CN115554862A - 一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，包含多孔主体，多孔主体内具有非定向曲折通路，多孔主体两侧分别为第一外表面和第二外表面，多孔主体包括预过滤层和分离层，分离层位于预过滤层靠近第二外表面的一侧，预过滤层和分离层之间以连续纤维过渡；预过滤层的SEM测量平均孔径大于分离层的SEM测量平均孔径；分离层的厚度为5～60μm，分离层的SEM测量平均孔径为25～85nm；对于PP7噬菌体，除病毒膜的顶洗LRV不小于4，除病毒膜的顶洗LRV与初始LRV之比不低于0.7。本申请进一步公开了上述除病毒膜的制备工艺。本申请的纤维素除病毒膜具有较高的蛋白质收率，且在顶洗前后都具有较高的病毒截留效果，不但能够降低病毒污染风险，还能提高经济效益。

Description

一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜及其制备工艺

技术领域

本申请涉及膜分离技术的领域，尤其是涉及一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜及其制备工艺。

背景技术

膜分离技术是指以外界能力(如压力)或化学位差为推动力，对双组分或多组分的混合流体进行分离、分级、富集、提纯等的技术。膜分离技术由于具有分离效率高、能耗低、无需外加化学试剂、能分离常规方法无法分离的体系(如共沸体系)等优点，而被各行业广泛采用。特别是对于生物、医药领域而言，膜分离技术不易引起活性物质变性的特性，使得膜分离技术在各类生物制剂的生产过程中被广泛使用。

这是由于，在生物制剂的生产过程中，难以避免引入各类病毒，不论是国内还是国外，都对生物制剂的病毒安全性有明确要求。实际上，在进行药品申报时，就必须附上病毒安全性评估测试结果的报告，该报告内容将直接影响审查结果。因此，对于各类生物、医药企业而言，生物制剂生产过程中的病毒清除和/或病毒灭活步骤，是必不可少的。

各类生物制剂由于能够预防、治疗、诊断各类传染病、免疫性疾病及其他常规方式难以防治的疾病而快速发展。生物制剂一般是以微生物(细菌、立克次体、病毒等)及其代谢产物有效抗原成分、动物毒素、人或动物的血液或组织等加工而成。除了一般的生产要求外，如疫苗、广谱生物制剂等生产还具有一系列特点，如其一般需要进行微生物、病毒、活体细胞等的培养，随后对获得的生物物质进行后续加工，同时还有纯化、洁净、钝化、提取、冷冻、冻干等操作。

申请公开号为CN113842792A的中国发明专利申请文件中，公开了一种除病毒用不对称的PES滤膜，该PES滤膜包含主体，主体包括预过滤层和用于截留病毒的分离层，预过滤层的另一侧和分离层的另一侧以连续纤维过渡。该PES膜具有典型的双层结构(大孔径的预过滤层和小孔径的分离层)，并且具有良好的病毒截留效果(LRV＞4)，但是PES材质本身较差的亲水性决定了其蛋白质收率往往较低。

如授权公告号为CN1759924B的中国专利公开了一种多层复合超滤膜；该复合超滤膜包括至少一层具有第一面和等价的第二面的第一多孔膜层，以及至少一层具有等价的第一面和第二面的第二多孔膜层，该第一层与第二层的连接相叠加并具有从所述第二层的等价的第一面至所述第一层的等价的第二面的孔隙率连接过渡区域，其中所述层中的至少一层是非对称超滤膜。该种多层膜结构复合得到的滤膜虽然对于小尺寸病毒具有较好的滤除效果，但是该复合膜的过渡区域处具有孔径的快速突变区域，孔径的快速突变虽然能够起到良好的病毒截留效果，但是同时也会对大范围粒径的颗粒产生截留作用，从而导致通量和使用寿命的下降。且其属于聚醚砜类滤膜，聚醚砜材料本身较差的亲水性决定了，该滤膜对于病毒的吸附率较高，导致蛋白质收率下降。

上述两种滤膜由于采用亲水性较差的PES原料作为成膜材料而具有较高的蛋白质截留效果，导致蛋白质收率较低，对于各类生物、医药企业而言，过低的蛋白质收率是较为致命的缺陷。

专利号为JP1984204911A的日本发明专利公开了，再生纤维素膜(RC膜)对于艾滋病毒(约100nm)具有良好的清除能力，且由于纤维素的良好亲水特性，其对于活性物质(蛋白质)的吸附性较低，往往能够获得良好的蛋白质收率。但是其对于如乙肝病毒(约42nm)、nAnB型肝炎病毒(30～60nm)、鼠细小病毒(约20nm)等尺寸为20～100nm病毒的清除能力较差(LRV＜4)，因此，已经无法满足当下严苛的病毒清除要求。

进一步的，申请公开号为CN105980038A的中国发明专利申请文件中，公开了一种去除病毒的膜，其包含纤维素，具有供给含有蛋白质的溶液的第一侧的表面、和将透过该去除病毒的膜的透过液排出的第二侧的表面。其对于猪细小病毒(约18～26nm)的对数去除率能够达到4以上(LRV＞4)，且由于是纤维素类滤膜，亲水性较好，对于蛋白质的吸附率较低，往往具有较高的蛋白质收率。但是该滤膜采用铜氨法制备，铜氨法造成的污染较大、环境治理成本较高，且生产过程中的需要用到刺激性较强且味道难闻的氨气(氨水)，容易引起操作人员的健康问题。

蛋白质高昂的价格使得生物、医药企业不断追求病毒滤除阶段更高的蛋白质收率，也正因此，纤维素类除病毒膜高蛋白质收率的特性使得其成为未来的发展方向之一。然而，即使采用蛋白质收率较高的纤维素类除病毒膜，不论是实验室阶段还是实际生产过程中，都仍存在顶洗操作，其目的是将被除病毒膜截留的蛋白质洗出得到顶洗液，进一步回收顶洗液中的蛋白质以提高蛋白质收率。但是顶洗操作往往需要工艺停留，工艺停留阶段需要撤去外压以使蛋白质从除病毒膜的曲折通路中释放，从而更好的将蛋白质洗出并进行回收；但是撤去外压后被截留的病毒同样会从除病毒膜的曲折通孔中释放，该部分病毒同样容易被洗出，使得顶洗液中的病毒滴度较高。

对于纤维素类滤膜而言，顶洗时病毒被洗脱的现象更加严重。这可能是由于，纤维素原料虽然亲水性较好，但是纤维素的质地较软、机械强度较差，以纤维素类原料作为成膜材料制得的纤维素类除病毒膜往往容易在受压时发生较大的形变。在工艺停留过程中，由于撤去外压，原本受到外压而发生形变的纤维素类除病毒膜会恢复形变，恢复形变的过程中伴随着除病毒膜复杂的孔隙结构变化过程，除病毒膜的形变越大，恢复形变过程中越可能将被复杂的孔隙结构所截留的病毒释放而出，进而被洗出到顶洗液中。

基于上述问题，如何在确保纤维素类除病毒膜具有较高蛋白质收率的基础上，确保纤维素类除病毒膜在顶洗前后均具有较高的病毒截留效率，降低顶洗操作过程中病毒被洗出的可能性，是目前亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜及其制备工艺，该纤维素除病毒膜具有较高的蛋白质收率，且在顶洗前后都具有较高的病毒截留效果，不但能够降低病毒污染风险，还能提高经济效益。

第一方面，本申请提供一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，采用如下的技术方案：

一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，包含多孔主体，所述多孔主体内具有非定向曲折通路，所述多孔主体的一侧表面为第一外表面，所述多孔主体的另一侧表面为第二外表面，

所述多孔主体包括预过滤层以及用于截留病毒的分离层，所述预过滤层的一侧为第一外表面，所述分离层位于所述预过滤层靠近所述第二外表面的一侧，所述预过滤层和分离层之间以连续纤维过渡；

所述预过滤层的SEM测量平均孔径大于所述分离层的SEM测量平均孔径；

所述分离层的厚度为5～60μm，所述分离层的SEM测量平均孔径为25～85nm；

对于PP7噬菌体，所述除病毒膜的顶洗LRV不小于4，所述除病毒膜的顶洗LRV与初始LRV之比不低于0.7。

通过采用上述技术方案，本申请中的除病毒膜在厚度方向上具有连续变化的孔隙结构，其中，靠近第一外表面的多孔主体孔洞尺寸较大，位于预过滤层靠近第二外表面的一侧的多孔主体的孔洞尺寸较小。因此，本申请中的除病毒膜在厚度方向上具有各向异性的孔隙结构，属于不对称结构的除病毒膜。平均孔径较大的多孔主体即为预过滤层，预过滤层能够滤除料液中粒径较大的颗粒，降低大粒径颗粒堵塞分离层的可能，使除病毒膜具有较高的通量和纳污量；平均孔径较小的多孔主体即为分离层，能够截留需要过滤的病毒，大大降低滤液中的病毒滴度，降低生物制剂的病毒风险。

然而，一般认为，若除病毒膜具有更好的病毒截留效果，往往也意味着除病毒膜对于料液中其余物料的较高截留率(如蛋白质)以及通量的下降，因此，高病毒截留率与高蛋白质收率往往是相矛盾的。例如，为了获得更高的病毒截留率，可以减小分离层的SEM测量平均孔径或提高分离层厚度等，通过分离层中SEM测量平均孔径较小的曲折通路形成对病毒的高效截留。这种SEM测量平均孔径较小的曲折通路不但具有对病毒更好的截留效果，结合更大的比表面积产生的更大的吸附力，对于蛋白质的截留效果也更高。因此，病毒截留效果的提高往往也意味着蛋白质截留效果的提高，导致蛋白质收率的下降。

然而，本申请的发明人们发现，若纤维素除病毒膜中分离层的厚度为5～60μm、SEM测量平均孔径为25～85nm时，纤维素除病毒膜不但具有对小尺寸病毒(如典型的模型病毒PP7噬菌体)良好的滤除效果，还具有较高的蛋白质收率。

这可能是由于，一般的PES滤膜和PVDF滤膜需要通过低厚度、小孔径的分离层进行病毒过滤，以确保高病毒截留率和较高的蛋白质收率。若分离层的厚度过大(不论SEM测量平均孔径是否增大)，由于具有较强截留和吸附作用的曲折通路结构的厚度增加，亲水性较差的PES及PVDF滤膜很可能吸附或截留大量蛋白质导致蛋白质收率大幅下降；若提高分离层的SEM测量平均孔径，虽然蛋白质收率会提高，但是病毒截留效果往往会下降。而纤维素除病毒膜的亲水性更好(一般认为纤维素类滤膜是有机滤膜中最不容易吸附蛋白质的)，即使具有更大的分离层厚度，协同配合较大的SEM测量平均孔径(更低的比表面积)，对于蛋白质的吸附率也较低，从而获得较高的蛋白质收率。与此同时，较厚的分离层协同配合适当提高的SEM测量平均孔径，通过在厚度方向上更长路径的曲折通路，仍能保证对于尺寸与孔隙结构处于同一数量级的病毒的良好截留效果；而对于尺寸明显低于孔隙结构的蛋白质的截留效果较差，从而在确保高病毒截留效果的基础上获得高蛋白质收率。即，与一般认为的高病毒截留率、高蛋白质收率无法兼得不同，通过选用纤维素类原料、提高分离层厚度(5～60μm)以及适当提高分离层的SEM测量平均孔径(25～85nm)，纤维素除病毒膜不但具有高病毒截留率，还具有高蛋白质收率，实际上，该纤维素除病毒膜还同时具有较高的通量，因而具有较高的过滤效率，从而提高生产效率。

除此之外，由于各类蛋白质活性物质的价格高昂，提高各工序中的蛋白质收率意义重大。在病毒滤除工序中，以具有良好亲水性的纤维素类除病毒膜对料液中的病毒进行滤除，能够降低除病毒膜对于蛋白质的吸附，从而在确保高病毒截留率的基础上提高蛋白质的收率，获得更高的经济效益。在此基础上，不论是在实验室的验证阶段(为了不浪费蛋白质或更贴近实际生产过程)，还是在生物医药企业的实际生产过程中，以膜过滤器(或滤膜)对料液进行病毒滤除操作后，一般还需要进行顶洗操作。这是由于，在病毒滤除操作过程中，即使采用亲水性较好的纤维素类滤膜，滤膜中仍然会截留部分蛋白质，蛋白质的高昂价格决定了，即使被滤膜截留的蛋白质较少，也需要通过顶洗操作将蛋白质从滤膜中洗下。

顶洗的操作方法以实验室的验证阶段为例(实际生产的操作流程虽有差异，但是机理相同，可通过实验室验证阶段进行表征)，一般是在连续过滤的过程中，当膜过滤器(或滤膜)的流量衰减至75％或料液仅有少量剩余时，撤去外压并进行工艺停留(保持无外压状态一段时间，如5min到15min)，使蛋白质从孔隙结构中释放；随后加入缓冲液(可根据实际料液体系进行调整)，将释放的蛋白质从滤膜中洗脱得到顶洗液，再对顶洗液进行后处理以回收顶洗液中的蛋白质，从而提高蛋白质的收率。

本申请中为了获得更高的病毒截留率(初始LRV)，以及高蛋白质收率，适当增大了分离层的SEM测量平均孔径。一般认为，在顶洗操作撤去外压并工艺停留的过程中，不但蛋白质会从多孔主体的曲折通路中释放，具有更强运动能力的病毒更易于从孔隙结构中释放，对于机械强度较差的纤维素类除病毒而言，这种现象更明显。由于分离层的SEM测量平均孔径有所增大，病毒更易于穿过曲折通路向除病毒膜的下端移动。这部分释放并且运动到滤膜下端的病毒极易被洗脱至顶洗液中，因此，顶洗液中的病毒滴度往往远高于连续过滤时滤液中的病毒滴度。相应的，对于纤维素类除病毒膜而言，顶洗LRV相较于初始LRV往往下降较多。

然而，本申请的发明人们意外发现，对于纤维素类除病毒膜，当分离层的厚度为5～60μm、分离层的SEM测量平均孔径为25～85nm时，该除病毒膜不但在连续过滤时能够获得良好的病毒滤除效果，对于PP7噬菌体的对数去除率甚至能够达到5以上(即初始LRV＞5)；且在顶洗操作后，其对于PP7噬菌体的对数去除率仍然较高(即顶洗LRV)，相较于连续过滤时的初始LRV，顶洗LRV保留率能够达到80％以上，顶洗LRV仍能保持不小于4，这是一种全新的技术路线和改进方向，效果也是未曾预料的。

这可能是由于，对于纤维素类除病毒膜而言，在适当提高分离层厚度的基础上，适当提高分离层的SEM测量平均孔径，不但能够降低分离层厚度提高对除病毒膜通量的影响，使除病毒膜仍具有较高的通量；具有较致密的三维网络结构的分离层由于具有良好的自支撑性能，还能显著提高除病毒膜的机械性能，从而大大降低除病毒膜受压后发生的形变，也就自然降低了除病毒膜恢复形变时大量释放病毒的可能。另外，分离层的SEM测量平均孔径即使增大后仍然较小，协同配合分离层内路径较长的曲折通路结构，仍能保持对病毒良好的滤除效果；然而，分离层的SEM测量平均孔径即使增大后，料液中的蛋白质与分离层的孔径差异过大，即使配合分离层内的曲折通路结构，仍不易截留小尺寸的蛋白质。即，通过增大分离层的厚度、提高分离层的SEM测量平均孔径，对于病毒和蛋白质的截留效率影响并不同。

需要注意的是，对于纤维素类除病毒膜而言，若仅提高分离层的厚度而不提高分离层的SEM测量平均孔径，虽然很可能使除病毒膜的病毒滤除效果得到提高，但是大厚度、小孔径的分离层很可能导致蛋白质无法在顶洗时被洗出，降低蛋白质收率；且高厚度、小孔径的分离层对于除病毒膜的通量影响极大，很可能导致除病毒膜通量倍数下降。

若仅提高分离层的SEM测量平均孔径而不提高分离层的厚度，虽然除病毒膜的通量较大，并且顶洗时容易将蛋白质洗出；但是低厚度、小孔径的分离层往往病毒截留效果较差，无法确保除病毒膜具有所需的病毒滤除效果；此外，虽然分离层形成的三维网络结构较为致密，但是由于其厚度较低，能够起到的支撑效果十分有限，导致除病毒膜受压时很容易发生较大的形变，一旦除病毒膜的形变过大，还可能导致滤膜通量、载量的下降，甚至可能导致滤膜的撕裂、损坏。

因此，提高分离层厚度以及提高分离层的SEM测量平均孔径必须同时进行，才能确保分离层对于病毒的高截留率、对于蛋白质的低截留率，以及除病毒膜受压时具有尽量小的形变，降低顶洗工艺停留时因为除病毒膜较大的恢复形变，释放过量病毒的可能，从而确保除病毒膜顶洗时仍具有较高的对数去除率(即顶洗LRV)。

除此之外，一般认为，顶洗LRV高意味着除病毒膜在顶洗时对病毒仍具有良好的截留效果，这同时也往往意味着除病毒膜在顶洗时对蛋白质也有较好的截留效果。然而，本申请的发明人们意外发现，顶洗时虽然病毒的顶洗LRV较高，但是蛋白质的洗脱率并不低。这可能是由于，正如前述的，病毒和蛋白质对于分离层结构变化的敏感度并不同，适当提高分离层厚度和SEM测量平均孔径虽然能够提高顶洗时对于病毒的截留率，但是较大的SEM测量平均孔径使得即使分离层的厚度有所提高，其对于蛋白质的截留率提高也不明显。也正因此，即使顶洗时病毒的顶洗LRV不小于4，仍能将被除病毒膜截留的少量蛋白质洗脱。

由于顶洗后的顶洗液中病毒滴度较低，顶洗液污染滤液的可能较低，此外，对于顶洗液进行后续处理时，处理的难度大大降低、处理的效率大幅提高，对于各类生物、医药企业意义重大。

可以理解的是，本申请中的“初始LRV”，是指在除病毒膜的连续过滤过程中获得的滤液的病毒对数去除率；而本申请中的“顶洗LRV”是指在除病毒膜的连续过滤完成后，进一步对除病毒膜进行顶洗操作，顶洗后获得的顶洗液的病毒对数去除率。

PP7噬菌体是一种典型的病毒，如美国注射剂协会(PDA)颁布的TR41文件中就以PP7噬菌体作为小尺寸病毒的模式病毒，对滤膜或膜过滤器的病毒截留能力进行评价。因此，以PP7噬菌体作为模式病毒，比较滤膜连续过滤时的病毒截留能力以及顶洗时的病毒截留能力，对于评价滤膜顶洗前后的病毒滤除效果是可信且可被认可的。

本申请中所谓“非定向曲折通路”，是指在多孔主体内具有无规则取向的沟槽结构和/或离散分布的孔洞结构，且这些非定向曲折通路是相互贯通的，从而使料液能够通过相互贯通的通路而穿透滤膜，料液中的病毒及大颗粒物质等，被截留于滤膜的进液面或多孔主体内部的非定向曲折通路内，从而起到滤除病毒的效果。

本申请中所谓“连续纤维过渡”是指，多孔主体在膜厚度方向上的所有纤维是一体形成，所有纤维呈整体的相互连接，并不需要使用额外的胶粘剂等物质将各纤维进行粘接，除非通过外力撕裂剥离，否则三维网络状的纤维之间不会发生相互分离。与此同时，连续过渡的三维网络状纤维与第一外表面、第二外表面也是相互连接的。

本申请中的平均孔径、层结构的厚度、平均纤维直径等参数，均可通过使用扫描电子显微镜对膜结构进行形貌表征后，再利用计算机软件(如Matlab、NIS-Elements等)或手工进行测量后计算平均值，在进行测量时对于尺寸明显偏小或明显偏大的部分均不纳入考虑。需要补充的是，孔隙率的测量方法也可以通过计算机软件(如Matlab、NIS-Elements等)来计算获得，或者，通过重量法对膜的孔隙率进行测量。在平均孔径的测试方面，除了能够通过对SEM图进行测量分析，还可以通过平均孔径分布仪直接分析各层平均孔径，也可以通过泡压法测试平均孔径等。以上对于各参数测量方法仅为距离，可以理解的是，本领域技术人员还可以通过其他测量手段获得上述参数。

另外，必须注意的是，由于纤维素在干燥时会发现明显收缩现象，因此，纤维素类滤膜的各类形貌参数等均是在润湿条件下或冻干条件下拍摄SEM图而测得的。

可选的，所述分离层远离预过滤层的一侧面为分离层底面，对捕捉有20nm胶体金的所述除病毒膜进行顶洗，顶洗后所述除病毒膜的截面中，捕捉20nm胶体金的峰值部位与所述分离层底面的距离为D₁，所述D₁为0.2～5μm。

通过采用上述技术方案，由于PP7噬菌体在除病毒膜中的截留位置难以观察(除非通过基因编辑手段等在PP7噬菌体中引入荧光基因等，但是观察效果也一般)，也就难以对除病毒膜对于PP7噬菌体在厚度方向上的截留行为进行直观的展现和评价。

为了更直观的展现除病毒膜在连续过滤后或顶洗后20nm病毒在除病毒膜中的截留位置，利用本申请的除病毒膜对20nm胶体金进行捕捉。

由于本申请中纤维素除病毒膜的分离层具有更大的孔径，一般认为大孔径的分离层更容易导致顶洗时20nm胶体金的泄露。然而，本申请的发明人们意外发现，当顶洗后20nm胶体金的峰值捕捉部位与分离层底面的距离为0.2～5μm时，不但能够确保顶洗时可将被除病毒膜截留的蛋白质洗脱至顶洗液中，还能够确保顶洗时病毒仍被大量截留于除病毒膜，从而使顶洗LRV仍较高。这对于确定除病毒膜的顶洗效果具有重要的理论指导意义。

这可能是由于，20nm胶体金在分离层中的截留量为先不断增大再逐渐减小，即20nm胶体金在分离层厚度方向上的捕捉量分布为类似正态分布的曲线，虽然峰值部位的分离层捕捉有最大量的20nm胶体金，但是峰值部位下端的分离层仍然捕捉有部分20nm胶体金。因此，为了降低连续过滤时20nm胶体金泄露的风险、减少顶洗时病毒被洗脱的可能，需要控制20nm胶体金的峰值捕捉部位与分离层底面之间的距离。

当D₁过大时，意味着在顶洗后，对20nm胶体金起主要截留作用的部分与分离层底面的距离较大，虽然顶洗LRV较高，但是分离层下端未起截留作用的部分过多，这部分分离层会对除病毒膜的通量产生较大影响，影响连续过滤和顶洗操作时的效率；当D₁过小时，由于一定范围内的20nm胶体金在厚度方向上为类似正态分布的分布方式，20nm胶体金的峰值捕捉部位下端的胶体金离下端距离过小，容易发生泄露。

可以理解的是，本申请中的“峰值捕捉部位”是指，以除病毒膜捕捉20nm胶体金，并以该捕捉有20nm胶体金的除病毒膜切出切片后，用光学显微镜进行测定，发现其亮度最暗的地方为捕捉峰值；或者用EDS能谱仪进行测试后，其波峰所在的位置即为捕捉峰值。由于光谱的偏移峰与20nm胶体金的量成正关系，因此，光谱的最大峰处即为20nm胶体金的峰值捕捉部位。胶体金在多孔膜的分布结果测定可以参照中国专利CN105980038B-去除病毒的膜中的测试方法进行。

可选的，所述除病毒膜的截面中，捕捉20nm胶体金的峰值部位与所述分离层底面的距离为D₀，所述D₀为0.5～5μm。

通过采用上述技术方案，D0的大小主要影响除病毒膜的初始LRV和通量，这可能是由于，

若D₀过大，说明大量20nm胶体金在分离层的上端就被截留，该种结构的除病毒膜往往具有更高的初始LRV和顶洗LRV。然而，由于20nm胶体金在分离层的上端已经被基本捕捉，分离层的下端基本不起截留作用，若这部分不起截留作用的分离层占比过多，不但对于进一步提高初始LRV和顶洗LRV帮助较小，还会对除病毒膜的通量产生较大的影响。较低的通量对于除病毒膜的连续过滤和顶洗操作的效率影响过大，反而会引起整体生产效率的降低。另外，大量病毒被分离层上端截留，病毒与病毒、病毒与纤维容易形成架桥结构，产生对蛋白质的截留，因此，若D₀过大，还可能导致蛋白质收率的下降。

若D₀过小，说明大量20nm胶体金在分离层的下端才被截留，该种结构的除病毒膜不但初始LRV较低，由于顶洗后20nm胶体金很可能会往下端移动，顶洗LRV往往会产生较大幅的下降，这往往会导致除病毒膜病毒泄露风险的提高。

当D₀为0.5～5μm时，在除病毒膜中以类似正态分布的20nm胶体金能够被较为完整的截留，且由于捕捉20nm胶体金的峰值部位与分离层底面的距离并不大，因此，下端几乎不起截留作用而对通量有较大影响的分离层占比较少，从而在获得较高初始LRV的基础上，仍能获得较大的通量。此外，由于病毒、分离层纤维的架桥作用相对靠近分离层底面，不论是在连续过滤时，还是在顶洗操作时，这些架桥作用都不易对蛋白质产生过高的截留作用，从而使得该除病毒膜具有较高的蛋白质收率。

可选的，所述D₁小于D₀，所述D₀与D₁之差为0.1～3μm。

通过采用上述技术方案，本申请的发明人们发现，顶洗前后20nm胶体金的峰值捕捉部位在除病毒膜厚度方向上的位置有所下移(根据料液流动方向，除病毒膜的第一外表面认为是上端，除病毒膜的第二外表面认为是下端，下移是指向第二外表面移动)。这意味着，即使是不具有活性的胶体金，在撤去外压一定时间后，也会从除病毒的孔隙结构中释放，因此，20nm胶体金的峰值捕捉部位在顶洗操作后也会有所下移，这大大提高了20nm胶体金(即约20nm病毒)的泄露风险。

一般认为，顶洗前后20nm胶体金的峰值捕捉部位向下端移动的距离(即D₀与D₁之差)越小越好，说明20nm胶体金在顶洗时被洗脱的较少，从而使顶洗LRV下降较少。

然而，本申请的发明人们发现，D₀与D₁之差并非越小越好。虽然D₀与D₁之差越小，往往意味着相较于初始LRV，顶洗LRV的保留率越高，但是D₀与D₁之差越小，往往意味着分离层下端的孔径过小或者分离层下端的平均孔径沿膜的厚度方向以较快的速度减小(其他可以影响20nm胶体金向下端移动的条件都可能会产生这样的结果)。不论是哪一种原因，其能够阻挡20nm胶体金向下端移动，往往也会影响料液以及蛋白质向下端移动，从而影响通量及蛋白质的收率。当D₀与D₁之差过小时，虽然顶洗LRV较大，但是对于通量和蛋白质的收率影响较大。因此，D₀与D₁之差并非是越小越好，当D₀与D₁之差为0.1～3μm时，不但能够确保蛋白质收率以及顶洗LRV较高，还能确保除病毒膜具有较高的通量，这是十分出人意料的。

可选的，所述分离层的SEM测量平均孔径变化梯度为0～3nm/μm；对于PP7噬菌体，所述除病毒膜的顶洗LRV与初始LRV之比为0.85～0.95。

通过采用上述技术方案，分离层的SEM测量平均孔径从上端到下端基本不变时，认为分离层为基本对称的结构，基本对称的分离层不具有孔径较小的层结构；分离层的SEM测量平均孔径从上端到下端逐渐减小时，认为分离层为不对称结构，不对称的分离层越靠近下端SEM测量平均孔径越小，因此具有大孔径区域和小孔径区域。例如，若分离层的SEM测量平均孔径从40nm逐渐减小为20nm，此时的分离层具有SEM测量平均孔径为约40nm的大孔径层结构和SEM测量平均孔径为20nm的小孔径层结构，此时，分离层的SEM测量平均孔径为约大概30nm，为不对称结构；而若分离层的SEM测量平均孔径为均匀分布的30nm，则认为不具有小孔径层结构，为对称结构。

在此基础上，本申请的发明人们发现，即使是SEM测量平均孔径基本相同的分离层，分离层的SEM测量平均孔径变化梯度较大往往意味着除病毒膜的通量越低、顶洗LRV的下降；分离层的SEM测量平均孔径变化梯度较小往往使得除病毒膜具有更高的通量。这可能是由于，分离层本就较为致密的结构使得其是影响除病毒通量的主要区域，而不对称结构的分离层由于具有小孔径区域，产生对料液强力的阻滞作用，导致除病毒膜通量的下降；而对于对称结构的分离层由于各向基本同性，料液在各处受到的阻力相对均匀，不存在明显的高阻力区域，使得除病毒膜的通量相对较高。此外，不对称结构的分离层由于机械性能的不均匀性，自支撑性能大大降低，受压时更容易发生形变，也就更容易在顶洗过程中释放出病毒，导致顶洗LRV的下降。

本申请的发明人们还发现，在分离层的厚度和平均孔径适当增大的基础上(厚度为5～60μm、平均孔径为25～85nm)，当分离层为对称结构或者平均孔径的变化梯度较小时(即分离层的平均孔径变化梯度为0～3nm/μm时)，不但对于除病毒膜的通量影响也较小，还能够获得较高的顶洗LRV(除病毒膜的顶洗LRV与初始LRV之比为0.85～0.95)，能够获得高通量、高蛋白质收率、高初始LRV和高顶洗LRV的除病毒膜，而高蛋白质收率和高病毒截留率、高通量一般认为是无法兼得的，因此，这一效果是十分出乎意料的。

另外，一般认为，为了进一步降低顶洗时病毒的泄露风险，顶洗LRV越高越好；然而，本申请的发明人们发现，随着顶洗LRV的逐渐提高，顶洗LRV的提高难度骤增，顶洗LRV的小幅提升往往需要以通量的较大幅下降以及蛋白质收率的下降作为代价，这不但会降低生产效率，还会降低经济效益，因此，顶洗LRV并非越高越好。

可以理解的是，平均孔径变化梯度是指，分离层的平均孔径在厚度方向上，沿上端到下端的方向，其平均孔径的变化幅度，平均孔径变化梯度越大，说明分离层的平均孔径在厚度方向上的变化速度越快。

可选的，所述分离层的孔隙率为6～30％，所述分离层的厚度变化率不高于10％。

通过采用上述技术方案，分离层的孔隙率和厚度对于除病毒膜的病毒滤除效果以及通量影响较大，过高的孔隙率或厚度过低虽然通量较高，但是不论是初始LRV还是顶洗LRV都往往较低，病毒泄露风险较高；过低的孔隙率或过高的厚度虽然病毒滤除效果较好，但是往往通量较低、蛋白质收率较低，过滤效率较低，不适用于实际生产。

除此之外，本申请的发明人们发现，即使分离层的孔隙率和厚度基本相同的除病毒膜，顶洗LRV也可能较低，这一结果是比较意外的。通过对照，本申请的发明人们发现，当分离层的厚度变化率超过10％时，即使分离层的平均厚度、孔隙率大致相同，顶洗LRV也可能有较大的波动。这可能是由于，料液在除病毒膜厚度方向上流动时，分离层的平均孔径较小，阻力较大，是影响料液流动的主要影响部位；若部分区域的分离层厚度较小，该处对于料液的阻力也较小，料液极易在厚度较薄的区域产生较大的通量，病毒容易在该薄弱处突破，从而导致顶洗LRV的下降。

可以理解的是，分离层的厚度变化率为最大厚度与最小厚度之差，与分离层的平均厚度之比，厚度变化率越大，说明分离层的薄厚越不均匀。

可选的，所述除病毒膜的通量大于35L·h^-1·m^-2@30psi；所述除病毒膜的蛋白质收率不低于98％。

通过采用上述技术方案，该除病毒膜不但具有良好的病毒滤除效果，还具有较高的通量和较高的蛋白质收率。

可选的，所述第一外表面包括若干长条状且相互连接的第一纤维，第一纤维的SEM测量平均直径为70～650nm，相邻且相连接的第一纤维相互环绕形成第一孔洞。

通过采用上述技术方案，预过滤层以及第一外表面的孔洞结构孔径大，虽然能够获得较好的纳污效果，但是其机械性能往往较差，受外压力时孔洞结构容易发生坍缩，不但导致纳污量下降，还会影响除病毒膜的通量。对于本就质地较软的纤维素类除病毒膜而言，这种现象更加突出，影响也更大。

在除病毒膜使用过程中，受到料液较大的压力(如30psi，甚至在验证除病毒膜的完整性时，可能达到50psi)，当第一纤维的SEM测量平均直径为70～650nm时，不但能够形成孔径大小较为合适的孔洞结构，还能够对这些孔洞结构形成良好的支撑，大大降低除病毒膜受到较大压力时孔洞坍缩的可能。这对于纤维素类除病毒膜而言至关重要，第一外表面作为直接接触料液并且直接承压的部位，一旦因为过大的料液压力发生形变，将很可能使得除病毒膜因为较大的形变而导致通量、载量等的下降。第一外表面特定SEM测量平均直径的第一纤维配合厚度较大的分离层结构，能够相互支撑、相互强化结构，从而使除病毒膜形成强有力的自支撑，大大降低除病毒膜在较大的压力下的形变。与一般的纤维素类除病毒膜(如CN105980038A中的纤维素类滤膜)往往只能在15psi甚至更低的压力下使用不同，本申请的除病毒膜能够在30psi的压力下长时间使用，这是十分显著且具备商业价值的改进。

可选的，所述分离层包括第二外表面，所述第二外表面具有第二孔洞，所述第二孔洞的SEM测量平均孔径为15～35nm，所述第二外表面的孔洞面积率为2～15％，所述分离层的纤维为长条状且所述分离层的SEM测量平均纤维直径为20～50nm。

通过采用上述技术方案，预过滤层包括第一外表面、分离层包括第二外表面，因此，除病毒膜为典型的两层结构(SEM测量平均孔径较大的预过滤层和SEM测量平均孔径较小的分离层)，预过滤层用于过滤尺寸较大的颗粒，提高除病毒膜的纳污量和使用寿命；分离层对病毒起主要截留作用，降低病毒泄露的风险。

其中，第二外表面较低的SEM测量平均孔径和较低的孔洞面积率能够确保除病毒膜不但具有较高的初始LRV，还有较高的顶洗LRV。分离层的SEM测量平均孔径为25～85nm，而第二外表面的SEM测量平均孔径为15～35nm，即第二外表面的SEM测量平均孔径基本不大于分离层的SEM测量平均孔径，顶洗时分离层靠近第二外表面的部分能够起到良好的截留效果，从而提高顶洗LRV，降低病毒泄露风险。

一般认为，孔径较小的分离层是影响除病毒膜通量的主要部位，料液在通过分离层时需要绕过纤维结构，因此，分离层的SEM测量平均纤维直径越小，对于料液的阻碍越小，除病毒膜也就具有更高的通量。然而，本申请的发明人们发现，分离层的SEM测量平均纤维直径并非越小越好，这可能是由于，当分离层的SEM测量平均纤维直径过小时，分离层形成的三维网络结构产生的自支撑能力较弱，在料液压力作用下容易被压缩，分离层的孔洞结构也被压缩，压缩后更小孔径的孔洞结构反而会导致通量的下降；此外，当分离层的SEM测量平均纤维直径过小时，即使采用亲水性较好的纤维素类原料，过大的比表面积也会产生更高的蛋白质吸附率，蛋白质收率会相应下降。因此，分离层的SEM测量平均纤维直径为20～50nm时能够确保分离层的三维网络结构具有良好的自支撑，且对于料液的阻力也相对较小，两者协同配合，确保除病毒膜具有较高的通量和病毒滤除效果。

可选的，所述分离层与所述多孔主体的厚度之比为8～25％，所述除病毒膜的孔隙率为20％～60％。

通过采用上述技术方案，对于纤维素类除病毒膜而言，由于其良好的亲水性，即使分离层的厚度较高，仍能获得较高的蛋白质收率，但是对于厚度较大的除病毒膜而言，由于料液在膜厚度上通过曲折通路的路径较长，虽然病毒在长距离的曲折通路中更易于被截留，但是通量往往有所下降，且蛋白质的吸附率也往往更高，从而导致蛋白质的收率下降。因此，当多孔主体的厚度较大时，不但要适当降低小孔径的分离层的占比，还要适当提高除病毒膜整体的孔隙率，从而在确保除病毒膜具有较高初始LRV和顶洗LRV的基础上，提高除病毒膜的通量和蛋白质收率。

本申请的发明人们发现，当多孔主体的厚度较大时(由于分离层的厚度占比较低，多孔主体的厚度也就相应较大)，分离层的厚度占比可适当降低至约为8～25％，除病毒膜的孔隙率可适当提高至20％～60％。此时，即使除病毒膜的厚度较大，也能够在确保高初始LRV和顶洗LRV的基础上，同时获得较高的通量和蛋白质收率。

可选的，所述第一外表面上第一孔洞的SEM测量平均孔径为400～5000nm，第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比为15～200，所述第一外表面的孔洞面积率为8～45％。

通过采用上述技术方案，当多孔主体的厚度较大时，第一孔洞的SEM测量平均孔径为400～5000nm、第一外表面的孔洞面积率为8～45％两者协同配合，确保除病毒膜的第一外表面能够较好的引导料液进入并通过第一外表面的孔洞结构，并进入到膜内部，从而获得更高的通量。此外，作为直接承压的第一外表面，虽然与分离层形成相互支撑，但是自身必须具有足够的耐压性能，本申请的发明人们发现，对于SEM测量平均直径为70～650nm的第一纤维，第一孔洞的SEM测量平均孔径为400～5000nm时，第一纤维对于第一孔洞具有较为良好的支撑效果，能够确保除病毒膜在30psi的压力下长时间使用。

当第一孔洞的SEM测量平均孔径和孔洞面积率过低时，由于多孔主体厚度较大，除病毒膜的通量往往较低，过滤效率较低。当第一孔洞的SEM测量平均孔径和孔洞面积率过高时，虽然料液更易于通过第一外表面的孔洞进入到膜内部，但是预过滤层对于大颗粒的预过滤效果较差，容易造成分离层的堵塞，导致使用寿命的下降。此外，若第一孔洞的SEM测量平均孔径和孔洞面积率进一步提高，甚至可能导致通量、载量等的大幅下降，这是由于，第一孔洞的SEM测量平均孔径和孔洞面积率过高必然导致第一纤维支撑力的不足，从而导致第一外表面附近膜结构机械性能的下降，在料液较大压力的作用下，第一外表面附近的膜结构很可能受压坍缩，导致通量下降。

除此之外，第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比一定程度上表征了多孔主体在膜厚度方向上的孔径变化程度，两者之比越大，往往说明孔径变化程度越大。由于多孔主体的厚度较大，病毒在长距离的曲折通路中更易于被截留，料液受到的阻力本就较大，此时，若第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比过大，往往导致除病毒膜的通量较大幅的下降；而若第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比过小，将大大提高病毒泄露风险。第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比为15～200能够在确保低病毒泄露风险的基础上，获得较高的通量。

可选的，所述预过滤层的SEM测量平均孔径为160～600nm，所述预过滤层的孔隙率为35％～75％，所述预过滤层的SEM测量平均孔径从靠近第一外表面向靠近第二外表面一侧逐渐减小，所述预过滤层靠近第一外表面的孔径减小速度大于所述预过滤层靠近第二外表面的孔径减小速度。

通过采用上述技术方案，预过滤层对于除病毒膜的使用寿命、通量等均有较大的影响，且由于多孔主体厚度较大，往往通量较低。当预过滤层的SEM测量平均孔径为160～600nm、预过滤层的孔隙率为35％～75％，预过滤层具有良好的纳污能力，从而提高除病毒膜的使用寿命；较大的SEM测量平均孔径和孔隙率对于料液的阻力较小，对于通量的影响较小。此外，预过滤层作为膜厚度上最主要的承压部位，必须具有良好的抗压、抗变形能力，一旦预过滤层的SEM测量平均孔径过大、预过滤层的孔隙率过大，即使第一外表面和分离层均能够起到良好的强化和自支撑作用，预过滤层仍很可能在较高压力的料液作用下发生形变，从而导致除病毒膜通量、载量等的下降。

除此之外，预过滤层的SEM测量平均孔径变化速度先快后慢，从而使大颗粒物质能够较快的被预过滤层截留，降低大颗粒物质对分离层的影响；且由于预过滤和分离层之间不存在平均孔径的突变区域，蛋白质不易被截留在平均孔径的突变区域，因此，即使除病毒膜的厚度较大，仍能获得较高的蛋白质收率。

可选的，所述分离层与所述多孔主体的厚度之比为40～95％，所述除病毒膜的孔隙率为15～50％。

通过采用上述技术方案，当多孔主体的厚度较小(由于分离层的厚度占比较高，多孔主体的厚度也就相应较小)，料液在膜厚度上的流动路径较短、阻力也较小，虽然较小阻力下除病毒膜往往具有较高的通量，但是短距离的曲折通道对于病毒的截留效果往往较差。较小的多孔主体厚度很容易造成初始LRV和顶洗LRV的下降，导致病毒泄露风险的提高。因此，当多孔主体的厚度较小时，需要提高分离层的占比、降低除病毒膜的整体孔隙率，从而提高除病毒膜对于病毒的滤除能力，从而使小厚度的除病毒膜在具有高通量和高蛋白质收率的基础上，仍具有较高的初始LRV和顶洗LRV。

本申请的发明人们发现，当分离层的占比达到40～95％，且除病毒膜的孔隙率需要较低，至约15～50％；能够确保除病毒膜具有较高的初始LRV和顶洗LRV，且除病毒膜的通量较高。

可选的，第一孔洞的SEM测量平均孔径为300～4500nm，第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比为10～150，所述第一外表面的孔洞面积率为5～40％。

通过采用上述技术方案，由于多孔主体的厚度较小，在此基础上，当第一孔洞的SEM测量平均孔径为300～4500nm、第一外表面的孔洞面积率为5～40％，除病毒膜的第一外表面对于大颗粒物质能够起到良好的预过滤作用，降低大颗粒物质对分离层的影响，使分离层能够更好的起到截留病毒的作用。且由于料液受阻较小，料液能够较好的穿透第一外表面的孔洞结构进入到膜内部。因此，对于小厚度的除病毒膜而言，在高分离层厚度、低整体孔隙率的基础上，SEM测量平均直径为70～650nm第一纤维能够对SEM测量平均孔径为300～4500nm的第一孔洞形成良好的支撑，配合厚度较大、自支撑效果较好的分离层解耦股，能够大大降低除病毒膜在较大压力下的形变，从而确保除病毒膜使用时不但具有良好的病毒滤除效果，还能具有较高的通量和载量。

当第一外表面的SEM测量平均孔径和孔洞面积率过低时，虽然多孔主体的厚度较小，但是除病毒膜的通量仍会产生较大幅的下降，这是由于，料液中的大颗粒物质很容易堵塞第一外表面或预过滤层，集中截留的大颗粒物质形成大量架桥结构，大大提高料液所受阻力。当第一外表面的SEM测量平均孔径和孔洞面积率过高时，大颗粒物质容易突破并聚集到预过滤层的下端甚至聚集到分离层，从而影响分离层对于病毒的截留作用，导致使用寿命的下降。

除此之外，第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比一定程度上表征了多孔主体在膜厚度方向上的孔径变化程度，两者之比越大，往往说明孔径变化程度越大。由于多孔主体的厚度较小，孔隙率较低，病毒在短距离的曲折通路中本就受阻较小，此时，若第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比过大，通量的提高并不明显，但是很可能导致除病毒膜使用寿命的下降以及初始LRV、顶洗LRV的下降；若第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比过小，第一外表面又很容易被大颗粒物质堵塞，除病毒膜的使用寿命以及初始LRV、顶洗LRV同样可能下降。

第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比为10～150能够在确保低厚度除病毒膜具有较高通量的基础上，具有较高的初始LRV、顶洗LRV以及使用寿命。

可选的，所述预过滤层的SEM测量平均孔径为150～500nm，所述预过滤层的孔隙率为30～70％，所述预过滤层的SEM测量平均孔径从靠近第一外表面向靠近第二外表面一侧逐渐减小，所述预过滤层靠近第一外表面的孔径减小速度大于所述预过滤层靠近第二外表面的孔径减小速度。

通过采用上述技术方案，预过滤层对于除病毒膜的使用寿命、通量等均有较大的影响，且由于多孔主体厚度较小，往往病毒滤除效果较差。更重要的是，对于小厚度的除病毒膜而言，预过滤层的占比较低，因此，大颗粒物质十分容易透过预过滤层，对分离层产生影响，从而影响除病毒膜的通量、病毒滤除效果等。预过滤层的上端(靠近第一外表面的一侧)孔径快速降低，形成孔径的突变区，该突变区对于蛋白质和小尺寸病毒的流通影响较小，但是对于大颗粒物质的影响很大，协同配合预过滤层相较于第一孔洞明显下降的孔洞尺寸能够确保预过滤层的上端对于大颗粒物质具有良好的截留效果，降低大颗粒物质从预过滤层泄露，影响分离层的可能。预过滤层的下端(靠近第二外表面的因此而)孔径变化较小，协同配合预过滤层高达30～70％的孔隙率能够提高预过滤层的纳污量，确保预过滤层能够容纳足够量的大颗粒物质，以提高滤膜的载量。

可选的，所述分离层远离预过滤层的一侧还设有保护层，所述保护层与所述分离层之间以连续纤维过渡，所述保护层包括第二外表面；

所述保护层的SEM测量平均孔径大于分离层的SEM测量平均孔径、小于预过滤层的SEM测量平均孔径，所述多孔主体的厚度为30～80um，所述保护层的厚度与所述多孔主体的厚度之比为5～20％。

通过采用上述技术方案，对于两层结构的除病毒膜而言，虽然已经能够获得较好的病毒滤除效果，但是由于分离层位于膜表面，是直接裸露的，易于受到机械破坏。进一步在分离层外侧引入SEM测量平均孔径大于分离层而小于预过滤层的保护层，并通过限定保护层的厚度，能够确保保护层形成对分离层的良好保护效果。此外，通过限定保护层的厚度及其与多孔主体的厚度之比，能够在降低除病毒膜中起主要分离截留作用的分离层受到机械性损伤的可能的基础上，确保除病毒膜具有较高的通量。

若保护层的厚度过小，虽然其对于通量的影响较小，但是其对于分离层的保护效果较差；而当保护层的厚度过大时，虽然其对于分离层的保护效果较好，但是其对于通量的影响较大。在多孔主体的厚度为30～80um的基础上，厚度占比为5～20％的保护层不但能够确保对于分离层具有良好的保护效果，还能够确保除病毒膜具有较高的通量。

这可能是由于，虽然保护层的引入一定程度上提高了料液在膜厚度上的阻力，但是分别位于分离层两侧的预过滤层和保护层能够一定程度上起到加强肋的效果，从而提高除病毒膜的机械性能，进一步降低除病毒膜受到料液压力时，孔隙结构受压形变导致通量降低的可能。即除病毒膜的通量受到保护层引入导致阻力变大，以及保护层引入降低孔隙结构压缩变形这两者的共同影响，在一定范围内，适当提高保护层的厚度甚至不会导致除病毒膜通量的下降，这是十分出乎意料的。

可选的，第一孔洞的SEM测量平均孔径为300～4500nm，第二孔洞的SEM测量平均孔径为100～500nm，第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比为2～25。

通过采用上述技术方案，进一步在分离层外侧引入的保护层一定程度上影响除病毒膜的通量，然而，本申请的发明人们发现，当第一孔洞的SEM测量平均孔径为300～4500nm、二孔洞的SEM测量平均孔径为100～500nm，并且两者之比为2～25时，结合保护层较低的厚度占比，除病毒膜能够在显著降低分离层抗机械破坏能力的基础上，仍具有较高的通量。

这可能是由于，第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径能够一定程度上表征除病毒膜两个表面附近的膜结构。当第一外表面的SEM测量平均孔径过大时，不但会导致对于大颗粒物质的截留效果变差，提高大颗粒物质直接堵塞分离层的可能，还可能因为第一纤维不足以提供足够的支撑力而导致预过滤层的机械性能降低，在料液压力作用下孔隙结构可能发生压缩形变，导致通量下降；当第一孔洞SEM测量平均孔径过小时，料液受到实体部分过大的阻力，不但会导致通量的下降，还可能会导致预过滤层纳污量的下降，使用寿命的降低。当第一孔洞的SEM测量平均孔径过大时，外部物体仍可能通过较大的孔隙结构对分离层造成机械损伤，且保护层的加强肋效果也可能下降；当第二孔洞的平均孔径过小时，虽然保护层对于分离层的保护效果较好，也能够起到更好的加强肋效果，但是第二孔洞过小的孔径对于通量的影响较大，对于整个过滤过程的效率影响较大。

而第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比为2～25能够确保除病毒膜两个表面的孔隙结构结合下，除病毒膜不但具有良好的病毒截留效果、机械强度，还具有较高的通量。

可选的，所述保护层的SEM测量平均孔径为50～450nm，所述保护层的孔隙率为20～55％。

通过采用上述技术方案，在保护层的厚度占比为5～25％的基础上，当保护层的平均孔径为50～450nm、孔隙率为20～55％时，不但保证了保护层对于分离层良好的保护效果，还通过降低除病毒膜受到料液压力时的压缩变形量等方式，确保除病毒膜具有较高的通量。此外，由于除病毒过滤一般为死端过滤，除病毒膜往往受到垂直于膜片较大的压力，从而导致除病毒膜容易发生朝向下端凸起的形变方式，该形变方式容易导致除病毒膜靠近上端部位的孔隙结构压缩，而除病毒膜靠近下端部位的孔隙结构被拉伸，纤维素纤维的特性决定了，相较于受压、纤维素纤维在受拉时更容易发生断裂，而一旦除病毒膜下端内部的纤维发生断裂，孔隙结构的尺寸将显著提高，本应被小孔径孔隙截留的病毒将很可能发生泄露，初始LRV和顶洗LRV都可能有较大幅的降低。在分离层下端引入的保护层不但能够提高分离层抗机械破坏的可能，还能够降低除病毒膜下端纤维断裂导致初始LRV以及顶洗LRV下降的可能，降低病毒泄露的可能。

可选的，所述分离层远离预过滤的一侧还设有多孔支撑层，所述多孔支撑层远离所述分离层的一侧还设有防渗漏层，所述分离层、多孔支撑层和防渗漏层以连续纤维过渡；

所述多孔支撑层的SEM测量平均孔径大于所述分离层和所述防渗漏层的SEM测量平均孔径且小于所述预过滤层的SEM测量平均孔径；

所述多孔支撑层的SEM测量平均孔径为50～400nm，所述防渗漏层的SEM测量平均孔径为25～35nm。

通过采用上述技术方案，四层结构在膜厚度方向上沿料液流经方向依次排列，分别是孔径最大的预过滤层、孔径较小的分离层、孔径中等的多孔支撑层和孔径较小的防渗漏层。

其中，预过滤层的SEM测量平均孔径较大，能够滤除料液中的大颗粒物质，降低大颗粒物质直接堵塞分离层导致除病毒膜使用寿命降低的可能。SEM测量平均孔径较小的分离层对病毒起主要截留作用，经过预过滤层滤除大颗粒后的料液经过分离层时，被截留或吸附在分离层的表面或内部，而粒径更小的蛋白质等能够通过分离层上的孔隙结构，随料液移动，因此经过分离层后的料液病毒浓度很低，而蛋白质浓度、纯度较高。经过分离层后的料液进入SEM测量平均孔径相较于分离层更大的多孔支撑层，多孔支撑层起到良好的缓冲作用，降低除病毒膜在料液压力作用下的形变，提高使用寿命和过滤效果(特别是对于中空纤维膜而言，由于膜丝外表面通过胶水相互粘接，不断形变的膜丝很容易与胶粘剂脱附，从而影响整个膜过滤组件的寿命)。

由于料液流经多孔支撑层后，流入孔径相较于多孔支撑层更小的防渗漏层，这一过程伴随孔径的突变(变小)，能够形成二次截留效果，以截留料液中本就浓度不高的病毒，进一步提高除病毒膜对于病毒的截留效果。这种二次截留效果不但能够大大提高除病毒膜的初始LRV，对于提高除病毒膜的顶洗LRV作用也很大。

另外，当多孔支撑层的SEM测量平均孔径为50～400nm、防渗漏层的平均孔径为25～35nm时，除病毒膜的初始LRV和顶洗LRV都有所提高，这可能是由于，分离层、多孔支撑层和防渗漏层使得除病毒膜在膜厚度上形成了小孔径、中孔径和小孔径的孔径的不连续变化趋势，料液特别是料液中病毒的运动状态变为不连续运动的状态，病毒的不连续运动状态结合防渗漏层较小的SEM测量平均孔径，能够确保除病毒膜具有较高的初始LRV和顶洗LRV。

另外，特定的分离层+防渗漏层的双截留层的结构，使得除病毒膜即使在制膜过程中因为种种原因具有一定缺陷，仍能保持良好的病毒截留效果。例如，即使预过滤层和分离层在制膜过程中产生缺陷，多孔支撑层配合防渗漏层也能够起到较好的截留效果(一张膜片两侧同时存在缺陷并且缺陷正好在同一处的概率很低)，这大大降低了病毒泄露的风险，提高了生物制剂的安全性。

可选的，所述预过滤层的SEM测量平均孔径为120～500nm，所述分离层的SEM测量平均孔径为25～35nm，所述分离层的SEM测量平均孔径与所述防渗漏层的SEM测量平均孔径之比为0.75～1.3。

通过采用上述技术方案，SEM测量平均孔径为120～500nm的预过滤层能够使除病毒膜具有良好的纳污量，降低大颗粒物质堵塞分离层的可能性，提高除病毒膜的使用寿命。且第一纤维的良好的支撑力配合预过滤层相对较小的孔径，协同配合进一步引入的多孔支撑层，能够确保除病毒膜在受压时形变较小，以降低其使用时通量、载量等的下降，进一步确保除病毒膜具有良好的初始LRV和顶洗LRV。

可选的，所述多孔主体的厚度为25～100μm，所述分离层与所述多孔主体的厚度之比为5～25％，所述多孔支撑层的厚度与所述多孔主体的厚度之比为5～25％，所述防渗漏层的厚度与所述多孔主体的厚度之比为2～5％。

通过采用上述技术方案，一般认为，分离层+防渗漏层的双截留层结构虽然能够获得更好的初始LRV和顶洗LRV、降低病毒泄露风险，但是这样结构的除病毒膜因为对于料液的阻力较大，因而往往通量较低，而除病毒膜的通量对于整个过滤过程的效率具有十分重要的影响。

实际上，当分离层的厚度、平均孔径等较为合理的基础上(分离层厚度占比为5～25％)，分离层本就具有良好的病毒滤除效果，即使是顶洗操作时，从分离层泄露的病毒量也较低，因此，防渗漏层主要起辅助截留的作用。考虑到防渗漏层的厚度、平均孔径等对于滤膜的通量的确影响较大，在确保高初始LRV和顶洗LRV的基础上，需要对防渗漏层进行条件以使除病毒膜具有较高的通量。

本申请的发明人们发现，实际上，只需控制多孔支撑层的平均孔径和厚度、防渗漏层的平均孔径和厚度等条件，即使具有双截留层结构的除病毒膜，仍能够具有较高的通量。这可能是由于，一定范围内，除病毒膜的初始LRV和顶洗LRV随着第二分离层的提高而提高，然而，这种病毒滤除效果的提升存在边际递减效应。随着第二分离层厚度的提高，除病毒膜的病毒滤除效果首先快速提高(快速上升阶段)；随着第二分离层厚度的进一步提高，除病毒膜的病毒滤除效果虽然仍有提升，但是提升速度明显放缓(慢速上升阶段和基本平稳阶段)。因此，只需第二分离层的厚度处于快速上升阶段，就能够以较薄的防渗漏层，在尽量降低对除病毒膜通量影响的基础上，显著提高除病毒膜的病毒滤除效果。

即，当防渗漏层占总膜厚的2～5％时，能够显著提高除病毒膜的病毒滤除效果，而对于处并对膜的通量影响较小，这就使得，获得高病毒滤除效果、高通量的双截留层除病毒膜得以实现。

第二方面，本申请提供一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜的制备工艺，采用如下的技术方案：

一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜的制备工艺，包括以下工艺步骤：

S1、铸膜液配置，并将其流延到载体上形成液膜；所述铸膜液包括下列重量份物质组成：醋酸纤维素10～30份；良溶剂20～50份；非溶剂3～6份；无机盐0.1～1份；

所述良溶剂为丙酮、二氧六环、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸中的至少一种；

所述非溶剂为水；

所述无机盐的阳离子为钠、钾、钙、镁中的一种或多种，所述无机盐的阴离子为硫酸根、亚硫酸根或碳酸盐中的一种或多种；

S2、预分相，以第一预分相液对液膜的第一外表面进行预分相，得到初生膜；所述第一预分相液为60～90wt％的丙酮水溶液，预分相的时间为2～15s；

S3、固化分相，将初生膜浸入凝固浴中分相固化，得到成膜，所述凝固浴包括水和渗透剂，所述渗透剂的浓度为0.1～5wt％，所述渗透剂为乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇、仲戊醇中的至少一种；

S4、后处理，将成膜置于氢氧化钠溶液中进行水解，水解后清洗形成固态膜；进一步将固态膜置于交联剂中进行交联处理，交联处理结束并清洗后得到成品膜，所述交联剂为卤代环氧化物、双卤代烷烃和双卤代醇中的至少一种。

通过采用上述技术方案，以醋酸纤维素作为成膜原料，成膜后水解再生得到再生纤维素膜，整个生产过程对于环境的污染较少，并且获得的除病毒膜具有良好的亲水性，因而对于蛋白质的吸附率较低，能够获得较高的蛋白质收率。

本申请特定的，在铸膜液中添加非溶剂和无机盐，是由于本申请的发明人们发现，在铸膜液中添加非溶剂和无机盐协同配合能够提高预分相和固化分相时的稳定性，调节分相速度，提高除病毒膜各层厚度的均匀性、各层孔隙结构的尺寸稳定性等。这可能是由于，无机盐虽然能够提高分相稳定性、调节分相速度，但是其在良溶剂中的溶解性较差，在铸膜液中的分散性较差；加入的无机溶剂本身就具有调节分相速度的作用，且其还能促进无机盐的溶解和均匀分散，两者协同，使除病毒膜的孔隙结构尺寸均匀性和稳定性等提高。

但是，需要注意，非溶剂的添加量需要严格控制，这是由于，非溶剂虽然能够与无机盐产生协同产生提高分相稳定性的效果，但是非溶剂的提高会提高成膜组分的分相速度，一旦非溶剂添加过量，很可能导致除病毒膜的整体孔隙率偏低，通量过低，失去应用价值。而若非溶剂的添加量过少，其对于无机盐的促溶、促分散作用较低，其自身对于成膜组分的促进分相稳定性的作用也较低，从而使得最终获得的除病毒膜均匀性较差。

在步骤S2中，以水含量较低的第一预分相液对液膜进行预分相，液膜的第一外表面(即原理载体的一侧)以较为缓慢的速度分相，从而在第一外表面形成孔径较大的孔洞结构。在步骤S3中，凝固浴中额外添加的小分子醇类渗透剂不但具有良好的提高分相稳定性的作用，还能够调节凝固浴的表面张力，促进凝固浴向膜内部的渗透，从而形成性能良好的分离层等结构。

对于质地本就较软的纤维素类原料而言，将醋酸纤维素水解为再生纤维素虽然能够提高除病毒膜的亲水性，但是也往往意味着除病毒膜中纤维结构的尺寸稳定下降、除病毒膜机械性能的下降，这对于本就机械性能较差的纤维素类除病毒膜而言是较为致命的。通过交联处理，能够将多条纤维高分子链连接到一起，从而形成微观上的三维网络自支撑结构，从而大大提高除病毒膜中纤维结构的机械性能和尺寸稳定性，提高除病毒膜的机械性能。

可选的，所述步骤S2中，还以第二预分相液对所述第二外表面进行预分相，所述第二预分相液为40～60wt％的丙酮水溶液，所述预分相时间为2～10s。

通过采用上述技术方案，第二预分相液的水含量相较于第一预分相液更高，因此形成的孔洞结构孔径也相较于第一外表面的孔洞结构更小。在第一预分相液和第二预分相液的作用下，第一外表面向膜厚度内部延伸形成预过滤层，第二外表面向膜厚度内部延伸形成保护层。添加有渗透剂的凝固浴通过第一外表面和第二外表面上形成的孔洞结构向膜内渗透，膜内部在水含量较高、量较大的凝固浴的作用下发生快速分相，从而形成平均孔径最小的分离层结构。

为了形成所需的第二外表面孔洞结构和保护层结构，需要控制第二预分相液中的水含量，还需要控制预分相时间，从而控制第二外表面的分相速度和分相时间，形成厚度、孔隙率、孔径合适的保护层和第二外表面结构。

可选的，所述步骤S2中，还以第三预分相液对所述第二外表面进行预分相，所述第三预分相液为20～40wt％的丙酮水溶液，且所述第三预分相液比液膜温度低5～10℃，所述预分相时间为2～10s。

通过采用上述技术方案，以水含量相较于第一预分相液更高的第三预分相液对第二外表面进行预分相，较高水含量的第三预分相液能够在第二外表面形成孔径较小的孔洞结构。在一定时间的预分相以及凝固液的协同作用下，能够形成平均孔径较小、厚度较低的防渗漏层，由于防渗漏层的平均孔径较小，即使凝固浴中添加有渗透剂仍较难通过孔隙率低、平均孔径小的防渗漏层，因此，在防渗漏层向膜内部延伸的区域往往具有较慢的分相速度，从而形成平均孔径大于防渗漏层的多孔支撑层。在具有较大孔径的多孔支撑层形成后，从预过滤层处渗入的凝固浴以及从多孔支撑层处渗入的凝固浴配合，使膜内部快速分相，从而形成平均孔径较小的分离层结构。

为了形成防渗漏层结构和多孔支撑层结构，需要控制第三预分相液中的水含量以及预分相时间，这是由于，为了获得小孔径的防渗漏层，获得良好的两层截留效果，需要第二外表面具有较快的分相速度，一般做法是提高第三预分相液中的水含量。然而，本申请的发明人们发现，单纯调节第三预分相液中的水含量很难获得所需的防渗漏层结构，这可能是由于第三预分相液中水含量的细微变化对于膜结构的影响较大，特别是对于平均孔径较小的防渗漏层而言，此时，通过适当调低预分相温度，能够对防渗漏层的结构进行更细微的调节。即，对于具有特定孔洞结构的防渗漏层而言，第三预分相液中的水含量起到主要的影响作用，通过降低预分相温度，起到辅助调节防渗漏层孔洞结构的作用。第三预分相液和预分相温度协同配合，在一定时间的预分相以及凝固浴处理后，能够较稳定的获得所需结构的防渗漏层，确保获得良好的两层截留效果，使除病毒膜具有良好的初始LRV和顶洗LRV。

综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

1.通过选用亲水性较好的纤维素类材料作为成膜材料，进一步以较厚的分离层协同配合适当提高的SEM测量平均孔径，确保除病毒膜对于与分离层孔隙结构尺寸同一数量级的病毒仍有良好的截留效果，而对于尺寸远小于分离层孔隙结构的蛋白质截留较差，因此，能够获得较高的蛋白质收率和高病毒截留率；此外，较厚的分离层协同配合适当提高的SEM测量平均孔径能够使分离层形成较为致密且厚度较大的三维网络结构，使分离层具有良好的自支撑性能，大大降低除病毒膜受压后形变的可能，也就能降低顶洗时由于除病毒膜恢复形变而导致的病毒的大量释放，从而提高顶洗LRV，降低顶洗液中蛋白质的回收难度。

2.为了更好表征病毒在除病毒膜中的截留区域，以除病毒膜对20nm胶体金进行捕捉，由于20nm胶体金在膜厚度上的分布，在一定区域内形成类似正态分布的曲线，限定连续过滤时20nm胶体金的峰值吸收峰和顶洗后20nm胶体金的峰值吸收峰与分离层底面之间的距离，能够在确保除病毒膜具有高初始LRV和高顶洗LRV的基础上，降低除病毒膜对蛋白质的吸附以及对通量的影响。

3.通过除病毒膜捕捉20nm胶体金，发现顶洗前后，除病毒膜中20nm胶体金的峰值捕捉部位存在向下移动的趋势，一般认为该峰值捕捉部位的下移越小越好，才能获得较高的顶洗LRV；然而，在本申请中的纤维素类除病毒膜通过对分离层结构的改进，具有较好的机械性能，因而不易因为恢复形变而释放较大量病毒的基础上，峰值捕捉部位的下移越小，说明其对于释放的病毒的截留效果越好，往往对于蛋白质收率和通量的影响也就越大。

4.通过控制分离层具有较小的孔径变化梯度(甚至基本不变)，能够提高料液在分离层内的受阻均匀性，从而提高除病毒膜的通量；此外，分离层内更均匀的三维网络结构能够提高分离层的自支撑能力，从而降低顶洗时释放病毒的可能，以提高除病毒膜的顶洗LRV。

5.当除病毒膜为预过滤层和分离层的两层结构时，在分离层具有良好的自支撑效果的基础上，通过对预过滤层的SEM测量平均孔径、孔隙率以及支撑纤维的SEM测量平均直径进行调节，确保预过滤层能形成具有较好支撑效果的三维网络结构，从而与分离层协同使除病毒膜具有良好的机械性能，以提高除病毒膜的通量、载量，并降低顶洗时病毒释放的量，以提高顶洗LRV。

6.当除病毒膜为预过滤层、分离层和保护层的三层结构时，在分离层具有良好的自支撑效果的基础上，通过对预过滤层和保护层的孔隙结构、纤维结构的调整，确保预过滤层和保护层能够对位于其中的分离层形成良好的结构强化作用，从而与分离层协同使除病毒膜具有良好的机械性能，以提高除病毒膜的通量、载量，并降低顶洗时病毒释放的量，以提高顶洗LRV。

7.当除病毒膜为预过滤层、分离层、多孔支撑层和防渗漏层的四层结构时，由于引入了双截留层结构，分离层、多孔支撑层和防渗漏层的配合能够在膜厚度上形成孔径的不连续变化区域，从而使病毒的运动状态不连续，以提高除病毒膜的病毒截留效果；进一步的，通过对预过滤层和多孔支撑层孔隙结构、纤维结构的调整，协同配合具有良好自支撑性能的分离层，能够大大降低除病毒膜使用时发生形变的可能。

附图说明

图1是本申请实施例1制得的除病毒膜的截面扫描电镜图，其放大倍率为10K×。

图2是本申请实施例1制得的除病毒膜的第一外表面的扫描电镜图，其放大倍率为50K×。

图3是本申请实施例1制得的除病毒膜的第二外表面的扫描电镜图，其放大倍率为50K×。

图4是本申请实施例7制得的除病毒膜的截面扫描电镜图，其放大倍率为5K×。

图5是本申请实施例7制得的除病毒膜的第一外表面的扫描电镜图，其放大倍率为10K×。

图6是本申请实施例7制得的除病毒膜的第二外表面的扫描电镜图，其放大倍率为50K×。

图7是本申请实施例9制得的除病毒膜靠近第一外表面处的截面扫描电镜图，其放大倍率为5K×。

图8是本申请实施例9制得的除病毒膜靠近第二外表面处的截面扫描电镜图，其放大倍率为5.4K×。

图9是本申请实施例9制得的除病毒膜的第一外表面的扫描电镜图，其放大倍率为50K×。

图10是本申请实施例9制得的除病毒膜第二外表面的扫描电镜图，其放大倍率为20K×。

图11是本申请实施例12制得的除病毒膜的截面扫描电镜图，其放大倍率为4K×。

图12是本申请实施例16制得的除病毒膜的截面扫描电镜图，其放大倍率为2K×。

图13是本申请实施例16制得的除病毒膜的第一外表面的扫描电镜图，其放大倍率为5K×。

图14是本申请实施例16制得的除病毒膜第二外表面的扫描电镜图，其放大倍率为2K×。

具体实施方式

以下结合附图1～14对本申请作进一步详细说明。

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。如未特殊说明，在下述实施例、对比例中，所用的原料及设备均可通过常规商业途径购得。其中，采用日立公司提供的型号为S-5500的扫描电镜对除病毒膜的结构形貌进行表征。

实施例1

一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜的制备工艺，包括以下工艺步骤：

S1、铸膜液配置，铸膜液中按照质量份，具体包括醋酸纤维素20份，良溶剂35份，非溶剂4份，无机盐0.5份。其中，醋酸纤维素选用二醋酸纤维、良溶剂选用丙酮，非溶剂选用去离子水，无机盐选用硫酸钠。铸膜液配置完成后，将铸膜液流延到载体上充分铺展形成液膜。

S2、预分相，以第一预分相液对液膜远离载体侧的第一外表面进行预分相，得到初生膜。其中，第一预分相液为80wt％的丙酮水溶液，预分相的时间为8s；经过预分相，液膜的第一外表面初步分相并形成孔洞结构。

S3、固化分相，将步骤S2中得到的初生膜浸入至凝固浴中，使初生膜中的铸膜液充分分相，形成分离的富溶剂相和富聚合物相，其中，富溶剂相形成孔洞结构，而富聚合物相固化形成多孔主体的纤维结构；初生膜充分分相、固化后，得到成膜。凝固浴为渗透剂的水溶液，渗透剂的浓度为1wt％，渗透剂选用乙醇。

S4、后处理，将成膜至于浓度为0.05mol/L、温度为50℃的氢氧化钠水溶液中进行水解，至醋酸纤维素水解成为再生纤维素；随后将水解完成后的膜取出进行水洗，水洗至pH为中性，得到的固态膜。随后将固态膜置于pH为9.5的交联剂水溶液中进行交联，交联剂为环氧氯丙烷，交联剂水溶液中交联剂的浓度为10wt％，交联时间为20min，交联温度为50℃。

实施例2～4

实施例2～4与实施例1的不同之处主要在于，各步骤中的工艺参数不同，记为下表：

实施例5～13

实施例5～13与实施例1的不同之处主要在于，各步骤中的工艺参数不同，记为下表：

实施例14

一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜的制备工艺，包括以下工艺步骤：

S1、铸膜液配置，铸膜液中按照质量份，具体包括醋酸纤维素20份，良溶剂30份，非溶剂4份，无机盐0.3份。其中，醋酸纤维素选用二醋酸纤维、良溶剂选用丙酮，非溶剂选用去离子水，无机盐选用硫酸钠。铸膜液配置完成后，将铸膜液流延到载体上充分铺展形成液膜。

S2、预分相，具体包括以第一预分相液对液膜远离载体侧的第一外表面进行预分相；以第二预分相液对液膜液膜靠近载体侧的第二外表面进行预分相，得到初生膜。

其中，第一预分相液为80wt％的丙酮水溶液，预分相的时间为5s；第二预分相液为50wt％的丙酮水溶液，预分相时间为6s；经过预分相，液膜的第一外表面和第二外表面均由于初步分相形成孔洞结构。

S3、固化分相，将步骤S2中得到的初生膜浸入至凝固浴中，使初生膜中的铸膜液充分分相，形成分离的富溶剂相和富聚合物相，其中，富溶剂相形成孔洞结构，而富聚合物相固化形成多孔主体的纤维结构；初生膜充分分相、固化后，得到成膜。凝固浴为渗透剂的水溶液，渗透剂的浓度为1wt％，渗透剂选用乙醇。

S4、后处理，将成膜至于浓度为0.05mol/L、温度为50℃的氢氧化钠水溶液中进行水解，至醋酸纤维素水解成为再生纤维素；随后将水解完成后的膜取出进行水洗，水洗至pH为中性，得到的固态膜。进一步将水解后得到的固态膜置于pH为9.5的交联剂水溶液中进行交联，交联剂为环氧氯丙烷，交联剂水溶液中交联剂的浓度为10wt％，交联时间为20min，交联温度为50℃。

实施例15～17

实施例15～17与实施例14的不同之处主要在于，各步骤中的工艺参数不同，记为下表：

实施例18

一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜的制备工艺，包括以下工艺步骤：

S1、铸膜液配置，铸膜液中按照质量份，具体包括醋酸纤维素25份，良溶剂35份，非溶剂4份，无机盐0.5份。其中，醋酸纤维素选用二醋酸纤维、良溶剂选用丙酮，非溶剂选用去离子水，无机盐选用硫酸钠。铸膜液配置完成后，将铸膜液流延到载体上充分铺展形成液膜。

S2、预分相，具体包括以第一预分相液对液膜远离载体侧的第一外表面进行预分相；以第三预分相液对液膜液膜靠近载体侧的第二外表面进行预分相，得到初生膜。

其中，第一预分相液为80wt％的丙酮水溶液，预分相的时间为6s；第三预分相液为30wt％的丙酮水溶液，预分相时间为6s，且第三预分相液的温度比液膜的温度低7℃；经过预分相，液膜的第一外表面和第二外表面均由于初步分相形成孔洞结构。

S3、固化分相，将步骤S2中得到的初生膜浸入至凝固浴中，使初生膜中的铸膜液充分分相，形成分离的富溶剂相和富聚合物相，其中，富溶剂相形成孔洞结构，而富聚合物相固化形成多孔主体的纤维结构；初生膜充分分相、固化后，得到成膜。凝固浴为渗透剂的水溶液，渗透剂的浓度为1wt％，渗透剂选用乙醇。

S4、后处理，将成膜至于浓度为0.05mol/L、温度为50℃的氢氧化钠水溶液中进行水解，至醋酸纤维素水解成为再生纤维素；随后将水解完成后的膜取出进行水洗，水洗至pH为中性，得到固态膜。进一步将水解后得到的固态膜置于pH为9.5的交联剂水溶液中进行交联，交联剂为环氧氯丙烷，交联剂水溶液中交联剂的浓度为10wt％，交联时间为20min，交联温度为50℃。

实施例19～21

实施例19～21与实施例18的不同之处主要在于，各步骤中的工艺参数不同，记为下表：

对比例

对比例1

一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜的制备工艺，包括以下工艺步骤：

S1、铸膜液配置，铸膜液中按照质量份，具体包括醋酸纤维素20份，良溶剂35份，非溶剂4份，无机盐0.5份。其中，醋酸纤维素选用二醋酸纤维、良溶剂选用丙酮，非溶剂选用去离子水，无机盐选用硫酸钠。铸膜液配置完成后，将铸膜液流延到载体上充分铺展形成液膜。

S2、预分相，以第一预分相液对液膜远离载体侧的第一外表面进行预分相，得到初生膜。其中，第一预分相液为60wt％的丙酮水溶液，预分相的时间为1.5s；经过预分相，液膜的第一外表面初步分相并形成孔洞结构。

S3、固化分相，将步骤S2中得到的初生膜浸入至凝固浴中，使初生膜中的铸膜液充分分相，形成分离的富溶剂相和富聚合物相，其中，富溶剂相形成孔洞结构，而富聚合物相固化形成多孔主体的纤维结构；初生膜充分分相、固化后，得到成膜。凝固浴为渗透剂的水溶液，渗透剂的浓度为6.0wt％，渗透剂选用乙醇。

S4、后处理，将成膜至于浓度为0.05mol/L、温度为50℃的氢氧化钠水溶液中进行水解，至醋酸纤维素水解成为再生纤维素；随后将水解完成后的膜取出进行水洗，水洗至pH为中性，得到固态膜。进一步将水解后得到的固态膜置于pH为9.5的交联剂水溶液中进行交联，交联剂为环氧氯丙烷，交联剂水溶液中交联剂的浓度为10wt％，交联时间为20min，交联温度为50℃。

对比例2

一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜的制备工艺，包括以下工艺步骤：

S1、铸膜液配置，铸膜液中按照质量份，具体包括醋酸纤维素10份，良溶剂25份，非溶剂3份，无机盐0.3份。其中，醋酸纤维素选用二醋酸纤维、良溶剂选用丙酮，非溶剂选用去离子水，无机盐选用硫酸钠。铸膜液配置完成后，将铸膜液流延到载体上充分铺展形成液膜。

S2、预分相，以第一预分相液对液膜远离载体侧的第一外表面进行预分相，得到初生膜。其中，第一预分相液为80wt％的丙酮水溶液，预分相的时间为6s；经过预分相，液膜的第一外表面初步分相并形成孔洞结构。

S3、固化分相，将步骤S2中得到的初生膜浸入至凝固浴中，使初生膜中的铸膜液充分分相，形成分离的富溶剂相和富聚合物相，其中，富溶剂相形成孔洞结构，而富聚合物相固化形成多孔主体的纤维结构；初生膜充分分相、固化后，得到成膜。凝固浴为渗透剂的水溶液，渗透剂的浓度为0.05wt％，渗透剂选用乙醇。

S4、后处理，将成膜至于浓度为0.05mol/L、温度为50℃的氢氧化钠水溶液中进行水解，至醋酸纤维素水解成为再生纤维素；随后将水解完成后的膜取出进行水洗，水洗至pH为中性，得到固态膜。进一步将水解后得到的固态膜置于pH为9.5的交联剂水溶液中进行交联，交联剂为环氧氯丙烷，交联剂水溶液中交联剂的浓度为10wt％，交联时间为20min，交联温度为50℃。

性能检测及数据记录

一：结构表征

用扫描电镜对各实施例所获得除病毒膜的膜结构进行形貌表征，即可获得所需数据；其中，实施例1～13以及对比例1～2均为两层膜结构(大孔预过滤层和小孔分离层)，实施例1～13以及对比例1～2各层膜结构的形貌参数记为下表：

上表中，各层厚度的单位为μm，各层平均孔径(即SEM测量平均孔径)的单位为nm，各层孔隙率的单位为％，平均孔径变化梯度(即SEM测量平均孔径变化梯度)的单位为nm/μm，厚度变化率的单位为％，纤维直径(即SEM测量平均直径)的单位为nm。

通过观察实施例1～13的截面电镜图，发现该除病毒膜的预过滤层在膜厚度的方向上，其平均孔径的变化速度沿料液流经方向先保持较大的变化速度，随后保持较小的变化速度，即预过滤层的平均孔径在靠近第一外表面的一侧存在孔径快速减小的突变区域。

实施例1～13以及对比例1～2的膜整体及两侧表面的形貌参数记为下表：

上表中，厚度单位为μm，孔隙率和孔洞面积率的单位为％，第一纤维直径(即SEM测量平均直径)的单位为nm，平均孔径(即SEM测量平均孔径)的单位为nm。

实施例14～17为三层膜结构(大孔预过滤层、小孔分离层和中孔的保护层)，实施例14～17各层膜结构的形貌参数记为下表：

上表中，各层厚度的单位为μm，各层平均孔径(即SEM测量平均孔径)的单位为nm，各层孔隙率的单位为％，平均孔径变化梯度(即SEM测量平均孔径变化梯度)的单位为nm/μm，厚度变化率的单位为％，纤维直径(即SEM测量平均直径)的单位为nm。

实施例14～17的膜整体及两侧表面的形貌参数记为下表：

上表中，厚度单位为μm，孔隙率和孔洞面积率的单位为％，第一纤维直径(即SEM测量平均直径)的单位为nm，平均孔径(即SEM测量平均孔径)的单位为nm。

实施例18～21为四层膜结构(大孔预过滤层、小孔分离层、中孔的多孔支撑层和小孔防渗漏层)，实施例18～21各层膜结构的形貌参数记为下表：

上表中，各层厚度的单位为μm，各层平均孔径(即SEM测量平均孔径)的单位为nm，各层孔隙率的单位为％，平均孔径变化梯度(即SEM测量平均孔径变化梯度)的单位为nm/μm，厚度变化率的单位为％，纤维直径(即SEM测量平均直径)的单位为nm。

实施例18～21的膜整体及两侧表面的形貌参数记为下表：

上表中，厚度单位为μm，孔隙率和孔洞面积率的单位为％，第一纤维直径(即SEM测量平均直径)的单位为nm，平均孔径(即SEM测量平均孔径)的单位为nm。

二、病毒滤除效果

2.1初始LRV

取各实施例或对比例中制得的除病毒膜作为试样进行病毒挑战测试，其中，除病毒膜的初始LRV检测方法参照PDA颁布的指导性文件TR41，测试时，以PP7噬菌体作为截留病毒、物料流为免疫球蛋白IVIG、缓冲体系为PBS，病毒挑战测试时料液加压为30psi。通过检测挑战液和滤液中PP7噬菌体的滴度计算初始LRV；通过通过检测挑战液和滤液中蛋白质的浓度计算蛋白质收率；通过记录流量和时间计算通量。

2.2顶洗LRV

在对除病毒膜的初始LRV进行检测时，当料液的流速衰减75％或料液仅有少量剩余时，停止过滤。随后缓慢释放压力，将盛放料液的筒体内的压力完全释放，并将筒体内的剩余料液倒出，并加入约30mL缓冲液，静置。当压力中断时间达到5min后，在筒体内加压至30psi，进行过滤，收集得到的滤液即为顶洗液，检测顶洗液中的PP7噬菌体滴度，并计算顶洗LRV。

三、胶体金捕捉试验

取各实施例或对比例中制得的除病毒膜作为检测的对象，每一个样品均截取两个试样，两个试样的距离不超过1cm，分别为试样1和试样2。

3.1顶洗前20nm胶体金的峰值捕捉部位

以试样1进行20nm胶体金捕捉测试，并对该捕捉有20nm胶体金的除病毒膜的截面测定亮度，光谱的最大峰处即为20nm胶体金的峰值捕捉部位。分离层远离预过滤层的一侧平面为分离层底面，除病毒膜截面上光谱最大峰处与分离层底面的距离为D₀。

3.2顶洗后20nm胶体金的峰值捕捉部位

以试样1进行20nm胶体金捕捉测试，当胶体金的流速衰减75％或胶体金仅有少量剩余时，停止过滤。随后缓慢释放压力，将盛放胶体金的筒体内的压力完全释放，并将筒体内的剩余胶体金倒出，并加入约30mL缓冲液，静置。当压力中断时间达到30min后，加压进行顶洗过滤。顶洗完成后，对该捕捉有20nm胶体金的除病毒膜的截面测定亮度，光谱的最大峰处即为20nm胶体金的峰值捕捉部位。分离层远离预过滤层的一侧平面为分离层底面，除病毒膜截面上光谱最大峰处与分离层底面的距离为D₁。

各实施例、对比例中制得的除病毒膜的性能参数记为下表：

需要注意的是，由于本申请各实施例和对比例中除病毒膜均为再生纤维素膜，因此蛋白质吸附率较低，各实施例中制得的除病毒膜均能够达到不低于98％的蛋白质收率。

此外，对于如实施例2、实施例4等初始LRV相对较低但是高于5的滤膜而言，可通过将两层除病毒膜层叠串联使用，获得LRV＞8甚至LRV＞10的膜过滤器，以适用于具有更高过滤要求的物料。即，本申请中的除病毒膜并不限定为单层使用，在实际使用时，可根据实际需求，选择单层除病毒膜进行使用或将双层甚至两层以上的除病毒膜串联使用，以获得所需的病毒滤除效果。

结论：

除病毒膜为两层结构的实施例1-13均能获得较高的初始LRV和顶洗LRV，且由于具有较高的通量，能够在确保良好的病毒滤除效果的基础上，提高过滤效率。

通过比较实施例5与实施例13的技术方案，能够看出，在膜厚度、分离层厚度、孔隙率等均较为近似的基础上，两者的初始LRV并没有太大差别，说明分离层的厚度变化率对于初始LRV的影响相对较小；而分离层厚度变化率较高的实施例13顶洗LRV显然更低。

除病毒膜为三层结构的实施例14-17同样能获得较高的初始LRV和顶洗LRV，且三层除病毒膜的通量相较于两层结构的除病毒膜并未出现明显的下降。这可能是由于保护层的引入起到了加强肋的效果，降低了除病毒膜收到滤液压力作用时孔隙结构的压缩形变。

除病毒膜为四层结构的实施例18-21具有明显更高的初始LRV和顶洗LRV，这可能是由于其特殊的双截留层结构破坏了病毒的连续运动状态，从而提高了除病毒膜的病毒滤除效果。另外，虽然引入了双截留层的结构，但是特定孔隙结构的多孔支撑层和防渗漏层结构协同，能降低对通量的影响，因此，实施例18-21的通量下降较少。

同样为两层结构除病毒膜的对比例1膜厚度比较大，且分离层的占比较高、预过滤层的平均孔径较小，导致其通量较低，不具有实际应用价值。

同样为两侧结构除病毒膜的对比例2膜厚度较小，且分离层的占比较低、预过滤层的平均孔径较大，导致其虽然通量较大，但是病毒滤除效果较差，无法保证生物制剂的安全性。

此外，对实施例1-21的试样均进行了耐压强度测试，其耐压强度均大于30psi，其在30psi压力作用下能够对相料液进行稳定、快速地过滤，同时在完整性测试时，还经受了50psi的压力作用，膜孔依然完好。说明本申请中各实施例的除病毒膜能够在30psi的较大压力下能够长时间正常工作，大大改善了目前纤维素类除病毒膜不耐高压的问题。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (24)

1.一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，包含多孔主体，所述多孔主体内具有非定向曲折通路，所述多孔主体的一侧表面为第一外表面，所述多孔主体的另一侧表面为第二外表面，其特征在于：

所述多孔主体包括预过滤层以及用于截留病毒的分离层，所述预过滤层的一侧为第一外表面，所述分离层位于所述预过滤层靠近所述第二外表面的一侧，所述预过滤层和分离层之间以连续纤维过渡；

所述预过滤层的SEM测量平均孔径大于所述分离层的SEM测量平均孔径；

所述分离层的厚度为5～60μm，所述分离层的SEM测量平均孔径为25～85nm；

对于PP7噬菌体，所述除病毒膜的顶洗LRV不小于4，所述除病毒膜的顶洗LRV与初始LRV之比不低于0.7。

2.根据权利要求1所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述分离层远离预过滤层的一侧面为分离层底面，对捕捉有20nm胶体金的所述除病毒膜进行顶洗，顶洗后所述除病毒膜的截面中，捕捉20nm胶体金的峰值部位与所述分离层底面的距离为D₁，所述D₁为0.2～5μm。

3.根据权利要求2所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述除病毒膜的截面中，捕捉20nm胶体金的峰值部位与所述分离层底面的距离为D₀，所述D₀为0.5～5μm。

4.根据权利要求3所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述D₁小于D₀，所述D₀与D₁之差为0.1～3μm。

5.根据权利要求1所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述分离层的SEM测量平均孔径变化梯度为0～3nm/μm；对于PP7噬菌体，所述除病毒膜的顶洗LRV与初始LRV之比为0.85～0.95。

6.根据权利要求1所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述分离层的孔隙率为6～30％，所述分离层的厚度变化率不高于10％。

7.根据权利要求1所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述除病毒膜的通量大于35L·h^-1·m^-2@30psi；所述除病毒膜的蛋白质收率不低于98％。

8.根据权利要求1所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述第一外表面包括若干长条状且相互连接的第一纤维，第一纤维的SEM测量平均直径为70～650nm，相邻且相连接的第一纤维相互环绕形成第一孔洞。

9.根据权利要求1～8任一项所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述分离层包括第二外表面，所述第二外表面具有第二孔洞，所述第二孔洞的SEM测量平均孔径为15～35nm，所述第二外表面的孔洞面积率为2～15％，所述分离层的纤维为长条状且所述分离层的SEM测量平均纤维直径为20～50nm。

10.根据权利要求9所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述分离层与所述多孔主体的厚度之比为8～25％，所述除病毒膜的孔隙率为20％～60％。

11.根据权利要求10所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述第一外表面上第一孔洞的SEM测量平均孔径为400～5000nm，第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比为15～200，所述第一外表面的孔洞面积率为8～45％。

12.根据权利要求10所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述预过滤层的SEM测量平均孔径为160～600nm，所述预过滤层的孔隙率为35％～75％，所述预过滤层的SEM测量平均孔径从靠近第一外表面向靠近第二外表面一侧逐渐减小，所述预过滤层靠近第一外表面的孔径减小速度大于所述预过滤层靠近第二外表面的孔径减小速度。

13.根据权利要求9所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述分离层与所述多孔主体的厚度之比为40～95％，所述除病毒膜的孔隙率为15～50％。

14.根据权利要求13所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：第一孔洞的SEM测量平均孔径为300～4500nm，第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比为10～150，所述第一外表面的孔洞面积率为5～40％。

15.根据权利要求13所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述预过滤层的SEM测量平均孔径为150～500nm，所述预过滤层的孔隙率为30～70％，所述预过滤层的SEM测量平均孔径从靠近第一外表面向靠近第二外表面一侧逐渐减小，所述预过滤层靠近第一外表面的孔径减小速度大于所述预过滤层靠近第二外表面的孔径减小速度。

16.根据权利要求1～8任一项所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述分离层远离预过滤层的一侧还设有保护层，所述保护层与所述分离层之间以连续纤维过渡，所述保护层包括第二外表面；

所述保护层的SEM测量平均孔径大于分离层的SEM测量平均孔径、小于预过滤层的SEM测量平均孔径，所述多孔主体的厚度为30～80um，所述保护层的厚度与所述多孔主体的厚度之比为5～20％。

17.根据权利要求16所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：第一孔洞的SEM测量平均孔径为300～4500nm，第二孔洞的SEM测量平均孔径为100～500nm，第一孔洞和第二孔洞的SEM测量平均孔径之比为2～25。

18.根据权利要求16所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述保护层的SEM测量平均孔径为50～450nm，所述保护层的孔隙率为20～55％。

19.根据权利要求1～8任一项所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述分离层远离预过滤的一侧还设有多孔支撑层，所述多孔支撑层远离所述分离层的一侧还设有防渗漏层，所述分离层、多孔支撑层和防渗漏层以连续纤维过渡；

所述多孔支撑层的SEM测量平均孔径大于所述分离层和所述防渗漏层的SEM测量平均孔径且小于所述预过滤层的SEM测量平均孔径；

所述多孔支撑层的SEM测量平均孔径为50～400nm，所述防渗漏层的SEM测量平均孔径为25～35nm。

20.根据权利要求19所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述预过滤层的SEM测量平均孔径为120～500nm，所述分离层的SEM测量平均孔径为25～35nm，所述分离层的SEM测量平均孔径与所述防渗漏层的SEM测量平均孔径之比为0.75～1.3。

21.根据权利要求19所述的一种高病毒截留率的纤维素除病毒膜，其特征在于：所述多孔主体的厚度为25～100μm，所述分离层与所述多孔主体的厚度之比为5～25％，所述多孔支撑层的厚度与所述多孔主体的厚度之比为5～25％，所述防渗漏层的厚度与所述多孔主体的厚度之比为2～5％。

22.权利要求1～21任一项所述的高病毒截留率的纤维素除病毒膜的制备工艺，其特征在于：包括以下工艺步骤：

S1、铸膜液配置，并将其流延到载体上形成液膜；所述铸膜液包括下列重量份物质组成：醋酸纤维素10～30份；良溶剂20～50份；非溶剂3～6份；无机盐0.1～1份；

所述良溶剂为丙酮、二氧六环、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸中的至少一种；

所述非溶剂为水；

所述无机盐的阳离子为钠、钾、钙、镁中的一种或多种，所述无机盐的阴离子为硫酸根、亚硫酸根或碳酸盐中的一种或多种；

S2、预分相，以第一预分相液对液膜的第一外表面进行预分相，得到初生膜；所述第一预分相液为60～90wt％的丙酮水溶液，预分相的时间为2～15s；

S3、固化分相，将初生膜浸入凝固浴中分相固化，得到成膜，所述凝固浴包括水和渗透剂，所述渗透剂的浓度为0.1～5wt％，所述渗透剂为乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇、仲戊醇中的至少一种；

S4、后处理，将成膜置于氢氧化钠溶液中进行水解，水解后清洗形成固态膜；进一步将固态膜置于交联剂中进行交联处理，交联处理结束并清洗后得到成品膜，所述交联剂为卤代环氧化物、双卤代烷烃和双卤代醇中的至少一种。

23.根据权利要求22所述的高病毒截留率的纤维素除病毒膜的制备工艺，其特征在于：所述步骤S2中，还以第二预分相液对所述第二外表面进行预分相，所述第二预分相液为40～60wt％的丙酮水溶液，所述预分相时间为2～10s。

24.根据权利要求22所述的高病毒截留率的纤维素除病毒膜的制备工艺，其特征在于：所述步骤S2中，还以第三预分相液对所述第二外表面进行预分相，所述第三预分相液为20～40wt％的丙酮水溶液，且所述第三预分相液比液膜温度低5～10℃，所述预分相时间为2～10s。

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