WO2018180907A1 - カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコールの精製方法 - Google Patents

カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコールの精製方法 Download PDF

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polyethylene glycol
glycol compound
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carboxyl group
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翠 平居
宏樹 吉岡
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日油株式会社
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    • C08G65/332—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying a polyethylene glycol compound having one carboxyl group used for pharmaceutical use. More specifically, the present invention is a purification method for obtaining a polyethylene glycol compound having one high-purity carboxyl group used as a raw material for activated polyethylene glycol for chemical modification in a drug delivery system.
  • the present invention relates to nucleic acid compounds including polypeptides, enzymes, antibodies and other low molecular weight drugs and genes, oligonucleic acids, etc., modification of nucleic acid drugs and other physiologically active substances, or drug delivery such as liposomes, polymer micelles, nanoparticles, etc. Particularly suitable for pharmaceutical use including application to system carriers.
  • Polyethylene glycol (PEG) is widely known as a standard carrier in drug delivery systems, and is still under active development.
  • bioactive substances and drugs such as liposomes
  • the high hydration layer of polyethylene glycol and the steric repulsion effect suppress the supplementation of the drug by the reticuloendothelial system (RES) and the excretion in the kidney. It is possible to improve blood retention and reduce antigenicity.
  • polyethylene glycol having a carboxyl group at the terminal is an activated ester that forms a stable amide bond with a lysine residue of protein or a primary amino group at the N terminal, or a raw material for conversion to other active groups. Therefore, it is a particularly important material.
  • PEGylated preparations using polyethylene glycol having a carboxyl group as a raw material include SOMAVERT (registered trademark): PEGVISOMANT (Pfizer), Mircera (registered trademark): MethoxyMPolyethylene glycol-epoetin beta (F Hoffmann-La Roche), Macugen ( (Registered trademark): Pegaptanib (Eyetech) is already on the market. In addition, many other PEGylated preparations have been clinically tested and have proved their usefulness.
  • polyethylene glycol intended for such pharmaceutical use has been required to have less impurities from the viewpoint of the performance and safety of a drug produced by modifying it.
  • polyethylene glycol compounds having a carboxyl group have been developed having various skeletons and linkers between the carboxyl group and polyethylene glycol, and impurities produced as a by-product vary depending on the production method. An example is shown below.
  • a method for producing a linear polyethylene glycol having a carboxyl group a method of oxidizing a terminal hydroxyl group of polyethylene glycol described in Non-Patent Document 1 with a heavy metal reagent, a terminal hydroxyl group of polyethylene glycol described in Patent Document 1 and A method in which an acrylic ester compound is bonded by a Michael reaction, followed by ester hydrolysis, and an ortho ester compound having a terminal hydroxyl group and a leaving group of polyethylene glycol described in Patent Document 2 is bonded by a Williamson reaction. A method for performing hydrolysis has been reported so far.
  • Patent Document 3 reports a method of hydrolyzing an ester after introducing methoxypolyethylene glycol into two amino groups of lysine ethyl ester. .
  • the conversion rate to the carboxyl group at the end of polyethylene glycol is not high, and the highest is the carboxylic acid purity of around 90%.
  • many impurities such as an unreacted drug and an unreacted or deactivated polyethylene glycol compound are contained.
  • the purification of PEGylated preparations causes technical problems that it is difficult to separate, and problems such as an increase in manufacturing costs due to a decrease in drug yield. Therefore, it is desirable to remove the polyethylene glycol compound, which is an impurity, as much as possible before bonding with the drug.
  • Patent Document 4 describes purification of branched polyethylene glycol.
  • concentration of the polyethylene glycol compound in the process must be a high dilution condition of about 0.1-2% in order to suppress a decrease in the separation ability, and the polyethylene glycol compound in the aqueous solution is recovered after fractionation. Therefore, industrial productivity cannot be sufficiently satisfied.
  • ion exchange resin since a large amount of ion exchange resin is finally produced as waste, this is an industrially problematic purification method.
  • Patent Document 5 describes a method of purifying polyethylene glycol having a carboxyl group dissolved in an organic solvent by physically adsorbing it on an inorganic adsorbent and then desorbing it using an alcohol solvent. ing.
  • this purification method the desorption reaction is insufficient and the yield is as low as 50 to 60%.
  • Patent Document 6 a polyethylene glycol compound having an amino group is dissolved in a strongly acidic aqueous solution having a pH of 1 to 3, to ionize the terminal amino group, and extracted in a specific temperature range using a specific mixed organic solvent.
  • the method of purifying by is described.
  • polyethylene glycol compounds having amino groups whose hydrophilicity has been increased by ionization are distributed to the aqueous layer, and polyethylene glycol compounds having no amino groups are distributed to the mixed organic layer, so that they are selectively separated and purified. can do.
  • Patent Document 6 there is no description regarding purification of a polyethylene glycol compound having a carboxyl group, and since the polyethylene glycol compound having a carboxyl group cannot be ionized by this purification method, selective separation, It is difficult to purify.
  • octanol water / partition coefficient Log Pow of n-butylamine (nC 4 H 10 NH 2 ) and valeric acid (nC 4 H 10 COOH) having the same alkyl chain length is n-butylamine: 0.86, valeric acid: 1.39 ing.
  • Log Pow is a value indicating the lipophilicity / hydrophilicity of chemical substances, and valeric acid is likely to migrate approximately 3 times in molar concentration to the octanol side of n-butylamine, that is, the lipophilicity of the carboxyl group is high. It is shown. Therefore, when a polyethylene glycol compound having a carboxyl group is ionized in an alkaline aqueous solution, the solubility of the carboxyl group and the amino group in the mixed organic solvent and water when ionized is different, so that the polyethylene glycol having an amino group is purified. It is not possible to apply organic solvent mixing ratios or specific temperature ranges optimized for the above.
  • the polyethylene glycol compound having a carboxyl group is an important material for pharmaceutical use, but has not been obtained by an industrially easy-to-manufacture method and has many problems.
  • An object of the present invention is to purify a polyethylene glycol compound having one carboxyl group with high efficiency and purity by an industrially practicable method.
  • the present inventors have ionized a polyethylene glycol compound having one carboxyl group in an alkaline aqueous solution in a specific pH range, and mixed them at a specific ratio.
  • the present inventors have found a method of purifying by performing an extraction operation in a specific temperature range in a system composed of more than one kind of organic solvent and an alkaline aqueous solution having a specific pH.
  • the characteristics of the present invention can be realized by controlling the ratio of mixing a specific hydrocarbon solvent and a halogenated hydrocarbon solvent and the extraction temperature within a specific pH range to an appropriate range. It is industrial because it can be carried out on a large scale without using a large amount of carrier such as gel / adsorbent, ultrafiltration membrane, etc.
  • the present invention is as follows.
  • a method for purifying a polyethylene glycol compound having one carboxyl group and having a total average added mole number of ethylene oxide units in the molecule of 20 to 1490 A method for purifying a polyethylene glycol compound, comprising the following steps (A), (B) and (C).
  • B) The aqueous solution obtained in the step (A) and the mixed organic solvent are mixed at a temperature of 15 ° C. or higher and 50 ° C. or lower, and are separated into an organic layer and an aqueous layer.
  • the ratio of the organic solvent I is 25 to 60% by mass, the ratio of the organic solvent II is 75 to 40% by mass, and the organic solvent I is composed of toluene, xylene, methyl acetate, ethyl acetate, and butyl acetate.
  • the organic solvent II is a halogenated hydrocarbon solvent selected from the group consisting of methylene chloride and chloroform, and the mixing ratio of the organic solvent I to the organic solvent II (organic solvent I / Organic solvent II) Y, extraction step in which the mixing temperature T (° C.) and the weight average molecular weight M of the polyethylene glycol compound satisfy the relationship of formula (1) 3.11 ⁇ 10 ⁇ 6 M + 0.084 ⁇ Y ⁇ 0.0135T ⁇ -1.77 ⁇ 10 -6 M + 0.404 ⁇ ⁇ (1) (C) recovering the polyethylene glycol compound from the aqueous layer
  • step (B) the mixing ratio of the organic solvent I to the organic solvent II (organic solvent I / organic solvent II) Y, the temperature T (° C.) at the time of mixing, and the weight average of the polyethylene glycol compound
  • the molecular weight M satisfies the relationship of the formula (2). 2.03 ⁇ 10 ⁇ 6 M + 0.175 ⁇ Y ⁇ 0.0135T ⁇ -1.77 ⁇ 10 ⁇ 6 M + 0.404 ⁇ ⁇ (2)
  • the buffer is one or more selected from the group consisting of organic salts and inorganic salts of one or more elements selected from the group consisting of sodium, potassium, lithium and ammonium.
  • the present invention is a novel purification method for obtaining a polyethylene glycol compound having one highly pure carboxyl group for the purpose of pharmaceutical use.
  • This purification method can separate a polyethylene glycol compound having no carboxyl group, which is difficult to separate by conventional techniques.
  • a polyethylene glycol compound has a hydrolyzable linker such as an amide bond or a carbamate bond, the bond is hardly decomposed, and the quality can be prevented from deteriorating.
  • it can be easily carried out industrially, is excellent in productivity, and can be carried out at a high yield in a process that does not generate waste such as an adsorbent and an ion exchange resin.
  • 4 is a graph showing the relationship between the solvent mixing ratio Y and the extraction temperature T when the weight average molecular weight of the polyethylene glycol compound is 5,000.
  • 3 is a graph showing the relationship between the solvent mixing ratio Y and the extraction temperature T when the weight average molecular weight of the polyethylene glycol compound is 40,000. It is a graph which shows the relationship between the solvent mixing ratio Y of the polyethyleneglycol compound in a certain weight average molecular weight M, and extraction temperature T, and is a graph which shows the range which can be refined
  • 4 is a graph showing the relationship between the weight average molecular weight M of a polyethylene glycol compound and the intercept of the solvent mixing ratio Y.
  • purification in Example 6 is shown.
  • the HPLC chromatogram of the refined product obtained in Example 6 is shown.
  • the polyethylene glycol compound having one carboxyl group of the present invention is a compound having one carboxyl group that can be reacted with another molecule in the polyethylene glycol molecule.
  • the total average added mole number of ethylene oxide units in the molecule of the polyethylene glycol compound having one carboxyl group of the present invention is 20 or more, preferably 40 or more, more preferably 110 or more. Further, the total average number of added moles of ethylene oxide units in the molecule of the polyethylene glycol compound is 1490 or less, preferably 1370 or less.
  • the weight average weight average molecular weight of the polyethylene glycol compound having one carboxyl group of the present invention is preferably 1000 or more, more preferably 2000 or more, more preferably 5000 or more. Further, the weight average molecular weight of the polyethylene glycol compound is preferably 65573 or less, more preferably 60263 or less.
  • the polyethylene glycol compound having one carboxyl group of the present invention has a linear or branched structure.
  • the branched type is preferably a glycerin skeleton, a lysine skeleton, a pentaerythritol skeleton, or a xylitol skeleton, and more preferably a glycerin skeleton or a lysine skeleton.
  • These compounds can be obtained through a step of polymerizing ethylene oxide from a starting material having a monovalent or polyvalent hydroxyl group and a subsequent activation step as in Patent Document 7 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-197077), Alternatively, it is typically obtained through a coupling reaction and activation step of two or more linear polyethylene glycols as disclosed in Patent Document 8 (Japanese Patent Publication No. 9-504299).
  • the polyethylene glycol compound that can be purified by the present invention has only one carboxyl group in the structure.
  • the functional group bonded to the end of the polyethylene glycol chain other than the carboxyl group is a hydrocarbon group having 1 to 7 carbon atoms, a reactive functional group stable in a weak alkaline aqueous solution, or a protective group for the functional group.
  • Examples of the hydrocarbon group having 1 to 7 carbon atoms include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, hexyl, and isohexyl.
  • the hydrocarbon group is a methyl group, an ethyl group, a tert-butyl group, or a benzyl group, and more preferably a methyl group.
  • the reactive functional group stable in the weak alkaline aqueous solution is preferably an amino group, an oxyamino group, a hydroxyl group, a thiol group, a cyano group, or an azide group.
  • the protective group for the functional group is preferably one that is stable in a weak alkaline aqueous solution among the protective groups for amino group, carboxyl group, hydroxyl group, thiol group, hydrazine group, hydrazide group, and oxyamino group.
  • Process (A) This is a step of preparing an aqueous solution of a polyethylene glycol compound having one carboxyl group and having a pH of 8-11.
  • the pH of the weak alkaline aqueous solution is low, the ionization of the carboxyl group is insufficient and the hydrophilicity of the polyethylene glycol compound cannot be increased, and if it is high, the hydrolyzability such as amide bond or carbamate bond in the polyethylene glycol compound.
  • the bond will be decomposed, so that it is 8 to 11, preferably 8 to 10.
  • the weak alkaline aqueous solution may contain a buffering agent for alleviating pH fluctuations.
  • a buffering agent for alleviating pH fluctuations.
  • an organic salt or an inorganic salt having a buffering property which is usually used for maintaining pH of 8 to 11 can be used.
  • organic compounds such as phosphate, acetate, carbonate, bicarbonate, borate, citrate, phthalate, tartrate or lactate composed of sodium, potassium, lithium or ammonium. Salts and inorganic salts are included. Moreover, you may use combining these some organic salt and inorganic salt.
  • the concentration of the buffering agent is not particularly limited as long as it is sufficient to maintain the solution of the present invention at the intended pH of 8-11.
  • the concentration of the aqueous solution of the present invention is preferably 10 to 500 mM because the solubility of the aqueous solution of the present invention is reduced, the target product is likely to be distributed to the organic layer side, and the yield may be reduced. Preferably, it is 25 to 300 mM.
  • the weight of the weak alkaline aqueous solution used is preferably 1 to 50 times by mass of the polyethylene glycol compound, more preferably 2 to 20 times by mass of the polyethylene glycol compound. Particularly preferred is 5 to 20 times the mass of the polyethylene glycol compound.
  • Process (B) This is a step of mixing an organic solvent and a weakly alkaline aqueous solution in which a polyethylene glycol compound having one carboxyl group is dissolved by stirring or shaking, and letting it stand for a certain period of time to separate it into an organic layer and an aqueous layer. .
  • this extraction step when a polyethylene glycol compound having one carboxyl group is mixed with a weak alkaline aqueous solution in a state of being previously dissolved in an organic solvent, it is highly likely that impurities cannot be separated and the target product cannot be recovered by emulsification. For this reason, it is preferably dissolved in advance in a weak alkaline aqueous solution.
  • the mixing and layering time in the process is not particularly limited, but is preferably between 1 minute and 12 hours, more preferably between 10 minutes and 3 hours.
  • the atmosphere in which this extraction operation is performed is not particularly limited, but it can also be preferably performed in the presence of an inert gas such as nitrogen for the purpose of minimizing oxidation.
  • the apparatus is not particularly limited, but it can also be performed in a pressure vessel in consideration of operation in nitrogen and in a sealed state where oxidation deterioration does not easily occur.
  • the organic solvent I to be used is a hydrocarbon solvent selected from toluene, xylene, methyl acetate, ethyl acetate and butyl acetate, preferably toluene and ethyl acetate, and more preferably toluene.
  • the organic solvent II to be used is a halogenated hydrocarbon solvent selected from methylene chloride and chloroform, preferably chloroform.
  • a general polyethylene glycol compound to be used exhibits a specific solubility, and the solubility is organic solvent II> water> organic solvent I.
  • a polyethylene glycol compound having an ionized carboxyl group is slightly more hydrophilic than a polyethylene glycol compound having no carboxyl group. Therefore, when an organic solvent in which an appropriate amount of an organic solvent II is mixed with the organic solvent I is used, the solubility of the polyethylene glycol compound having a carboxyl group is water> (organic solvent I + organic solvent II) and does not have a carboxyl group.
  • the solubility of the polyethylene glycol compound is (organic solvent I + organic solvent II)> water. That is, since the polyethylene glycol compound having a carboxyl group is distributed to the aqueous layer and the polyethylene glycol compound having no carboxyl group is distributed to the organic layer, it can be selectively separated and purified.
  • the organic solvent to be used is a mixed solution having a mixing ratio of organic solvent I: 25 to 60% by mass and organic solvent II: 75 to 40% by mass. Since the specific gravity of the organic solvent I is smaller than 1 and the specific gravity of the organic solvent II is larger than 1, when the ratio of the organic solvent I increases, the specific gravity of the mixed solvent tends to approach the specific gravity of the aqueous solution, so that the layer separation tends to be worse . Therefore, it is preferable that the mixing ratio is a mixed solution of organic solvent I: 25 to 50% by mass and organic solvent II: 75 to 50% by mass.
  • the mixing ratio of organic solvent I to organic solvent II is Y
  • the temperature in step (B) is T (° C.)
  • the weight of the polyethylene glycol compound When the average molecular weight is M, purification is possible within the range satisfying the relationship of the following formula (1).
  • the inventors succeeded in providing a purification method capable of industrially separating the high-purity polyethylene glycol compound for the first time. 3.11 ⁇ 10 ⁇ 6 M + 0.084 ⁇ Y ⁇ 0.0135T ⁇ -1.77 ⁇ 10 ⁇ 6 M + 0.404 (1)
  • the mass of the organic solvents I and II to be used is preferably 1 to 50 times by mass of the polyethylene glycol compound, and more preferably 2 to 20 times by mass of the polyethylene glycol compound, respectively. Particularly preferably, it is 5 to 20 times by mass of the polyethylene glycol compound.
  • the temperature at which the extraction operation is performed is preferably 50 ° C. or less, more preferably 45 ° C. or less, because the solvent mixing ratio may change due to volatilization of the organic solvent and the solubility of the polyethylene glycol compound may change as the temperature increases. 35 ° C. or lower is more preferable. Further, the temperature at which the extraction operation is performed is preferably 10 ° C. or higher, more preferably 15 ° C. or higher, and further preferably 20 ° C. or higher because the viscosity of polyethylene glycol increases as the temperature decreases.
  • a weak alkaline aqueous solution containing a polyethylene glycol compound having one carboxyl group is made neutral or acidic with an acid. Thereafter, after extraction into an organic layer, a polyethylene glycol compound having one carboxyl group is recovered by a process including any of concentration, crystallization, and drying.
  • the polyethylene glycol impurity having no carboxyl group to be separated and removed is an impurity having the same weight average molecular weight as that of the polyethylene glycol compound having one carboxyl group.
  • GPC and HPLC were used for the analysis of the polyethylene glycol compound.
  • the carboxylic acid yield described in the examples is (mass after purification (g) x carboxylic acid purity after purification (%)) ⁇ (mass of raw material (g) x carboxylic acid purity of raw material (% )) ⁇ 100.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol compound was measured under the following conditions using LC-10Avp (Shimadzu) as a GPC system.
  • GPC equipment LC-10Avp (Shimadzu)
  • Mobile phase DMF (10 mM LiBr)
  • Flow rate 0.7ml / min
  • Column PL gel MIXED-D (Polymer Laboratory)
  • the calibration curve was prepared using a polyethylene glycol compound as a standard substance.
  • the carboxylic acid purity of the polyethylene glycol compound was measured under the following conditions using alliance (Waters) as an HPLC system.
  • HPLC system alliance (Waters)
  • Mobile phase ammonium formate buffer (solvent: water, pH: 8.0)
  • Flow rate 1.0ml / min
  • Column Anion exchange column ES-502N (Asahipak)
  • a polyethylene glycol compound having one ionized carboxyl group remains mainly in the aqueous layer at the time of extraction, and a polyethylene glycol compound having no carboxyl group tends to move to the organic layer, so that purification is possible.
  • purification cannot be performed without performing extraction at an appropriate solvent mixing ratio and extraction temperature.
  • Y1 be the mixing ratio Y of the solvent at which the polyethylene glycol compound starts to be obtained from the organic layer.
  • Y1 is an index of the mixing ratio that can be purified by the extraction method of the present invention. That is, a polyethylene glycol compound having no carboxyl group as an impurity starts to be distributed to the organic layer preferentially.
  • the mixing ratio Y of the solvent is larger than Y1, purification cannot be performed because the polyethylene glycol compound having no carboxyl group is not distributed and removed in the organic layer.
  • a mixing ratio Y in which 20% by mass of a polyethylene glycol compound having one carboxyl group is contained in the polyethylene glycol compound obtained by concentrating the organic layer is defined as Y2.
  • Y2 is an index of the mixing ratio related to the carboxylic acid yield by extraction, and is a lower limit value that enables efficient purification.
  • Y1 and Y2 The relationship between Y1 and Y2 is always Y1> Y2. Therefore, if the mixing ratio Y of the solvent is between Y1 and Y2 (Y1>Y> Y2), it means that a polyethylene glycol compound having one carboxyl group can be purified by extraction with an industrially available efficiency. To do.
  • a mixing ratio Y in which 5% by mass of a polyethylene glycol compound having one carboxyl group is contained in a polyethylene glycol compound obtained by concentrating the organic layer is Y3.
  • Y3 is a preferable lower limit value that enables efficient purification because the loss of the polyethylene glycol compound having a carboxyl group to the organic layer is less than that of Y2.
  • the relationship between Y1, Y2 and Y3 is always Y1>Y3> Y2. If the mixing ratio Y of the solvent is between Y1 and Y3 (Y1>Y> Y3), the polyethylene glycol compound having one carboxyl group can be purified by extraction with more industrially efficient efficiency under more favorable conditions. Means.
  • the purification by extraction is possible when the mixing ratio Y is in the region satisfying Y ⁇ 0.0135T + A and Y ⁇ 0.0135T + B in FIG. It can be expressed as B ⁇ Y-0.0135T ⁇ A (6)
  • the region satisfies Y ⁇ 0.0135T + A and Y ⁇ 0.0135T + C in FIG. 3, and the two equations can be combined and expressed as equation (7).
  • the mixing ratio of organic solvent I to organic solvent II is Y
  • the temperature in step (B) is T (° C.)
  • the weight average molecular weight of the polyethylene glycol compound is M.
  • the range in which purification by extraction is possible was derived from Equation (6) and Equation (8). 3.11 ⁇ 10 -6 M + 0.084 ⁇ Y ⁇ 0.0135T ⁇ -1.77 ⁇ 10 -6 M + 0.404 And more preferably derived from Equation (7) and Equation (8). 2.03 ⁇ 10 ⁇ 6 M + 0.175 ⁇ Y ⁇ 0.0135T ⁇ -1.77 ⁇ 10 ⁇ 6 M + 0.404 It is.
  • the upper limit of the weight average molecular weight capable of extracting and purifying a polyethylene glycol compound having an amino group was 104167.
  • the upper limit of the weight average molecular weight that enables extraction and purification of a polyethylene glycol compound having a carboxyl group is low because the carboxyl group has a lower hydrophilicity than an amino group.
  • the difference in solubility in the mixed solvent and aqueous solution is small, indicating that the weight average molecular weight range in which separation and purification can be performed selectively is narrower.
  • Example 1 In this example, the weight average molecular weight M is 5000, the extraction temperature T is 27.5 ° C., and Y is 0.53.
  • the separated lower organic layer was extracted, a newly prepared mixed solvent of toluene: 16 g and chloroform: 30 g was added, and extraction operation was performed in the same manner. After stirring and separation, the organic layer was extracted, and 10 g of sodium chloride was added to the remaining aqueous layer, followed by stirring and dissolution at room temperature.
  • Example 1-1 In Example 1, the mixing ratio Y was variously changed at an extraction temperature of 27.5 ° C. to obtain a mixing ratio (Y1) in which the weight of ⁇ -methoxy- ⁇ -carboxymethyl-polyethylene glycol in the concentrated substance amount was 5%.
  • the mixing ratio (Y2) at which the resulting concentrate is minimal, the mixing ratio (Y3) at 20% was investigated.
  • Y1 was 0.751
  • Y2 was 0.490
  • Y3 was 0.565.
  • Example 1-2 In Example 1, the mixing ratio Y was variously changed at an extraction temperature of 32.5 ° C., and Y1, Y2, and Y3 were investigated. As a result, Y1 was 0.842, Y2 was 0.530, and Y3 was 0.620.
  • Example 1-3 In Example 1, the mixing ratio Y was variously changed at an extraction temperature of 22.5 ° C., and Y1, Y2, and Y3 were investigated. As a result, Y1 was 0.707, Y2 was 0.395, and Y3 was 0.485. A plot of the results of Examples 1 to 3 is shown in FIG.
  • Example 2 In this example, the weight average molecular weight M is 40000, the extraction temperature T is 27.5 ° C., and Y is 0.63.
  • ⁇ -methoxy- ⁇ -carboxymethyl-polyethylene glycol represented by the formula [1] weight average molecular weight: 40000, purity of carboxylic acid
  • a mechanical stirrer, thermometer, and nitrogen blowing tube 80.5%
  • 5 g was added, and 100 mM sodium borate buffer (pH 9) was dissolved in 50 g.
  • the separated lower organic layer was extracted, a newly prepared mixed solvent of toluene: 19 g and chloroform: 30 g was added, and extraction operation was performed in the same manner. After stirring and separation, the organic layer was extracted, and 10 g of sodium chloride was added to the remaining aqueous layer, followed by stirring and dissolution at room temperature. To this aqueous solution was added 6N hydrochloric acid to adjust the pH to 2, and then 25 g of chloroform was added. The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, stirred and stopped for 30 minutes to separate the layers. The lower organic layer was collected in an eggplant flask.
  • the organic layer was concentrated with an evaporator at 40 ° C., diluted by adding 50 g of ethyl acetate, dehydrated and filtered with 1.5 g of magnesium sulfate. To this, 25 g of hexane was added to precipitate crystals. The slurry was stirred for 30 minutes, filtered, and the residue was washed with 25 g of hexane and dried in vacuo to obtain a purified product (3.8 g, carboxylic acid purity: 99.2%, carboxylic acid yield: 93.7 %).
  • Example 2-1 In Example 1, the mixing ratio Y was variously changed at an extraction temperature of 27.5 ° C. to obtain a mixing ratio (Y1) in which the weight of ⁇ -methoxy- ⁇ -carboxymethyl-polyethylene glycol in the concentrated substance amount was 5%.
  • the mixing ratio (Y2) at which the resulting concentrate is minimal, the mixing ratio (Y3) at 20% was investigated.
  • Y1 was 0.704
  • Y2 was 0.580
  • Y3 was 0.627.
  • Example 2-2 In Example 1, the mixing ratio Y was variously changed at an extraction temperature of 32.5 ° C., and Y1, Y2, and Y3 were investigated. As a result, Y1 was 0.771, Y2 was 0.648, and Y3 was 0.695.
  • Example 2-3 In Example 1, the mixing ratio Y was variously changed at an extraction temperature of 22.5 ° C., and Y1, Y2, and Y3 were investigated. As a result, Y1 was 0.637, Y2 was 0.513, and Y3 was 0.561. A plot of the results of Examples 2-1 to 3 is shown in FIG.
  • Example 3 In this example, the weight average molecular weight M is 5000, the extraction temperature T is 27.5 ° C., and Y is 0.67.
  • ⁇ -methoxy- ⁇ -2-carboxyethyl-polyethylene glycol represented by the formula [2] weight average molecular weight: 5000, carvone Acid purity: 78.1%): 5 g was added, and 50 mM sodium borate buffer (pH 9) was dissolved in 50 g. To this was added a mixed solvent of toluene: 20 g and chloroform: 30 g, and the mixture was stirred at 27.5 ° C. for 30 minutes. The stirring was stopped and the mixture was allowed to stand at the same temperature for 30 minutes to separate the layers.
  • ⁇ -methoxy- ⁇ -2-carboxyethyl-polyethylene glycol represented by the formula [2] (weight average molecular weight: 5000, carvone Acid purity: 78.1%): 5 g was added, and 50 mM sodium borate buffer (pH 9) was dissolved in 50 g. To this was added a mixed solvent of toluene: 20 g and chloroform: 30 g, and
  • the separated lower organic layer was extracted, a newly prepared mixed solvent of toluene: 20 g and chloroform: 30 g was added, and extraction operation was performed in the same manner. After stirring and separation, the organic layer was extracted, and 10 g of sodium chloride was added to the remaining aqueous layer, followed by stirring and dissolution at room temperature. To this aqueous solution was added 6N hydrochloric acid to adjust the pH to 2, and then 25 g of chloroform was added. The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, stirred and stopped for 30 minutes to separate the layers. The lower organic layer was collected in an eggplant flask.
  • the organic layer was concentrated with an evaporator at 40 ° C., diluted by adding 50 g of ethyl acetate, dehydrated and filtered with 1.5 g of magnesium sulfate. To this, 25 g of hexane was added to precipitate crystals. The slurry was stirred for 30 minutes, filtered, and the residue was washed with 25 g of hexane and dried in vacuo to obtain a purified product (3.6 g, carboxylic acid purity: 99.0%, carboxylic acid yield: 91.3 %).
  • Example 4 In this example, the weight average molecular weight M is 20000, the extraction temperature T is 27.5 ° C., and Y is 0.67.
  • ⁇ -methoxy- ⁇ -5-carboxypentyl-polyethylene glycol represented by the formula [3] weight average molecular weight: 20000, carvone (Acid purity: 79.5%): 5 g and water: 50 g were added and dissolved at room temperature with stirring under nitrogen.
  • a 1M aqueous sodium carbonate solution was added thereto to adjust the pH to 10.
  • a mixed solvent of toluene: 18 g and chloroform: 30 g was added thereto, and the mixture was stirred at 27.5 ° C. for 30 minutes.
  • the organic layer was concentrated with an evaporator at 40 ° C., diluted by adding 50 g of ethyl acetate, dehydrated and filtered with 1.5 g of magnesium sulfate. To this, 25 g of hexane was added to precipitate crystals. The slurry was stirred for 30 minutes, filtered, and the residue was washed with 25 g of hexane and dried in vacuo to obtain a purified product (3.5 g, carboxylic acid purity: 99.3%, carboxylic acid yield: 86.8). %).
  • Example 5 In this example, the weight average molecular weight M is 10,000, the extraction temperature T is 27.5 ° C., and Y is 0.50.
  • ⁇ -2-cyanoethoxy- ⁇ -5-carboxypentyl-polyethylene glycol represented by the formula [4] weight average molecular weight: 10000, carboxylic acid purity: 81.7%): 5 g was added, and 100 mM sodium borate buffer (pH 9) was dissolved in 50 g.
  • the separated lower organic layer was extracted, and a newly prepared mixed solvent of toluene: 15 g and chloroform: 30 g was added, and extraction operation was performed in the same manner. After stirring and separation, the organic layer was extracted, and 10 g of sodium chloride was added to the remaining aqueous layer, followed by stirring and dissolution at room temperature. To this aqueous solution was added 6N hydrochloric acid to adjust the pH to 2, and then 25 g of chloroform was added. The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, stirred and stopped for 30 minutes to separate the layers. The lower organic layer was collected in an eggplant flask.
  • the organic layer was concentrated with an evaporator at 40 ° C., diluted by adding 50 g of ethyl acetate, dehydrated and filtered with 1.5 g of magnesium sulfate. To this, 25 g of hexane was added to precipitate crystals. The slurry was stirred for 30 minutes, filtered, and the residue was washed with 25 g of hexane and dried in vacuo to obtain a purified product (3.7 g, carboxylic acid purity: 99.1%, carboxylic acid yield: 89.8 %).
  • Example 6 In this example, the weight average molecular weight M is 40000, the extraction temperature T is 27.5 ° C., and Y is 0.65.
  • Branched polyethylene glycol represented by formula [5] (weight average molecular weight: 40000, carboxylic acid purity: 81.3%): 10 g in a 200 mL four-necked flask equipped with a mechanical stirrer, thermometer and nitrogen blowing tube Then, 100 mM sodium borate buffer (pH 9) was dissolved in 100 g. To this was added a mixed solvent of toluene: 39 g and chloroform: 60 g, and the mixture was stirred at 27.5 ° C. for 30 minutes. The stirring was stopped and the mixture was allowed to stand at the same temperature for 30 minutes to separate the layers.
  • the separated lower organic layer was extracted, a newly prepared mixed solvent of toluene: 39 g and chloroform: 60 g was added, and extraction operation was performed in the same manner. After stirring and separating the layers, the organic layer was extracted, and 25 g of sodium chloride was added to the remaining aqueous layer, followed by stirring and dissolution at room temperature. After adjusting the pH to 3 by adding 6N hydrochloric acid to this aqueous solution, 100 g of chloroform was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The stirring was stopped and the mixture was allowed to stand for 30 minutes to separate the layers. The lower organic layer was collected in an eggplant flask.
  • the organic layer was concentrated with an evaporator at 40 ° C., diluted by adding 100 g of ethyl acetate, dehydrated and filtered with 3.0 g of magnesium sulfate. To this, 50 g of hexane was added to precipitate crystals. The slurry was stirred for 30 minutes, filtered, and the residue was washed with 50 g of hexane and dried in vacuo to obtain a purified product (7.1 g, carboxylic acid purity: 99.3%, carboxylic acid yield: 90.4). %).
  • the organic layer was concentrated with an evaporator at 40 ° C., diluted by adding 50 g of ethyl acetate, dehydrated and filtered with 1.5 g of magnesium sulfate. To this, 25 g of hexane was added to precipitate crystals. The slurry was stirred for 30 minutes, filtered, and the residue was washed with 25 g of hexane and dried in vacuo to obtain a purified product (3.8 g, carboxylic acid purity: 99.3%, carboxylic acid yield: 22.9 %).
  • Example 6 The slurry was stirred for 30 minutes, filtered, and the residue was washed with 25 g of hexane and dried in vacuo to obtain a purified product (12.3 g, carboxylic acid purity: 99.4%, carboxylic acid yield: 50.0 %).
  • the results of Example 6 and Comparative Examples 1 and 2 are shown in Table 1 below.
  • the carboxylic acid purity of the polyethylene glycol compound having one carboxyl group obtained by the purification method of the present invention is purified by the ion exchange resin of Comparative Example 1 and by the inorganic adsorbent of Comparative Example 2. It was equivalent to the purified product, and the carboxylic acid yield was significantly higher.
  • FIG. 5 shows an HPLC chromatogram of the raw material used for extraction and purification in Example 5
  • FIG. 6 shows an HPLC chromatogram of the purified product obtained in Example 5.
  • the organic layer was concentrated with an evaporator at 40 ° C., diluted by adding 50 g of ethyl acetate, dehydrated and filtered with 1.5 g of magnesium sulfate. To this, 25 g of hexane was added to precipitate crystals. The slurry was stirred for 30 minutes, filtered, and the residue was washed with 25 g of hexane and dried in vacuo to obtain the final product.
  • the final product obtained had a carboxylic acid purity of 64.3%.
  • a branched polyethylene glycol derivative represented by the formula [6] (weight average molecular weight: 80000, amine purity: 78.3% ): 5 g and 50 g of water were added and dissolved at room temperature with stirring under nitrogen.
  • the pH was adjusted to 2 by adding 1N hydrochloric acid thereto.
  • a mixed solvent of toluene: 20 g and chloroform: 30 g was added, and the mixture was stirred at 27.5 ° C. for 30 minutes. The stirring was stopped and the mixture was allowed to stand at the same temperature for 30 minutes to separate the layers.
  • the separated lower organic layer was extracted, a newly prepared mixed solvent of toluene: 20 g and chloroform: 30 g was added, and extraction operation was performed in the same manner. After stirring and separation, the organic layer was extracted, and 10 g of sodium chloride was added to the remaining aqueous layer, followed by stirring and dissolution at room temperature. The pH was adjusted to 12 by adding 1N NaOH NaOH to this solution. The mixture was slowly stirred and heated to 50 ° C., 37.5 g of toluene was added, and the mixture was stirred at 50 ° C. for 30 minutes. Stirring was stopped and the mixture was allowed to stand at the same temperature for 30 minutes to separate the layers. The lower organic layer was collected in an eggplant flask.
  • Toluene 37.5 g was added and extraction was performed again, and the organic layer was recovered in an eggplant flask. The organic layer was concentrated with an evaporator at 50 ° C., dehydrated with magnesium sulfate: 1.5 g, and filtered. The filter cake was washed with 10 g of toluene and combined with the filtrate. This solution was cooled to room temperature while stirring using a magnetic stirrer, and then 25 g of hexane was added thereto to precipitate crystals.
  • Branched polyethylene glycol represented by formula [7] (weight average molecular weight: 80000, carboxylic acid purity: 77.6%): 5 g in a 100 mL four-necked flask equipped with a mechanical stirrer, thermometer, and nitrogen blowing tube Then, 100 mM sodium borate buffer (pH 9) was dissolved in 50 g. To this was added a mixed solvent of toluene: 20 g and chloroform: 30 g, and the mixture was stirred at 27.5 ° C. for 30 minutes. The stirring was stopped and the mixture was allowed to stand at the same temperature for 30 minutes to separate the layers.
  • formula [7] weight average molecular weight: 80000, carboxylic acid purity: 77.6%
  • the separated lower organic layer was extracted, a newly prepared mixed solvent of toluene: 20 g and chloroform: 30 g was added, and extraction operation was performed in the same manner. After stirring and separation, the organic layer was extracted, and 12.5 g of sodium chloride was added to the remaining aqueous layer, and the mixture was stirred and dissolved at room temperature. To this aqueous solution, 6N hydrochloric acid was added to adjust the pH to 2, and then 50 g of chloroform was added. The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, stopped stirring and allowed to stand for 30 minutes to separate the layers. The lower organic layer was collected in an eggplant flask.
  • the organic layer was concentrated with an evaporator at 40 ° C., diluted by adding 50 g of ethyl acetate, dehydrated and filtered with 1.5 g of magnesium sulfate. To this, 25 g of hexane was added to precipitate crystals. The slurry was stirred for 30 minutes, filtered, and the residue was washed with 25 g of hexane and then dried in vacuo to obtain a purified product. The final product obtained had a carboxylic acid purity of 77.8%.
  • the polyethylene glycol compound containing one carboxyl group is purified at the ratio and temperature of the mixed solvent capable of purifying the polyethylene glycol compound containing one amino group. I could't.
  • the carboxyl group is less hydrophilic than the amino group, the difference in solubility in a mixed solvent and an aqueous solution of a polyethylene glycol compound having a carboxyl group and a polyethylene glycol compound having no carboxyl group is small, It was shown that the weight average molecular weight range that can be selectively separated and purified is narrower.
  • the present invention is a useful purification method capable of industrially producing a polyethylene glycol compound having one carboxyl group with high purity and good yield.

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Abstract

カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物を効率及び純度良く、吸着剤やイオン交換樹脂といった廃棄物が出ない、工業的に実施可能な精製方法を提供する。ポリエチレングリコール化合物の水溶液であって、pHが8～11の水溶液を調製する。この水溶液と混合有機溶剤とを15℃以上、50℃以下の温度で混合し、有機層と水層とに分層させる。混合有機溶剤における有機溶剤Ｉの比率が25～60質量％であり、有機溶剤IIの比率が75～40質量％である。有機溶剤Ｉが、トルエン、キシレン等から選ばれる炭化水素系溶剤であり、前記有機溶剤IIがクロロホルム等から選ばれるハロゲン化炭化水素系溶剤であり、有機溶剤Ｉの有機溶剤IIに対する混合比率(有機溶剤Ｉ/有機溶剤II)Y、温度T(℃)、ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量Mが、3.11×10-6M＋0.084≦Y－0.0135T≦-1.77×10-6M＋0.404の関係を満足する。

Description

カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコールの精製方法
　本発明は、医薬用途に用いられるカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物の精製方法に関するものである。更に詳しくは、本発明は、ドラッグデリバリーシステムにおける化学修飾用途の活性化ポリエチレングリコールであり、かつその原料として用いられる高純度なカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物を得る精製方法である。
　本発明は、ポリペプチド、酵素、抗体やその他低分子薬物や遺伝子、オリゴ核酸などを含む核酸化合物、核酸医薬やその他の生理活性物質の修飾、または、リポソーム、ポリマーミセル、ナノパーティクルなどのドラッグデリバリーシステムキャリアへの応用を含む医薬用途に特に適する。
　ポリエチレングリコール（PEG）は、ドラッグデリバリーシステムにおけるスタンダードな担体として広く知られており、現在も精力的に開発が進められている。ポリエチレングリコールを生理活性物質やリポソーム等の薬剤に修飾することで、ポリエチレングリコールの高い水和層と立体反発効果により、薬剤の細網内皮系（RES）による補足や腎臓での排泄作用を抑制し、血中滞留性の改善及び抗原性の低減が可能である。中でも末端にカルボキシル基を有するポリエチレングリコールは、タンパク質のリジン残基やＮ末端の１級アミノ基と安定なアミド結合を形成する活性化エステル体や、その他の活性基に変換するための原料となるため特に重要な素材である。カルボキシル基を有するポリエチレングリコールを原料として使用したPEG化製剤としては、SOMAVERT（登録商標）：PEGVISOMANT（Pfizer）、Mircera（登録商標）：Methoxy Polyethylene glycol-epoetin beta（F Hoffmann-La Roche）、Macugen（登録商標）：Pegaptanib（Eyetech）などが既に上市されている。加えて、他にも多くのPEG化製剤の臨床試験が行なわれており、その有用性を立証している。
　このような医薬用途を目的とした活性化ポリエチレングリコールは、これを修飾して製造される薬剤の性能や安全性の観点から不純物の少ないものが求められてきた。現在、カルボキシル基を持つポリエチレングリコール化合物には、様々な骨格、及びカルボキシル基とポリエチレングリコールの間のリンカーを持つものが開発されており、その製造方法により副生する不純物は様々である。以下にその例を示す。
　カルボキシル基を有する直鎖型のポリエチレングリコールの製造方法としては、非特許文献1に記載のポリエチレングリコールの末端ヒドロキシル基を重金属試薬により酸化する方法、特許文献１に記載のポリエチレングリコールの末端ヒドロキシル基とアクリル酸エステル化合物とをMichael反応により結合させた後、エステル加水分解を行なう方法、特許文献２に記載のポリエチレングリコールの末端ヒドロキシル基と脱離基を有するオルトエステル化合物をWilliamson反応により結合させた後、加水分解を行なう方法などがこれまでに報告されている。
　また、カルボキシル基を１つ有する分岐型のポリエチレングリコールに関して、特許文献３にはリジンエチルエステルの２つのアミノ基にメトキシポリエチレングリコールを導入した後に、エステルの加水分解を行なう方法などが報告されている。
　しかし、上述のいずれの製造方法でもポリエチレングリコール末端のカルボキシル基への変換率は高くなく、最も高いものでカルボン酸純度は90%前後である。この状態で薬剤に修飾した場合、目的のPEG化製剤の他に、未反応の薬剤や未反応または失活したポリエチレングリコール化合物等の不純物が多く含まれることになる。PEG化製剤の精製は、分離が困難であるという技術的問題、及び薬物収率の低下による製造コストの上昇といった問題が生じる。よって、不純物であるポリエチレングリコール化合物は、できるだけ薬剤との結合前に除去しておくことが望ましい。
　ポリエチレングリコールのような高分子化合物から低分子化合物や塩などの不純物を除去する場合、分子量に起因する物理化学的性質、特に溶媒に対する溶解性の大きな差を利用した晶析及び抽出操作による精製が一般的である。一方で、不純物であるポリエチレングリコール化合物が存在する場合、不純物と目的物のポリエチレングリコール化合物の間に溶解性などの物理化学的な性質に大きな違いが現れない。そのためカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物から、カルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物を、低分子不純物を除去する一般的な操作で除去、精製することは困難である。
　カルボキシル基を有するポリエチレングリコール化合物の精製方法としては、その極性を利用してイオン交換樹脂によるカラム精製が行なわれており、特許文献４では分岐型のポリエチレングリコールについての精製が記載されている。しかし、工程中のポリエチレングリコール化合物の濃度は、分離能の低下を抑えるため０．１－２％程度と高希釈条件でなければならず、分画後は水溶液中のポリエチレングリコール化合物を回収するための大容量の抽出設備または濃縮設備が必要となるため、工業的な生産性を十分に満足できるものではない。また、最終的に廃棄物として大量のイオン交換樹脂が出てしまうため、工業的に問題がある精製法である。
　また、特許文献５においては、有機溶剤に溶解させたカルボキシル基を有するポリエチレングリコールを無機系吸着剤に物理的に吸着させた後に、アルコール系溶剤を用いて脱着させることで精製する方法が記載されている。しかし、この精製方法では脱着反応が不十分で歩留りが50～60％と低い。また、最終的に廃棄物として大量の吸着剤が出てしまうため、工業的に問題がある精製法である。
　一方、特許文献６においては、アミノ基を有するポリエチレングリコール化合物をｐＨ１～３の強酸性水溶液中に溶解させて末端アミノ基をイオン化し、特定の混合有機溶剤を用いて特定の温度範囲で抽出することによって精製する方法が記載されている。この特許においては、イオン化により親水性の高まったアミノ基を有するポリエチレングリコール化合物が水層に分配し、アミノ基を有さないポリエチレングリコール化合物は混合有機層に分配するため、選択的に分離、精製することができる。
J. Chromatography A 1986,368, 309-317
日本国特許5015608号公報 日本国特許4959133号公報 米国特許6113609号明細書 米国特許5932462号明細書 日本国特許5618248号公報 日本国特開2014-059754号公報 日本国特開2004-197077号公報 日本国特表平9-504299号公報
　しかし、特許文献６には、カルボキシル基を有したポリエチレングリコール化合物の精製に関する記載は無く、また、この精製方法ではカルボキシル基を有したポリエチレングリコール化合物をイオン化することができないため、選択的に分離、精製することは困難である。
　また、仮にカルボキシル基をイオン化することを試みたとしても、カルボキシル基とアミノ基は同じ極性基であるが、水に対する溶解性は異なっている。例えば、同じアルキル鎖長を有するn-ブチルアミン（n-C4H10NH2）と吉草酸(n-C4H10COOH)のオクタノール水／分配係数 Log Powはn-ブチルアミン：0.86、吉草酸：1.39となっている。Log Powは化学物質の親油／親水性の指標となる値であり、吉草酸はn-ブチルアミンよりもオクタノール側にモル濃度で約３倍移行しやすい、つまりカルボキシル基の親油性が高いことが示されている。よって、カルボキシル基を有するポリエチレングリコール化合物をアルカリ性水溶液中でイオン化した場合、カルボキシル基とアミノ基ではイオン化した際の混合有機溶剤と水に対する溶解性が異なるため、アミノ基を有するポリエチレングリコールを精製するために最適化された有機溶剤の混合比率や特定の温度範囲を適用することはできない。
　このように、カルボキシル基を有するポリエチレングリコール化合物は、医薬用途において重要な素材であるにも関わらず、工業的に製造容易な方法では得られておらず、多くの課題を有している。
　本発明の課題は、カルボキシル基を１つ有するポリエチレングリコール化合物を、工業的に実施可能な方法にて効率及び純度良く精製することである。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物を特定のｐＨの範囲のアルカリ性水溶液中でイオン化し、特定の比率で混合した２種類以上の有機溶剤と特定のｐＨのアルカリ性水溶液からなる系において、特定の温度範囲で抽出操作を行なうことで精製する方法を見出した。
　この発明の特徴は、特定のｐＨの範囲で、特定の炭化水素系溶剤と、ハロゲン化炭化水素系溶剤を混合する比率と抽出温度を適切な範囲に制御することにより実現可能であり、樹脂やゲルなど大量の担体/吸着剤、限外ろ過膜などを用いず、大スケールでも実施可能なため工業的である点にある。
　すなわち、本発明は、以下のものである。 
（１）　カルボキシル基を一つ有しており、分子内のエチレンオキシドユニットの合計平均付加モル数が20～1490であるポリエチレングリコール化合物を精製する方法であって、
　以下の工程（A）、工程（B）および工程（C）を有することを特徴とする、ポリエチレングリコール化合物の精製方法。
(A)　前記ポリエチレングリコール化合物の水溶液であって、pHが8～11の弱アルカリ性水溶液を調製する工程
(B)  前記工程(A)で得られた前記水溶液と混合有機溶剤とを15℃以上、50℃以下の温度で混合し、有機層と水層とに分層させ、この際前記混合有機溶剤における有機溶剤Ｉの比率が25～60質量％であり、有機溶剤IIの比率が75～40質量％であり、前記有機溶剤Ｉが、トルエン、キシレン、酢酸メチル、酢酸エチルおよび酢酸ブチルからなる群より選ばれる炭化水素系溶剤であり、前記有機溶剤IIが塩化メチレンおよびクロロホルムからなる群より選ばれるハロゲン化炭化水素系溶剤であり、前記有機溶剤Ｉの前記有機溶剤IIに対する混合比率(有機溶剤Ｉ/有機溶剤II)Y、前記混合時の温度T(℃)および前記ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量Mが、式（１）の関係を満足する抽出工程
　3.11×10-6M＋0.084≦Y－0.0135T≦-1.77×10-6M＋0.404　・・　（１）
(C)  前記水層から前記ポリエチレングリコール化合物を回収する工程
（２）　前記工程(B)において、前記有機溶剤Ｉの前記有機溶剤IIに対する混合比率(有機溶剤Ｉ/有機溶剤II)Y、前記混合時の温度T(℃)および前記ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量Mが、式（２）の関係を満足することを特徴とする、（１）の方法。
　2.03×10-6M＋0.175≦Y－0.0135T≦-1.77×10-6M＋0.404　・・　（２）
（３）　前記工程(B)において分層した前記水層に対して、前記抽出工程（B）を複数回実施することを特徴とする、（１）または（２）の方法。
（４）　前記工程(A)において、前記弱アルカリ性水溶液が緩衝剤を含むことを特徴とする、（1）～（３）のいずれかの方法。
（５）　前記工程(A)において、前記緩衝剤が、ナトリウム、カリウム、リチウムおよびアンモニウムからなる群より選ばれた一種以上の元素の有機塩および無機塩からなる群より選ばれた１種以上の塩であることを特徴とする、（４）の方法。
（６）　前記工程(B)において、前記有機溶剤Ｉがトルエンを含むことを特徴とする、（１）～（５）のいずれかの方法。
　前記工程(B)において、前記有機溶剤IIがクロロホルムを含むことを特徴とする、（１）～（６）のいずれかの方法。
　本発明は、医薬用途を目的とした高純度なカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物を得るための新規な精製法である。この精製方法は、従来の技術では分離が困難な、カルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物を分離することが可能である。また、ポリエチレングリコール化合物中にアミド結合やカーバメート結合のような加水分解性のリンカーがある場合も結合の分解が起こりにくく、品質の低下を防ぐことが可能である。また、工業的に容易に実施可能で、生産性に優れ、吸着剤やイオン交換樹脂といった廃棄物を生成しない工程にて高収率に実施することが可能である。
ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量が5,000である場合の溶剤の混合比率Yと抽出温度Tとの関係を示すグラフである。 ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量が40,000である場合の溶剤の混合比率Yと抽出温度Tとの関係を示すグラフである。 ある重量平均分子量Ｍにおけるポリエチレングリコール化合物の溶剤混合比率Yと抽出温度Tとの関係性を示すグラフであり、精製処理が可能な範囲を示すグラフである。 ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量Mと、溶剤混合比率Yの切片との関係を示すグラフである。 実施例６で抽出精製に用いた原料のHPLCクロマトグラムを示す。 実施例６で得られた精製品のHPLCクロマトグラムを示す。
　本発明の、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物とは、ポリエチレングリコール分子内に他の分子と反応させることができるカルボキシル基を一つ有する化合物のことである。
　本発明の、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物の分子内のエチレンオキシドユニットの合計平均付加モル数は、20以上であり、好ましくは40以上、より好ましくは110以上である。また、本ポリエチレングリコール化合物の分子内のエチレンオキシドユニットの合計平均付加モル数は1490以下であり、好ましくは1370以下である。
　本発明のカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物の重量平均重量平均分子量は、1000以上が好ましく、更に好ましくは2000以上であり、より好ましくは5000以上である。また、本ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量は65573以下が好ましく、より好ましくは60263以下である。
　本発明のカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物は、直鎖型または分岐型の構造を有している。分岐型は、好ましくは、グリセリン骨格、リジン骨格、ペンタエリスリトール骨格、キシリトール骨格であり、より好ましくは、グリセリン骨格及びリジン骨格である。これらの化合物は、例えば特許文献７（特開2004-197077号公報）のように１価または多価の水酸基を有する出発物質よりエチレンオキシドを重合する工程とその後の活性化工程を経て得られるか、または特許文献８（特表平9-504299号公報）のように典型的には２本以上の直鎖型ポリエチレングリコールのカップリング反応と活性化工程を経て得られる。
　本発明で精製できるポリエチレングリコール化合物は構造中にカルボキシル基を一つだけ有するものである。カルボキシル基以外のポリエチレングリコール鎖の末端に結合している官能基としては、炭素数1から7の炭化水素基、弱アルカリ水溶液中で安定な反応性官能基、または官能基の保護基である。炭素数1から7の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ヘプチル基、イソヘプチル基などのアルキル基、フェニル基、ベンジル基などを挙げることができる。好ましくは、炭化水素基としてはメチル基、エチル基、tert-ブチル基、ベンジル基、であり、より好ましくはメチル基である。弱アルカリ水溶液中で安定な反応性官能基は、好ましくはアミノ基、オキシアミノ基、水酸基、チオール基、シアノ基、アジド基である。官能基の保護基は、好ましくはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、オキシアミノ基の保護基のうち弱アルカリ性水溶液中で安定なものである。
（工程（A））
　カルボキシル基を１つ有するポリエチレングリコール化合物の水溶液であって、ｐＨが８～１１の弱アルカリ性水溶液を調製する工程である。
　弱アルカリ性水溶液のｐＨは、低いとカルボキシル基のイオン化が不十分で、ポリエチレングリコール化合物の親水性を増加させることができず、高いとポリエチレングリコール化合物中にアミド結合やカーバメート結合のような加水分解性のリンカーがある場合に結合の分解が起こる恐れがあるため、８～１１とし、好ましくは８～１０である。
　弱アルカリ性水溶液はｐＨの変動を緩和するための緩衝剤を含んでいてもよい。緩衝剤としては、ｐＨを８～１１を維持するために通常用いられる緩衝性を示す有機塩や無機塩を使用することができる。具体的には、ナトリウム、カリウム、リチウム又はアンモニウムからなるの、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、フタル酸塩、酒石酸塩又は乳酸塩などの有機塩及び無機塩が含まれる。また、これらの複数の有機塩や無機塩を組み合わせて用いてもよい。
　緩衝剤の濃度は、本発明の溶液を目的とするｐＨ８～１１に維持するために十分であれば特に限定されないが、低いと緩衝作用が発現せず、高いとポリエチレングリコール化合物の水に対しての溶解性が低下し、目的物が有機層側に分配されやすくなり、歩留が低下する恐れがあるため、本発明の水溶液の総量に対して１０～５００ｍＭの濃度となることが好ましく、より好ましくは２５～３００ｍＭである。
　使用する弱アルカリ性水溶液の質量は、ポリエチレングリコール化合物の１～５０質量倍とするのが好ましく、より好ましくはポリエチレングリコール化合物の２～２０質量倍である。特に好ましくはポリエチレングリコール化合物の５～２０質量倍である。
（工程（B））
　有機溶剤と、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物が溶解した弱アルカリ性水溶液を撹拌や振とうなどにより混合し、一定時間これを静置することにより有機層と水層に分層させる工程である。この抽出工程において、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物は、予め有機溶剤に溶解させた状態で弱アルカリ性水溶液と混合すると、乳化により不純物の分離、目的物の回収が不能となる可能性が高いため、予め弱アルカリ性水溶液に溶解していることが好ましい。
　工程中の混合、分層の時間は特に限定されないが、好ましくは1分～12時間の間であり、より好ましくは10分～3時間である。また、この抽出操作を実施する雰囲気は特に限定されないが、好ましくは酸化を最小限に抑えることを目的として、窒素などの不活性ガス存在下にて行うこともできる。また、装置も特に限定されないが、酸化劣化の起きにくい窒素下かつ密閉状態での操作を考慮して耐圧容器にて行うこともできる。
　使用する有機溶剤Ｉは、トルエン、キシレン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチルから選ばれる炭化水素系溶剤であり、好ましくは、トルエン、酢酸エチルであり、より好ましくは、トルエンである。
　使用する有機溶剤IIは、塩化メチレン、クロロホルムから選ばれるハロゲン化炭化水素系溶剤であり、好ましくはクロロホルムである。
　使用する一般的なポリエチレングリコール化合物は特有の溶解性を示し、その溶解性は、有機溶剤II＞水＞有機溶剤Ｉである。一方、イオン化されたカルボキシル基を有するポリエチレングリコール化合物は、カルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物よりもわすかに親水性が高い。そのため、有機溶剤Ｉに有機溶剤IIを適当量混合した有機溶剤を用いると、カルボキシル基を有するポリエチレングリコール化合物の溶解性は、水＞（有機溶剤Ｉ＋有機溶剤II）となり、カルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物の溶解性は、（有機溶剤Ｉ＋有機溶剤II）＞水となる。つまり、カルボキシル基を有するポリエチレングリコール化合物は水層に分配し、カルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物は有機層に分配するため、選択的に分離、精製することができる。
　使用する有機溶剤は、混合比率が、有機溶剤Ｉ：25～60質量％、有機溶剤II：75～40質量％の混合溶液である。有機溶剤Ｉの比重は1より小さく、有機溶剤IIの比重は1より大きいため、有機溶剤Ｉの比率が増加すると、混合溶剤の比重が水溶液の比重に近づくため分層性が悪くなる傾向がある。そのため、混合比率が、有機溶剤Ｉ：25～50質量％、有機溶剤II：75～50質量％の混合溶液であることが好ましい。
　下記の実施例にて示すが、有機溶剤Ｉの有機溶剤IIに対する混合比率(有機溶剤Ｉ/有機溶剤II)をY、工程(B)における温度をT(℃)、および前記ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量をMとしたとき、以下の式（１）の関係を満足する範囲で精製が可能である。これによって、高純度の前記ポリエチレングリコール化合物を初めて工業的に分離可能な精製方法を提供することに成功した。
　3.11×10-6M＋0.084≦Y－0.0135T≦-1.77×10-6M＋0.404　　（１）
　使用する有機溶剤ＩとIIの質量は、それぞれポリエチレングリコール化合物の１～５０質量倍が好ましく、より好ましくは、それぞれポリエチレングリコール化合物の２～２０質量倍である。特に好ましくは、それぞれポリエチレングリコール化合物の５～２０質量倍である。
　抽出操作を行なう温度としては、温度が高くなると有機溶剤の揮発により溶剤の混合比率が変化しポリエチレングリコール化合物の溶解性が変化する恐れがあるため、50℃以下が好ましく、45℃以下がより好ましく、35℃以下が更に好ましい。また、抽出操作を行なう温度としては、温度が低くなるとポリエチレングリコールの粘性が増大するため、10℃以上が好ましく、15℃以上がより好ましく、20℃以上が更に好ましい。
(工程(C))
　抽出後の水層からカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物を回収する方法である。
　カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物を含んだ弱アルカリ性水溶液を酸によって中性、または酸性にする。その後、有機層への抽出を経て、濃縮、結晶化、乾燥などのいずれかを含む工程によってカルボキシル基を１つ有するポリエチレングリコール化合物を回収する。
　以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
　実施例において分離、除去されるカルボキシル基を有さないポリエチレングリコール不純物は、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物と重量平均分子量が同程度の不純物である。なお、ポリエチレングリコール化合物の分析にはGPC、HPLCを使用した。実施例中に記載されているカルボン酸収率とは、(精製後の質量(g)×精製後のカルボン酸純度(%))÷(原料の質量(g)×原料のカルボン酸純度(%))×100のことである。
　ポリエチレングリコール化合物の分子量は、GPCシステムとしてLC-10Avp（島津）を用い、以下の条件で測定を行った。
GPC装置：LC-10Avp（島津）
移動相：DMF（10mM LiBr）
流速：0.7ml/min
カラム：PL gel MIXED-D （ポリマーラボラトリー）
カラム温度：65℃
検出器：RI
注入量：30mg/30mL（100μl）
　検量線は、ポリエチレングリコール化合物を標準物質として作成した。
　ポリエチレングリコール化合物のカルボン酸純度は、HPLCシステムとしてalliance (Waters)を用い、以下の条件で測定を行なった。
HPLC装置：alliance (Waters)
移動相：ギ酸アンモニウム緩衝液（溶媒：水、pH：8.0）
流速：1.0ml/min
カラム：陰イオン交換カラム ES-502N（Asahipak）
カラム温度：30℃
検出器：RI
注入量：10mg/mL（20μl）
　弱アルカリ性水溶液中で、イオン化したカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物は抽出時に主として水層に残り、カルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物は有機層に移る傾向があるため精製が可能となる。しかし、適切な溶剤の混合比率及び抽出温度で抽出を実施しなくては精製をすることはできない。
　まず、有機層からポリエチレングリコール化合物が得られ始める溶剤の混合比率YをY1とする。Y1は、本発明の抽出方法により精製が可能となる混合比率の指標である。つまり、不純物であるカルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物が優先して有機層に分配され始める点である。溶剤の混合比率YがY1より大きい場合は、カルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物が有機層に分配、除去されないため精製はできない。
　次に、溶剤の混合比率YをY1よりも下げて抽出を行なうと、有機層から得られるカルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物の質量は増加するが、ある混合比率からはカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコールも有機層に分配されるようになる。そして、有機層を濃縮して得られるポリエチレングリコール化合物中にカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物が20質量%含まれる混合比率YをY2とする。Y2は、抽出によるカルボン酸収率に関わる混合比率の指標であり、効率的な精製が可能な下限値である。溶剤の混合比率YがY2より小さい場合は、カルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物とともに目的物であるカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物が有機層へ分配、除去されるため、精製後のカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物のカルボン酸収率が低下することになる。
　混合比率YがY2である場合のカルボン酸収率をより具体的に説明する。カルボン酸純度90%のポリエチレングリコール化合物100gを用いて抽出し、有機層を濃縮したところ濃縮物が10g得られたとする。この濃縮物の20%に該当するカルボキシル基を１つ有するポリエチレングリコール化合物の質量は、10g×20%÷100＝2gである。カルボン酸収率の低下としては、2g÷(100g×90%÷100)×100＝2.2%となる。
　Y1、Y2の関係は、常にY1＞Y2である。
　したがって、前記溶剤の混合比率YがY1とY2の間にあれば（Y1＞Y＞Y2）、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物を抽出によって、工業的に利用可能な効率で精製できることを意味する。
　さらに、有機層を濃縮して得られるポリエチレングリコール化合物中にカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物が5質量%含まれる混合比率YをY3とする。Y3はカルボキシル基を有するポリエチレングリコール化合物の有機層へのロスがY2よりも少なく、効率的な精製が可能な好ましい下限値である。
　混合比率YがY3である場合のカルボン酸収率をより具体的に説明する。カルボン酸純度90%のポリエチレングリコール化合物100gを用いて抽出し、有機層を濃縮したところ濃縮物が10g得られたとする。この濃縮物の5%に該当するカルボキシル基を１つ有するポリエチレングリコール化合物の質量は、10g×5%÷100＝0.5gである。カルボン酸収率の低下としては、0.5g÷(100g×90%÷100)×100＝0.55%となる。
　Y1、Y2及びY3の関係は、常にY1＞Y3＞Y2である。
前記溶剤の混合比率YがY1とY3の間にあれば（Y1＞Y＞Y3）、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物を抽出によって、より好ましい条件で工業的に利用可能な効率で精製できることを意味する。
　種々の分子量のカルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物について、抽出による精製の効果を調査した。以下に代表として、重量平均分子量5000と40000のデータを挙げて説明を行う。
　はじめに、溶剤の混合比率Y及び温度Tの適切な範囲を調べた。
カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物を弱アルカリ水溶液に溶解させた。有機溶剤Ｉと有機溶剤IIの混合溶液を加えて抽出操作を2回行った。有機層をエバポレーターで減圧留去し、回収したポリエチレングリコール化合物の質量測定及びHPLC測定を行った。HPLCのクロマトグラムのピーク面積比及び質量から、カルボキシル基を有するポリエチレングリコール化合物及びカルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物の質量を算出した。この抽出検討を、様々な抽出温度及び溶剤の混合比率の条件下で行ない、それぞれの温度でのY1、Y2及びY3を算出した。縦軸に溶剤の混合比率Y、横軸に抽出温度Tをとり、Y1、Y2及びY3をプロットした。
　図1及び2に示すように、重量平均分子量M=5000及び40000のポリエチレングリコール化合物の場合、Y1、Y2、Y3はそれぞれ温度Tの関数として式（３）及び（４）のように表すことができた。
M=5000の場合：
　Y1=0.0135T＋0.395、Y2=0.0135T＋0.100、Y3=0.0135T＋0.185　（３）
M=40000の場合：
　Y1=0.0135T＋0.333、Y2=0.0135T＋0.209、Y3=0.0135T＋0.256　（４）
　式（３）及び（４）より、温度変化に対するグラフの傾き0.0135は、ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量に依存せず、一定であることがわかった。つまり、図3に示すように、ある重量平均分子量Mのポリエチレングリコール化合物を用いて抽出精製を行う場合、Y1、Y2及びY3はそれぞれ温度Tの関数とし、各切片をA、B及びCとした時に式（５）のように表すことができる。
Y1=0.0135T＋A、Y2=0.0135T＋B、Y3=0.0135T+C　・・（５）
　図3に示すように、抽出による精製が可能なのは、混合比率Yが、図3のY≦0.0135T＋AかつY≧0.0135T＋Bを満たす領域にあるときであり、2つの式をまとめると式（６）のように表すことができる。 
B≦Y-0.0135T≦A　・・（６）
　好ましくは、図3のY≦0.0135T＋AかつY≧0.0135T＋Cを満たす領域であり、2つの式をまとめると式（７）のように表すことができる。
C≦Y-0.0135T≦A　・・（７）
　次に、図4に示すように、縦軸にYの切片、横軸に重量平均分子量Mをとり、式（３）及び（４）から得られたA、B及びCをそれぞれプロットした。図4より各切片A、B及びCを重量平均分子量Mの関数とすると、式（８）のように表すことができる。
A= -1.77×10-6M＋0.404
B= 3.11×10-6M＋0.084
C= 2.03×10-6M＋0.175　・・(８）
　以上をまとめると、有機溶剤Ｉの有機溶剤IIに対する混合比率(有機溶剤Ｉ/有機溶剤II)をY、工程(B)における温度をT(℃)、及びポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量をMとしたとき、抽出による精製が可能である範囲は、式（６）と式（８）より導いた
3.11×10-6M＋0.084≦Y－0.0135T≦-1.77×10-6M＋0.404
であり、より好ましくは式（７）と式（８）より導いた
2.03×10-6M＋0.175≦Y－0.0135T≦-1.77×10-6M＋0.404
である。
　切片A、Bが一致するとき、図４の抽出精製が可能な領域は存在しない。このときの重量平均分子量Mは、A＝Bより、M＝65573である。つまり、抽出精製が可能な重量平均分子量の上限は、65573ということになる。より好ましくは、切片A，Cが一致する時であって、B＝Cより、M＝60263である。つまり、より好ましい抽出精製が可能な重量平均分子量の上限は、60263ということになる。
　一方、特許文献６によると、アミノ基を有するポリエチレングリコール化合物の抽出精製が可能な重量平均分子量の上限は104167であった。カルボキシル基を有するポリエチレングリコール化合物の抽出精製が可能な重量平均分子量の上限が低くなったのは、カルボキシル基はアミノ基と比較すると親水性が低いために、カルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物との混合溶剤及び水溶液に対する溶解性の差が小さく、選択的に分離精製ができる重量平均分子量範囲がより狭いことを示している。
(実施例1)
　本例では、重量平均分子量Mは5000であり、抽出温度Tは27.5℃であり、Yは0.53である。
　機械式攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を装着した200mLの4つ口フラスコに、式[1]で示されるα-メトキシ-ω-カルボキシメチル-ポリエチレングリコール（重量平均分子量：5000、カルボン酸純度：79.2%)：5gを入れ、100mM ホウ酸緩衝液(pH9)を50gに溶解させた。これにトルエン：16gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加えて、27.5℃で30分撹拌し、撹拌を停止して同温度にて30分間静置して分層させた。分層した下層の有機層を抜き取り、新たに調製したトルエン：16gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加え、同様に抽出操作を行った。撹拌、分層後、有機層を抜き取り、残った水層に食塩：10gを添加し、室温で撹拌、溶解した。
　この水溶液に6N 塩酸を添加してpHを2に調整した後にクロロホルム：25gを加え、室温で30分間撹拌し、撹拌を停止して30分間静置して分層させた。下層の有機層をナスフラスコに回収した。有機層はエバポレーターにて40℃で濃縮し、酢酸エチル：50gを添加して希釈した後、硫酸マグネシウム：1.5gで脱水、ろ過した。これにヘキサン：25gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を25gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行い精製品を得た（3.9g、カルボン酸純度：99.0%、カルボン酸収率：98.5%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
(実施例1－1)
　実施例１において、抽出温度27.5℃にて、混合比率Yを種々変更し、濃縮物質量中のα-メトキシ-ω-カルボキシメチル-ポリエチレングリコールの重量が5%である混合比率（Y1）、得られる濃縮物が最小である混合比率（Y2）、20%である混合比率（Y3）を調査した。その結果、Y1は0.751、Y2は0.490、Y3は0.565であった。
(実施例1－2)
　実施例１において、抽出温度32.5℃にて、混合比率Yを種々変更し、Y1、Y2、Y3を調査した。その結果、Y1は0.842、Y2は0.530、Y3は0.620であった。
(実施例1－3)
　実施例１において、抽出温度22.5℃にて、混合比率Yを種々変更し、Y1、Y2、Y3を調査した。その結果、Y1は0.707、Y2は0.395、Y3は0.485であった。
 実施例1～3の結果をプロットしたものが図1である。
(実施例2)
　本例では、重量平均分子量Mは40000であり、抽出温度Tは27.5℃であり、Yは0.63である。
　機械式攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を装着した200mLの4つ口フラスコに、式[1]で示されるα-メトキシ-ω-カルボキシメチル-ポリエチレングリコール（重量平均分子量：40000、カルボン酸純度：80.5%)：5gを入れ、100mM ホウ酸緩衝液(pH9)を50gに溶解させた。これにトルエン：19gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加えて、27.5℃で30分撹拌し、撹拌を停止して同温度にて30分間静置して分層させた。分層した下層の有機層を抜き取り、新たに調製したトルエン：19gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加え、同様に抽出操作を行った。撹拌、分層後、有機層を抜き取り、残った水層に食塩：10gを添加し、室温で撹拌、溶解した。この水溶液に6N 塩酸を添加してpHを2に調整した後にクロロホルム：25gを加え、室温で30分間撹拌し、撹拌を停止して30分間静置して分層させた。下層の有機層をナスフラスコに回収した。有機層はエバポレーターにて40℃で濃縮し、酢酸エチル：50gを添加して希釈した後、硫酸マグネシウム：1.5gで脱水、ろ過した。これにヘキサン：25gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を25gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行い精製品を得た（3.8g、カルボン酸純度：99.2%、カルボン酸収率：93.7%）。
(実施例2－1)
　実施例１において、抽出温度27.5℃にて、混合比率Yを種々変更し、濃縮物質量中のα-メトキシ-ω-カルボキシメチル-ポリエチレングリコールの重量が5%である混合比率（Y1）、得られる濃縮物が最小である混合比率（Y2）、20%である混合比率（Y3）を調査した。その結果、Y1は0.704、Y2は0.580、Y3は0.627であった。
(実施例2－2)
　実施例１において、抽出温度32.5℃にて、混合比率Yを種々変更し、Y1、Y2、Y3を調査した。その結果、Y1は0.771、Y2は0.648、Y3は0.695であった。
(実施例2－3)
　実施例１において、抽出温度22.5℃にて、混合比率Yを種々変更し、Y1、Y2、Y3を調査した。その結果、Y1は0.637、Y2は0.513、Y3は0.561であった。
　実施例2-1～3の結果をプロットしたものが図2である。
(実施例3)
　本例では、重量平均分子量Mは5000であり、抽出温度Tは27.5℃であり、Yは0.67である。
　機械式攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を装着した200mLの4つ口フラスコに、式[2]で示されるα－メトキシ－ω－２－カルボキシエチル-ポリエチレングリコール（重量平均分子量：5000、カルボン酸純度：78.1%)：5gを入れ、50mM ホウ酸緩衝液(pH9)を50gに溶解させた。これにトルエン：20gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加えて、27.5℃で30分撹拌し、撹拌を停止して同温度にて30分間静置して分層させた。分層した下層の有機層を抜き取り、新たに調製したトルエン：20gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加え、同様に抽出操作を行った。撹拌、分層後、有機層を抜き取り、残った水層に食塩：10gを添加し、室温で撹拌、溶解した。この水溶液に6N 塩酸を添加してpHを2に調整した後にクロロホルム：25gを加え、室温で30分間撹拌し、撹拌を停止して30分間静置して分層させた。下層の有機層をナスフラスコに回収した。有機層はエバポレーターにて40℃で濃縮し、酢酸エチル：50gを添加して希釈した後、硫酸マグネシウム：1.5gで脱水、ろ過した。これにヘキサン：25gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を25gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行い精製品を得た（3.6g、カルボン酸純度：99.0%、カルボン酸収率：91.3%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
(実施例4)
　本例では、重量平均分子量Mは20000であり、抽出温度Tは27.5℃であり、Yは0.67である。
　機械式攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を装着した200mLの3つ口フラスコに、式[3]で示されるα-メトキシ-ω-５-カルボキシペンチル－ポリエチレングリコール（重量平均分子量：20000、カルボン酸純度：79.5%)：5gと水：50gを入れ、窒素下で攪拌しながら室温で溶解した。これに1M炭酸ナトリウム水溶液を添加してpHを10に調整した。これにトルエン：18gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加えて、27.5℃で30分撹拌し、撹拌を停止して同温度にて30分間静置して分層させた。分層した下層の有機層を抜き取り、新たに調製したトルエン：20gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加え、同様に抽出操作を行った。撹拌、分層後、有機層を抜き取り、残った水層に食塩：10gを添加し、室温で撹拌、溶解した。この水溶液に6N 塩酸を添加してpHを2に調整した後にクロロホルム：25gを加え、室温で30分間撹拌し、撹拌を停止して30分間静置して分層させた。下層の有機層をナスフラスコに回収した。有機層はエバポレーターにて40℃で濃縮し、酢酸エチル：50gを添加して希釈した後、硫酸マグネシウム：1.5gで脱水、ろ過した。これにヘキサン：25gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を25gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行い精製品を得た（3.5g、カルボン酸純度：99.3%、カルボン酸収率：86.8%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
(実施例5)
　本例では、重量平均分子量Mは10000であり、抽出温度Tは27.5℃であり、Yは0.50である。
　機械式攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を装着した200mLの4つ口フラスコに、式[4]で示されるα－２－シアノエトキシ－ω－５－カルボキシペンチル－ポリエチレングリコール（重量平均分子量：10000、カルボン酸純度：81.7%)：5gを入れ、100mM ホウ酸緩衝液(pH9)を50gに溶解させた。これにトルエン：15gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加えて、27.5℃で30分撹拌し、撹拌を停止して同温度にて30分間静置して分層させた。分層した下層の有機層を抜き取り、新たに調製したトルエン：15gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加え、同様に抽出操作を行った。撹拌、分層後、有機層を抜き取り、残った水層に食塩：10gを添加し、室温で撹拌、溶解した。この水溶液に6N 塩酸を添加してpHを2に調整した後にクロロホルム：25gを加え、室温で30分間撹拌し、撹拌を停止して30分間静置して分層させた。下層の有機層をナスフラスコに回収した。有機層はエバポレーターにて40℃で濃縮し、酢酸エチル：50gを添加して希釈した後、硫酸マグネシウム：1.5gで脱水、ろ過した。これにヘキサン：25gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を25gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行い精製品を得た（3.7g、カルボン酸純度：99.1%、カルボン酸収率：89.8%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（実施例6）
　本例では、重量平均分子量Mは40000であり、抽出温度Tは27.5℃であり、Yは0.65である。
　機械式攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を装着した200mLの4つ口フラスコに、式[5]で示される分岐型ポリエチレングリコール（重量平均分子量：40000、カルボン酸純度：81.3%)：10gを入れ、100mM ホウ酸緩衝液(pH9)を100gに溶解させた。これにトルエン：39gとクロロホルム：60gの混合溶剤を加えて、27.5℃で30分撹拌し、撹拌を停止して同温度にて30分間静置して分層させた。分層した下層の有機層を抜き取り、新たに調製したトルエン：39gとクロロホルム：60gの混合溶剤を加え、同様に抽出操作を行った。撹拌、分層後、有機層を抜き取り、残った水層に食塩：25gを添加し、室温で撹拌、溶解した。この水溶液に6N 塩酸を添加してpHを3に調整した後にクロロホルム：100gを加え、室温で30分間撹拌し、撹拌を停止して30分間静置して分層させた。下層の有機層をナスフラスコに回収した。有機層はエバポレーターにて40℃で濃縮し、酢酸エチル：100gを添加して希釈した後、硫酸マグネシウム：3.0gで脱水、ろ過した。これにヘキサン：50gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を50gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行い精製品を得た（7.1g、カルボン酸純度：99.3%、カルボン酸収率：90.4%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（比較例１）
　次に、特許文献４の実施例と同様の方法にてイオン交換カラムで精製を行い、結果を比較した。
　φ6cmのカラムに、DEAE Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社製） 約850mlを高さが30cmとなるように展開液はイオン交換水を用いて充填した。式[5]で示される分岐型ポリエチレングリコール20g をイオン交換水 4.4Lに溶解してカラムにチャージ後、精製した[5]が含まれるフラクションをTLCにより確認しながら溶出液を回収した。回収した溶出液は、食塩を加えた後にクロロホルムを加え、室温で30分間撹拌し、撹拌を停止して30分間静置して分層させた。下層の有機層をナスフラスコに回収した。有機層はエバポレーターにて40℃で濃縮し、酢酸エチル：50gを添加して希釈した後、硫酸マグネシウム：1.5gで脱水、ろ過した。これにヘキサン：25gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を25gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行い精製品を得た（3.8g、カルボン酸純度：99.3%、カルボン酸収率：22.9%）。
（比較例２）
　次に、特許文献５の実施例と同様の方法にて無機系吸着剤で精製を行い、結果を比較した。
　機械式攪拌装置、ジムロート冷却管、温度計、窒素吹き込み管を装着した1L4つ口フラスコに、式[5]で示す分岐型ポリエチレングリコール30gとトルエン：450gを入れ、窒素下で攪拌しながら55℃で溶解した。これにキョーワード２００B(協和化学工業)：120gを添加し、50℃で1時間攪拌し、吸着操作を行った後ろ過した。その後、予め50℃に加温しておいたトルエン：300gを用いてろ過ケーキの洗浄を行った。その後、ろ過ケーキにエタノールを加えて50℃で加温、攪拌を行った後にろ過してろ液を回収した。更に50℃に加温したエタノール300gでろ過ケーキの洗浄を行い、ろ液を回収した。ろ液をエバポレーターを用いて濃縮し、酢酸エチル：50gを添加して希釈した後、硫酸マグネシウム：1.5gで脱水、ろ過した。これにヘキサン：25gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を25gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行い精製品を得た（12.3g、カルボン酸純度：99.4%、カルボン酸収率：50.0%）。
　実施例６、比較例１、２の結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表１に示すように、本発明の精製方法で得られるカルボキシル基を１つ有するポリエチレングリコール化合物のカルボン酸純度は、比較例１のイオン交換樹脂による精製、及び比較例２の無機系吸着剤による精製品と同等であり、カルボン酸収率については大幅に高い結果となった。
　なお、図５は、実施例５で抽出精製に用いた原料のHPLCクロマトグラムを示し，図６は、実施例５で得られた精製品のHPLCクロマトグラムを示す。
　次に、特許文献６に記載の、アミノ基を一つ有するポリエチレングリコール化合物の精製可能範囲にて、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物の精製が可能か比較検討を行った。
（比較例３）
　機械式攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を装着した100mLの3つ口フラスコに、式[3]で示されるα-メトキシ-ω-５-カルボキシペンチル－ポリエチレングリコール（重量平均分子量：20000、カルボン酸純度：79.5%)：5gと水：50gを入れ、窒素下で攪拌しながら室温で溶解した。この水溶液に6N 塩酸を添加してpHを2に調整した。これにトルエン：18gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加えて、27.5℃で30分撹拌し、撹拌を停止して同温度にて30分間静置して分層させた。分層した下層の有機層を抜き取り、新たに調製したトルエン：18gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加え、同様に抽出操作を行った。撹拌、分層後、有機層を抜き取り、残った水層に食塩：10gを添加し、室温で撹拌、溶解した。クロロホルム：25gを加え、室温で30分間撹拌し、撹拌を停止して30分間静置して分層させた。下層の有機層をナスフラスコに回収した。有機層はエバポレーターにて40℃で濃縮し、酢酸エチル：50gを添加して希釈した後、硫酸マグネシウム：1.5gで脱水、ろ過した。これにヘキサン：25gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を25gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行って最終品を得た。得られた最終品のカルボン酸純度は64.3%であった。
　以上のように、酸性条件下ではカルボキシル基がイオン化していないために精製を行うことはできなかった。
次に、特許文献６に記載のアミノ基を一つ有するポリエチレングリコール化合物が精製可能な混合溶剤の比率及び温度において、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物の精製が可能か比較例４－１及び比較例４－２において比較検討を行った。
（比較例４－１）
　本例では、重量平均分子量Mは80000であり、抽出温度Tは27.5℃であり、Yは0.67である。
　機械式攪拌装置、ジムロート冷却管、温度計、窒素吹き込み管を装着した200mLの4つ口フラスコに、式[6]で示される分岐型ポリエチレングリコール誘導体（重量平均分子量：80000、アミン純度：78.3%)：5gと水：50gを入れ、窒素下で攪拌しながら室温で溶解した。これに1N塩酸を添加してpHを2に調整した。これにトルエン：20gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加えて、27.5℃で30分撹拌し、撹拌を停止して同温度にて30分間静置して分層させた。分層した下層の有機層を抜き取り、新たに調製したトルエン：20gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加え、同様に抽出操作を行った。撹拌、分層後、有機層を抜き取り、残った水層に食塩：10gを添加し、室温で撹拌、溶解した。この溶液に1N NaOH aqを添加してpHを12に調整した。ゆっくりと撹拌し50℃になるまで加温し、トルエン：37.5gを添加して50℃で30分間撹拌し、撹拌を停止して同温度にて30分間静置して分層させた。下層の有機層をナスフラスコに回収した。トルエン：37.5gを添加して再度抽出を行い、有機層をナスフラスコに回収した。有機層はエバポレーターにて50℃で濃縮し、硫酸マグネシウム：1.5gで脱水、ろ過した。ろ過ケーキをトルエン：10gで洗浄し、ろ液と合わせた。この溶液をマグネチックスターラーを用いて攪拌しながら室温まで冷却した後、これにヘキサン：25gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を40gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行い、精製品を得た（3.7g、アミン純度：97.4%、アミン収率：92.1%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（比較例４－２）
　本例では、重量平均分子量Mは80000であり、抽出温度Tは27.5℃であり、Yは0.67である。
　機械式攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を装着した100mLの4つ口フラスコに、式[7]で示される分岐型ポリエチレングリコール（重量平均分子量：80000、カルボン酸純度：77.6%)：5gを入れ、100mM ホウ酸緩衝液(pH9)を50gに溶解させた。これにトルエン：20gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加えて、27.5℃で30分撹拌し、撹拌を停止して同温度にて30分間静置して分層させた。分層した下層の有機層を抜き取り、新たに調製したトルエン：20gとクロロホルム：30gの混合溶剤を加え、同様に抽出操作を行った。撹拌、分層後、有機層を抜き取り、残った水層に食塩：12.5gを添加し、室温で撹拌、溶解した。この水溶液に6N 塩酸を添加してpHを2に調整した後にクロロホルム：50gを加え、室温で30分間撹拌し、撹拌を停止して30分間静置して分層させた。下層の有機層をナスフラスコに回収した。有機層はエバポレーターにて40℃で濃縮し、酢酸エチル：50gを添加して希釈した後、硫酸マグネシウム：1.5gで脱水、ろ過した。これにヘキサン：25gを加えて結晶を析出させた。このスラリーを30分攪拌し、ろ過し、残渣を25gのヘキサンにて洗浄した後、真空にて乾燥を行い精製品を得た。得られた最終品のカルボン酸純度は77.8%であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　比較例４－１及び４－２に示したように、アミノ基を一つ含むポリエチレングリコール化合物が精製可能な混合溶剤の比率及び温度において、カルボキシル基を一つ含むポリエチレングリコール化合物の精製を行うことはできなかった。
　本例により、カルボキシル基はアミノ基と比較すると親水性が低いために、カルボキシル基を有するポリエチレングリコール化合物とカルボキシル基を有さないポリエチレングリコール化合物との混合溶剤及び水溶液に対する溶解性の差が小さく、選択的に分離精製ができる重量平均分子量範囲がより狭いことが示された。
　以上より、本発明は、カルボキシル基を一つ有するポリエチレングリコール化合物を高純度で、収率良く、工業的に製造することができる有用な精製方法である。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。
　なお、本願は、２０１７年３月３０日付で出願された日本国特許出願（２０１７－０６６６９５）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

Claims (7)

  1. 　カルボキシル基を一つ有しており、分子内のエチレンオキシドユニットの合計平均付加モル数が20～1490であるポリエチレングリコール化合物を精製する方法であって、
    　以下の工程（A）、工程（B）および工程（C）を有することを特徴とする、ポリエチレングリコール化合物の精製方法。
    (A)　前記ポリエチレングリコール化合物の水溶液であって、pHが8～11の弱アルカリ性水溶液を調製する工程
     (B)  前記工程(A)で得られた前記水溶液と混合有機溶剤とを15℃以上、50℃以下の温度で混合し、有機層と水層とに分層させ、この際前記混合有機溶剤における有機溶剤Ｉの比率が25～60質量％であり、有機溶剤IIの比率が75～40質量％であり、前記有機溶剤Ｉが、トルエン、キシレン、酢酸メチル、酢酸エチルおよび酢酸ブチルからなる群より選ばれる炭化水素系溶剤であり、前記有機溶剤IIが塩化メチレンおよびクロロホルムからなる群より選ばれるハロゲン化炭化水素系溶剤であり、前記有機溶剤Ｉの前記有機溶剤IIに対する混合比率(有機溶剤Ｉ/有機溶剤II)Y、前記混合時の温度T(℃)および前記ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量Mが、式（１）の関係を満足する抽出工程
    　3.11×10-6M＋0.084≦Y－0.0135T≦-1.77×10-6M＋0.404
    　・・　（１）
    (C)  前記水層から前記ポリエチレングリコール化合物を回収する工程
  2. 　前記工程(B)において、前記有機溶剤Ｉの前記有機溶剤IIに対する混合比率(有機溶剤Ｉ/有機溶剤II)Y、前記混合時の温度T(℃)および前記ポリエチレングリコール化合物の重量平均分子量Mが、式（２）の関係を満足することを特徴とする、請求項１記載の方法。
    　2.03×10-6M＋0.175≦Y－0.0135T≦-1.77×10-6M＋0.404
    　・・　（２）
  3. 　前記工程(B)において分層した前記水層に対して、前記抽出工程（B）を複数回実施することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
  4. 　前記工程(A)において、前記弱アルカリ性水溶液が緩衝剤を含むことを特徴とする、請求項1～３のいずれか一つの請求項に記載の方法。
  5. 　前記工程(A)において、前記緩衝剤が、ナトリウム、カリウム、リチウムおよびアンモニウムからなる群より選ばれた１種以上の元素の有機塩および無機塩からなる群より選ばれた１種以上の塩であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
  6. 　前記工程(B)において、前記有機溶剤Ｉがトルエンを含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一つの請求項に記載の方法。
  7. 　前記工程(B)において、前記有機溶剤IIがクロロホルムを含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一つの請求項に記載の方法。
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