KR102393786B1

KR102393786B1 - 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜의 정제 방법

Info

Publication number: KR102393786B1
Application number: KR1020197027935A
Authority: KR
Inventors: 미도리 히라이; 히로키 요시오카
Original assignee: 니치유 가부시키가이샤
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2018-03-22
Publication date: 2022-05-03
Also published as: KR20190127758A; WO2018180907A1; US10752732B2; EP3604382B1; JP6935059B2; EP3604382A1; EP3604382A4; CN110475800B; CA3058303A1; JP2018172645A; US20200079905A1; CN110475800A

Abstract

카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 효율 및 순도 좋게, 흡착제나 이온 교환 수지와 같은 폐기물이 나오지 않는, 공업적으로 실시 가능한 정제 방법을 제공한다. 폴리에틸렌글리콜 화합물의 수용액으로서, pH가 8~11인 수용액을 조제한다. 이 수용액과 혼합 유기용제를 15℃ 이상, 50℃ 이하의 온도에서 혼합하여, 유기층과 수층으로 분층시킨다. 혼합 유기용제에 있어서의 유기용제 I의 비율이 25~60질량%이며, 유기용제 II의 비율이 75~40질량%이다. 유기용제 I이, 톨루엔, 크실렌 등으로부터 선택되는 탄화수소계 용제이고, 상기 유기용제 II가 클로로포름 등으로부터 선택되는 할로겐화 탄화수소계 용제이며, 유기용제 I의 유기용제 II에 대한 혼합 비율(유기용제 I/유기용제 II) Y, 온도 T(℃), 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량 M이, 3.11×10^-6M＋0.084≤Y-0.0135T≤-1.77×10^-6M＋0.404의 관계를 만족한다.

Description

카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜의 정제 방법

본 발명은, 의약 용도에 이용되는 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 정제 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은, 드러그 딜리버리 시스템에 있어서의 화학 수식 용도의 활성화 폴리에틸렌글리콜이며, 또한 그 원료로서 이용되는 고순도의 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 얻는 정제 방법이다.

본 발명은, 폴리펩티드, 효소, 항체나 그 외 저분자 약물이나 유전자, 올리고 핵산 등을 포함하는 핵산 화합물, 핵산 의약이나 그 밖의 생리 활성 물질의 수식, 또는, 리포솜, 폴리머 미셀, 나노파티클 등의 드러그 딜리버리 시스템 캐리어로의 응용을 포함하는 의약 용도에 특히 적합하다.

폴리에틸렌글리콜(PEG)은, 드러그 딜리버리 시스템에 있어서의 표준적인 담체로서 널리 알려져 있으며, 현재도 정력적으로 개발이 진행되고 있다. 폴리에틸렌글리콜을 생리 활성 물질이나 리포솜 등의 약제에 수식함으로써, 폴리에틸렌글리콜의 높은 수화층과 입체 반발 효과에 의해, 약제의 세망내피계(RES)에 의한 보충이나 신장에서의 배설 작용을 억제하여, 혈중 체류성의 개선 및 항원성의 저감이 가능하다. 그 중에서도 말단에 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜은, 단백질의 리신 잔기나 N 말단의 1급 아미노기와 안정적인 아미드 결합을 형성하는 활성화 에스테르체나, 그 밖의 활성기로 변환하기 위한 원료가 되므로 특히 중요한 소재이다. 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 원료로서 사용한 PEG화 제제로서는, SOMAVERT(등록상표) : PEGVISOMANT(Pfizer), Mircera(등록상표) : Methoxy Polyethylene glycol-epoetin beta(F Hoffmann-La Roche), Macugen(등록상표) : Pegaptanib(Eyetech) 등이 이미 출시되어 있다. 또한, 그 밖에도 많은 PEG화 제제의 임상시험이 행해지고 있으며, 그 유용성을 입증하고 있다.

이러한 의약 용도를 목적으로 한 활성화 폴리에틸렌글리콜은, 이를 수식하여 제조되는 약제의 성능이나 안전성의 관점에서 불순물이 적은 것이 요구되어 왔다. 현재, 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물에는, 여러 가지 골격, 및 카복실기와 폴리에틸렌글리콜 사이의 링커를 갖는 것이 개발되어 있으며, 그 제조 방법에 의해 부생되는 불순물은 다양하다. 이하에 그 예를 나타낸다.

카복실기를 갖는 직쇄형의 폴리에틸렌글리콜의 제조 방법으로서는, 비특허문헌 1에 기재된 폴리에틸렌글리콜의 말단 히드록실기를 중금속 시약에 의해 산화하는 방법, 특허문헌 1에 기재된 폴리에틸렌글리콜의 말단 히드록실기와 아크릴산에스테르 화합물을 Michael 반응에 의해 결합시킨 후, 에스테르 가수분해를 행하는 방법, 특허문헌 2에 기재된 폴리에틸렌글리콜의 말단 히드록실기와 탈리기를 갖는 오르토에스테르 화합물을 Williamson 반응에 의해 결합시킨 후, 가수분해를 행하는 방법 등이 지금까지 보고되어 있다.

또, 카복실기를 1개 갖는 분기형의 폴리에틸렌글리콜에 관해, 특허문헌 3에는 리신에틸에스테르의 2개의 아미노기에 메톡시폴리에틸렌글리콜을 도입한 후에, 에스테르의 가수분해를 행하는 방법 등이 보고되어 있다.

그러나, 상술한 어느 제조 방법에서나 폴리에틸렌글리콜 말단의 카복실기로의 변환율은 높지 않고, 가장 높은 것으로 카본산 순도는 90% 전후이다. 이 상태로 약제에 수식한 경우, 목적의 PEG화 제제 외에, 미반응의 약제나 미반응 또는 활성 상실한 폴리에틸렌글리콜 화합물 등의 불순물이 많이 포함되게 된다. PEG화 제제의 정제는, 분리가 곤란하다는 기술적 문제, 및 약물 수율의 저하에 의한 제조 비용의 상승과 같은 문제가 발생한다. 따라서, 불순물인 폴리에틸렌글리콜 화합물은, 가능한 한 약제와의 결합 전에 제거해 두는 것이 바람직하다.

폴리에틸렌글리콜과 같은 고분자 화합물로부터 저분자 화합물이나 염 등의 불순물을 제거하는 경우, 분자량에 기인하는 물리 화학적 성질, 특히 용매에 대한 용해성의 큰 차를 이용한 정석(晶析) 및 추출 조작에 의한 정제가 일반적이다. 한편, 불순물인 폴리에틸렌글리콜 화합물이 존재하는 경우, 불순물과 목적물인 폴리에틸렌글리콜 화합물의 사이에 용해성 등의 물리 화학적인 성질에 큰 차이가 나타나지 않는다. 그 때문에 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물로부터, 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물을, 저분자 불순물을 제거하는 일반적인 조작으로 제거, 정제하는 것은 곤란하다.

카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 정제 방법으로서는, 그 극성을 이용하여 이온 교환 수지에 의한 칼럼 정제가 행해지고 있으며, 특허문헌 4에서는 분기형의 폴리에틸렌글리콜에 대한 정제가 기재되어 있다. 그러나, 공정 중의 폴리에틸렌글리콜 화합물의 농도는, 분리능의 저하를 억제하기 위해 0.1~2% 정도로 고희석 조건이 아니면 안 되고, 분획 후에는 수용액 중의 폴리에틸렌글리콜 화합물을 회수하기 위한 대용량의 추출 설비 또는 농축 설비가 필요해지므로, 공업적인 생산성을 충분히 만족할 수 있는 것은 아니다. 또, 최종적으로 폐기물로서 대량의 이온 교환 수지가 나와 버리므로, 공업적으로 문제가 있는 정제법이다.

또, 특허문헌 5에 있어서는, 유기용제에 용해시킨 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 무기계 흡착제에 물리적으로 흡착시킨 후에, 알코올계 용제를 이용하여 탈착시킴으로써 정제하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 이 정제 방법에서는 탈착 반응이 불충분하여 수율이 50~60%로 낮다. 또, 최종적으로 폐기물로서 대량의 흡착제가 나와 버리므로, 공업적으로 문제가 있는 정제법이다.

한편, 특허문헌 6에 있어서는, 아미노기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 pH1~3의 강산성 수용액 중에 용해시켜 말단 아미노기를 이온화하여, 특정 혼합 유기용제를 이용하여 특정 온도 범위에서 추출함으로써 정제하는 방법이 기재되어 있다. 이 특허에 있어서는, 이온화에 의해 친수성이 높아진 아미노기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물이 수층에 분배되고, 아미노기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물은 혼합 유기층에 분배되므로, 선택적으로 분리, 정제할 수 있다.

일본국 특허 5015608호 공보 일본국 특허 4959133호 공보 미국 특허 6113609호 명세서 미국 특허 5932462호 명세서 일본국 특허 5618248호 공보 일본국 특허공개 2014-059754호 공보 일본국 특허공개 2004-197077호 공보 일본국 특허공표 평9-504299호 공보

J. Chromatography A 1986, 368, 309-317

그러나, 특허문헌 6에는, 카복실기를 가진 폴리에틸렌글리콜 화합물의 정제에 관한 기재는 없으며, 또, 이 정제 방법에서는 카복실기를 가진 폴리에틸렌글리콜 화합물을 이온화할 수 없으므로, 선택적으로 분리, 정제하는 것은 곤란하다.

또, 가령 카복실기를 이온화하는 것을 시도하였다고 해도, 카복실기와 아미노기는 동일한 극성기이지만, 물에 대한 용해성은 차이가 있다. 예를 들면, 동일 알킬쇄 길이를 갖는 n-부틸아민(n-C₄H₁₀NH₂)과 길초산(n-C₄H₁₀COOH)의 옥타놀수/분배 계수 Log Pow는 n-부틸아민 : 0.86, 길초산 : 1.39가 되어 있다. Log Pow는 화학 물질의 친유/친수성의 지표가 되는 값이며, 길초산은 n-부틸아민보다 옥타놀측으로 몰 농도로 약 3배 이행하기 쉬운, 즉 카복실기의 친유성이 높은 것이 나타나 있다. 따라서, 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 알칼리성 수용액 중에서 이온화한 경우, 카복실기와 아미노기에서는 이온화했을 때의 혼합 유기용제와 물에 대한 용해성이 다르므로, 아미노기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 정제하기 위해 최적화된 유기용제의 혼합 비율이나 특정 온도 범위를 적용할 수는 없다.

이와 같이, 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물은, 의약 용도에 있어서 중요한 소재임에도 불구하고, 공업적으로 제조 용이한 방법으로는 얻을 수 없어, 많은 과제를 갖고 있다.

본 발명의 과제는, 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을, 공업적으로 실시 가능한 방법으로 효율 및 순도 좋게 정제하는 것이다.

본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 특정 pH 범위의 알칼리성 수용액 중에서 이온화하여, 특정 비율로 혼합한 2종류 이상의 유기용제와 특정 pH의 알칼리성 수용액으로 이루어지는 계에 있어서, 특정 온도 범위에서 추출 조작을 행함으로써 정제하는 방법을 알아내었다.

본 발명의 특징은, 특정 pH의 범위에서, 특정 탄화수소계 용제와, 할로겐화 탄화수소계 용제를 혼합하는 비율과 추출 온도를 적절한 범위로 제어함으로써 실현 가능하고, 수지나 겔 등 대량의 담체/흡착제, 한외 여과막 등을 이용하지 않고, 큰 스케일에서도 실시 가능하므로 공업적인 점에 있다.

즉, 본 발명은, 이하의 것이다.

(1) 카복실기를 1개 갖고 있으며, 분자 내의 에틸렌옥시드 유닛의 합계 평균 부가 몰수가 20~1490인 폴리에틸렌글리콜 화합물을 정제하는 방법으로서,

이하의 공정 (A), 공정 (B) 및 공정 (C)를 갖는 것을 특징으로 하는, 폴리에틸렌글리콜 화합물의 정제 방법.

(A) 상기 폴리에틸렌글리콜 화합물의 수용액으로서, pH가 8~11인 약알칼리성 수용액을 조제하는 공정

(B) 상기 공정 (A)에서 얻어진 상기 수용액과 혼합 유기용제를 15℃ 이상, 50℃ 이하의 온도에서 혼합하여, 유기층과 수층으로 분층시키고, 이 때 상기 혼합 유기용제에 있어서의 유기용제 I의 비율이 25~60질량%이고, 유기용제 II의 비율이 75~40질량%이며, 상기 유기용제 I이, 톨루엔, 크실렌, 아세트산메틸, 아세트산에틸 및 아세트산부틸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 탄화수소계 용제이고, 상기 유기용제 II가 염화메틸렌 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 할로겐화 탄화수소계 용제이며, 상기 유기용제 I의 상기 유기용제 II에 대한 혼합 비율(유기용제 I/유기용제 II) Y, 상기 혼합 시의 온도 T(℃) 및 상기 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량 M이, 식 (1)의 관계를 만족하는 추출 공정

3.11×10^-6M＋0.084≤Y-0.0135T≤-1.77×10^-6M＋0.404 ··(1)

(C) 상기 수층으로부터 상기 폴리에틸렌글리콜 화합물을 회수하는 공정

(2) 상기 공정 (B)에 있어서, 상기 유기용제 I의 상기 유기용제 II에 대한 혼합 비율(유기용제 I/유기용제 II) Y, 상기 혼합 시의 온도 T(℃) 및 상기 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량 M이, 식 (2)의 관계를 만족하는 것을 특징으로 하는, (1)의 방법.

2.03×10^-6M＋0.175≤Y-0.0135T≤-1.77×10^-6M＋0.404 ··(2)

(3) 상기 공정 (B)에 있어서 분층된 상기 수층에 대해, 상기 추출 공정 (B)를 복수회 실시하는 것을 특징으로 하는, (1) 또는 (2)의 방법.

(4) 상기 공정 (A)에 있어서, 상기 약알칼리성 수용액이 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는, (1)~(3) 중 어느 하나의 방법.

(5) 상기 공정 (A)에 있어서, 상기 완충제가, 나트륨, 칼륨, 리튬 및 암모늄으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 원소의 유기염 및 무기염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 염인 것을 특징으로 하는, (4)의 방법.

(6) 상기 공정 (B)에 있어서, 상기 유기용제 I이 톨루엔을 포함하는 것을 특징으로 하는, (1)~(5) 중 어느 하나의 방법.

상기 공정 (B)에 있어서, 상기 유기용제 II가 클로로포름을 포함하는 것을 특징으로 하는, (1)~(6) 중 어느 하나의 방법.

본 발명은, 의약 용도를 목적으로 한 고순도의 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 얻기 위한 신규의 정제법이다. 이 정제 방법은, 종래의 기술에서는 분리가 곤란한, 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 분리하는 것이 가능하다. 또, 폴리에틸렌글리콜 화합물 중에 아미드 결합이나 카바메이트 결합과 같은 가수분해성의 링커가 있는 경우도 결합의 분해가 일어나기 어렵고, 품질의 저하를 방지하는 것이 가능하다. 또, 공업적으로 용이하게 실시 가능하고, 생산성이 우수하며, 흡착제나 이온 교환 수지와 같은 폐기물을 생성하지 않는 공정에서 고수율로 실시하는 것이 가능하다.

도 1은, 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량이 5,000인 경우의 용제의 혼합 비율 Y와 추출 온도 T의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 2는, 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량이 40,000인 경우의 용제의 혼합 비율 Y와 추출 온도 T의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 어떤 중량 평균 분자량 M에 있어서의 폴리에틸렌글리콜 화합물의 용제 혼합 비율 Y와 추출 온도 T의 관계성을 나타낸 그래프이며, 정제 처리가 가능한 범위를 나타낸 그래프이다.
도 4는, 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량 M과, 용제 혼합 비율 Y의 절편의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 5는, 실시예 6에서 추출 정제에 이용한 원료의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은, 실시예 6에서 얻어진 정제품의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

본 발명의, 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물이란, 폴리에틸렌글리콜 분자 내에 다른 분자와 반응시킬 수 있는 카복실기를 1개 갖는 화합물을 말한다.

본 발명의, 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 분자 내의 에틸렌옥시드 유닛의 합계 평균 부가 몰수는 20 이상이며, 바람직하게는 40 이상, 보다 바람직하게는 110 이상이다. 또, 본 폴리에틸렌글리콜 화합물의 분자 내의 에틸렌옥시드 유닛의 합계 평균 부가 몰수는 1490 이하이며, 바람직하게는 1370 이하이다.

본 발명의 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량은, 1000 이상이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 2000 이상이며, 보다 바람직하게는 5000 이상이다. 또, 본 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량은 65573 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 60263 이하이다.

본 발명의 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물은, 직쇄형 또는 분기형의 구조를 갖고 있다. 분기형은, 바람직하게는, 글리세린 골격, 리신 골격, 펜타에리트리톨 골격, 자일리톨 골격이며, 보다 바람직하게는, 글리세린 골격 및 리신 골격이다. 이들 화합물은, 예를 들면 특허문헌 7(일본국 특허공개 2004-197077호 공보)과 같이 1가 또는 다가의 수산기를 갖는 출발 물질로부터 에틸렌옥시드를 중합하는 공정과 그 후의 활성화 공정을 거쳐 얻어지거나, 또는 특허문헌 8(일본국 특허공표 평9-504299호 공보)과 같이 전형적으로는 2개 이상의 직쇄형 폴리에틸렌글리콜의 커플링 반응과 활성화 공정을 거쳐 얻어진다.

본 발명에서 정제할 수 있는 폴리에틸렌글리콜 화합물은 구조 중에 카복실기를 1개만 갖는 것이다. 카복실기 이외의 폴리에틸렌글리콜쇄의 말단에 결합되어 있는 관능기로서는, 탄소수 1 내지 7의 탄화수소기, 약알칼리 수용액 중에서 안정적인 반응성 관능기, 또는 관능기의 보호기이다. 탄소수 1 내지 7의 탄화수소기로서는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 헥실기, 이소헥실기, 헵틸기, 이소헵틸기 등의 알킬기, 페닐기, 벤질기 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 탄화수소기로서는 메틸기, 에틸기, tert-부틸기, 벤질기이며, 보다 바람직하게는 메틸기이다. 약알칼리 수용액 중에서 안정적인 반응성 관능기는, 바람직하게는 아미노기, 옥시아미노기, 수산기, 티올기, 시아노기, 아미드기이다. 관능기의 보호기는, 바람직하게는 아미노기, 카복실기, 수산기, 티올기, 히드라진기, 히드라지드기, 옥시아미노기의 보호기 중 약알칼리성 수용액 중에서 안정적인 것이다.

(공정 (A))

카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 수용액으로서, pH가 8~11인 약알칼리성 수용액을 조제하는 공정이다.

약알칼리성 수용액의 pH는, 낮으면 카복실기의 이온화가 불충분하여, 폴리에틸렌글리콜 화합물의 친수성을 증가시킬 수 없으며, 높으면 폴리에틸렌글리콜 화합물 중에 아미드 결합이나 카바메이트 결합과 같은 가수분해성의 링커가 있는 경우에 결합의 분해가 일어날 우려가 있으므로, 8~11로 하고, 바람직하게는 8~10이다.

약알칼리성 수용액은 pH의 변동을 완화하기 위한 완충제를 포함하고 있어도 된다. 완충제로서는, pH를 8~11로 유지하기 위해 통상 이용되는 완충성을 나타내는 유기염이나 무기염을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 나트륨, 칼륨, 리튬 또는 암모늄으로 이루어지는, 인산염, 아세트산염, 탄산염, 중탄산염, 붕산염, 구연산염, 프탈산염, 주석산염 또는 젖산염 등의 유기염 및 무기염이 포함된다. 또, 이들 복수의 유기염이나 무기염을 조합하여 이용해도 된다.

완충제의 농도는, 본 발명의 용액을, 목적으로 하는 pH8~11로 유지하기 위해 충분하면 특별히 한정되지 않지만, 낮으면 완충 작용이 발현되지 않고, 높으면 폴리에틸렌글리콜 화합물의 물에 대한 용해성이 저하하여, 목적물이 유기층측에 분배되기 쉬워져, 수율이 저하할 우려가 있으므로, 본 발명의 수용액의 총량에 대해 10~500mM의 농도가 되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 25~300mM이다.

사용하는 약알칼리성 수용액의 질량은, 폴리에틸렌글리콜 화합물의 1~50질량배로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 2~20질량배이다. 특히 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 5~20질량배이다.

(공정 (B))

유기용제와, 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물이 용해된 약알칼리성 수용액을 교반이나 진탕 등에 의해 혼합하여, 일정 시간 이를 정치함으로써 유기층과 수층으로 분층시키는 공정이다. 이 추출 공정에 있어서, 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물은, 미리 유기용제에 용해시킨 상태로 약알칼리성 수용액과 혼합하면, 유화에 의해 불순물의 분리, 목적물의 회수가 불가능해질 가능성이 높기 때문에, 미리 약알칼리성 수용액에 용해되어 있는 것이 바람직하다.

공정 중의 혼합, 분층의 시간은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1분~12시간의 사이이며, 보다 바람직하게는 10분~3시간이다. 또, 이 추출 조작을 실시하는 분위기는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 산화를 최소한으로 억제하는 것을 목적으로 하여, 질소 등의 불활성 가스 존재 하에서 행할 수도 있다. 또, 장치도 특별히 한정되지 않지만, 산화 열화가 일어나기 어려운 질소 하이며 또한 밀폐 상태에서의 조작을 고려하여 내압 용기에서 행할 수도 있다.

사용하는 유기용제 I은, 톨루엔, 크실렌, 아세트산메틸, 아세트산에틸, 아세트산부틸로부터 선택되는 탄화수소계 용제이며, 바람직하게는, 톨루엔, 아세트산에틸이고, 보다 바람직하게는 톨루엔이다.

사용하는 유기용제 II는, 염화메틸렌, 클로로포름으로부터 선택되는 할로겐화 탄화수소계 용제이며, 바람직하게는 클로로포름이다.

사용하는 일반적인 폴리에틸렌글리콜 화합물은 특유의 용해성을 나타내며, 그 용해성은, 유기용제 II＞물＞유기용제 I이다. 한편, 이온화된 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물은, 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물보다 약간 친수성이 높다. 그 때문에, 유기용제 I에 유기용제 II를 적당량 혼합한 유기용제를 이용하면, 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 용해성은, 물＞(유기용제 I＋유기용제 II)가 되고, 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 용해성은, (유기용제 I＋유기용제 II)＞물이 된다. 즉, 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물은 수층에 분배하고, 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물은 유기층에 분배하므로, 선택적으로 분리, 정제할 수 있다.

사용하는 유기용제는, 혼합 비율이, 유기용제 I : 25~60질량%, 유기용제 II : 75~40질량%인 혼합 용액이다. 유기용제 I의 비중은 1보다 작고, 유기용제 II의 비중은 1보다 크기 때문에, 유기용제 I의 비율이 증가하면, 혼합 용제의 비중이 수용액의 비중에 가까워지므로 분층성이 나빠지는 경향이 있다. 그 때문에, 혼합 비율이, 유기용제 I : 25~50질량%, 유기용제 II : 75~50질량%인 혼합 용액인 것이 바람직하다.

하기의 실시예에서 나타내지만, 유기용제 I의 유기용제 II에 대한 혼합 비율(유기용제 I/유기용제 II)을 Y, 공정 (B)에 있어서의 온도를 T(℃), 및 상기 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량을 M으로 했을 때, 이하의 식 (1)의 관계를 만족하는 범위에서 정제가 가능하다. 이에 따라, 고순도의 상기 폴리에틸렌글리콜 화합물을 처음으로 공업적으로 분리 가능한 정제 방법을 제공하는 것에 성공하였다.

3.11×10^-6M＋0.084≤Y-0.0135T≤-1.77×10^-6M＋0.404 (1)

사용하는 유기용제 I과 II의 질량은, 각각 폴리에틸렌글리콜 화합물의 1~50질량배가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 각각 폴리에틸렌글리콜 화합물의 2~20질량배이다. 특히 바람직하게는, 각각 폴리에틸렌글리콜 화합물의 5~20질량배이다.

추출 조작을 행하는 온도로서는, 온도가 높아지면 유기용제의 휘발에 의해 용제의 혼합 비율이 변화하여 폴리에틸렌글리콜 화합물의 용해성이 변화할 우려가 있으므로, 50℃ 이하가 바람직하고, 45℃ 이하가 보다 바람직하며, 35℃ 이하가 더욱 바람직하다. 또, 추출 조작을 행하는 온도로서는, 온도가 낮아지면 폴리에틸렌글리콜의 점성이 증대하므로, 10℃ 이상이 바람직하고, 15℃ 이상이 보다 바람직하며, 20℃ 이상이 더욱 바람직하다.

(공정 (C))

추출 후의 수층으로부터 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 회수하는 방법이다.

카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 포함한 약알칼리성 수용액을 산에 의해 중성, 또는 산성으로 한다. 그 후, 유기층으로의 추출을 거쳐, 농축, 결정화, 건조 등 중 어느 하나를 포함하는 공정에 의해 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 회수한다.

[실시예]

이하에, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예에 있어서 분리, 제거되는 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 불순물은, 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물과 중량 평균 분자량이 동일한 정도의 불순물이다. 또한, 폴리에틸렌글리콜 화합물의 분석에는 GPC, HPLC를 사용하였다. 실시예 중에 기재되어 있는 카본산 수율이란, (정제 후의 질량(g)×정제 후의 카본산 순도(%))÷(원료의 질량(g)×원료의 카본산 순도(%))×100을 말한다.

폴리에틸렌글리콜 화합물의 분자량은, GPC 시스템으로서 LC-10Avp(시마즈)를 이용하여, 이하의 조건으로 측정을 행하였다.

GPC 장치 : LC-10Avp(시마즈)

이동상 : DMF(10mM LiBr)

유속 : 0.7ml/min

칼럼 : PL gel MIXED-D(폴리머 라보라토리)

칼럼 온도 : 65℃

검출기 : RI

주입량 : 30mg/30mL(100μl)

검량선은, 폴리에틸렌글리콜 화합물을 표준 물질로 하여 작성하였다.

폴리에틸렌글리콜 화합물의 카본산 순도는, HPLC 시스템으로서 alliance(Waters)를 이용하여, 이하의 조건으로 측정을 행하였다.

HPLC 장치 : alliance(Waters)

이동상 : 포름산암모늄 완충액(용매 : 물, pH : 8.0)

유속 : 1.0ml/min

칼럼 : 음이온 교환 칼럼 ES-502N(Asahipak)

칼럼 온도 : 30℃

검출기 : RI

주입량 : 10mg/mL(20μl)

약알칼리성 수용액 중에서, 이온화된 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물은 추출 시에 주로 수층에 남고, 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물은 유기층으로 이동하는 경향이 있으므로 정제가 가능해진다. 그러나, 적절한 용제의 혼합 비율 및 추출 온도로 추출을 실시하지 않으면 정제를 할 수는 없다.

우선, 유기층으로부터 폴리에틸렌글리콜 화합물이 얻어지기 시작하는 용제의 혼합 비율 Y를 Y1로 한다. Y1은, 본 발명의 추출 방법에 의해 정제가 가능해지는 혼합 비율의 지표이다. 즉, 불순물인 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물이 우선하여 유기층에 분배되기 시작하는 점이다. 용제의 혼합 비율 Y가 Y1보다 큰 경우는, 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물이 유기층에 분배, 제거되지 않으므로 정제는 불가능하다.

다음에, 용제의 혼합 비율 Y를 Y1보다 낮춰 추출을 행하면, 유기층으로부터 얻어지는 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 질량은 증가하지만, 어떤 혼합 비율로부터는 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜도 유기층에 분배되게 된다. 그리고, 유기층을 농축하여 얻어지는 폴리에틸렌글리콜 화합물 중에 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물이 20질량% 포함되는 혼합 비율 Y를 Y2로 한다. Y2는, 추출에 의한 카본산 수율에 관한 혼합 비율의 지표이며, 효율적인 정제가 가능한 하한치이다. 용제의 혼합 비율 Y가 Y2보다 작은 경우는, 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물과 함께 목적물인 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물이 유기층으로 분배, 제거되므로, 정제 후의 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 카본산 수율이 저하하게 된다.

혼합 비율 Y가 Y2인 경우의 카본산 수율을 보다 구체적으로 설명한다. 카본산 순도 90%의 폴리에틸렌글리콜 화합물 100g을 이용해 추출하여, 유기층을 농축한 바, 농축물이 10g 얻어진 것으로 한다. 이 농축물의 20%에 해당하는 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 질량은, 10g×20%÷100=2g이다. 카본산 수율의 저하로서는, 2g÷(100g×90%÷100)×100=2.2%가 된다.

Y1, Y2의 관계는, 항상 Y1＞Y2이다.

따라서, 상기 용제의 혼합 비율 Y가 Y1과 Y2의 사이에 있으면(Y1＞Y＞Y2), 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 추출에 의해, 공업적으로 이용 가능한 효율로 정제할 수 있는 것을 의미한다.

또한, 유기층을 농축하여 얻어지는 폴리에틸렌글리콜 화합물 중에 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물이 5질량% 포함되는 혼합 비율 Y를 Y3으로 한다. Y3은 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 유기층으로의 손실이 Y2보다 적어, 효율적인 정제가 가능한 바람직한 하한치이다.

혼합 비율 Y가 Y3인 경우의 카본산 수율을 보다 구체적으로 설명한다. 카본산 순도 90%의 폴리에틸렌글리콜 화합물 100g을 이용해 추출하여, 유기층을 농축한 바, 농축물이 10g 얻어지는 것으로 한다. 이 농축물의 5%에 해당하는 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 질량은, 10g×5%÷100=0.5g이다. 카본산 수율의 저하로서는, 0.5g÷(100g×90%÷100)×100=0.55%가 된다.

Y1, Y2 및 Y3의 관계는, 항상 Y1＞Y3＞Y2이다.

상기 용제의 혼합 비율 Y가 Y1과 Y3의 사이에 있으면(Y1＞Y＞Y3), 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 추출에 의해, 보다 바람직한 조건으로 공업적으로 이용 가능한 효율로 정제할 수 있는 것을 의미한다.

여러 가지 분자량의 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물에 대해, 추출에 의한 정제의 효과를 조사하였다. 이하에 대표로서, 중량 평균 분자량 5000과 40000의 데이터를 들어 설명을 행한다.

처음에, 용제의 혼합 비율 Y 및 온도 T의 적절한 범위를 조사하였다.

카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 약알칼리 수용액에 용해시켰다. 유기용제 I과 유기용제 II의 혼합 용액을 더하여 추출 조작을 2회 행하였다. 유기층을 에바포레이터로 감압 증류 제거하여, 회수한 폴리에틸렌글리콜 화합물의 질량 측정 및 HPLC 측정을 행하였다. HPLC의 크로마토그램의 피크 면적비 및 질량으로부터, 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물 및 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 질량을 산출하였다. 이 추출 검토를, 다양한 추출 온도 및 용제의 혼합 비율의 조건 하에서 행하여, 각각의 온도에서의 Y1, Y2 및 Y3을 산출하였다. 세로축에 용제의 혼합 비율 Y, 가로축에 추출 온도 T를 취하여, Y1, Y2 및 Y3을 플롯하였다.

도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 중량 평균 분자량 M=5000 및 40000의 폴리에틸렌글리콜 화합물의 경우, Y1, Y2, Y3은 각각 온도 T의 함수로 하여 식 (3) 및 (4)와 같이 나타낼 수 있었다.

M=5000의 경우 :

Y1=0.0135T＋0.395, Y2=0.0135T＋0.100, Y3=0.0135T＋0.185 (3)

M=40000의 경우 :

Y1=0.0135T＋0.333, Y2=0.0135T＋0.209, Y3=0.0135T＋0.256 (4)

식 (3) 및 (4)로부터, 온도 변화에 대한 그래프의 기울기 0.0135는, 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량에 의존하지 않고, 일정한 것을 알 수 있었다. 즉, 도 3에 나타낸 바와 같이, 어떤 중량 평균 분자량 M의 폴리에틸렌글리콜 화합물을 이용하여 추출 정제를 행하는 경우, Y1, Y2 및 Y3은 각각 온도 T의 함수로 하고, 각 절편을 A, B 및 C로 했을 때에 식 (5)와 같이 나타낼 수 있다.

Y1=0.0135T＋A, Y2=0.0135T＋B, Y3=0.0135T+C …(5)

도 3에 나타낸 바와 같이, 추출에 의한 정제가 가능한 것은, 혼합 비율 Y가, 도 3의 Y≤0.0135T＋A 또한 Y≥0.0135T＋B를 만족하는 영역에 있을 때이며, 2개의 식을 합치면 식 (6)과 같이 나타낼 수 있다.

B≤Y-0.0135T≤A …(6)

바람직하게는, 도 3의 Y≤0.0135T＋A 또한 Y≥0.0135T＋C를 만족하는 영역이며, 2개의 식을 합치면 식 (7)과 같이 나타낼 수 있다.

C≤Y-0.0135T≤A …(7)

다음에, 도 4에 나타낸 바와 같이, 세로축에 Y의 절편, 가로축에 중량 평균 분자량 M을 취하여, 식 (3) 및 (4)에서 얻어진 A, B 및 C를 각각 플롯하였다. 도 4로부터 각 절편 A, B 및 C를 중량 평균 분자량 M의 함수로 하면, 식 (8)과 같이 나타낼 수 있다.

A=-1.77×10^-6M＋0.404

B=3.11×10^-6M＋0.084

C=2.03×10^-6M＋0.175 …(8)

이상을 정리하면, 유기용제 I의 유기용제 II에 대한 혼합 비율(유기용제 I/유기용제 II)을 Y, 공정 (B)에 있어서의 온도를 T(℃), 및 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량을 M으로 했을 때, 추출에 의한 정제가 가능한 범위는, 식 (6)과 식 (8)로부터 도출한

3.11×10^-6M＋0.084≤Y-0.0135T≤-1.77×10^-6M＋0.404

이며, 보다 바람직하게는 식 (7)과 식 (8)로부터 도출한

2.03×10^-6M＋0.175≤Y-0.0135T≤-1.77×10^-6M＋0.404

이다.

절편 A, B가 일치할 때, 도 4의 추출 정제가 가능한 영역은 존재하지 않는다. 이 때의 중량 평균 분자량 M은, A=B로부터, M=65573이다. 즉, 추출 정제가 가능한 중량 평균 분자량의 상한은, 65573이 된다. 보다 바람직하게는, 절편 A, C가 일치할 때이고, B=C로부터, M=60263이다. 즉, 보다 바람직한 추출 정제가 가능한 중량 평균 분자량의 상한은, 60263이 된다.

한편, 특허문헌 6에 의하면, 아미노기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 추출 정제가 가능한 중량 평균 분자량의 상한은 104167이었다. 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 추출 정제가 가능한 중량 평균 분자량의 상한이 낮아진 것은, 카복실기는 아미노기와 비교하면 친수성이 낮기 때문에, 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물과의 혼합 용제 및 수용액에 대한 용해성의 차가 작고, 선택적으로 분리 정제가 가능한 중량 평균 분자량 범위가 보다 좁은 것을 나타내고 있다.

(실시예 1)

본 예에서는, 중량 평균 분자량 M은 5000이고, 추출 온도 T는 27.5℃이며, Y는 0.53이다.

기계식 교반 장치, 온도계, 질소 주입관을 장착한 200mL의 4구 플라스크에, 식 [1]로 나타내어지는 α-메톡시-ω-카복시메틸-폴리에틸렌글리콜(중량 평균 분자량 : 5000, 카본산 순도 : 79.2%) : 5g을 넣어, 100mM 붕산 완충액(pH9) 50g에 용해시켰다. 이것에 톨루엔 : 16g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 27.5℃에서 30분 교반하고, 교반을 정지하고 같은 온도에서 30분간 정치하여 분층시켰다. 분층된 하층의 유기층을 빼내고, 새롭게 조제한 톨루엔 : 16g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 동일하게 추출 조작을 행하였다. 교반, 분층 후, 유기층을 빼내고, 남은 수층에 식염 : 10g을 첨가하여, 실온에서 교반, 용해시켰다.

이 수용액에 6N 염산을 첨가하여 pH를 2로 조정한 후에 클로로포름 : 25g을 더하여, 실온에서 30분간 교반하고, 교반을 정지하고 30분간 정치하여 분층시켰다. 하층의 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 유기층은 에바포레이터로 40℃에서 농축하고, 아세트산에틸 : 50g을 첨가하여 희석한 후, 황산마그네슘 : 1.5g으로 탈수, 여과하였다. 이것에 헥산 : 25g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 25g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여 정제품을 얻었다(3.9g, 카본산 순도 : 99.0%, 카본산 수율 : 98.5%).

(실시예 1-1)

실시예 1에 있어서, 추출 온도 27.5℃에서, 혼합 비율 Y를 여러 가지 변경하여, 농축물 질량 중의 α-메톡시-ω-카복시메틸-폴리에틸렌글리콜의 중량이 5%인 혼합 비율(Y1), 얻어지는 농축물이 최소인 혼합 비율(Y2), 20%인 혼합 비율(Y3)을 조사하였다. 그 결과, Y1은 0.751, Y2는 0.490, Y3은 0.565였다.

(실시예 1-2)

실시예 1에 있어서, 추출 온도 32.5℃에서, 혼합 비율 Y를 여러 가지 변경하여, Y1, Y2, Y3을 조사하였다. 그 결과, Y1은 0.842, Y2는 0.530, Y3은 0.620이었다.

(실시예 1-3)

실시예 1에 있어서, 추출 온도 22.5℃에서, 혼합 비율 Y를 여러 가지 변경하여, Y1, Y2, Y3를 조사하였다. 그 결과, Y1은 0.707, Y2는 0.395, Y3은 0.485였다.

실시예 1~3의 결과를 플롯한 것이 도 1이다.

(실시예 2)

본 예에서는, 중량 평균 분자량 M은 40000이고, 추출 온도 T는 27.5℃이며, Y는 0.63이다.

기계식 교반 장치, 온도계, 질소 주입관을 장착한 200mL의 4구 플라스크에, 식 [1]로 나타내어지는 α-메톡시-ω-카복시메틸-폴리에틸렌글리콜(중량 평균 분자량 : 40000, 카본산 순도 : 80.5%) : 5g을 넣어, 100mM 붕산 완충액(pH9) 50g에 용해시켰다. 이것에 톨루엔 : 19g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 27.5℃에서 30분 교반하고, 교반을 정지하고 같은 온도에서 30분간 정치하여 분층시켰다. 분층된 하층의 유기층을 빼내고, 새롭게 조제한 톨루엔 : 19g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 동일하게 추출 조작을 행하였다. 교반, 분층 후, 유기층을 빼내고, 남은 수층에 식염 : 10g을 첨가하여, 실온에서 교반, 용해시켰다. 이 수용액에 6N 염산을 첨가하여 pH를 2로 조정한 후에 클로로포름 : 25g을 더하여, 실온에서 30분간 교반하고, 교반을 정지하고 30분간 정치하여 분층시켰다. 하층의 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 유기층은 에바포레이터로 40℃에서 농축하고, 아세트산에틸 : 50g을 첨가하여 희석한 후, 황산마그네슘 : 1.5g으로 탈수, 여과하였다. 이것에 헥산 : 25g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 25g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여 정제품을 얻었다(3.8g, 카본산 순도 : 99.2%, 카본산 수율 : 93.7%).

(실시예 2-1)

실시예 1에 있어서, 추출 온도 27.5℃에서, 혼합 비율 Y를 여러 가지 변경하여, 농축물 질량 중의 α-메톡시-ω-카복시메틸-폴리에틸렌글리콜의 중량이 5%인 혼합 비율(Y1), 얻어지는 농축물이 최소인 혼합 비율(Y2), 20%인 혼합 비율(Y3)을 조사하였다. 그 결과, Y1은 0.704, Y2는 0.580, Y3은 0.627이었다.

(실시예 2-2)

실시예 1에 있어서, 추출 온도 32.5℃에서, 혼합 비율 Y를 여러 가지 변경하여, Y1, Y2, Y3을 조사하였다. 그 결과, Y1은 0.771, Y2는 0.648, Y3은 0.695였다.

(실시예 2-3)

실시예 1에 있어서, 추출 온도 22.5℃에서, 혼합 비율 Y를 여러 가지 변경하여, Y1, Y2, Y3을 조사하였다. 그 결과, Y1은 0.637, Y2는 0.513, Y3은 0.561이었다.

실시예 2-1~3의 결과를 플롯한 것이 도 2이다.

(실시예 3)

본 예에서는, 중량 평균 분자량 M은 5000이고, 추출 온도 T는 27.5℃이며, Y는 0.67이다.

기계식 교반 장치, 온도계, 질소 주입관을 장착한 200mL의 4구 플라스크에, 식 [2]로 나타내어지는 α-메톡시-ω-2-카복시에틸-폴리에틸렌글리콜(중량 평균 분자량 : 5000, 카본산 순도 : 78.1%) : 5g을 넣어, 50mM 붕산 완충액(pH9) 50g에 용해시켰다. 이것에 톨루엔 : 20g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 27.5℃에서 30분 교반하고, 교반을 정지하고 같은 온도에서 30분간 정치하여 분층시켰다. 분층된 하층의 유기층을 빼내고, 새롭게 조제한 톨루엔 : 20g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 동일하게 추출 조작을 행하였다. 교반, 분층 후, 유기층을 빼내고, 남은 수층에 식염 : 10g을 첨가하여, 실온에서 교반, 용해시켰다. 이 수용액에 6N 염산을 첨가하여 pH를 2로 조정한 후에 클로로포름 : 25g을 더하여, 실온에서 30분간 교반하고, 교반을 정지하고 30분간 정치하여 분층시켰다. 하층의 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 유기층은 에바포레이터로 40℃에서 농축하고, 아세트산에틸 : 50g을 첨가하여 희석한 후, 황산마그네슘 : 1.5g으로 탈수, 여과하였다. 이것에 헥산 : 25g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 25g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여 정제품을 얻었다(3.6g, 카본산 순도 : 99.0%, 카본산 수율 : 91.3%).

(실시예 4)

본 예에서는, 중량 평균 분자량 M은 20000이고, 추출 온도 T는 27.5℃이며, Y는 0.67이다.

기계식 교반 장치, 온도계, 질소 주입관을 장착한 200mL의 3구 플라스크에, 식 [3]으로 나타내어지는 α-메톡시-ω-5-카복시펜틸-폴리에틸렌글리콜(중량 평균 분자량 : 20000, 카본산 순도 : 79.5%) : 5g과 물 : 50g을 넣어, 질소 하에서 교반하면서 실온에서 용해시켰다. 이것에 1M 탄산나트륨 수용액을 첨가하여 pH를 10으로 조정하였다. 이것에 톨루엔 : 18g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 27.5℃에서 30분 교반하고, 교반을 정지하고 같은 온도에서 30분간 정치하여 분층시켰다. 분층된 하층의 유기층을 빼내고, 새롭게 조제한 톨루엔 : 20g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 동일하게 추출 조작을 행하였다. 교반, 분층 후, 유기층을 빼내고, 남은 수층에 식염 : 10g을 첨가하여, 실온에서 교반, 용해시켰다. 이 수용액에 6N 염산을 첨가하여 pH를 2로 조정한 후에 클로로포름 : 25g을 더하여, 실온에서 30분간 교반하고, 교반을 정지하고 30분간 정치하여 분층시켰다. 하층의 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 유기층은 에바포레이터로 40℃에서 농축하고, 아세트산에틸 : 50g을 첨가하여 희석한 후, 황산마그네슘 : 1.5g으로 탈수, 여과하였다. 이것에 헥산 : 25g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 25g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여 정제품을 얻었다(3.5g, 카본산 순도 : 99.3%, 카본산 수율 : 86.8%).

(실시예 5)

본 예에서는, 중량 평균 분자량 M은 10000이고, 추출 온도 T는 27.5℃이며, Y는 0.50이다.

기계식 교반 장치, 온도계, 질소 주입관을 장착한 200mL의 4구 플라스크에, 식 [4]로 나타내어지는 α-2-시아노에톡시-ω-5-카복시펜틸-폴리에틸렌글리콜(중량 평균 분자량 : 10000, 카본산 순도 : 81.7%) : 5g을 넣어, 100mM 붕산 완충액(pH9) 50g에 용해시켰다. 이것에 톨루엔 : 15g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 27.5℃에서 30분 교반하고, 교반을 정지하고 같은 온도에서 30분간 정치하여 분층시켰다. 분층된 하층의 유기층을 빼내고, 새롭게 조제한 톨루엔 : 15g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 동일하게 추출 조작을 행하였다. 교반, 분층 후, 유기층을 빼내고, 남은 수층에 식염 : 10g을 첨가하여, 실온에서 교반, 용해시켰다. 이 수용액에 6N 염산을 첨가하여 pH를 2로 조정한 후에 클로로포름 : 25g을 더하여, 실온에서 30분간 교반하고, 교반을 정지하고 30분간 정치하여 분층시켰다. 하층의 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 유기층은 에바포레이터로 40℃에서 농축하고, 아세트산에틸 : 50g을 첨가하여 희석한 후, 황산마그네슘 : 1.5g으로 탈수, 여과하였다. 이것에 헥산 : 25g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 25g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여 정제품을 얻었다(3.7g, 카본산 순도 : 99.1%, 카본산 수율 : 89.8%).

(실시예 6)

본 예에서는, 중량 평균 분자량 M은 40000이고, 추출 온도 T는 27.5℃이며, Y는 0.65이다.

기계식 교반 장치, 온도계, 질소 주입관을 장착한 200mL의 4구 플라스크에, 식 [5]로 나타내어지는 분기형 폴리에틸렌글리콜(중량 평균 분자량 : 40000, 카본산 순도 : 81.3%) : 10g을 넣어, 100mM 붕산 완충액(pH9) 100g에 용해시켰다. 이것에 톨루엔 : 39g과 클로로포름 : 60g의 혼합 용제를 더하여, 27.5℃에서 30분 교반하고, 교반을 정지하고 같은 온도에서 30분간 정치하여 분층시켰다. 분층된 하층의 유기층을 빼내고, 새롭게 조제한 톨루엔 : 39g과 클로로포름 : 60g의 혼합 용제를 더하여, 동일하게 추출 조작을 행하였다. 교반, 분층 후, 유기층을 빼내고, 남은 수층에 식염 : 25g을 첨가하여, 실온에서 교반, 용해시켰다. 이 수용액에 6N 염산을 첨가하여 pH를 3으로 조정한 후에 클로로포름 : 100g을 더하여, 실온에서 30분간 교반하고, 교반을 정지하고 30분간 정치하여 분층시켰다. 하층의 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 유기층은 에바포레이터로 40℃에서 농축하고, 아세트산에틸 : 100g을 첨가하여 희석한 후, 황산마그네슘 : 3.0g으로 탈수, 여과하였다. 이것에 헥산 : 50g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 50g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여 정제품을 얻었다(7.1g, 카본산 순도 : 99.3%, 카본산 수율 : 90.4%).

(비교예 1)

다음에, 특허문헌 4의 실시예와 동일한 방법으로 이온 교환 칼럼으로 정제를 행하여, 결과를 비교하였다.

φ6cm의 칼럼에, DEAE Sepharose FF(GE 헬스케어사제) 약 850ml를 높이가 30cm가 되도록 전개액은 이온 교환수를 이용하여 충전하였다. 식 [5]로 나타내어지는 분기형 폴리에틸렌글리콜 20g을 이온 교환수 4.4L에 용해시켜 칼럼에 차지 후, 정제한 [5]가 포함되는 프랙션을 TLC에 의해 확인하면서 용출액을 회수하였다. 회수한 용출액은, 식염을 더한 후에 클로로포름을 더하여, 실온에서 30분간 교반하고, 교반을 정지하고 30분간 정치하여 분층시켰다. 하층의 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 유기층은 에바포레이터로 40℃에서 농축하고, 아세트산에틸 : 50g을 첨가하여 희석한 후, 황산마그네슘 : 1.5g으로 탈수, 여과하였다. 이것에 헥산 : 25g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 25g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여 정제품을 얻었다(3.8g, 카본산 순도 : 99.3%, 카본산 수율 : 22.9%).

(비교예 2)

다음에, 특허문헌 5의 실시예와 동일한 방법으로 무기계 흡착제로 정제를 행하여, 결과를 비교하였다.

기계식 교반 장치, 딤로드 냉각관, 온도계, 질소 주입관을 장착한 1L 4구 플라스크에, 식 [5]로 나타내는 분기형 폴리에틸렌글리콜 30g과 톨루엔 : 450g을 넣어, 질소 하에서 교반하면서 55℃에서 용해시켰다. 이것에 쿄워드 200B(쿄와 화학 공업) : 120g을 첨가하여, 50℃에서 1시간 교반하고, 흡착 조작을 행한 후 여과하였다. 그 후, 미리 50℃로 가온해 둔 톨루엔 : 300g을 이용하여 여과 케이크의 세정을 행하였다. 그 후, 여과 케이크에 에탄올을 더하여 50℃에서 가온, 교반을 행한 후에 여과하여 여과액을 회수하였다. 50℃로 더 가온한 에탄올 300g으로 여과 케이크의 세정을 행하여, 여과액을 회수하였다. 여과액을 에바포레이터를 이용하여 농축하고, 아세트산에틸 : 50g을 첨가하여 희석한 후, 황산마그네슘 : 1.5g으로 탈수, 여과하였다. 이것에 헥산 : 25g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 25g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여 정제품을 얻었다(12.3g, 카본산 순도 : 99.4%, 카본산 수율 : 50.0%).

실시예 6, 비교예 1, 2의 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[표 1]

표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 정제 방법으로 얻어지는 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 카본산 순도는, 비교예 1의 이온 교환 수지에 의한 정제, 및 비교예 2의 무기계 흡착제에 의한 정제품과 동등하고, 카본산 수율에 대해서는 대폭으로 높은 결과가 되었다.

또한, 도 5는, 실시예 5에서 추출 정제에 이용한 원료의 HPLC 크로마토그램을 나타내고, 도 6은, 실시예 5에서 얻어진 정제품의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

다음에, 특허문헌 6에 기재된, 아미노기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 정제 가능 범위에서, 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 정제가 가능한지 비교 검토를 행하였다.

(비교예 3)

기계식 교반 장치, 온도계, 질소 주입관을 장착한 100mL의 3구 플라스크에, 식 [3]으로 나타내어지는 α-메톡시-ω-5-카복시펜틸-폴리에틸렌글리콜(중량 평균 분자량 : 20000, 카본산 순도 : 79.5%) : 5g과 물 : 50g을 넣어, 질소 하에서 교반하면서 실온에서 용해시켰다. 이 수용액에 6N 염산을 첨가하여 pH를 2로 조정하였다. 이것에 톨루엔 : 18g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 27.5℃에서 30분 교반하고, 교반을 정지하고 같은 온도에서 30분간 정치하여 분층시켰다. 분층된 하층의 유기층을 빼내고, 새롭게 조제한 톨루엔 : 18g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 동일하게 추출 조작을 행하였다. 교반, 분층 후, 유기층을 빼내고, 남은 수층에 식염 : 10g을 첨가하여, 실온에서 교반, 용해시켰다. 클로로포름 : 25g을 더하여, 실온에서 30분간 교반하고, 교반을 정지하고 30분간 정치하여 분층시켰다. 하층의 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 유기층은 에바포레이터로 40℃에서 농축하고, 아세트산에틸 : 50g을 첨가하여 희석한 후, 황산마그네슘 : 1.5g으로 탈수, 여과하였다. 이것에 헥산 : 25g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 25g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여 최종품을 얻었다. 얻어진 최종품의 카본산 순도는 64.3%였다.

이상과 같이, 산성 조건 하에서는 카복실기가 이온화되어 있지 않으므로 정제를 행할 수는 없었다.

다음에, 특허문헌 6에 기재된 아미노기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물이 정제 가능한 혼합 용제의 비율 및 온도에 있어서, 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 정제가 가능한지 비교예 4-1 및 비교예 4-2에 있어서 비교 검토를 행하였다.

(비교예 4-1)

본 예에서는, 중량 평균 분자량 M은 80000이고, 추출 온도 T는 27.5℃이며, Y는 0.67이다.

기계식 교반 장치, 딤로드 냉각관, 온도계, 질소 주입관을 장착한 200mL의 4구 플라스크에, 식 [6]으로 나타내어지는 분기형 폴리에틸렌글리콜 유도체(중량 평균 분자량 : 80000, 아민 순도 : 78.3%) : 5g과 물 : 50g을 넣어, 질소 하에서 교반하면서 실온에서 용해시켰다. 이것에 1N 염산을 첨가하여 pH를 2로 조정하였다. 이것에 톨루엔 : 20g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 27.5℃에서 30분 교반하고, 교반을 정지하고 같은 온도에서 30분간 정치하여 분층시켰다. 분층된 하층의 유기층을 빼내고, 새롭게 조제한 톨루엔 : 20g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 동일하게 추출 조작을 행하였다. 교반, 분층 후, 유기층을 빼내고, 남은 수층에 식염 : 10g을 첨가하여, 실온에서 교반, 용해시켰다. 이 용액에 1N NaOH aq를 첨가하여 pH를 12로 조정하였다. 천천히 교반하여 50℃가 될 때까지 가온하고, 톨루엔 : 37.5g을 첨가하여 50℃에서 30분간 교반하고, 교반을 정지하고 같은 온도에서 30분간 정치하여 분층시켰다. 하층의 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 톨루엔 : 37.5g을 첨가하여 재차 추출을 행하여, 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 유기층은 에바포레이터로 50℃에서 농축하고, 황산마그네슘 : 1.5g으로 탈수, 여과하였다. 여과 케이크를 톨루엔 : 10g으로 세정하여, 여과액과 합쳤다. 이 용액을 마그네틱 스터러를 이용하여 교반하면서 실온까지 냉각한 후, 이것에 헥산 : 25g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 40g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여, 정제품을 얻었다(3.7g, 아민 순도 : 97.4%, 아민 수율 : 92.1%).

(비교예 4-2)

기계식 교반 장치, 온도계, 질소 주입관을 장착한 100mL의 4구 플라스크에, 식 [7]로 나타내어지는 분기형 폴리에틸렌글리콜(중량 평균 분자량 : 80000, 카본산 순도 : 77.6%) : 5g을 넣어, 100mM 붕산 완충액(pH9) 50g에 용해시켰다. 이것에 톨루엔 : 20g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 27.5℃에서 30분 교반하고, 교반을 정지하고 같은 온도에서 30분간 정치하여 분층시켰다. 분층된 하층의 유기층을 빼내고, 새롭게 조제한 톨루엔 : 20g과 클로로포름 : 30g의 혼합 용제를 더하여, 동일하게 추출 조작을 행하였다. 교반, 분층 후, 유기층을 빼내고, 남은 수층에 식염 : 12.5g을 첨가하여, 실온에서 교반, 용해시켰다. 이 수용액에 6N 염산을 첨가하여 pH를 2로 조정한 후에 클로로포름 : 50g을 더하여, 실온에서 30분간 교반하고, 교반을 정지하고 30분간 정치하여 분층시켰다. 하층의 유기층을 가지형 플라스크에 회수하였다. 유기층은 에바포레이터로 40℃에서 농축하고, 아세트산에틸 : 50g을 첨가하여 희석한 후, 황산마그네슘 : 1.5g으로 탈수, 여과하였다. 이것에 헥산 : 25g을 더하여 결정을 석출시켰다. 이 슬러리를 30분 교반하고, 여과하여, 잔사를 25g의 헥산으로 세정한 후, 진공에서 건조를 행하여 정제품을 얻었다. 얻어진 최종품의 카본산 순도는 77.8%였다.

비교예 4-1 및 4-2에 나타낸 바와 같이, 아미노기를 1개 포함하는 폴리에틸렌글리콜 화합물이 정제 가능한 혼합 용제의 비율 및 온도에 있어서, 카복실기를 1개 포함하는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 정제를 행할 수는 없었다.

본 예에 의해, 카복실기는 아미노기와 비교하면 친수성이 낮기 때문에, 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물과 카복실기를 갖지 않는 폴리에틸렌글리콜 화합물의 혼합 용제 및 수용액에 대한 용해성의 차가 작고, 선택적으로 분리 정제가 가능한 중량 평균 분자량 범위가 보다 좁은 것이 나타났다.

이상으로부터, 본 발명은, 카복실기를 1개 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물을 고순도로, 수율 좋게, 공업적으로 제조할 수 있는 유용한 정제 방법이다.

본 발명을 특정 양태를 참조하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고 여러 가지 변경 및 수정이 가능한 것은, 당업자에게 있어서 분명하다.

또한, 본원은, 2017년 3월 30일자로 출원된 일본국 특허 출원(2017-066695)에 의거하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다. 또, 여기에 인용되는 모든 참조는 전체로서 도입된다.

Claims

카복실기를 1개 갖고 있으며, 분자 내의 에틸렌옥시드 유닛의 합계 평균 부가 몰수가 20~1490인 폴리에틸렌글리콜 화합물을 정제하는 방법으로서,
이하의 공정 (A), 공정 (B) 및 공정 (C)를 갖는 것을 특징으로 하는, 폴리에틸렌글리콜 화합물의 정제 방법.
(A) 상기 폴리에틸렌글리콜 화합물의 수용액으로서, pH가 8~11인 약알칼리성 수용액을 조제하는 공정
(B) 상기 공정 (A)에서 얻어진 상기 수용액과 혼합 유기용제를 15℃ 이상, 50℃ 이하의 온도에서 혼합하여, 유기층과 수층으로 분층시키고, 이 때 상기 혼합 유기용제에 있어서의 유기용제 I의 비율이 25~60질량%이고, 유기용제 II의 비율이 75~40질량%이며, 상기 유기용제 I이, 톨루엔, 크실렌, 아세트산메틸, 아세트산에틸 및 아세트산부틸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 탄화수소계 용제이고, 상기 유기용제 II가 염화메틸렌 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 할로겐화 탄화수소계 용제이며, 상기 유기용제 I의 상기 유기용제 II에 대한 혼합 비율(유기용제 I/유기용제 II) Y, 상기 혼합 시의 온도 T(℃) 및 상기 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량 M이, 식 (1)의 관계를 만족하는 추출 공정
3.11×10^-6M＋0.084≤Y-0.0135T≤-1.77×10^-6M＋0.404 ··(1)
(C) 상기 수층으로부터 상기 폴리에틸렌글리콜 화합물을 회수하는 공정
청구항 1에 있어서,
상기 공정 (B)에 있어서, 상기 유기용제 I의 상기 유기용제 II에 대한 혼합 비율(유기용제 I/유기용제 II) Y, 상기 혼합 시의 온도 T(℃) 및 상기 폴리에틸렌글리콜 화합물의 중량 평균 분자량 M이, 식 (2)의 관계를 만족하는 것을 특징으로 하는 방법.
2.03×10^-6M＋0.175≤Y-0.0135T≤-1.77×10^-6M＋0.404 ··(2)
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 공정 (B)에 있어서 분층된 상기 수층에 대해, 상기 추출 공정 (B)를 복수회 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 공정 (A)에 있어서, 상기 약알칼리성 수용액이 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 공정 (A)에 있어서, 상기 약알칼리성 수용액이 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서.
상기 공정 (A)에 있어서, 상기 완충제가, 나트륨, 칼륨, 리튬 및 암모늄으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 원소의 유기염 및 무기염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 염인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 5에 있어서,
상기 공정 (A)에 있어서, 상기 완충제가, 나트륨, 칼륨, 리튬 및 암모늄으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 원소의 유기염 및 무기염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 염인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 공정 (B)에 있어서, 상기 유기용제 I이 톨루엔을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 공정 (B)에 있어서, 상기 유기용제 II가 클로로포름을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.