CN110475800A - 具有一个羧基的聚乙二醇的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种工业上可行的纯化方法，其能够有效且高纯度地纯化具有一个羧基的聚乙二醇化合物，不产生例如吸附剂或者离子交换树脂的废料。制备pH 8至11的聚乙二醇化合物的水溶液。将水溶液和混合有机溶剂在15℃至50℃的范围内的温度下混合，使其分层为有机层和水层。在混合有机溶剂中，有机溶剂I的比率为25至60质量％，并且有机溶剂II的比率为75至40质量％。有机溶剂I是选自由甲苯、二甲苯等所组成的组中的烃类溶剂，有机溶剂II是选自由氯仿等所组成的组中的卤代烃类溶剂，并且有机溶剂I与有机溶剂II的混合比率Y(有机溶剂I/有机溶剂II)、混合时的温度T(℃)和聚乙二醇化合物的重均分子量M满足3.11×10‑6M+0.084≤Y–0.0135T≤‑1.77×10‑6M+0.404的关系。

Description

具有一个羧基的聚乙二醇的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种在医学应用中使用的具有一个羧基的聚乙二醇化合物的纯化方法。更具体地，本发明涉及一种用于获得高纯度的具有一个羧基的聚乙二醇化合物的纯化方法，该具有一个羧基的聚乙二醇化合物是用于在药物递送系统中的化学修饰用途的活化聚乙二醇并且用作其原材料。
本发明特别适用于以下医学应用，包括：多肽、酶、抗体及其他低分子药物、包括基因、寡核酸等的核酸化合物、核酸药物和其他生理活性物质的修饰，或者应用于例如脂质体、聚合物胶团或者纳米颗粒的药物递送系统载体。
背景技术
聚乙二醇(PEG)广泛的被认知为药物递送系统中的标准载体并且至今仍在快速发展。通过用聚乙二醇对生理活性物质或者例如脂质体的药物修饰，由于聚乙二醇的高水合层和空间排斥效应，抑制了药物被网状内皮系统(RES)的捕获或者在肾脏中的排泄，并且能够提高在血液中的循环并且减弱抗原性。其中，在末端具有羧基的聚乙二醇是特别重要的材料，因为其用作用于与蛋白质的赖氨酸残基或N端的一级氨基或者其他活性基团形成稳定的酰胺键从而转化为活性酯的原材料。作为使用具有羧基的聚乙二醇作为原材料的PEG化的制剂，SOMAVERT(注册商标)：PEGVISOMANT(辉瑞)、Mircera(注册商标)：甲氧基聚乙二醇-红细胞生成素β(F Hoffmann-La Roche)、Macugen(注册商标)：哌加他尼(Pegaptanib)(Eyetech)等已经投放市场。此外，进行了许多其他PEG化制剂的临床实验，所以已经展现了其效用。
作为用于医学应用目的的活化聚乙二醇，从通过对药物进行修饰而制造的药物的性能和安全性的角度，有着减少杂质的需求。现在，作为具有羧基的聚乙二醇化合物，已经开发了具有各种骨架以及在羧基和聚乙二醇之间具有连接基团的具有羧基的聚乙二醇化合物，并且根据其制造方法各种杂质作为副产物产出。下面示出其实例。
作为具有羧基的直链聚乙二醇的制造方法，已经报道了以下方法：非专利文献1中描述的用重金属试剂氧化聚乙二醇的末端羟基的方法，专利文献1中描述的通过迈克尔反应结合聚乙二醇的末端羟基和丙烯酸酯化合物并且随后进行酯水解的方法，专利文献2中描述的通过威廉森反应结合聚乙二醇的末端羟基和具有离去基团的原酸酯化合物并且随后进行水解的方法等。
此外，作为具有一个羧基的分枝聚乙二醇，专利文献3中报道了将甲氧基聚乙二醇引入赖氨酸乙酯的两个氨基并且随后进行酯水解的方法等。
然而，上述制造方法中的任一者对于在聚乙二醇的末端的羧基转化率都不高，并且羧酸纯度最高为大约90％。在以此状态修饰药物的情况下，除了想要的PEG化的制剂，还包含了许多杂质，例如，未反应的药物或者未反应的或者失活的聚乙二醇化合物。PEG化的制剂的纯化导致了分离困难的技术问题和由于药物产量减少而使生产成本增加的问题。由此，期望在与药物结合之前尽可能去除作为杂质的聚乙二醇化合物。
在从例如聚乙二醇的高分子化合物去除例如低分子化合物或者盐的杂质的情况下，通常进行利用源于分子量的物理化学性质，特别是对于溶剂的溶解度的大的差异的结晶和萃取操作的纯化。另一方面，在存在作为杂质的聚乙二醇化合物的情况下，杂质与目标物质的聚乙二醇化合物之间不出现例如溶解度的物理化学性质的大的差异。因此，难以通过用于去除低分子杂质的传统操作从具有一个羧基的聚乙二醇化合物去除不具有羧基的聚乙二醇化合物并进行纯化。
作为具有羧基的聚乙二醇化合物的纯化方法，能够通过使用其极性进行利用离子交换树脂的柱纯化，并且专利文献4中描述了分枝聚乙二醇的纯化。然而，在处理中的聚乙二醇化合物的浓度必须在大约0.1至2％的高度稀释条件下，以抑制分离能力的降低，并且在分馏之后要求用于在水溶液中回收聚乙二醇化合物的大容量萃取设备或浓缩设备，使得不能充分满足工业生产率。此外，由于大量离子交换树脂最终作为废料排出，该纯化方法具有工业化问题。
此外，专利文献5中描述了其中溶解在有机溶剂中的具有羧基的聚乙二醇被无机吸附剂物理地吸附，并且随后使用醇类溶剂解吸的纯化方法。然而，在该纯化方法中，解吸反应不充分并且产率低至50至60％。此外，由于大量吸附剂最终作为废料排出，该纯化方法具有工业化问题。
另一方面，专利文献6中描述了其中具有氨基的聚乙二醇化合物溶解在pH 1至3的强酸性水溶液中以电离末端氨基并且使用特定的混合有机溶剂在特定温度范围下萃取的纯化方法。根据该专利，亲水性由于电离而增加的具有氨基的聚乙二醇化合物分布到水层中，并且不具有氨基的聚乙二醇化合物分布到混合有机层中，使得能够进行选择的分离和纯化。
现有技术文献
专利文献
非专利文献1：J.Chromatography A，1986,368,309-317
专利文献
专利文献1：日本专利No.5015608
专利文献2：日本专利No.4959133
专利文献3：美国专利6,113,609
专利文献4：美国专利5,932,462
专利文献5：日本专利No.5618248
专利文献6：JP-A-2014-059754
专利文献7：JP-A-2004-197077
专利文献8：JP-T-9-504299
发明内容
本发明要解决的问题
然而，在专利文献6中，没有给出具有羧基的聚乙二醇化合物的纯化的描述。此外，由于具有羧基的聚乙二醇化合物不能通过纯化方法电离，所以难以进行选择的分离和纯化。
此外，即使尝试羧基的电离，虽然羧基和氨基都是极性基团，但是它们在水中的溶解度不同。例如，作为分别具有相同的烷基链长的正丁胺(n-C4H10NH2)和戊酸(n-C4H10COOH)，正丁胺的辛醇/水分布系数Log Pow为0.86并且戊酸的辛醇/水分布系数LogPow为1.39。Log Pow是亲油性/亲水性的指数的数值，并且戊酸可能以约3倍于正丁胺的摩尔浓度迁移到辛醇侧，即，示出羧基的亲油性高。由此，在具有羧基的聚乙二醇化合物在碱性水溶液中电离的情况下，由于在羧基和氨基电离时在混合有机溶剂和水中的溶解度不同，所以不能应用对具有氨基的聚乙二醇的纯化最优的有机溶剂的混合比率和特定的温度范围。
如上所述，尽管具有羧基的聚乙二醇化合物是医学应用中的重要材料，其也不能通过工业上容易制造的方法获得并且存在很多问题。
本发明的目的是通过工业上可行的方法有效和高纯度地纯化具有一个羧基的聚乙二醇化合物。
解决问题的方法
作为透彻研究以解决上述问题的结果，发明人已经发现一种纯化方法，其中将具有一个羧基的聚乙二醇化合物在具有特定pH范围的碱性水溶液中电离，并且在以特定比率混合的两种以上有机溶剂和具有特定pH范围的碱性水溶液构成的系统中在特定温度范围内进行萃取操作。
本发明的特征在于具有工业可行性，这是因为通过在特定pH范围内将特定烃类溶剂和卤代烃类溶剂的混合比率以及萃取温度控制在适当的范围内可以实现本发明的方法，并且在不使用例如树脂或者凝胶的载体/吸附剂、超滤膜等的情况下，甚至能大规模地进行本发明的方法。
由此，本发明如下。
(1)一种具有一个羧基的聚乙二醇化合物的纯化方法，其中，该聚乙二醇化合物的分子内加成的环氧乙烷单元的总平均摩尔数量为20至1490，所述方法包括下列步骤(A)、步骤(B)和步骤(C)：
(A)制备所述聚乙二醇化合物的水溶液的步骤，所述聚乙二醇化合物的水溶液为pH 8至11的弱碱性水溶液；
(B)萃取步骤，其中，将所述步骤(A)中获得的水溶液和混合有机溶剂在15℃以上且50℃以下的温度混合，并且将混合物分层为有机层和水层，其中在所述混合有机溶剂中，有机溶剂I的比率为25至60质量％，有机溶剂II的比率为75至40质量％，所述有机溶剂I是选自由甲苯、二甲苯、乙酸甲酯、乙酸乙酯和乙酸丁酯所组成的组中的烃类溶剂，所述有机溶剂II是选自由二氯甲烷和氯仿所组成的组中的卤代烃类溶剂，并且所述有机溶剂I与所述有机溶剂II的混合比率Y(有机溶剂I/有机溶剂II)、混合时的温度T(℃)和所述聚乙二醇化合物的重均分子量M满足式(1)的关系：
3.11×10-6M+0.084≤Y–0.0135T≤-1.77×10-6M+0.404 (1)；
以及
(C)从所述水层回收所述聚乙二醇化合物的步骤。
(2)根据(1)所述的方法，其中在所述步骤(B)中，所述有机溶剂I与所述有机溶剂II的所述混合比率Y(有机溶剂I/有机溶剂II)、所述混合时的温度T(℃)和所述聚乙二醇化合物的所述重均分子量M满足式(2)的关系：
2.03×10-6M+0.175≤Y–0.0135T≤-1.77×10-6M+0.404 (2)。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中对所述步骤(B)中分离的水层进行多次所述萃取步骤(B)。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的方法，其中在所述步骤(A)中，所述弱碱性水溶液包含缓冲剂。
(5)根据(4)所述的方法，其中在所述步骤(A)中，所述缓冲剂为选自由钠、钾、锂和铵所组成的组中的一种以上元素的有机盐和无机盐所组成的组中的一种以上盐。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的方法，其中在所述步骤(B)中，所述有机溶剂I包含甲苯。
根据(1)至(6)中任一项所述的方法，其中在所述步骤(B)中，所述有机溶剂II包含氯仿。
发明的效果
本发明涉及一种用于获得高纯度的用于医学应用目的的具有一个羧基的聚乙二醇化合物的新颖的纯化方法。该纯化方法能够分离传统技术难以分离的不具有羧基的聚乙二醇化合物。此外，即使在聚乙二醇化合物包括例如酰胺键或者氨基甲酸酯键的可水解连接基团的情况下，键的分解也难以发生，并且也能够防止质量劣化。此外，该纯化方法能够容易地在工业上进行，生产率优秀，并且能够在其中不生成例如吸附剂或者离子交换树脂的废料的处理中以高产率进行。
附图说明
图1是示出在聚乙二醇化合物的重均分子量为5,000的情况下溶剂的混合比率Y和萃取温度T之间的关系的图表。
图2是示出在聚乙二醇化合物的重均分子量为40,000的情况下溶剂的混合比率Y和萃取温度T之间的关系的图表。
图3是示出在聚乙二醇化合物的特定重均分子量M下溶剂的混合比率Y和萃取温度T之间的关系的图表，以及示出纯化处理可行的范围的图表。
图4是示出聚乙二醇化合物的重均分子量M与溶剂的混合比率Y的截距之间的关系的图表。
图5示出在实施例6中的萃取纯化中使用的原材料的HPLC色谱图。
图6示出实施例6中获得的纯化产物的HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明的具有一个羧基的聚乙二醇化合物是指在聚乙二醇分子中具有一个能够与其他分子反应的羧基的化合物。
在本发明的具有一个羧基的聚乙二醇化合物中，在分子内加成的环氧乙烷单元的总平均摩尔数量为20以上，优选为40以上，并且更优选为110以上。此外，在聚乙二醇化合物的分子内加成的环氧乙烷单元的总平均摩尔数量为1,490以下，并且优选为1,370以下。
本发明的具有一个羧基的聚乙二醇化合物的重均分子量优选为1,000以上，更优选为2,000以上，并且进一步更优选5,000以上。此外，聚乙二醇化合物的重均分子量优选为65573以下，并且更优选为60263以下。
本发明的具有一个羧基的聚乙二醇化合物具有直链或者分枝结构。分枝结构优选为甘油骨架、赖氨酸骨架、季戊四醇骨架或者木糖醇骨架，并且更优选为甘油骨架或者赖氨酸骨架。这些化合物通过例如专利文献7(JP-A-2004-197077)中描述的从具有羟基的单价或者多价的起始材料聚合环氧乙烷的步骤和后续活化步骤获得，或者典型地通过专利文献8(JP-T-9-504299)中描述的两个以上直链聚乙二醇的偶联反应和活化步骤获得。
在本发明中能够纯化的聚乙二醇化合物是在结构中仅具有一个羧基的聚乙二醇化合物。除羧基之外的结合至聚乙二醇链的末端的官能团是具有1至7个碳原子的烃基、在弱碱性水溶液中稳定的反应性官能团或者官能团的保护基团。具有1至7个碳原子的烃基包括，例如，诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基、庚基或者异庚基的烷基、苯基以及苄基。烃基优选为甲基、乙基、叔丁基或者苄基，并且更优选为甲基。在弱碱性水溶液中稳定的反应性官能团优选为氨基、氧氨基、羟基、巯基、氰基或者叠氮基。官能团的保护基团优选为氨基、羧基、羟基、巯基、肼基、酰肼基和氧氨基的保护基团中的在弱碱性水溶液中稳定的那些基团。
(步骤(A))
步骤(A)是制备具有一个羧基的聚乙二醇化合物的水溶液的步骤，该水溶液是pH8至11的弱碱性水溶液。
弱碱性水溶液的pH设定为8至11，优选为8至10，这是由于当弱碱性水溶液的pH低时，羧基的电离不充分，并且因此聚乙二醇化合物的亲水性不能提高，并且当弱碱性水溶液的pH高时，在聚乙二醇化合物包括例如酰胺键或者氨基甲酸酯键的可水解连接基团的情况下，倾向于发生键的分解。
弱碱性水溶液可以包含缓冲剂，以缓和pH的波动。作为缓冲剂，能够使用通常用于将pH维持为8至11的展现缓冲性的有机盐或者无机盐。具体地，缓冲剂包括有机盐或者无机盐，例如，包含钠、钾、锂或者铵的磷酸盐、醋酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸盐、柠檬酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐或者乳酸盐。此外，可以组合使用多个有机盐和无机盐。
缓冲剂的浓度不特别限定，只要足以将本发明的溶液维持在期望的8至11的pH即可。当缓冲剂的浓度低时，不展现缓冲作用，并且当缓冲剂的浓度高时，聚乙二醇化合物在水中的溶解度降低并且目标物质容易分布到有机层侧，使得产量倾向于降低。因此，浓度优选为本发明的水溶液的总量的10至500mM，更优选为25至300mM。
使用的弱碱性水溶液的质量优选为聚乙二醇化合物的质量的1至50倍，更优选为聚乙二醇化合物的质量的2至20倍，并且特别优选为聚乙二醇化合物的质量的5至20倍。
(步骤(B))
步骤(B)是通过搅拌、震荡等混合有机溶剂和包含溶解在弱碱性水溶液中的具有一个羧基的聚乙二醇化合物的弱碱性水溶液，并且，使混合物静置一定时间以分层为有机层和水层的步骤。在萃取步骤中，由于具有一个羧基的聚乙二醇化合物在处于预先溶解在有机溶剂中的状态下与弱碱性水溶液混合时的乳化，导致杂质的分离和目标物质的目标物质的回收变得不可能的可能性高，所以具有一个羧基的聚乙二醇化合物优选为预先溶解在弱碱性水溶液中。
所述步骤期间用于混合和分层的时间不特别限定并且优选为1分钟至12小时之间，并且更优选为10分钟至3小时。此外，用于进行萃取操作的气氛不特别限定，并且出于最小化氧化的目的，能够优选为在例如氮气的惰性气体存在的情况下进行操作。此外，装置也不特别限定，并且考虑到在氮气和密封状态下的操作以减少氧化降解的发生，也能够在压力容器中进行操作。
待使用的有机溶剂I是选自甲苯、二甲苯、乙酸甲酯、乙酸乙酯和乙酸丁酯的烃类溶剂，并且优选为甲苯或者乙酸乙酯，并且更优选为甲苯。
待使用的有机溶剂II是选自二氯甲烷和氯仿的卤代烃类溶剂，并且优选为氯仿。
待使用的一般的聚乙二醇化合物展示出特有的溶解度，并且该溶解度如下：有机溶剂II>水>有机溶剂I。另一方面，具有电离羧基的聚乙二醇化合物的亲水性稍高于不具有羧基的聚乙二醇化合物的亲水性。因此，当使用其中适当量的有机溶剂II与有机溶剂I混合的有机溶剂时，具有羧基的聚乙二醇化合物的溶解度变为如下：水>(有机溶剂I+有机溶剂II)，并且不具有羧基的聚乙二醇化合物的溶解度变为如下：(有机溶剂I+有机溶剂II)>水。即，由于具有羧基的聚乙二醇化合物分布到水层并且不具有羧基的聚乙二醇化合物分布到有机层中，所以能够进行选择性分离和纯化。
待使用的有机溶剂是有机溶剂I：25至60质量％和有机溶剂II：75至40质量％的混合比率的混合溶液。由于有机溶剂I的比重小于1并且有机溶剂II的比重大于1，所以当有机溶剂I的比率增加时，混合溶剂的比重接近水溶液的比重并且因此分层能力趋向于劣化。因此，优选有机溶剂I：25至50质量％和有机溶剂II：75至50质量％的混合比率的混合溶液。
如下述实施例所示的，当有机溶剂I与有机溶剂II的混合比率(有机溶剂I/有机溶剂II)取为Y，步骤(B)中的温度取为T(℃)，并且聚乙二醇化合物的重均分子量取为M时，纯化在下文示出的式(1)的关系满足的范围内是可能的。从而，发明人首次成功地提供了能够工业分离上述高纯度聚乙二醇化合物的纯化方法。
3.11×10-6M+0.084≤Y–0.0135T≤-1.77×10-6M+0.404 (1)
待使用的有机溶剂I的质量和有机溶剂II的质量优选分别为聚乙二醇化合物的质量的1至50倍，更优选分别为聚乙二醇化合物的质量的2至20倍，并且特别优选分别为聚乙二醇化合物的质量的5至20倍。
进行萃取操作的温度优选为50℃以下，更优选为45℃以下，并且进一步更优选35℃以下，这是因为当温度变高时，由于有机溶剂的挥发，倾向于发生溶剂混合比率的变化和聚乙二醇化合物的溶解度变化。此外，进行萃取操作的温度优选为10℃以上，更优选为15℃以上，并且进一步更优选20℃以上，这是因为当温度变低时，聚乙二醇的粘性增加。
(步骤(C))
步骤(C)是在萃取之后从水层回收具有一个羧基的聚乙二醇化合物的方法。
用酸使得包含具有一个羧基的聚乙二醇化合物的弱碱性水溶液变为中性或者酸性。其后，通过萃取至有机层，通过包括浓缩、结晶、干燥等的任意的步骤而回收具有一个羧基的聚乙二醇化合物。
实施例
将参考实施例更具体地描述本发明。
实施例中待分离和去除的不具有羧基的聚乙二醇杂质为与具有一个羧基的聚乙二醇化合物具有大约相同的重均分子量的杂质。对于聚乙二醇化合物的分析，使用GPC和HPLC。实施例中描述的羧酸产率是指(纯化后的质量(g)×纯化后的羧酸纯度(％))÷(原材料的质量(g)×原材料的羧酸纯度(％))×100。
使用LC-10Avp(Shimadzu)作为GPC系统，在下面描述的条件下测量聚乙二醇化合物的分子量。
GPC装置：LC-10Avp(Shimadzu)
流动相：DMF(10mM LiBr)
流速：0.7mL/分钟
柱：PL gel MIXED-D(Polymer Laboratory)
柱温：65℃
检测器：RI
进样量：30mg/30mL(100μL)
使用聚乙二醇化合物作为标准物质形成校准曲线。
使用alliance(Waters)作为HPLC系统，在下面描述的条件下测量聚乙二醇化合物的羧酸纯度。
HPLC装置：alliance(Waters)
流动相：甲酸铵缓冲溶液(溶剂：水，pH：8.0)
流速：1.0mL/分钟
柱：阴离子交换柱ES-502N(Asahipak)
柱温：30℃
检测器：RI
进样量：10mg/mL(20μL)
由于在萃取时在弱碱性水溶液中电离的具有一个羧基的聚乙二醇化合物主要地保留在水层中并且不具有羧基的聚乙二醇化合物趋向于迁移至有机层，所以纯化变得可行。然而，除非以适当的溶剂混合比率和萃取温度进行萃取，纯化不能实现。
首先，将聚乙二醇化合物开始被有机层获得的溶剂混合比率Y取作Y1。Y1是通过本发明的萃取法能够进行纯化的混合比率的指数。即，其为作为杂质的不具有羧基的聚乙二醇化合物开始优先地分布到有机层中的点。在溶剂混合比率Y大于Y1的情况下，不具有羧基的聚乙二醇化合物不能分布到有机层中并被去除，使得不能进行纯化。
接着，当以低于Y1的溶剂混合比率Y进行萃取时，从有机层获得的不具有羧基的聚乙二醇化合物的质量增加，但是具有一个羧基的聚乙二醇化合物也开始从一定的混合比率分布到有机层中。然后，将通过浓缩有机层获得的浓缩物中包含的具有一个羧基的聚乙二醇化合物的质量变为20质量％时的混合比率Y取作Y2。Y2是与通过萃取获得的羧酸产率相关的混合比率的指数，并且是效率地纯化可行时的下限。在溶剂混合比率Y小于Y2的情况下，作为目标物质的具有一个羧基的聚乙二醇化合物分布到有机层中并且与不具有羧基的聚乙二醇化合物被一起去除，使得纯化后的具有一个羧基的聚乙二醇化合物的羧酸产率降低。
更详细地说明混合比率Y为Y2以上的情况下的羧酸产率。假定对100g羧酸纯度90％的聚乙二醇化合物进行萃取并且浓缩有机层时，获得10g浓缩物。对应于20％的浓缩物的具有一个羧基的聚乙二醇化合物的质量如下：10g×20％÷÷100＝2g。羧酸产率降低如下：2g÷(100g×90％÷100)×100＝2.2％。
Y1和Y2之间的关系总是Y1>Y2。
因此，当溶剂混合比率Y在Y1和Y2之间(Y1>Y>Y2)时，意味着能够以工业可利用的效率通过萃取纯化具有一个羧基的聚乙二醇化合物。
另外，将通过浓缩有机层获得的聚乙二醇化合物中包含的具有一个羧基的聚乙二醇化合物为5质量％时的混合比率Y取作Y3。由于具有羧基的聚乙二醇化合物在有机层中的损耗小于Y2时的损耗，所以Y3是效率地纯化可行时的优选下限。
更详细地说明混合比率Y为Y3的情况下的羧酸产率。假定对100g羧酸纯度90％的聚乙二醇化合物进行萃取并且浓缩有机层时，获得10g浓缩物。对应于5％的浓缩物的具有一个羧基的聚乙二醇化合物的质量如下：10g×5％÷100＝0.5g。羧酸产率降低如下：0.5g÷(100g×90％÷100)×100＝0.55％。
Y1、Y2和Y3之间的关系总是Y1>Y3>Y2。
当溶剂混合比率Y在Y1和Y3之间(Y1>Y>Y3)时，意味着能够在更优选的条件下以工业可利用的效率通过萃取纯化具有一个羧基的聚乙二醇化合物。
关于各种分子量的具有一个羧基的聚乙二醇化合物，研究了通过萃取的纯化效果。作为代表，下面参考5,000和40,000的重均分子量的数据进行说明。
首先，研究了溶剂混合比率Y和温度T的适当范围。
将具有一个羧基的聚乙二醇化合物溶解在弱碱性水溶液中。向其中添加有机溶剂I和有机溶剂II的混合溶液并且进行萃取操作两次。在减压下通过蒸发器馏出有机层，并且进行回收的聚乙二醇化合物的质量测量和HPLC测量。根据HPLC色谱图的峰面积比和质量计算具有羧基的聚乙二醇化合物和不具有羧基的聚乙二醇化合物各自的质量。在各种萃取温度和溶剂的混合比率的条件下进行萃取研究并且计算各个温度下的Y1、Y2和Y3。取溶剂混合比率Y作为纵轴并且取萃取温度T作为横轴，由此标绘Y1、Y2和Y3。
如图1和2所示，在具有5,000和40,000的重均分子量M的聚乙二醇化合物的情况下，Y1、Y2和Y3能够分别通过作为温度T的函数的式(3)和(4)表达。
M＝5,000的情况下：
Y1＝0.0135T+0.395，Y2＝0.0135T+0.100，Y3＝0.0135T+0.185(3)
M＝40,000的情况下：
Y1＝0.0135T+0.333，Y2＝0.0135T+0.209，Y3＝0.0135T+0.256(4)
根据式(3)和(4)，能够看出，曲线相对于温度变化的斜率0.0135独立于聚乙二醇化合物的重均分子量并且是恒定的。换言之，如图3所示，在使用具有一定的重均分子量M的聚乙二醇化合物进行萃取纯化的情况下，Y1、Y2和Y3能够分别通过作为温度T的函数的式(5)表达，并且各自的截距取作A、B和C。
Y1＝0.0135T+A，Y2＝0.0135T+B，Y3＝0.0135T+C (5)
如图3所示，在混合比率Y落入满足图3的Y≤0.0135T+A且Y≥0.0135T+B的范围时通过萃取的纯化是可行的，并且两式总结为式(6)所示的表达。
B≤Y–0.0135T≤A (6)
图3中满足Y≤0.0135T+A且Y≥0.0135T+C的范围是优选的，并且，并且两式总结为式(7)所示的表达。
C≤Y–0.0135T≤A (7)
接着，如图4所示，取Y的截距作为纵轴并且取重均分子量M作为横轴，分别地标绘从式(3)和(4)获得的A、B和C。根据图4，当各个截距A、B和C视为重均分子量M的函数时，其能如式(8)所示的表达。
A＝-1.77×10-6M+0.404
B＝3.11×10-6M+0.084
C＝2.03×10-6M+0.175 (8)
总结上文，当有机溶剂I与有机溶剂II的混合比率(有机溶剂I/有机溶剂II)取为Y，步骤(B)中的温度取为T(℃)，并且聚乙二醇化合物的重均分子量取为M时，通过萃取的纯化可行的范围为
由式(6)和式(8)导出的3.11×10-6M+0.084≤Y-0.0135T≤-1.77×10-6M+0.404，并且更优选为
式(7)和式(8)导出的2.03×10-6M+0.175≤Y-0.0135T≤-1.77×10-6M+0.404。
当截距A和B互相重叠时，图4中的萃取纯化可行的区域不存在。基于A＝B的事实，此时的重均分子量M为M＝65573。即，萃取纯化可行的重均分子量的上限接近65573。当截距A和C互相重叠时更优选，并且基于B＝C的事实，此时的M＝60263。即，更优选的萃取纯化可行的重均分子量的上限接近60263。
另一方面，根据专利文献6，具有氨基的聚乙二醇化合物中萃取纯化可行的重均分子量的上限为104167。具有羧基的聚乙二醇化合物中萃取纯化可行的重均分子量的上限低于具有氨基的聚乙二醇化合物中萃取纯化可行的重均分子量的上限的事实表明：由于相比于氨基，羧基的亲水性更弱，所以具有羧基的聚乙二醇化合物和不具有羧基的聚乙二醇化合物之间的在混合溶剂与水溶液中的溶解度的差异小，使得萃取纯化能够选择性地进行的具有羧基的聚乙二醇化合物的重均分子量的区域更窄。
(实施例1)
在本实施例中，重均分子量M为5,000，萃取温度T为27.5℃，并且Y为0.53。
向装备有机械搅拌装置、温度计和氮气入口管的200mL四颈烧瓶中放入5g式[1]表示的α-甲氧基-ω-羧甲基聚乙二醇(重均分子量：5,000，羧酸纯度：79.2％)并且溶解在50g的100mM硼酸盐缓冲液中(pH 9)。向其中添加16g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且在27.5℃下搅拌混合物30分钟。在搅拌停止之后，使混合物在相同温度静置30分钟以进行分层。去除分离的下部有机层，并且添加新鲜制备的16g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且以相同的方式进行萃取操作。在搅拌和分层之后，去除有机层并且将10g氯化钠添加至剩下的水层，在室温下搅拌混合物以溶解。
通过向水溶液添加6N盐酸将pH调整至2之后，向其中添加25g氯仿，并且在室温下搅拌混合物30分钟。搅拌停止之后，使混合物静置30分钟以进行分层。在茄形烧瓶中回收下部有机层。在40℃下通过蒸发器浓缩有机层，并且在通过添加50g乙酸乙酯稀释之后，用1.5g硫酸镁进行脱水，随后过滤。向滤液添加25g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟，过滤，并且用25g己烷洗涤残留物并且随后在真空中进行干燥以获得纯化产物(3.9g，羧酸纯度：99.0％，羧酸产率：98.5％)。
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2COOH [1]
(实施例1-1)
在27.5℃的萃取温度下对实施例1中的混合比率Y进行各种改变，并且研究浓缩物的质量中的α-甲氧基-ω-羧甲基聚乙二醇的重量为5％的混合比率(Y1)、获得的浓缩物最少的混合比率(Y2)以及化合物的重量为20％的混合比率(Y3)。结果，Y1为0.751，Y2为0.490并且Y3为0.565。
(实施例1-2)
在32.5℃的萃取温度下对实施例1中的混合比率Y进行各种改变，并且研究混合比率(Y1)、(Y2)和(Y3)。结果，Y1为0.842，Y2为0.530并且Y3为0.620。
(实施例1-3)
在22.5℃的萃取温度下对实施例1中的混合比率Y进行各种改变，并且研究混合比率(Y1)、(Y2)和(Y3)。结果，Y1为0.707，Y2为0.395并且Y3为0.485。
图1是其中标绘了实施例1至3的结果的图表。
(实施例2)
在本实施例中，重均分子量M为40,000，萃取温度T为27.5℃，并且Y为0.63。
向装备有机械搅拌装置、温度计和氮气入口管的200mL四颈烧瓶中放入5g式[1]表示的α-甲氧基-ω-羧甲基聚乙二醇(重均分子量：40,000，羧酸纯度：80.5％)并且溶解在50g的100mM硼酸盐缓冲液中(pH 9)。向其中添加19g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且在27.5℃下搅拌混合物30分钟。在搅拌停止之后，使混合物在相同温度静置30分钟以进行分层。去除分离的下部有机层，并且添加新鲜制备的19g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且以相同的方式进行萃取操作。在搅拌和分层之后，去除有机层并且将10g氯化钠添加至剩下的水层，在室温下搅拌混合物以溶解。通过向水溶液添加6N盐酸将pH调整至2之后，向其中添加25g氯仿，并且在室温下搅拌混合物30分钟。搅拌停止之后，使混合物静置30分钟以进行分层。在茄形烧瓶中回收下部有机层。在40℃下通过蒸发器浓缩有机层，并且在通过添加50g乙酸乙酯稀释之后，用1.5g硫酸镁进行脱水，随后过滤。向滤液添加25g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟，过滤，并且用25g己烷洗涤残留物并且随后在真空中进行干燥以获得纯化产物(3.8g，羧酸纯度：99.2％，羧酸产率：93.7％)。
(实施例2-1)
在27.5℃的萃取温度下对实施例1中的混合比率Y进行各种改变，并且研究浓缩物的质量中的α-甲氧基-ω-羧甲基聚乙二醇的重量为5％的混合比率(Y1)、获得的浓缩物最少的混合比率(Y2)以及化合物的重量为20％的混合比率(Y3)。结果，Y1为0.704，Y2为0.580并且Y3为0.627。
(实施例2-2)
在32.5℃的萃取温度下对实施例1中的混合比率Y进行各种改变，并且研究混合比率(Y1)、(Y2)和(Y3)。结果，Y1为0.771，Y2为0.648并且Y3为0.695。
(实施例2-3)
在22.5℃的萃取温度下对实施例1中的混合比率Y进行各种改变，并且研究混合比率(Y1)、(Y2)和(Y3)。结果，Y1为0.637，Y2为0.513并且Y3为0.561。
图2是其中标绘了实施例2-1至2-3的结果的图表。
(实施例3)
在本实施例中，重均分子量M为5,000，萃取温度T为27.5℃，并且Y为0.67。
向装备有机械搅拌装置、温度计和氮气入口管的200mL四颈烧瓶中放入5g式[2]表示的α-甲氧基-ω-2-羧甲基聚乙二醇(重均分子量：5,000，羧酸纯度：78.1％)并且溶解在50g的50mM硼酸盐缓冲液中(pH 9)。向其中添加20g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且在27.5℃下搅拌混合物30分钟。在搅拌停止之后，使混合物在相同温度静置30分钟以进行分层。去除分离的下部有机层，并且添加新鲜制备的20g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且以相同的方式进行萃取操作。在搅拌和分层之后，去除有机层并且将10g氯化钠添加至剩下的水层，在室温下搅拌混合物以溶解。通过向水溶液添加6N盐酸将pH调整至2之后，向其中添加25g氯仿，并且在室温下搅拌混合物30分钟。搅拌停止之后，使混合物静置30分钟以进行分层。在茄形烧瓶中回收下部有机层。在40℃下通过蒸发器浓缩有机层，并且在通过添加50g乙酸乙酯稀释之后，用1.5g硫酸镁进行脱水，随后过滤。向滤液添加25g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟，过滤，并且用25g己烷洗涤残留物并且随后在真空中进行干燥以获得纯化产物(3.6g，羧酸纯度：99.0％，羧酸产率：91.3％)。
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2COOH [2]
(实施例4)
在本实施例中，重均分子量M为20,000，萃取温度T为27.5℃，并且Y为0.67。
向装备有机械搅拌装置、温度计和氮气入口管的200mL三颈烧瓶中放入5g式[3]表示的α-甲氧基-ω-5-羧甲基聚乙二醇(重均分子量：20,000，羧酸纯度：79.5％)和50g的水，并且在室温下在氮气气氛下搅拌混合物以溶解。向溶液添加1M碳酸钠水溶液以将pH调整至10。向其中添加18g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且在27.5℃下搅拌混合物30分钟。在搅拌停止之后，使混合物在相同温度静置30分钟以进行分层。去除分离的下部有机层，并且添加新鲜制备的20g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且以相同的方式进行萃取操作。在搅拌和分层之后，去除有机层并且将10g氯化钠添加至剩下的水层，在室温下搅拌混合物以溶解。通过向水溶液添加6N盐酸将pH调整至2之后，向中其添加25g氯仿，并且在室温下搅拌混合物30分钟。搅拌停止之后，使混合物静置30分钟以进行分层。在茄形烧瓶中回收下部有机层。在40℃下通过蒸发器浓缩有机层，并且在通过添加50g乙酸乙酯稀释之后，用1.5g硫酸镁进行脱水，随后过滤。向滤液添加25g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟，过滤，并且用25g己烷洗涤残留物并且随后在真空中进行干燥以获得纯化产物(3.5g，羧酸纯度：99.3％，羧酸产率：86.8％)。
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2CH2CH2COOH [3]
(实施例5)
在本实施例中，重均分子量M为10,000，萃取温度T为27.5℃，并且Y为0.50。
向装备有机械搅拌装置、温度计和氮气入口管的200mL四颈烧瓶中放入5g式[4]表示的α-2-氰乙氧基-ω-5-羧戊基聚乙二醇(重均分子量：10,000，羧酸纯度：81.7％)并且溶解在50g的100mM硼酸盐缓冲液中(pH 9)。向其中添加15g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且在27.5℃下搅拌混合物30分钟。在搅拌停止之后，使混合物在相同温度静置30分钟以进行分层。去除分离的下部有机层，并且添加新鲜制备的15g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且以相同的方式进行萃取操作。在搅拌和分层之后，去除有机层并且将10g氯化钠添加至剩下的水层，在室温下搅拌混合物以溶解。通过向水溶液添加6N盐酸将pH调整至2之后，向其中添加25g氯仿，并且在室温下搅拌混合物30分钟。搅拌停止之后，使混合物静置30分钟以进行分层。在茄形烧瓶中回收下部有机层。在40℃下通过蒸发器浓缩有机层，并且在通过添加50g乙酸乙酯稀释之后，用1.5g硫酸镁进行脱水，随后过滤。向滤液添加25g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟，过滤，并且用25g己烷洗涤残留物并且随后在真空中进行干燥以获得纯化产物(3.7g，羧酸纯度：99.1％，羧酸产率：89.8％)。
NC-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2CH2CH2COOH [4]
(实施例6)
在本实施例中，重均分子量M为40,000，萃取温度T为27.5℃，并且Y为0.65。
向装备有机械搅拌装置、温度计和氮气入口管的200mL四颈烧瓶中放入10g式[5]表示的分枝聚乙二醇(重均分子量：40,000，羧酸纯度：81.3％)并且溶解在100g的100mM硼酸盐缓冲液中(pH 9)。向其中添加39g甲苯和60g氯仿的混合溶剂并且在27.5℃下搅拌混合物30分钟。在搅拌停止之后，使混合物在相同温度静置30分钟以进行分层。去除分离的下部有机层，并且添加新鲜制备的39g甲苯和60g氯仿的混合溶剂并且以相同的方式进行萃取操作。在搅拌和分层之后，去除有机层并且将25g氯化钠添加至剩下的水层，在室温下搅拌混合物以溶解。通过向水溶液添加6N盐酸将pH调整至3之后，向其中添加100g氯仿，并且在室温下搅拌混合物30分钟。搅拌停止之后，使混合物静置30分钟以进行分层。在茄形烧瓶中回收下部有机层。在40℃下通过蒸发器浓缩有机层，并且在通过添加100g乙酸乙酯稀释之后，用3.0g硫酸镁进行脱水，随后过滤。向滤液添加50g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟，过滤，并且用50g己烷洗涤残留物并且随后在真空中进行干燥以获得纯化产物(7.1g，羧酸纯度：99.3％，羧酸产率：90.4％)。
(比较例1)
接着，以与专利文献4的实施例中相同的方式通过离子交换柱进行纯化并且比较结果。
在直径6cm的柱中填充约850mL的DEAE Sepharose FF(由GE Healthcare制造)以具有30cm的高度，使用离子交换水作为展开剂。在4.4L的离子交换水中溶解20g式[5]表示的分枝聚乙二醇，将溶液注入柱内并且在通过TLC确认包含纯化的[5]的馏分的同时回收洗出液。向回收的洗出液添加氯化钠并且随后添加氯仿，并且在室温下搅拌混合物30分钟。搅拌停止之后，使混合物静置30分钟以进行分层。在茄形烧瓶中回收下部有机层。在40℃下通过蒸发器浓缩有机层，并且在通过添加50g乙酸乙酯稀释之后，用1.5g硫酸镁进行脱水，随后过滤。向滤液添加25g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟，过滤，并且用25g己烷洗涤残留物并且随后在真空中进行干燥以获得纯化产物(3.8g，羧酸纯度：99.3％，羧酸产率：22.9％)。
(比较例2)
接着，以与专利文献5的实施例中相同的方式通过无机吸附剂进行纯化并且比较结果。
向装备有机械搅拌装置、戴氏冷凝器、温度计和氮气入口管的1L四颈烧瓶中放入30g式[5]表示的分枝聚乙二醇和450g甲苯，并且在55℃下在氮气气氛下搅拌混合物以溶解。向溶液添加120g KYOWAAD200B(Kyowa Chemical Industry Co.,Ltd.)，在50℃下搅拌混合物一小时以进行吸附操作，随后过滤。然后，用300g预热至50℃的甲苯洗涤滤饼。然后，向滤饼添加乙醇，并且在搅拌下将混合物加热至50℃并且过滤以回收滤液。进一步地，用加热至50℃的300g乙醇洗涤滤饼，并且回收滤液。使用蒸发器浓缩滤液并且在通过添加50g乙酸乙酯稀释之后，用1.5g硫酸镁进行脱水，随后过滤。向滤液添加25g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟，过滤，并且用25g己烷洗涤残留物并且随后在真空中进行干燥以获得纯化产物(12.3g，羧酸纯度：99.4％，羧酸产率：50.0％)。
结果实施例6和比较例1和2的结果如下表1所示。
[表1]
如表1所示，通过本发明的纯化方法获得的具有一个羧基的聚乙二醇化合物的羧酸纯度等于比较例1中通过离子交换树脂获得的纯化产物和比较例2中通过无机吸附剂获得的纯化产物的羧酸纯度，并且羧酸产率获得了显著提高的结果。
此外，图5示出在实施例5中用于萃取纯化的原材料的HPLC色谱图并且图6示出实施例5中获得的纯化产物的HPLC色谱图。
接着，进行是否能够在专利文献6中描述的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的纯化可行的范围内进行具有一个羧基的聚乙二醇化合物的纯化的比较研究。
(比较例3)
向装备有机械搅拌装置、温度计和氮气入口管的100mL三颈烧瓶中放入5g式[3]表示的α-甲氧基-ω-5-羧甲基聚乙二醇(重均分子量：20,000，羧酸纯度：79.5％)和50g的水，并且在室温下在氮气气氛下搅拌混合物以溶解。向水溶液添加6N盐酸以将pH调整至2。向其中添加18g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且在27.5℃下搅拌混合物30分钟。在搅拌停止之后，使混合物在相同温度静置30分钟以进行分层。去除分离的下部有机层，并且添加新鲜制备的18g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且以相同的方式进行萃取操作。在搅拌和分层之后，去除有机层并且将10g氯化钠添加至剩下的水层，在室温下搅拌混合物以溶解。向溶液添加25g氯仿，并且在室温下搅拌混合物30分钟。搅拌停止之后，使混合物静置30分钟以进行分层。在茄形烧瓶中回收下部有机层。在40℃下通过蒸发器浓缩有机层，并且在通过添加50g乙酸乙酯稀释之后，用1.5g硫酸镁进行脱水，随后过滤。向滤液添加25g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟，过滤，并且用25g己烷洗涤残留物并随后在真空中进行干燥以获得最终产物。获得的最终产物的羧酸纯度为64.3％。
如上所述，因为羧基在酸性条件下不电离，所以纯化不能进行。
接着，在比较例4-1和比较例4-2中，进行是否能够在专利文献6中描述的具有一个氨基的聚乙二醇化合物的纯化可行的混合溶剂比率和温度下进行具有一个羧基的聚乙二醇化合物的纯化的比较研究。
(比较例4-1)
在本例中，重均分子量M为80,000，萃取温度T为27.5℃，并且Y为0.67。
向装备有机械搅拌装置、戴氏冷凝器、温度计和氮气入口管的200mL四颈烧瓶中放入5g式[6]表示的分枝聚乙二醇衍生物(重均分子量：80,000，胺纯度：78.3％)和50g的水，并且在室温下在氮气气氛下搅拌混合物以溶解。向水溶液添加1N盐酸以将pH调整至2。向其中添加20g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且在27.5℃下搅拌混合物30分钟。在搅拌停止之后，使混合物在相同温度静置30分钟以进行分层。去除分离的下部有机层，并且添加新鲜制备的20g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且以相同的方式进行萃取操作。在搅拌和分层之后，去除有机层并且将10g氯化钠添加至剩下的水层，在室温下搅拌混合物以溶解。向溶液添加1N NaOH水溶液以将pH调整至12。慢慢地搅拌溶液并将溶液加热至50℃，向其中添加37.5g甲苯，并且在50℃下搅拌混合物30分钟。在搅拌停止之后，使混合物在相同温度静置30分钟以进行分层。在茄形烧瓶中回收下部有机层。通过添加37.5g甲苯再次进行萃取并且在茄形烧瓶中回收有机层。在50℃下通过蒸发器浓缩有机层，并且用1.5g硫酸镁进行脱水，随后过滤。用10g甲苯洗涤滤饼并且合并洗涤液与滤液。在溶液在使用磁力搅拌器搅拌的情况下冷却至室温之后，向其中添加25g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟并过滤，并在用40g己烷洗涤残留物之后，在真空中进行干燥以获得纯化产物(3.7g，胺纯度：97.4％，胺产率：92.1％)。
(比较例4-2)
在本例中，重均分子量M为80,000，萃取温度T为27.5℃，并且Y为0.67。
向装备有机械搅拌装置、温度计和氮气入口管的100mL四颈烧瓶中放入5g式[7]表示的分枝聚乙二醇(重均分子量：80,000，羧酸纯度：77.6％)并且溶解在50g的100mM硼酸盐缓冲液中(pH 9)。向其中添加20g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且在27.5℃下搅拌混合物30分钟。在搅拌停止之后，使混合物在相同温度静置30分钟以进行分层。去除分离的下部有机层，并且添加新鲜制备的20g甲苯和30g氯仿的混合溶剂并且以相同的方式进行萃取操作。在搅拌和分层之后，去除有机层并且将12.5g氯化钠添加至剩下的水层，在室温下搅拌混合物以溶解。通过向水溶液添加6N盐酸将pH调整至2之后，向其中添加50g氯仿，并且在室温下搅拌混合物30分钟。搅拌停止之后，使混合物静置30分钟以进行分层。在茄形烧瓶中回收下部有机层。在40℃下通过蒸发器浓缩有机层，并且在通过添加50g乙酸乙酯稀释之后，用1.5g硫酸镁进行脱水，随后过滤。向滤液添加25g己烷以析出晶体。搅拌悬浮液30分钟，过滤，并且用25g己烷洗涤残留物并随后在真空中进行干燥以获得纯化产物。获得的最终产物的羧酸纯度为77.8％。
如比较例4-1和4-2所示，在具有一个氨基的聚乙二醇化合物的纯化可行的混合溶剂比率和温度下不能进行具有一个羧基的聚乙二醇化合物的纯化。
根据实施例，表明：由于相比于氨基，羧基的亲水性更弱，所以具有羧基的聚乙二醇化合物和不具有羧基的聚乙二醇化合物之间的在混合溶剂与水溶液中的溶解度的差异小，使得萃取纯化能够选择性地进行的具有羧基的聚乙二醇化合物的重均分子量的区域更窄。
根据上文，本发明是一种有用的纯化方法，其能够以高纯度和良好产率工业地制造具有一个羧基的聚乙二醇化合物。
虽然已经参考其具体实施例详细地描述了本发明，但对本领域技术人员显而易见的是，能够在不背离本发明的精神和范围的情况下，对本发明进行各种变化或修改。
本申请基于2017年3月30日提交的日本专利申请(日本专利申请No.2017-066695)，并且该全文作为参考并入本申请。另外，本文引用的所有文献以其整体并入本文。

Claims (7)

1.一种具有一个羧基的聚乙二醇化合物的纯化方法，其中所述聚乙二醇化合物的分子内加成的环氧乙烷单元的总平均摩尔数量为20至1490，所述方法包括下列步骤(A)、步骤(B)和步骤(C)：
(A)制备所述聚乙二醇化合物的水溶液的步骤，该聚乙二醇化合物的水溶液为pH 8至11的弱碱性水溶液；
(B)萃取步骤，其中，将所述步骤(A)中获得的水溶液和混合有机溶剂在15℃以上且50℃以下的温度下混合，并且将混合物分层为有机层和水层，其中，在所述混合有机溶剂中，有机溶剂I的比率为25至60质量％，有机溶剂II的比率为75至40质量％，所述有机溶剂I是选自由甲苯、二甲苯、乙酸甲酯、乙酸乙酯和乙酸丁酯所组成的组中的烃类溶剂，所述有机溶剂II是选自由二氯甲烷和氯仿所组成的组中的卤代烃类溶剂，并且所述有机溶剂I与所述有机溶剂II的混合比率Y(有机溶剂I/有机溶剂II)、混合时的温度T(℃)和所述聚乙二醇化合物的重均分子量M满足式(1)的关系：
3.11×10-6M+0.084≤Y–0.0135T≤-1.77×10-6M+0.404 (1)；
以及
(C)从所述水层回收所述聚乙二醇化合物的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤(B)中，所述有机溶剂I与所述有机溶剂II的混合比率Y(有机溶剂I/有机溶剂II)、所述混合时的温度T(℃)和所述聚乙二醇化合物的重均分子量M满足式(2)的关系：
2.03×10-6M+0.175≤Y–0.0135T≤-1.77×10-6M+0.404 (2)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，对所述步骤(B)中分离的水层进行多次所述萃取步骤(B)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在所述步骤(A)中，所述弱碱性水溶液包含缓冲剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在所述步骤(A)中，所述缓冲剂为选自由钠、钾、锂和铵所组成的组中的一种以上元素的有机盐和无机盐所组成的组中的一种以上盐。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在所述步骤(B)中，所述有机溶剂I包含甲苯。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在所述步骤(B)中，所述有机溶剂II包含氯仿。
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