CN115725391A

CN115725391A - 降低滤器中病毒穿出风险的方法

Info

Publication number: CN115725391A
Application number: CN202211478782.0A
Authority: CN
Inventors: 刘娜; 徐天丹
Original assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Current assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date: 2022-11-21
Filing date: 2022-11-21
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本申请公开了一种降低滤器中病毒穿出风险的方法。该方法包括：在第一滤器压力下进行除病毒过滤；在第二滤器压力下中断除病毒过滤，其中所述第二滤器压力小于所述第一滤器压力；和在第三滤器压力下进行除病毒过滤，其中所述第三滤器压力大于所述第一滤器压力。

Description

降低滤器中病毒穿出风险的方法

技术领域

本申请涉及除病毒过滤技术领域，具体涉及降低滤器中病毒穿出风险的方法。

背景技术

哺乳动物CHO细胞系制备的生物技术产品，不能完全排除病毒污染的风险。监管机构要求进行病毒清除研究，以证明下游工艺在灭活/清除病毒方面是有效的，并定量估计整体下游工艺可达到的病毒减少水平。除病毒过滤是下游工艺过程中去除病毒的专用步骤。一般来说，此步骤对于病毒清除是有效且稳健的，并且不会损害产品的质量。除病毒过滤器可以通过分子排阻机制，截留多种病毒。

自20世纪90年代初以来，Asahi Kasei公司的除病毒过滤器Planova 20N已广泛应用于生物药的生产。除病毒过滤的主要工艺性能指标是产品载量和病毒清除能力。Planova20N是一种由不对称铜氨再生纤维素中空纤维构建的小型病毒过滤器。许多研究已经证明了Planova 20N在操作范围内的除病毒过滤的稳健性。Planova 20N膜的孔径由内表面向外表面逐渐减小。这种膜结构有助于蛋白渗透和病毒去除。

在2011年以前，高压操作通常被认为是病毒过滤的最坏情况。近年来，越来越多的研究表明，低压或压力释放对Planova 20N去除细小病毒有负面影响。例如，在非常低的压力下观察到Planova 20N滤液中细小病毒增加。比较广泛认可的机理是，较低流速促进了病毒颗粒的扩散，从而提高了病毒穿出的几率。一般情况下，大规模生产时需要提供除病毒滤器工作压力范围的上限和下限。在Asahi Kasei公司出具的Planova 20N验证报告中，声称Planova 20N过滤器在0.8bar时对细小病毒的对数去除值(LRV)≥3.0，并且LRV不受0.5bar-1.4bar操作压力的影响。然而，其验证的蛋白载量低于60L/m²。更高载量和更高压力对病毒去除效果的影响并未提及。这些数据不足以让用户定义合适的操作压力范围和上样载量。

中国专利申请公布号CN110860126公开了一种除病毒过滤装置及其控制系统，其通过在管路上连接有压力传感器、减压装置和压力控制模块，能够实现恒压输送和压力调节。然而，这样的控制系统只是根据需要调整系统内的压力，并没有给出如何设置过滤压力以降低病毒穿出的技术启示。

本领域仍然需要寻找一种能实现以更高载量和更高压力对病毒进行过滤去除，同时缩短过滤时间并降低病毒穿出风险的方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请提供一种降低滤器中病毒穿出风险的方法，所述方法包括：

a.在第一滤器压力下进行除病毒过滤；

b.在第二滤器压力下中断除病毒过滤，其中所述第二滤器压力小于所述第一滤器压力；和

c.在第三滤器压力下进行除病毒过滤，其中所述第三滤器压力大于所述第一滤器压力。

附图说明

下面结合附图更详细地说明本申请，附图中：

图1是根据实施例的添加X-MuLV的两组压力组合实验(实验1和3)下，滤器出口端流速(通量)与载量的关系图。每组实验设计2个平行实验。

图2是根据实施例的添加MVM的三组压力组合实验(实验1，2，3)下，滤器出口端流速(通量)与载量的关系图。每组实验设计2个平行实验。

图3是根据实施例的添加MVM的第四组压力组合实验(实验4)下，滤器出口端流速(通量)与载量及淋洗步骤的关系图。每组实验设计2个平行实验。

图4是病毒在滤器中不同条件下扩散情况的示意图。其中：(a)恒压下；(b)压力释放后；(c)压力增强时。病毒以带刺粒子表示。滤器膜结构的外表面显示为底部框架。病毒扩散方向用箭头表示。叉代表小孔发生堵塞。

具体实施方式

本申请涉及一种降低滤器中病毒穿出风险的方法，该方法包括：a.在第一滤器压力下进行除病毒过滤。在本申请中，使用的滤器可以是本领域已知的任何适用于去除样品中病毒的滤器。在本申请中，滤器压力是指滤器前端的压力减去滤器后端的压力。在本申请的一个实施方式中，滤器包括除病毒过滤膜。在本申请的一个实施方式中，除病毒过滤膜的材质包括再生纤维素、聚醚砜或聚偏氟乙烯。在本申请的一个优选实施方式中，再生纤维素包括中空纤维。在本申请的一个实施方式中，除病毒过滤膜的截留孔径为15-35nm。在本申请的一个实施方式中，除病毒过滤膜的截留孔径为约20nm。在本申请的一个实施方式中，滤器包括旭化成公司的Planova 20N除病毒过滤膜。在本申请的一个实施方式中，病毒包括哺乳动物细胞系表达的内源病毒或者在生产过程中引入的病毒。在本申请的一个实施方式中，病毒包括以下之一或两者：异嗜性小鼠白血病病毒(X-MuLV)和小鼠细小病毒(MVM)。在本申请中，可以通过任何合适的手段调整滤器压力。在本申请的一个实施方式中，通过加压空气来调整滤器压力。在本申请的一个实施方式中，第一滤器压力为0.5-2.0bar。在本申请的一个实施方式中，第一滤器压力为0.7-1.0bar。在本申请的一个实施方式中，第一滤器压力为约0.7bar。在本申请的一个实施方式中，步骤a中的除病毒过滤持续至达到目标载量。在本申请的一个实施方式中，目标载量为50-500L/m²，优选100-200L/m²，更优选约150L/m²。在本申请的一个实施方式中，在该步骤中，滤器出口端流速(通量)为20-100升每平米每小时(LMH)，优选30-80LMH，例如，约30LMH或约70LMH。

在本申请的一个实施方式中，通过滤器过滤的样品是生物制品，优选人注射用生物制品。在本申请的一个实施方式中，该样品包含生物大分子，优选蛋白质如抗体，更优选由哺乳动物细胞系如CHO细胞系表达的单克隆抗体。在本申请的一个实施方式中，该样品经过纯化处理。在本申请的一个实施方式中，该样品经过亲和层析和/或精纯层析。在本申请的一个实施方式中，该样品的蛋白质浓度为5-30g/L，优选10-20g/L，更优选约15g/L。

该降低滤器中病毒穿出风险的方法还包括：b.在第二滤器压力下中断除病毒过滤，其中所述第二滤器压力小于所述第一滤器压力。在本申请的一个实施方式中，第二滤器压力为0-1.0bar。在本申请的一个实施方式中，第二滤器压力为0-0.5bar。在本申请的一个实施方式中，第二滤器压力为约0bar。在本申请的一个实施方式中，中断持续时间不少于1分钟。在本申请的一个实施方式中，中断持续时间不少于3分钟。在本申请的一个实施方式中，中断持续时间不少于5分钟。在本申请的一个实施方式中，中断持续时间为约5分钟。在本申请的一个实施方式中，在该步骤中，滤器出口端流速(通量)为0-100LMH，优选0-30LMH，例如，约0LMH。在本申请的一个实施方式中，步骤b的滤器出口端流速(通量)小于步骤a的滤器出口端流速(通量)。

降低滤器中病毒穿出风险的方法还包括：c.在第三滤器压力下进行除病毒过滤，其中所述第三滤器压力大于所述第一滤器压力。在本申请的一个实施方式中，第三滤器压力为0.5-2.0bar。在本申请的一个实施方式中，第三滤器压力为1.0-1.6bar。在本申请的一个实施方式中，第三滤器压力为约1.0bar。在本申请的一个实施方式中，第三滤器压力比第一滤器压力大0.1bar以上。在本申请的一个实施方式中，第三滤器压力比第一滤器压力大0.3bar以上。在本申请的一个实施方式中，第三滤器压力比第一滤器压力大约0.3bar。在本申请的一个实施方式中，步骤c中的除病毒过滤持续至目标体积。在本申请的一个实施方式中，目标体积为不少于1L/m²，优选不少于5L/m²，更优选不少于10L/m²。在本申请的一个实施方式中，该步骤的除病毒过滤包括淋洗。在本申请的一个实施方式中，该步骤中通过滤器过滤的样品可不含病毒。在本申请的一个实施方式中，该步骤中通过滤器过滤的样品可不含生物大分子，优选不含蛋白质如抗体。在本申请的一个实施方式中，该步骤中通过滤器过滤的样品可包括不含病毒和/或生物大分子的样品，例如溶液或缓冲液。在本申请的一个实施方式中，在该步骤中，滤器出口端流速(通量)为20-100LMH，优选30-80LMH，例如，约55LMH。在本申请的一个实施方式中，步骤c的滤器出口端流速(通量)大于步骤a的滤器出口端流速(通量)。在本申请的一个实施方式中，步骤a的滤器出口端流速(通量)为约30LMH，并且步骤c的滤器出口端流速(通量)为约55LMH。

在本申请中，病毒滴度通过噬斑法定量测定，除病毒效果通过对数清除率(LRV)表征，LRV定义为上样样品的病毒对数值减去过滤产品中的病毒对数值(LRV＝log10[C_上样样品×V_上样样品]-log10[C_过滤产品×V_过滤产品])。在本申请的一个实施方式中，通过本申请的方法获得的过滤产品的对数清除率不小于4.0，优选不小于4.5，更优选不小于5.0。

下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整的表述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例都属于本申请保护的范围。

实施例

除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

表1：设备/耗材信息

设备/耗材名称	厂商	型号/货号
			除病毒过滤器	旭化成	Planova 20N
电子天平	OHAUS	STX1202ZH
			压力表	雅斯科	ASHCROFT，60psi
鲁尔接头	CPC	LM-41/LF-41
			管路	圣戈班	523-034200

表2：上样样品信息

表3.病毒信息

本实施例描述了利用本发明进行单克隆抗体的除病毒过滤。利用CHO细胞系表达了单克隆抗体，上样样品信息如表2所示。经过亲和层析、精纯层析步骤，除病毒前样品浓度达到15g/L。MVM和X-MuLV均由苏州药明检测检验有限责任公司提供，MVM病毒的滴度为7.9×10⁸PFU/mL，X-MuLV病毒的滴度为3.1×10⁸PFU/mL。

本实施例的所有过滤实验均使用0.001m²的Planova 20N过滤器进行。如下构建过滤系统：

将压力表及压力调节阀与压缩空气气源和压力储罐连接。压力储罐使用铁架台固定并保持出口端离天平一定高度。将压力储罐出口端通过硅胶管和鲁尔接头与除病毒过滤器相连。将滤出液收集容器置于天平上。除病毒过滤器出口端置于收集容器上方。

本实施例设计了四组不同压力组合的实验。在病毒添加环节，所添加的病毒类型如表3所示，四组实验均添加了MVM，而X-MuLV仅在实验1和实验3中添加。最后，四组实验分别取上样样品、淋洗前滤出液和淋洗后终产品进行病毒滴度测定。病毒滴度测试将待测样品的pH调节至6.5-7.5之间，进行0.45μm过滤，取其中0.5mL淋洗前收集液或7mL合并收集液立即进行感染实验。每个样品使用三个平行病毒培养皿进行病毒滴度检测。

在上样样品中分别添加X-MuLV(最终添加体积比为0.05％)或MVM(最终添加体积比为0.01％)，病毒信息如表3所示。通过加压空气进行除病毒过滤。每组实验，一旦达到目标载量(150L/m²)即停止上样，释放压力(即滤器压力降至0bar)并暂停后，开始使用不含病毒的缓冲液进行淋洗操作，淋洗体积为≥10L/m²。

实验1、实验2和实验3的初始压力分别设为0.7、1.0和1.6bar，压力中断时间为5分钟。淋洗的操作压力与上样步骤相同。每组实验均设计2个平行实验。实验4除淋洗压力提高为1.0bar，其余操作条件与实验1相同。

病毒滴度通过噬斑法定量测定，病毒清除效果通过对数清除率(LRV)表征。本方案根据LRV≥4.0的标准来给出操作压力的合理范围。并通过比较LRV数值评估不同压力组合下的除病毒效果，从而找到最合适的压力组合。

实验结果

图1是根据实施例的添加X-MuLV的两组压力组合实验(实验1和3)下，滤器出口端流速(通量)与载量的关系图。每组实验设计2个平行实验。从图中可以看出，2个平行实验结果一致。随着过滤时间延长，通量缓慢衰减，直至基本维持恒定。在1.6bar压力下，过滤流速为70LMH，比0.7bar压力下的流速高出130％，此结果说明，高压力操作可缩短工艺时间。

图2是根据实施例的添加MVM的三组压力组合实验(实验1，2，3)下，滤器出口端流速(通量)与载量的关系图。每组实验设计2个平行实验。从图中可以看出，不同压力下，2个平行实验结果一致。随着过滤时间延长，通量缓慢衰减，直至基本维持恒定。与X-MuLV的两组实验的趋势一致，高压力操作下过滤流速较快，可缩短工艺时间。

图3是根据实施例的添加MVM的第四组压力组合实验(实验4)下，滤器出口端流速(通量)与载量及淋洗步骤的关系图。每组实验设计2个平行实验。从图中可以看出，不同压力下，2个平行实验结果一致。在带病毒样品上样阶段，过滤压力为0.7bar，流速较慢，基本维持在30LMH。当使用缓冲液淋洗时，过滤流速增大至55LMH左右。样品过滤与缓冲液淋洗阶段的流速差异是由压力变化引起。过滤压力在淋洗阶段增加至1.0bar。

病毒去除率如表4所示。在0.7-1.6bar压力范围内，LRV值都达到4.0以上。实验3中提高操作压力至1.6bar后，在淋洗滤出液中未检测到MVM感染性。因此在保证滤器完整性的前提下，提高操作压力可缩短工艺时长，且更能保证病毒清除效果。说明压力上限可设置为1.6bar。并且随着压力增加，LRV值增大，即病毒截留效果更好。

表4中实验4结果所示，从病毒去除率可以看出，中断后，采用正向压差继续进行过滤可以有效消除病毒穿出风险，与表4中实验1和实验2相比，过滤中断后采用正向压差进行过滤在截留病毒方面更加有效。

表4.除病毒验证数据

*：＞表示病毒滴度低于检测限。

不受理论限制，在本申请的方法中，病毒在滤器中不同条件下扩散情况如图4所示，其中：(a)恒压下；(b)压力释放后；(c)压力增强时。病毒以带刺粒子表示。滤器膜结构的外表面显示为底部框架。病毒扩散方向用箭头表示。叉代表小孔发生堵塞。图(a)显示，病毒粒子在恒压过滤下可以进入滤膜的小孔。图(b)显示，在压力中断后，滤膜变得更加松弛，病毒粒子倾向于向滤膜的外表面扩散。图(c)显示，重新加压，并且压力较图(a)压力高的情况下，滤膜被压缩，病毒可以进入的一些小孔也被压缩，病毒粒子可被截流在滤膜内部。

综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.本发明验证了Planova 20N过滤过程中降压或者压力释放，对细小病毒MVM的去除效果有负面影响。在此基础上，创造性地提出了先恒压过滤，降压或者压力释放后提高过滤压力这一操作。这一升压操作(正向压差)被证明可以显著降低降压操作导致的病毒穿出风险。

2.本发明在验证更高载量(150L/m²)和有效的除病毒效果(LRV≥4.0)的基础上，拓展了供应商给出的可操作压力范围，提高压力上限至至少1.6bar，不仅具有更好的病毒清除效果，也进一步缩短了工艺时间。

3.本发明使得即便在较低的初始滤器压力下，通过中断且释放压力并随后提高滤器压力，大幅降低了病毒穿出的风险，改善了除病毒效果。这对于一些要求低压过滤的生产工艺而言非常友好。

4.本发明的过滤方法适用于几乎所有的除病毒过滤方案，载量高，操作简单，可拓展性强。

以上仅是本申请的具体应用范例，对本申请的保护范围不构成任何限制。对于所述领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举说明。凡采用等同变换或者等效替换而形成的类似此种的技术方案，均落在本申请权利保护范围之内。

Claims

1.一种降低滤器中病毒穿出风险的方法，所述方法包括：

a.在第一滤器压力下进行除病毒过滤；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒包括哺乳动物细胞系表达的内源病毒或者在生产过程中引入的病毒。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一滤器压力为0.5-2.0bar。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二滤器压力为0-1.0bar。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中断持续时间不少于1分钟。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三滤器压力为0.5-2.0bar。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三滤器压力比所述第一滤器压力大0.3bar以上。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滤器包括除病毒过滤膜。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述除病毒过滤膜的材质包括再生纤维素、聚醚砜或聚偏氟乙烯，优选地，所述再生纤维素包括中空纤维。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述除病毒过滤膜的截留孔径为15-35nm，优选20nm。