組成物の構成成分の一部を凝集させる、水溶性高分子凝集剤で前処理され得る。好適な凝集剤の例としては、カチオン性リガンドで官能化した合成ポリマー、例えば、米国特許第８，３７７，６７２号（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）及び同第８，４３５，７７６号（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）に開示のものが挙げられる。
好適な容器は、少なくとも１つの混合体積（例えば、チャンバ）を備える。容器の例としては、標本収集チューブ及びバッグ（好ましくはシールされた標本収集チューブ及びバッグ）、ドレーンを備えた混合容器、フラスコ、ビーカー、バレル、バッグ、槽、管型流通反応器、スタティックミキサー、及びタンクが挙げられる。いくつかの実施形態では、容器は、密封及び／又はシールされる（例えば、ゴム製セプタム／ストッパー又は蓋により）。好適な容器は、例えば、使い捨て又は再使用可能なものであってよい。撹拌装置（例えば、パドル、撹拌機、プロペラ、又は撹拌子）を混合容器と組み合わせて使用して、撹拌を促進することもできる。
スタティックミキサー（例えば、図２に概略的に示すとおり）は、例えば、Ｋｏｆｌｏ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｙ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）及びＣｈａｒｌｅｓ Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｓｏｎ Ｃｏ．（Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）などの様々な供給元から市販されている。いくつかの実施形態では、容器には、バルブ（例えば、コック栓）の開閉により操作可能なドレーンが取り付けられる。これは、手作業では容易に取り扱うことのできない大型の容器の場合に特に有用であり得る。
ここで図１を参照すると、生物学的組成物を精製する例示的な物品１００は、内部に配置された混合体積１１５を有する容器１１０を含む。本開示による、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバー１２０は、混合体積１１５内に配置される。任意選択的なカバー１３０（例えば、ゴム製セプタム、樹脂製プレスフィット・トップ（press-fit top）、又はねじ蓋）と容器１００とが共に混合体積１１５を囲む。任意選択的に、合成高分子凝集剤粒子１８０を存在させてもよい。
使用時において、生物学的組成物（図示せず）は混合体積内に配置され、ファイバー１２０及び生物学的組成物は緊密に接触するまで撹拌される。任意選択的なバルブ１５０を開栓することで、精製した生物学的組成物が多孔質基材１４０を通って排出され、任意選択的な排出口１６０を通過させることができる。
本開示による方法を実施する際の実施形態の一例を図２に示す。ここで、図２を参照すると、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバー１２０が、溶解された合成ポリマー凝集剤を任意に含有する流体２２５（例えば、生理食塩水又は水）に懸濁され、生物学的組成物２１０と組み合わせられて、スタティックミキサー２２０内を通過する。多孔性フィルタ２３０により粒子状材料及びファイバー材料を除去し、精製された生物学的組成物２４０を多孔性フィルタ２３０に通過させ回収する。
カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、生物学的組成物を容器の混合チャンバ内に配置する前、後、又は配置すると同時に混合チャンバ内に配置されてよい。
混合容器内で組み合わせられたら、生物学的組成物及びカチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、混合チャンバ内で互いに緊密に接触するまで撹拌され、これによりファイバーが改質され（すなわち、生物学的組成物由来のなんらかの物質（複数可）が結合する）、生物学的組成物が精製される。好適な混合方法としては、例えば、手動振盪、実験用撹拌機、機械的及び／又は磁気撹拌子、並びにスタティックミキサー内の通過が挙げられる。撹拌は、生体化合物をファイバーに効果的に結合させるのに十分な任意の時間長にわたって実施することができる。いくつかの実施形態では、撹拌は、好ましくは６０秒未満、４５秒未満、又は更には３０秒未満である。他の実施形態では、撹拌は、例えば、２０分程度又はそれ以上の長さであってよい。
改質されたファイバーからの、精製された生物学的組成物の分離は、例えば、遠心分離、デカント、濾過、及びふるい分けなどのなんらかの好適な手法により実施され得る。特に好ましい一実施形態では、撹拌後の混合チャンバの内容物が多孔質基材（例えば、多孔質スクリム、多孔質膜、多孔質不織布、又はメッシュ）を通して輸送されると、多孔質基材を通過しなかったファイバーが、基材の上流に配置されたファイバーからなる多孔質マットを形成し、これにより、精製された生物学的組成物中に残存している粒子状残渣が機械的に除去され得る。例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、金属、及びガラスを多孔性基材の材料として使用することができる。
典型的な多孔性基材は、多孔性基材を通る流体の流れを過度に妨げることなく、改質されたファイバーの効率的な回収を達成するために、約０．５ｍｍ〜約０．５ｃｍの開口部／細孔部を有するが、他の開口／細孔径を使用することもできる。
いくつかの実施形態では、流体から除去される生物学的分子種が精製の対象となる。例えば、組み換えタンパク質又は酵素を細胞培養で調製することができ、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーを添加してタンパク質又は酵素を凝集させることができ、タンパク質又は酵素の精製プロセスにおける第１ステップとしてその沈殿物を分離することができる。別の実施例では、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーを使用して、微生物の濃縮、計数及び／又は同定プロセスにおける第１のステップとして、流体から微生物を捕捉することもできる。
他の実施形態では、流体から除去される生物学的分子種は、流体を更に加工するステップに先立ち除去する必要のある夾雑物である。
したがって、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、例えば、細胞培養物又は発酵ブロスなどの生物学的組成物由来の細胞及び細胞残渣に結合させて、かかる細胞及び細胞残渣の除去を促進するのに使用できる。かかるルーズ・ステープル・ファイバーは、溶液から所望の又は夾雑するタンパク質又は核酸を沈殿させるために使用することもできる。有意に、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、高塩濃度又は高イオン強度の条件下で有用である。
［本開示の選択的な実施形態］
第１の実施形態では、本開示は、生物学的組成物の精製方法を提供し、方法は、
ａ）容器の混合体積内に、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバー及び生物学的組成物を配置するステップであって、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーが、カチオン化可能なモノマー単位を１０〜１００重量％含むグラフト化アクリル系ポリマーを含む改質表面層を有する、ステップと、
ｂ）生物学的組成物及びカチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーを、それらが混合体積内で互いに緊密に接触して、改質されたファイバー及び精製された生物学的組成物が提供されるまでの間、撹拌するステップと、
ｃ）改質されたファイバー、及び接触している、カチオン性リガンドで官能化した任意のルーズ・ステープル・ファイバーから、精製された生物学的組成物の少なくとも一部を分離するステップと、を含む。
第２の実施形態では、本開示は、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーが、生物学的組成物が混合体積内に配置される前に混合体積内に配置される、第１の実施形態による方法を提供する。
第３の実施形態では、本開示は、ステップｂ）が、少なくとも部分的にスタティックミキサーを使用して実施される、第１又は２の実施形態による方法を提供する。
第４の実施形態では、本開示は、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーの少なくとも一部がフィブリル化されている、第１〜３の実施形態のいずれか１つによる方法を提供する。
第５の実施形態では、本開示は、生物学的組成物が合成高分子凝集剤を含有する、第１〜４の実施形態のいずれか１つによる方法を提供する。
第６の実施形態では、本開示は、グラフト化アクリル系ポリマーが、多官能性モノマー単位を更に含む、第５の実施形態による方法を提供する。
第７の実施形態では、本開示は、グラフト化アクリル系ポリマーが、少なくとも１種の非イオン性親水性モノマー単位を０．１〜９０重量％更に含む、第１〜６の実施形態のいずれか１つによる方法を提供する。
第８の実施形態では、本開示は、非イオン性親水性モノマー単位が、４〜６個の炭素原子を有するＮ−ビニルラクタムを含む、第７の実施形態による方法を提供する。
第９の実施形態では、本開示は、カチオン化可能なモノマー単位が、次式により表される二価のモノマー単位である、第１〜８の実施形態のいずれか１つによる方法を提供する。
Figure 2018513848
［式中、Ｒ１は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり；
Ｒ２は、カテナリーカルボニルオキシ、カルボニルアミノ、オキシカルボニルアミノ、又はウレイレン二価結合基で任意に置換された二価のアルキレン基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり；
Ｒ４は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、又は−Ｎ（Ｒ３）２であり；及び
Ｘ１は、−Ｏ−又は−ＮＲ３−である。］
第１０の実施形態では、本開示は、カチオン化可能なモノマー単位が、次式により表される二価のモノマー単位を含む、第１〜８の実施形態のいずれか１つによる方法を提供する。
Figure 2018513848
［式中、Ｒ１は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり；
Ｒ２は、カテナリーカルボニルオキシ、カルボニルアミノ、オキシカルボニルアミノ、又はウレイレン二価結合基で任意に置換された二価のアルキレン基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり；Ｒ４は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、又は−Ｎ（Ｒ３）２であり；及び
Ｘ１は、−Ｏ−又は−ＮＲ３−である。］
第１１の実施形態では、本開示は、容器が任意選択的にシールされた標本収集バッグ又はチューブを含む、第１〜１０の実施形態のいずれか１つによる方法を提供する。
第１２の実施形態では、本開示は、ステップｃ）が、改質されたファイバー及びカチオン性リガンドで官能化した任意のルーズ・ステープル・ファイバーの少なくとも一部を多孔質基材上に配置することを含む、第１〜１１の実施形態のいずれか１つによる方法を提供する。
第１３の実施形態では、本開示は、生物学的組成物を精製するための物品を提供し、物品は、
内部に配置された混合体積を有する容器と、
混合体積内に配置された、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーと、を含み、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、少なくとも１種のカチオン化可能なアクリル系モノマー単位を１０〜１００重量％含むグラフト化アクリル系ポリマーを含む改質表面層を有する。
第１４の実施形態では、本開示は、グラフト化アクリル系ポリマーが、多官能性モノマー単位を含む、第１３の実施形態による物品を提供する。
第１５の実施形態では、本開示は、グラフト化アクリル系ポリマーが、少なくとも１種の非イオン性親水性モノマー単位を、０．１〜９０重量％更に含む、第１３の実施形態又は第１４の実施形態による方法を提供する。
第１６の実施形態では、本開示は、非イオン性親水性モノマー単位が、４〜６個の炭素原子を有するＮ−ビニルラクタムを含む、第１５の実施形態による物品を提供する。
第１７の実施形態では、本開示は、カチオン化可能なアクリル系モノマー単位が、次式により表される、第１３〜１６の実施形態のいずれか１つによる物品を提供する。
Figure 2018513848
［式中、Ｒ１は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり；
Ｒ２は、カテナリーカルボニルオキシ、カルボニルアミノ、オキシカルボニルアミノ、又はウレイレン二価結合基で任意に置換された二価のアルキレン基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり；
Ｒ４は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、又は−Ｎ（Ｒ３）２であり；及び
Ｘ１は、−Ｏ−又は−ＮＲ３−である。］
第１８の実施形態では、本開示は、カチオン化可能なモノマー単位が、次式により表される二価のモノマー単位を含む、第１３〜１６の実施形態のいずれか１つによる物品を提供する。
Figure 2018513848
［式中、Ｒ１は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり；
Ｒ２は、カテナリーカルボニルオキシ、カルボニルアミノ、オキシカルボニルアミノ、又はウレイレン二価結合基で任意に置換された二価のアルキレン基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基である。］
第１９の実施形態では、本開示は、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーの少なくとも一部がフィブリル化されている、第１３〜１８の実施形態のいずれか１つによる物品を提供する。
第２０の実施形態では、本開示は、生物学的組成物が、合成高分子凝集剤を含有する、第１３〜１９の実施形態のいずれか１つによる物品を提供する。
本開示の目的及び利点は、以下の非限定的な実施例によって更に例示されるが、これらの実施例で引用される特定の材料及びそれらの量、並びに他の条件及び詳細は、本開示を不当に限定するものとして解釈されるべきではない。
別途記載のない限り、実施例及び本明細書の残りの部分における全ての部、割合（％）、比率などは、重量による。実施例に使用する材料は、別途記載のない限り、一般的な化学物質供給業者（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）など）から入手可能であり、及び／又は既知の方法により調製される。実施例において使用される材料の略記を以下の表１に掲載する。
Figure 2018513848
調製例１（ＰＥ１）
酸素を除去した（酸素５０ｐｐｍ未満）グローブボックス内で、１０ｇのポリエチレン（ＰＥ）ファイバー（ＳＨＯＲＴ ＳＴＵＦＦ Ｅ３８０Ｆ、長さ約７ｍｍ、直径０．０１５ｍｍ、Ｍｉｎｉｆｉｂｅｒｓ Ｉｎｃ．（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｉｔｙ，Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）から入手）に窒素をパージした。ファイバーを樹脂製バッグ内にシールし、グローブボックスから取り出した。ＰＣＴ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｉｏｗａ）のＢＲＯＡＤＢＥＡＭ ＥＰ電子線装置下を通過させることによりファイバーに１０Ｍｒａｄ及び３００ｋＶで電子線照射した。次にバッグを裏返し、再度１０Ｍｒａｄ及び３００ｋＶで電子線照射を行った。次に、窒素をパージしたグローブボックスにバッグを戻した。
電子線照射したファイバーをガラス製のジャーに移し、１１．１重量％のＮＶＰと、６．７重量％のＩＥＭ−Ａｇと、５重量％のＧＭＡと、７７．２重量％の脱イオン水と、を含有する、モノマー含有コーティング溶液２２３ｇでコーティングした。窒素をパージしたグローブボックス内で、ファイバー及びモノマーを終夜反応させた。
反応したファイバーを１４ｍＭ塩化ナトリウム水で３回洗浄して、ファイバーを保有させつつ塩水をスクリーンメッシュを通して排出させた。次に、ファイバーを大型のアルミニウムパンに移し、乾燥させた。乾燥させたファイバーを秤量して、最終的なグラフト収率を決定した。洗浄したファイバーの重量は４１．９ｇであり、１０ｇのファイバーには３１．９ｇのグラフト化ポリマーが添加されたことが示される。
調製例２及び３（ＰＥ２及びＰＥ３）
ＰＥファイバーを、ＳＨＯＲＴ ＳＴＵＦＦ Ｅ７８０Ｆ、長さ１．３〜２ｍｍ、直径０．０２５ｍｍとし、それぞれの構成成分量を表２に掲載するとおりに変更したことを除き、実施例１の手順を使用してファイバーを官能化させた。このファイバーを実施例２及び３に使用した。
Figure 2018513848
実施例５〜６及び比較例Ａ〜Ｃ
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）培養物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）からＣＨＯ−Ｓとして入手可能）を、大気中５体積％ ＣＯ２、加湿雰囲気下、３７℃にて、適切な添加物を加えたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）で生育させた。実施例１の３２０ｍｇのＩＥＭ−アグマチン官能化ファイバーを入れた１５ｍＬのコニカルチューブに１５ｍＬの培養物を入れた後、手で１０秒混合するか、又は、ローテーターで１０分間混合した。混合後、２５ｍｍのガラス製真空フィルタホルダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、試料をすぐに最大圧１８〜２０ｉｎＨｇ（６１〜６８ｋＰａ）（２５２２Ｂ−０１モデル真空ポンプ、Ｗｅｌｃｈ−Ｉｌｍｖａｃ（Ｎｉｌｅｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））にてポリプロピレン製ブラウンマイクロファイバー不織布フィルタ（坪量＝１０７ｇ／ｍ２、固体分５．９％、及び繊維有効径３７．８マイクロメートル）を介して減圧濾過した。比較として、同量のファイバーを１０ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）と混合して予充填し、ベース基材に対し減圧濾過した。ファイバーマットの充填後、ＣＨＯ培養物（１５ｍＬ）を加え、減圧濾過した。全ての試料に関し、真空ポンプの動作を開始した時点でストップウォッチを開始させ、溶液が流れ、乾いたファイバーマットが後に残された時点でポンプを停止し、試料の濾過時間を決定した。各試料について接触時間を決定し、これは、ファイバーが生体液と接触した総時間量を指す。総時間量は、生体液がファイバーに加えられ、混合され、濾過漏斗に注ぎ入れられ、ベース基材を介して濾過された時間とみなす。更なる解析（濁度、ＤＮＡ濃度、宿主細胞タンパク質濃度）のために、濾過液を回収した。
Ｈａｃｈ ２１００ＡＮ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ（Ｈａｃｈ Ｃｏ．（Ｌｏｖｅｌａｎｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ））を使用して濾過液を測定し、濾過液の濁度を決定した。試料濾過液の１ｍＬのアリコートを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、不溶性材料を除去した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、ＱＵＡＮＴ ＩＴ ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ ＤＳＤＮＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ））をそれぞれ製造元のプロトコルに従って使用し、遠心分離物から、総タンパク質濃度、ＤＮＡ濃度、及びＣＨＯ宿主細胞タンパク質濃度（ＣＨＯＰ）を決定した。培養開始時の代表的なベースラインを示す出発培養物（ｎ＝１）を除き、試料抽出を３回実施した。結果を以下の表３に報告する。「ＮＡ」は、「該当なし」を意味する。
Figure 2018513848
実施例７〜１０及び比較例Ｄ〜Ｇ
以下の変更を加え、上記実施例５〜６及び比較例Ａ〜Ｃ同様、実施例７〜１０及び比較例Ｄ〜Ｇを実施した。ｉ）新しいＣＨＯ培養物を使用した；ｉｉ）ファイバー及び生体液を１５ｍＬのチューブではなく５０ｍＬコニカルチューブ内で混合した；並びにｉｉｉ）未結合のファイバー試料と、予充填ファイバー媒体との接触時間に合わせて混合時間を変更した。
培養開始時の代表的なベースラインを示す出発培養物（ｎ＝１）を除き、試料抽出を３回実施した。結果を以下の表４に報告する。
Figure 2018513848
特許証のための上記出願において引用された全ての参考文献、特許文献及び特許出願は、一貫した形でその全文が参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参照文献の部分と本出願の部分との間に不一致又は矛盾がある場合は、前述の説明の情報が優先されるものとする。特許請求される開示を当業者が実施することを可能にするために示される前述の説明は、特許請求の範囲及びその全ての均等物によって規定される本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

Claims (20)

  1. ａ）容器の混合体積内に、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバー及び生物学的組成物を配置するステップであって、前記カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーが、カチオン化可能なモノマー単位を１０〜１００重量％含むグラフト化アクリル系ポリマーを含む改質表面層を有する、ステップと、
    ｂ）前記生物学的組成物及び前記カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーを、それらが前記混合体積内で互いに緊密に接触して、改質されたファイバー及び精製された生物学的組成物が提供されるまでの間、撹拌するステップと、
    ｃ）前記改質されたファイバー、及び接触している、カチオン性リガンドで官能化した任意のルーズ・ステープル・ファイバーから、前記精製された生物学的組成物の少なくとも一部を分離するステップと、を含む、生物学的組成物の精製方法。
  2. 前記カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーが、前記生物学的組成物が前記混合体積内に配置される前に前記混合体積内に配置される、請求項１に記載の方法。
  3. ステップｂ）が、少なくとも部分的にスタティックミキサーを使用して実施される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーの少なくとも一部がフィブリル化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記生物学的組成物が、合成高分子凝集剤を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記グラフト化アクリル系ポリマーが、多官能性モノマー単位を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記グラフト化アクリル系ポリマーが、少なくとも１種の非イオン性親水性モノマー単位を０．１〜９０重量％更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記非イオン性親水性モノマー単位が、４〜６個の炭素原子を有するＮ−ビニルラクタムを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記カチオン化可能なモノマー単位が、次式により表される二価のモノマー単位：
    Figure 2018513848
    ［式中、Ｒ１は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、
    Ｒ２は、カテナリーカルボニルオキシ、カルボニルアミノ、オキシカルボニルアミノ、又はウレイレン二価結合基で任意に置換された二価のアルキレン基であり、
    各Ｒ３は、独立して、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、
    Ｒ４は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、又は−Ｎ（Ｒ３）２であり、及び
    Ｘ１は、−Ｏ−又は−ＮＲ３−である。］である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記カチオン化可能なモノマー単位が、次式により表される二価のモノマー単位：
    Figure 2018513848
    ［式中、Ｒ１は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、
    Ｒ２は、カテナリーカルボニルオキシ、カルボニルアミノ、オキシカルボニルアミノ、又はウレイレン二価結合基で任意に置換された二価のアルキレン基であり、
    各Ｒ３は、独立して、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基である。］を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記容器がシールされた標本バッグを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ステップｃ）が、前記改質されたファイバー及びカチオン性リガンドで官能化した任意のルーズ・ステープル・ファイバーの少なくとも一部を多孔質基材上に配置することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 内部に配置された混合体積を有する容器と、
    前記混合体積内に配置された、カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーと、を含み、
    前記カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーは、少なくとも１種のカチオン化可能なアクリル系モノマー単位を１０〜１００重量％含むグラフト化アクリル系ポリマーを含む改質表面層を有する、生物学的組成物を精製するための物品。
  14. 前記グラフト化アクリル系ポリマーが、多官能性モノマー単位を含む、請求項１３に記載の物品。
  15. 前記グラフト化アクリル系ポリマーが、少なくとも１種の非イオン性親水性モノマー単位を０．１〜９０重量％更に含む、請求項１３又は１４に記載の物品。
  16. 前記非イオン性親水性モノマー単位が、４〜６個の炭素原子を有するＮ−ビニルラクタムを含む、請求項１５に記載の物品。
  17. 前記カチオン化可能なアクリル系モノマー単位が、次式により表される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の物品。
    Figure 2018513848
    ［式中、Ｒ１は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、
    Ｒ２は、カテナリーカルボニルオキシ、カルボニルアミノ、オキシカルボニルアミノ、又はウレイレン二価結合基で任意に置換された二価のアルキレン基であり、
    各Ｒ３は、独立して、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、
    Ｒ４は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基、又は−Ｎ（Ｒ３）２であり、及び
    Ｘ１は、−Ｏ−又は−ＮＲ３−である。］
  18. 前記カチオン化可能なモノマー単位が、次式により表される二価のモノマー単位：
    Figure 2018513848
    ［式中、Ｒ１は、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、
    Ｒ２は、カテナリーカルボニルオキシ、カルボニルアミノ、オキシカルボニルアミノ、又はウレイレン二価結合基で任意に置換された二価のアルキレン基であり、
    各Ｒ３は、独立して、Ｈ、又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基である。］を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の物品。
  19. 前記カチオン性リガンドで官能化したルーズ・ステープル・ファイバーの少なくとも一部がフィブリル化されている、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の物品。
  20. 前記生物学的組成物が、合成高分子凝集剤を含有する、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の物品。
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