CN112105430A

CN112105430A - Cex色谱介质和生物药物进料中目标蛋白的低盐洗脱

Info

Publication number: CN112105430A
Application number: CN201980031425.XA
Authority: CN
Inventors: M·T·斯通; R·斯库达什
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2018-04-03
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2020-12-18
Also published as: US20210024573A1; WO2019192877A1; EP3773969A1; SG11202009581TA; CA3095850A1; KR20200138346A; JP2021519339A

Abstract

结合/洗脱色谱方法和组合物，其用于低盐/低溶液电导率地将目标蛋白由包含聚集体和其他杂质的混合物中分离。

Description

CEX色谱介质和生物药物进料中目标蛋白的低盐洗脱

相关申请的交叉引用

本申请享有2018年4月3日提交的美国专利申请号62/651,878的优先权，该专利申请通过引用全部并入本文。

技术领域

本文描述了使用结合/洗脱阳离子交换色谱从生物制药进料中纯化靶蛋白(如治疗性蛋白和抗体分子抗体)的方法。

背景技术

在培养物中培养细胞以生产目标生物药物产品。收获该目标产品，并使用级联的分离技术纯化以除去杂质。杂质的例子包括聚集体、宿主细胞蛋白(HCP)和核酸、内毒素、病毒等(例如，参见State-of-the-Art in Downstream Processing of MonoclonalAntibodies:Process Trends in Design and Validation Biotechnol.Prog.,2012,899-916)。在将产品用于诊断、治疗或其他应用之前，必须从含有目标产品的生物药物进料中去除蛋白聚集体和其他污染物。蛋白聚集体通常存在于从杂交瘤细胞系收获的抗体制剂中，并且需要在将该抗体制剂用于其预期目的之前将其去除。这对于治疗应用和遵守监管机构(如美国食品药品监督管理局，Food and Drug Administration)尤其重要。

由于蛋白聚集体的物理和化学性质与生物药物制剂(通常是单体分子)中目标产品之间的许多相似性，去除蛋白聚集体可能具有挑战性。目前有多种方法可用于去除生物药物制剂中的蛋白聚集体，例如包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、混合模式、羟基磷灰石和疏水作用色谱。

已知结合和洗脱色谱法可以用于从目标产品中分离蛋白聚集体，但这些并不是理想的方法。例如，羟基磷灰石已用于蛋白、核酸以及抗体的色谱分离。在羟基磷灰石色谱中，首先平衡该色谱柱，然后将样品加样至低浓度磷酸盐缓冲液中。为洗脱所吸附的蛋白，应用高浓度梯度的磷酸盐缓冲液(例如，参见Giovannini,Biotechnology and Bioengineering73:522-529(2000))。然而，在一些情况下，研究人员无法从羟基磷灰石中选择性洗脱抗体或发现羟基磷灰石色谱不能得到足够纯的产品(例如，参见Jungbauer,J.Chromatography476:257-268(1989)；Giovannini,Biotechnology and Bioengineering 73:522-529(2000))。

陶瓷羟基磷灰石(CHT)是一种市售的色谱树脂，其一定程度上已成功用于以树脂形式去除蛋白聚集体(BIORAD公司，例如，也可参见已公开的PCT申请WO2005/044856)，但是，它通常是昂贵的，并且表现出对蛋白聚集体的低结合能力。因此，样品仍受到聚集体杂质的污染。

虽然有已知的阳离子结合/洗脱色谱方法，如上述的那些方法，但传统的强阳离子交换色谱介质需要高浓度的用于洗脱的盐以洗脱目标蛋白。

发明内容

本文描述了在生物药物组合物中将目标产品(例如，治疗性抗体或单体蛋白)与杂质(包括蛋白聚集体)分离的方法。更具体地说，本公开描述了一种新型强阳离子交换(CEX)介质的用途，其中，与标准市售CEX树脂相比，在结合/洗脱色谱中，目标产品(例如，单克隆抗体(mAb))的洗脱是通过具有低浓度盐的缓冲液来实现的。

本文描述了在样品中将目标单体蛋白与包含目标蛋白聚集体的混合物分离的方法。该方法包括将该样品与包括一种或多种所附阳离子结合基团的固体载体接触。用电导率小于20mS/cm的缓冲液选择性洗脱目标单体蛋白。在各种实施方案中，用缓冲液以流速洗脱该目标单体蛋白，使其停留时间约为10min或更短，例如5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、0.5分钟。

在各种实施方案中，所述目标单体蛋白为单克隆抗体或重组蛋白。

在各种实施方案中，所述样品包括目标单体蛋白和目标单体蛋白聚集体的混合物，其中该样品包含至少1％的聚集体(例如，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多)。此类聚集体可以为二聚体、三聚体、四聚体或更高阶聚集体，或此类聚集体的组合。

在各种实施方案中，所述固体载体为珠或膜。通常，所述固体载体能够结合目标单体蛋白和目标蛋白聚集体。所述单体和聚集体在具有较高浓度盐和较高电导率的缓冲液洗脱后分离，其减少了带正电荷的蛋白和带负电荷的CEX介质之间的静电相互作用。

附图说明

提供附图以说明本发明的一个或多个版本，但不应理解为限定本权利要求的范围。

图1A-1D描述了本发明所包含的各种组合物的代表性化学结构。图1A-1D描述了共价连接到固体载体上的接枝聚合物结构。R¹为阳离子交换基团，例如磺酸基、硫酸基、磷酸基、膦酸基或羧基基团；R²为不含带电基团的任何脂肪族或芳香族有机残基；x、y和z为聚合物中每个单体的平均摩尔分数，而y>x；符号m表示连接子的另一端连接有相似的聚合物链；R⁴为NH或O；R⁵为线性或支链脂肪族或芳香族基团，如-CH₂-、-C₂H₄-、-C₃H₆-、-C(CH₃)₂-CH₂-、-C₆H₄-；R⁶为线性或支链的脂肪族或芳香族不带电基团，其含有至聚合物链的NH、O或S连接子；以及R⁷和R⁸为独立选自含有一个或多个中性脂肪族和芳香族有机残基的基团，并且可以含有杂原子，如O、N、S、P、F、Cl等。

具体实施方式

为了使本发明更容易理解，定义了某些术语。在整个详细说明中规定了其他定义。

术语“色谱”是指在样品(例如，生物药物进料或制剂)中将目标产品(例如，治疗性蛋白或抗体)与其他组分的混合物分离的任何技术。

术语“亲和色谱”是指一种蛋白分离技术，其中该分离是基于固定化配体与其结合伴侣之间的特异性结合相互作用。示例包括抗体-抗原、Fc结构域-蛋白A、酶-底物和酶-抑制剂相互作用。

本文可互换使用的术语“离子交换”和“离子交换色谱”是指基于样品中的蛋白与色谱介质之间的电荷-电荷相互作用的分离技术。

离子交换色谱可以细分为其中带正电荷的离子与带负电荷的色谱介质结合的“阳离子交换色谱”和其中带负电荷的离子与带正电荷的色谱介质结合的“阴离子交换色谱”。

术语“离子交换基质”是指带负电荷(即阳离子交换树脂)或带正电荷(即阴离子交换树脂)的色谱基质。通过将一个或多个带电配体连接到所述基质上，例如通过共价连接，可以提供该电荷。可替换地或另外，该电荷可以为所述基质的固有性质(例如，具有总体上带负电荷的二氧化硅的情况)。

“阳离子交换基质”(“CEX”)是指带负电荷的色谱基质，而且该色谱基质含有用于与在与所述基质接触的水溶液中的阳离子交换的游离阳离子。例如，附着在固相上以形成阳离子交换基质的带负电荷的配体可以为羧酸盐或硫酸盐。市售的阳离子交换树脂包括羧甲基纤维素，固定在琼脂糖上的磺基丙基(SP，例如GE Healthcare的SP-SEPHAROSE FASTFLOW^TM或SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE^TM)和固定在琼脂糖上的磺酰基(例如GEHealthcare的S-SEPHAROSE FAST FLOW^TM)。其他示例包括亲水性聚合物基珠上的

EMD SO3、

EMD SE Highcap、

S和

EMDCOO(EMD Millipore)。

术语“阴离子交换基质”(“AEX”)是指带正电荷的色谱基质，例如具有一个或多个在其上连接的带正电荷的配体，如季氨基基团。市售的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、QAE SEPHADEX^TM和FAST Q SEPHAROSE^TM(GE Healthcare)。额外的示例包括亲水性聚合物基珠上的

EMD TMAE、

EMD TMAE highcap、

Q和

EMD DEAE(EMD Millipore)。

正如本文中可互换使用的术语“结合和洗脱工艺”、“结合和洗脱模式”和“结合和洗脱色谱”是指一产品分离技术，其中，在有利于目标产品与固体载体结合的条件下，生物药物组合物中所包含的至少一种目标产品和一种或多种杂质与固体载体接触。随后从该固体载体上洗脱目标产品。

相比之下，正如本文中可互换使用的术语“流经工艺”、“流经模式”和“流经色谱”是指一产品分离技术，其中，生物药物组合物中包含的至少一种目标产品和一种或多种杂质预期流经色谱基质，该色谱基质通常结合一种或多种杂质，但目标产品不结合而是流经。

术语“污染物”、“杂质”和“碎片”是指任何外来或不需要的分子(包括生物大分子，如DNA、RNA、一种或多种宿主细胞蛋白(HCP)、内毒素、脂质、蛋白聚集体)，和一种或多种添加剂，其可以存在于含有与一种或多种外来或不需要分子分离的目标产品的样品中。此外，此类污染物可以包括分离工艺之前生物处理步骤中使用的任何试剂。在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法旨在从含有目标产品的样品中选择性地去除蛋白聚集体。

术语“蛋白聚集体”或“蛋白聚集体”是指目标产品(例如治疗性蛋白或抗体)的至少两个分子(例如二聚体、三聚体、四聚体、高分子量聚集体)的结合。通过任何方式可以发生蛋白聚集，包括但不限于共价、非共价、二硫键或非还原性交联。

术语“二聚体(dimer)”、“二聚体(dimers)”、“蛋白二聚体(protein dimer)”或“蛋白二聚体(protein dimers)”是指蛋白聚集体的较低阶级分，其主要包含含有两个单体分子的聚集体，但也可以含有一定量的三聚体和四聚体。在SEC色谱图中，这一级分通常观察为在紧邻单体主峰之前的第一可分离峰。

术语“高分子量聚集体”或“HMW”是指蛋白聚集体的较高阶级分，即五聚体及以上。在SEC色谱图中，这一级分通常观察为二聚体峰之前的一个或多个峰。可以使用尺寸排阻色谱(SEC)测定蛋白样品中的聚集体含量或浓度，SEC是本领域众所周知且被广泛接受的方法(例如，参见Gabrielson et al.,J.Pharm.Sci.,96,(2007),268–279)。使用UV吸光度测定洗脱液中各种分子量物质的相对浓度，同时按照色谱柱生产商的说明进行系统校准以测定这些级分的分子量。

在标准单克隆抗体(mAb)纯化方案中，将澄清的细胞培养物进行蛋白A亲和色谱以捕获mAb，并去除一定量的宿主细胞蛋白、DNA和不含Fc的抗体片段。除捕获mAb外，蛋白A还将捕获mAb聚集体和含Fc的抗体片段。将这一混合物从蛋白A中洗脱，并进行精制以进一步降低杂质，最常用的方法是阳离子交换(CEX)结合/洗脱色谱。通过增加盐浓度(有或无pH值变化)，可以调节CEX介质的洗脱。增加缓冲液中的盐浓度也会增加缓冲液的电导率。随着盐浓度和溶液缓冲液电导率的增加，带负电荷的磺酸盐CEX树脂与带正电荷的蛋白之间的静电力降低了。CEX步骤的目标是去除聚集体及浸出的蛋白A。通常，需要进一步精制以去除宿主细胞蛋白(HCP)和DNA，并通过阴离子交换(AEX)流经色谱来实现。

这一工艺具有挑战性的方面是，使用具有高浓度盐和高溶液电导率的缓冲液从结合/洗脱CEX色谱柱中洗脱mAb蛋白。如本领域所知，标准结合/洗脱色谱的溶液电导率范围在约20mS/cm至约50mS/cm之间。因此，CEX色谱所得洗脱的盐浓度对于在随后的流经色谱步骤中杂质与AEX介质静电结合而言过高。传统上，这一问题是通过在进行AEX色谱之前稀释CEX mAb洗脱来解决的。然而，这引入了另一问题，因为稀释mAb蛋白CEX洗脱显著增加了mAb蛋白溶液的体积，并因此需要显著延长处理后续步骤(包括AEX色谱、病毒去除膜和超滤)所需的时间。更长的处理时间阻碍了生产，增加了生产成本，增加了设备故障的可能性，从而使产品暴露于设备故障导致的潜在污染中。

这一工艺洗脱方面另一个挑战性的方面是，mAb蛋白是当mAb与CEX介质强烈相互作用时，mAb只能在较低浓度下以几个不同级分从色谱柱中缓慢洗脱。因此，所得洗脱的体积较大，浓度较低。mAb蛋白溶液体积的增加，并因此需要显著延长处理后续步骤(包括AEX色谱、病毒去除膜和超滤)所需的时间。较长的处理时间阻碍了生产，增加了生产成本，增加了设备故障的可能性，从而使产品暴露于设备故障导致的潜在污染中。

相比之下，如本文所述，令人惊讶地发现设计用于流经去除聚集体的强CEX色谱介质(本文称为“流经CEX色谱介质”或“流经CEX色谱介质”)也可以用于以色谱的结合/洗脱模式去除聚集体。如本文所示，与用于结合/洗脱色谱的当前市售的强CEX色谱介质相比，mAb蛋白可以在更高的蛋白浓度和更低的溶液电导率下从这一流经CEX介质中洗脱。

如本文所述，可以在所述流经CEX介质上用具有低盐浓度并且具有低电导率的缓冲液进行结合/洗脱的洗脱。如本文所使用的，低溶液电导率洗脱缓冲液的电导率范围为约10mS/cm至约20mS/cm。在各种实施方案中，所述低电导率洗脱缓冲液的电导率约为10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17mS/cm、18mS/cm、19mS/cm、20mS/cm或其任何范围。从该流经CEX色谱介质中以较低浓度的盐洗脱目标蛋白是有利的，因为其减少了后续AEX流经色谱步骤之前所需的稀释量，因为高盐浓度否则会抑制杂质与AEX的静电结合。

出乎意料的是，还发现使用所述流经CEX色谱介质的色谱结合/洗脱模式导致含有较高浓度目标蛋白(例如重组蛋白或抗体，如mAb)的较小级分体积。因此，在剩余下游纯化步骤中处理较高浓度的目标蛋白有助于减少后续处理步骤(例如，AEX流经、病毒膜、超滤/渗滤(UF/DF)膜步骤)和成本，因为不需要显著稀释洗脱液，否则将显著增加洗脱液体积，从而增加所需介质的量和每个后续工艺步骤所需的时间。

更具体而言，该令人惊奇的发现是其中发现一种强触手阳离子交换介质，在使用用于洗脱的异常低盐浓度的结合/洗脱色谱模式中可以去除蛋白聚集体，如抗体聚集体。US2013/0245139中描述了示例性的阳离子交换色谱介质，其内容全部并入本文以作为启示。例如，该固体载体可以是多孔的或非多孔的，或其可以是连续的，如以整体或膜的形式。该固体载体也可以是不连续的，如颗粒、珠或纤维的形式。在任何一种情况下(连续或不连续)，该固体载体的重要特征是具有高的表面积、机械完整性、在水环境中的完整性以及能够提供流动分布以确保结合基团的可及性。在各种实施方案中，所述流经CEX介质包括聚乙烯醚树脂。通常，珠树脂的直径为约50μm。

示例性的不连续固体载体包括多孔色谱珠。正如本领域技术人员很容易识别的，色谱珠可以采用多种聚合物和无机材料生产，如多糖、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、乙烯基醚、孔可控玻璃、陶瓷等。示例性的市售色谱珠为EMD Millipore公司的CPG；GEHealthcare Life Sciences AB的

Tosoh Bioscience的

和Life Technologies的

在各种实施方案中，该珠为聚乙烯醚树脂。

其他固体载体包括薄膜、块状物、编织和非编织纤维载体，正如本领域所已知的。

在一些实施方案中，优选的结合基团为离子基团。在特定的实施方案中，结合基团为带负电荷的磺酸盐基团。通常，带负电荷的磺酸盐基团具有几个优点。例如，它们表现出广泛的适用性，以结合溶液中带正电荷的蛋白；该化学物是廉价和直接的，而且有许多合成生产方法很容易得到它；结合基团和蛋白之间的相互作用已得到充分认识(例如，参见Stein et al.,J.Chrom.B,848(2007)151–158)，并且通过改变溶液条件可以很容易地操纵所述相互作用，以及此类相互作用可以从其他相互作用中分离出来。

在各种实施方案中，根据本发明的聚合物包含以下化学结构，其中该聚合物通过共价键接枝到固体载体上：

其中R¹是阳离子交换基团；R²为不含带电基团的任何脂肪族或芳香族有机残基；以及x和y为该聚合物中每个单体的平均摩尔分数，其中y>x。在各种实施方案中，y为至少1.5x、至少2x、至少2.5x、至少3x、至少4x或更大。

在一些实施方案中，根据本发明的聚合物包含以下化学结构：

树脂

其中x和y为该聚合物中每个单体的平均摩尔分数，其中y>x，并且其中该聚合物通过键接枝到色谱树脂上。在各种实施方案中，y为至少1.5x、至少2x、至少2.5x、至少3x、至少4x或更大。

图1A中描述了接枝到固体载体上的含有聚合物的结合基团的另一代表性化学结构。该固体载体被描述为矩形。在图1A中，显示了聚合物结构，其中R¹是含有阳离子交换基团的任何脂肪族或芳香族有机残基，例如磺酸基、硫酸(盐)、磷酸、膦酸或羧基；R²为不含带电基团的任何脂肪族或芳香族有机残基。在图1A中描述的聚合物结构中，y>x表示中性基团(用“R²”表示)的量大于带电基团(用“R¹”表示)的量。

在一些实施方案中，含有结合基团的接枝聚合物为嵌段共聚物，这意味着它包括一种单体类型的长串或嵌段(例如，含有中性或带电结合基团)，然后是不同单体类型的长串或嵌段(例如，如果第一嵌段为中性，则该不同单体带电；如果第一嵌段带电，则该不同单体中性)。

在其他实施方案中，该含有结合基团的聚合物以随机顺序含有所述单体。

在其他实施方案中，该含有结合基团的聚合物为交替共聚物，其中每个单体始终与两种不同类型的单体相邻。

在一些实施方案中，图1B中描述了含有聚合物的结合基团的代表性化学结构，其中R⁴为NH或O；R⁵为线性或支链脂肪族或芳香族基团，如-CH₂-、-C₂H₄-、-C₃H₆-、-C(CH₃)₂-CH₂-、-C₆H₄-；以及R⁶为线性或支链的脂肪族或芳香族不带电基团，其含有至聚合物链的NH、O或S连接子。

在一些实施方案中，图1C中描述了含有结合基团的聚合物的代表性化学结构。R⁷和R⁸为独立地选自含有一个或多个中性脂肪族和芳香族有机残基的基团，而且可以含有杂原子，如O、N、S、P、F、Cl等。

在又一些实施方案中，图1D中描述了含有结合基团的聚合物的代表性结构。

图1B-1D中的磺酸基团可以是如图所示的质子化形式，也可以是盐形式，其含有合适的反荷离子，如钠、钾、铵等。

在各种实施方案中，该固体载体包括用2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)和N,N-二甲基丙烯酰胺(DMMA)官能化的聚乙烯醚树脂。在各种实施方案中，DMMA与AMPS的摩尔比大于2.0。例如，DMMA与AMPS的摩尔比为至少或约2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0或更大。

色谱柱可以由许多合适的材料制得，如玻璃、金属、陶瓷和塑料。这些色谱柱可以由最终用户使用固体载体进行填充，也可以由生产商进行预填充，并以填充状态运送给最终用户。

在各种实施方案中，该洗脱缓冲液包含低盐缓冲液或基本上由低盐缓冲液组成，其溶液电导率在10mS/cm和20mS/cm之间。在各种实施方案中，低电导率洗脱缓冲液的电导率为约10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17mS/cm、18mS/cm、19mS/cm、20mS/cm或其任何范围。

在各种实施方案中，含有目标产品的洗脱液进行本文所述的一种或多种分离方法，其中该洗脱液含有小于20％，或小于15％，或小于10％，或小于5％，或小于2％，或小于1％的蛋白聚集体。

在根据本发明的一些实施方案中，本发明的方法和/或组合物可以与蛋白A色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、固定化金属亲和色谱、尺寸排阻色谱、渗滤、超滤、病毒去除过滤、阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱中的一种或多种结合使用。

实施例

实施例1：停留时间为0.5min的结合/洗脱色谱的洗脱

进行结合/洗脱色谱实验，以比较在停留时间为0.5min的洗脱时单克隆抗体进料中聚集体的去除。对两种CEX色谱介质进行了检测，以测定传统结合/洗脱CEX色谱介质(以

CPX为代表)和流经CEX色谱介质的相对能力，其中流经CEX色谱介质用于结合/洗脱模式而非流经模式。两种CEX色谱介质均为亲水性聚乙烯醚CEX珠介质，其购自美国马萨诸塞州伯灵顿的EMD Millipore公司。

用于实验的进料为mAb05单克隆抗体进料，并且在100mM乙酸钠(pH为4.9)中，浓度为18mg/mL时具有7％的聚集体。逐滴加入1.0M的乙酸以调节进料至pH 4.5，然后通过0.45μM的膜(

-HV，0.45μM，PVDF，放射性灭菌，部件号：SE1M003M00，美国马萨诸塞州伯灵顿的EMD Millipore公司)过滤。

在GE Healthcare Life Sciences的

Avant 25色谱系统上进行该实验，其中使用了UV吸光度检测器，波长为280nm。将色谱树脂填充至

5mm内径中，直至柱床高度为20.0cm(柱体积＝3.93mL)，压缩因子为12％。用100mM的乙酸钠(其pH为4.5)以1.0mL/min的流速平衡5个柱体积，然后用1.0M的氢氧化钠以1.0mL/min的流速清洗10个柱体积，然后用100mM的乙酸钠(其pH为4.5)以1.0mL/min的流速平衡10个柱体积，由此对所述色谱柱进行预清洗。

该结合/洗脱色谱实验采用梯度洗脱，并根据表1中所述的序列进行。在这一实验中，“缓冲液A”由100mM的乙酸钠组成，其pH为4.5，“缓冲液B”由100mM的乙酸钠、0.5M的氯化钠组成，其pH为4.5。在3.93mL色谱柱中上样8.8mL的浓度为18mg/mL的mAb05进料，以得到40mg/mL的上样量。

表1：结合/洗脱色谱工艺

步骤	缓冲液	体积(CV)	流速(mL/min)
				平衡	缓冲液A	10	1.3
上样样品	mAb单体和聚集体溶液	8.8ml	1.3
				冲洗	缓冲液A	10	1.3
梯度洗脱	缓冲液A中0％至100％缓冲液B的线性梯度	20	1.3
				保持洗脱	100％缓冲液B	5	1.3
原位清洗	1.0M的氢氧化钠	5	1.3
				平衡	缓冲液B	5	1.3
平衡	缓冲液A	10	1.3

收集梯度洗脱的级分。测定溶液在280nm处的吸光度，由此测定各级分中mAb05的浓度。使用VWR系统的LaChrom

L-2200HPLC，通过分析尺寸排阻色谱，测定各级分中聚集体的百分比。HPLC系统使用了Phenomenex公司的预柱(HPLC GFC 3000色谱柱用Security Guard^TM色谱柱，内径为3.2-8.0mm，部件号：AJ0-4488)和分析尺寸排阻色谱柱(BioSep^TM5μm SEC-s3000

LC色谱柱300×7.8mm，部件号：00H-2146-K0)。然后计算聚集体百分比、mAb回收率、电导率和mAb浓度的累积库，正如表2和表3所示。

表2：停留时间为0.5min的

CPX

表3：停留时间为0.5min的流经CEX色谱介质

表2和表3显示了对于以

CPX为代表的传统CEX色谱介质或流经CEX色谱介质，在停留时间为0.5min时作为色谱柱的上样函数计算的累积合并库(见下文)。上样到该色谱柱上的mAb05进料具有7％聚集体，并使用梯度洗脱将其由所述柱中洗脱，所述梯度洗脱在20个柱体积上从100mM乙酸盐(pH为4.5)洗脱开始，然后增加至具有0.5M NaCl的100mM乙酸盐(pH为4.5)的洗脱。

结果发现，mAb05在停留时间为0.5min时从

CPX中缓慢洗脱(表4)。合并级分1-10得到的累积聚集体为0.15％，累积mAb回收率为85％，累积电导率为35.87mS/cm，以及累积浓度为2.89mg/mL。相比之下，mAb05从流经CEX色谱介质中洗脱更快。合并级分1-3得到的累积聚集体为0.72％，累积mAb回收率为93％，累积电导率为15.28mS/cm，以及累积浓度为10.58mg/mL。注意到，两种色谱介质的聚集体去除和mAb回收率非常相似。然而，在溶液电导率低于

CPX洗脱所需溶液电导率的一半时，完成了流经CEX色谱介质的洗脱，并且该洗脱的浓度是其三倍以上。

表4：

CPX和流经CEX色谱介质在0.5min停留时间时结合/洗脱聚集体的去除。

实施例2：停留时间为3min时结合/洗脱色谱的洗脱

与实施例1相似，进行了结合/洗脱色谱实验，但替代使用3min停留时间的洗脱。

用于实验的进料为mAb05单克隆抗体进料，其具有7％的聚集体，而且在100mM乙酸钠(pH为4.9)中浓度为18mg/mL。逐滴加入1.0M的乙酸以调节进料至pH 4.5，然后通过购自EMD Millipore公司的0.45μM的膜(

-HV，0.45μM，PVDF，放射性灭菌，部件号：SE1M003M00)过滤。

在GE Healthcare Life Sciences的

Avant 25色谱系统上进行该实验，其使用了UV吸光度检测器，波长为280nm。将色谱树脂填充至

5mm内径中，至柱床高度为20.0cm(柱体积＝3.93mL)，压缩因子为12％。用100mM的乙酸钠(pH为4.5)以1.0mL/min的流速平衡5个柱体积，然后用1.0M的氢氧化钠以1.0mL/min的流速清洗10个柱体积，接着用100mM的乙酸钠(pH为4.5)以1.0mL/min的流速平衡10个柱体积，由此对该色谱柱进行预清洗。

该结合/洗脱色谱实验采用梯度洗脱，并根据表5中所述的序列进行。在这一实验中，“缓冲液A”由100mM的乙酸钠组成，其pH为4.5，“缓冲液B”由100mM的乙酸钠、0.5M的氯化钠组成，其pH为4.5。在3.93mL色谱柱中上样8.8mL的浓度为18mg/mL的mAb05进料，以得到40mg/mL的上样量。

表5：结合/洗脱色谱工艺

步骤	缓冲液	体积(CV)	流速(mL/min)
				平衡	缓冲液A	10	7.8
上样样品	mAb单体和聚集体溶液	8.8ml	7.8
				冲洗	缓冲液A	10	7.8
梯度洗脱	缓冲液A中0％至100％缓冲液B的线性梯度	20	7.8
				保持洗脱	100％缓冲液B	5	7.8
原位清洗	1.0M的氢氧化钠	5	7.8
				平衡	缓冲液B	5	7.8
平衡	缓冲液A	10	7.8

收集梯度洗脱的级分。通过测定溶液在280nm处的吸光度，测定各级分中mAb05的浓度。使用VWR的LaChrom

L-2200HPLC系统，通过分析尺寸排阻色谱，测定各级分中聚集体的百分比。HPLC系统使用了Phenomenex公司的预柱(HPLC GFC 3000色谱柱用Security Guard^TM色谱柱，内径为3.2-8.0mm，部件号：AJ0-4488)和分析尺寸排阻色谱柱(BioSep^TM5μm SEC-s3000

LC色谱柱300×7.8mm，部件号：00H-2146-K0)。然后计算聚集体百分比、mAb回收率、电导率和mAb浓度的累积库，正如表6和表7所示。

表6：停留时间为3.0min的

CPX

表7：停留时间为3.0min的流经CEX色谱介质

表6和表7显示了对于以

CPX为代表的传统CEX色谱介质或流经CEX色谱介质，在停留时间为3.0min时作为色谱柱的上样函数计算的累积合并库(见下文)。上样到所述柱上的mAb05进料具有7％聚集体，并使用梯度洗脱将其由所述柱中洗脱，所述梯度洗脱在20个柱体积上从100mM乙酸盐(pH为4.5)洗脱开始，并增加至具有0.5M NaCl的100mM乙酸盐(pH为4.5)的洗脱。

结果发现，mAb05在停留时间为3.0min时从

CPX中缓慢洗脱(表8)。合并级分1-11得到的累积聚集体为0.45％，累积mAb回收率为92％，累积电导率为35.44mS/cm，累积浓度为2.86mg/mL。相比之下，mAb05从流经CEX色谱介质中洗脱更快。合并级分1-4得到的累积聚集体为0.57％，累积mAb回收率为90％，累积电导率为14.99mS/cm，累积浓度为7.66mg/mL。注意到，两种色谱介质的聚集体去除和mAb回收率非常相似。然而，在溶液电导率低于

CPX洗脱所需溶液电导率的一半时，完成了流经CEX色谱介质的洗脱，并且该洗脱的浓度是其两倍以上。

表8：

CPX和流经CEX色谱介质在3.0min停留时间时结合/洗脱聚集体的去除。

说明书中引用的参考文献的教导能够最彻底地理解本说明书，其通过引用的方式并入本文。本说明书中的实施方案提供了本发明实施方案的解释，不应解释为限制其范围。熟练的技术人员很容易认识到，本发明包含了许多其他的实施方案。所有出版物和发明均以引用的方式全部并入。如果通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致，则本说明书将取代任何此类材料。引用本文中的任意参考文献并不承认此类参考文献是本发明的现有技术。

除非另有说明，否则在所有情况下，将本说明书(包括权利要求书)中所用的表示成分数量、细胞培养、处理条件等均应理解为通过术语“约”进行修改。因此，除非另有相反的说明，否则数值参数是近似值，并且可以根据本发明寻求获得的所需性质而发生变化。除非另有说明，否则应理解系列元素之前的术语“至少”是指系列中的每个元素。本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定许多等同于本文所述发明的具体实施方案。此类等同物预期包含在以下权利要求书中。

在不脱离本发明实质和范围的情况下可以对本发明做出许多修改和变化，这对本领域的技术人员是显而易见的。本文所述的具体实施方案仅以示例的方式提供，并不意味着以任何方式进行限制。本说明书和实施例仅被视为示例性的，以下权利要求书表明了本发明的真正范围和精神。

Claims

1.一种在样品中将目标单体蛋白与包含目标蛋白聚集体的混合物分离的方法，所述方法包括将所述样品与固体载体接触，所述固体载体包括用2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)和N,N-二甲基丙烯酰胺(DMMA)官能化的聚乙烯醚树脂，其中DMMA与AMPS的摩尔比大于2.0，并用溶液电导率为约10mS/cm至20mS/cm的缓冲液从所述固体载体中洗脱所述目标单体蛋白。

2.如权利要求1或2所述的方法，其中所述目标单体蛋白为单克隆抗体。

3.如上述权利要求中任何一项所述的方法，其中所述目标蛋白为重组蛋白。

4.如上述权利要求中任何一项所述的方法，其中所述混合物包含至少1％的所述目标蛋白聚集体。

5.如上述权利要求中任何一项所述的方法，其中所述固体载体为珠。

6.如上述权利要求中任何一项所述的方法，其中所述固体载体为膜。