KR102039531B1 - 폴리올 산화 효소 - Google Patents

Abstract

신규 폴리올 산화 효소의 제공. 해결 수단: 하기 (a)로부터 (e)에 기재된 성질에 의해 특정되는 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 미생물 유래의 폴리올 산화 효소. (a) 안정 pH는 pH 6.0 이상이며, 반응 최적 pH는 7.0으로부터 9.0이다. (b) 작용 온도는 50°C 이하이며, 반응 최적 온도는 40°C이다. (c) 분자량이 약 113 kDa이다. (d) 폴리올의 2번 위치와 3번 위치의 OH기가 L-에리트로형의 구조를 특이적으로 인식하여 반응하고, 4번 위치의 OH기가 L-리보형인 것은 인식하지 못하고 반응하지 않는다. (e) 기질 특이성이, D-아라비톨, 에리트리톨, D-만니톨, D-소르비톨의 순서이다.

Description

폴리올 산화 효소{POLYOL OXIDASE}

본 발명은, 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 미생물로부터 유래하는 신규 폴리올 산화 효소, 이 폴리올 산화 효소의 희소당에 특이적인 성질을 이용함으로써, 희소당을 효율적으로 제조하는 제조 방법에 관한 것이다.

효소가 특정한 물질에 대해서만 선택적으로 반응하는 분자 식별 기능을 이용하여, 목적으로 하는 물질의 제조나, 목적으로 하는 물질의 검출을 행하는 센서에 이용되고 있는 것은 잘 알려져 있다.

효소 센서는, 지금까지 일반적인 분석 방법인 액체 크로마토그래피나 가스 크로마토그래피 등에 비해, 간편, 신속, 정확, 소형, 나아가서는 저비용 등의 장점을 가지고 있다. 이 때문에, 임상 진단이나 식품 분석, 환경 오염의 측정 등에 널리 이용되고 있다.

효소 센서로서는, 예를 들면, D-소르비톨이나 글루코오스가 혼재하는 검체에, 크실리톨옥시다제 함유 시약을 첨가하여 크실리톨을 D-크실로오스로 변환한 후, 크실로오스디하이드로게나제 함유 시약을 작용시켜, 생성되는 D-크실로오스를 검출하고, 검체 중에 존재하는 크실리톨을 간편하고도 특이적으로 정량 가능하도록 한 것(특허 문헌 1)이나, 소르비톨, 만니톨, 크실리톨 및 아라비톨로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1종의 폴리올을 함유하는 시료에 소르비톨옥시다제를 작용시켜, 생성되는 과산화 수소 또는 D-글루코오스, 만노오스, 크실로오스 또는 아라비노스 또는 소비하는 산소량을 측정하여 폴리올을 측정하는 시료 중의 폴리올의 측정법(특허 문헌 2) 등 수많은 제안이 이루어져 있다.

효소 센서가 실용화된 대표적인 예로서는, 글루코오스 산화 효소를 이용한 당뇨병 환자가 이용하는 혈당치 측정기가 있다. 혈액에는 많은 성분이 혼재하고 있으며, 이 중에서 선택적으로 글루코오스를 검출하는 것은 대단히 곤란하다. 그러나, 글루코오스 산화 효소를 이용함으로써 혈중으로부터 글루코오스를 선택적으로 식별할 수 있다. 이 혈당치 측정기는 당뇨병 환자가 인슐린을 투여할 때 자기 채혈에 의해 간편하게 혈당값을 모니터링할 수 있으므로, 그 시장은 확대되고 있다. 혈당치 측정기에도 사용되고 있는 산화 효소는 일반적으로, 기질을 산화할 때 전자 수용체로서 산소를 소비하고, 과산화 수소를 생산하는 반응을 촉매한다. 산소의 소비는 산소 전극을 사용하여, 과산화 수소의 생성은 과산화 수소 전극을 사용함으로써 간편하게 측정할 수 있으므로, 산화 효소는 효소 센서에 대한 이용에 적절한 효소이다.

최근, 일본에서는 고령화 사회가 진행되고 있으며, 그에 따른 의료 기술의 충실을 부르짖고 있다. 또한, 효소 센서의 응용이 진행되고 있는 식품 분석이나 환경 측정은, 향후 효소 센서에 대한 요구가 더욱 높아지는 분야인 것으로 예상된다. 그러나, 현재, 기질 특이성이 높은 산화 효소는 한정되어 있으므로, 향후 효소 센서를 개발하는 데 있어서, 신규 산화 효소에 대한 검색이 필요하다.

그런데, 희소당은 자연계에는 존재하지 않는, 또는 매우 미량밖에 존재하지 않는 단당이며, 지금까지 거의 연구되고 있지 않았지만, D-프시코스, D-알로오스의 대량생산이 가능하게 됨으로써, 희소당의 생산기술의 연구나, 생리 작용, 화학적 성질에 관한 연구가 착수되어 특이적인 생리 작용이 계속적으로 규명되어 왔다. 이들이 의약으로서 실용화될 때에는 희소당에 특이적으로 반응하는 효소의 제공이 요구되고 있다. 희소당의 생리 활성의 예를 하기 표 1에 나타내었다.

또한, 효소의 화합물의 제조에 대한 이용에 대해서도 수많은 화합물이나 효소와 대한 제안이 행해지고 있으며, 예를 들면, 최근, D-타가토오스-3-에피머라제(DTE)를 이용함으로써, 희소당의 일종인 D-프시코스나 D-알로오스의 대량생산 기술이 확립되었다. Pseudomonas stutzeri(IPOD FERM BP-08593) 유래의 L-람노스이소머라제 활성을 가지는 단백질을 작용시켜 D-알로오스로 이성화하는 D-알로오스의 생산 방법(특허 문헌 3)이나, D-프시코스 및/또는 L-프시코스를 함유하는 용액에 D-크실로오스·이소머라제를 작용시켜, D-프시코스로부터는 D-알로오스와 D-알트로오스를, L-프시코스로부터는 L-알트로오스를 생성시키고, 이들 D-알로오스, D-알트로오스 및 L-알트로오스로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알도헥소스를 채취하는 알도헥소스의 제조 방법(특허 문헌 4)이 제안되어 있다.

일본공개특허 평11-346797호 공보 일본공개특허 평6-169764호 공보 일본공개특허 제2008-109933호 공보 일본공개특허 제2002-17392호 공보

Agric. Biol. Chem., 43, 2531-2535(1979) J. Biosci. Bioeng., 88, 676-678(1999) 식품위생학 잡지 49, 82-87.(2008) Jan. J. Med. Mycol., 45, 55-58.(2004)

전술한 바와 같이, 희소당에는 실용성이 높은 생리 활성이 있는 것을 알 수 있게 되었고, 이 외에도 감미료, 농약, 의약, 공업 재료 등, 폭 넓은 분야에서의 실용화의 가능성을 지니고 있다. 그러므로, 향후에는, 간편하고 신속한 정량법이 필요하게 될 것으로 여겨진다. 그러나, 그 미량 정량법은 아직도 확립되어 있지 않으므로, 각각의 희소당에 특이성이 높은 산화 효소를 발견하고, 효소 센서로 이용할 수 있으면 그 의의는 크다. 또한, 모든 희소당에서 대량생산이 확립되어 있는 것은 아니며, 다단계의 반응을 거쳐, 소량밖에 생산할 수 없는 것도 많으며, 산화 반응에 의해 희소당을 생산하는 효소가 발견되면, 일단계의 반응에 의해 고수율로 신규 희소당 대량생산 경로를 작성할 수 있어, 새로운 희소당 연구의 진전으로 이어질 것으로 기대된다.

이러한 상황속에서, 밀기울 배지는 습도가 낮은 배지의 표면에서 미생물이 생육하는 점에서, 미생물이 자연계에서 생육하고 있는 상황과 닮아 있는 점은 잘 알려져 있다. 밀기울 배지를 사용하여 방선균이나 사상균을 배양하면, 통상의 액체 배지 등에서는 생산되지 않는, 많은 독특한 효소를 균체 외에서 생산하는 것에 대하여 다수 보고되어 있다. 예를 들면, Trichoderma viride가 생산하는 리신 산화 효소(비특허 문헌 1) 등은, 밀기울 배지를 사용함으로써 기질 특이성이 높은 산화 효소를 얻을 수 있다. 이러한 종래 기술을 검토함으로써, 본 발명은 희소당에 특이적으로 작용하는 신규한 효소를 제공하는 것을 가능하게 하고 있다.

본 발명은, 희소당에 대하여 기질 특이성이 높은 폴리올 산화 효소를 제공하는 것, 및 이 폴리올 산화 효소의 희소당에 특이적인 성질을 이용함으로써, 희소당의 효율적인 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 각각의 희소당에 특이성이 높은 산화 효소를 발견하고, 각각의 희소당의 효소 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 이하의 (1) 내지 (3)에 기재된 폴리올 산화 효소인 것으로 요지로 한다.

(1) 하기 (a)로부터 (e)에 기재된 성질에 의해 특정되는 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 미생물 유래의 폴리올 산화 효소.

(a) 안정 pH는 pH 6.0 이상이며, 반응 최적 pH는 7.0으로부터 9.0이다.

(b) 작용 온도는 50°C 이하이며, 반응 최적 온도는 40°C이다.

(c) 분자량이 약 113 kDa이다.

(d) 폴리올의 2번 위치와 3번 위치의 OH기가 L-에리트로형의 구조를 특이적으로 인식하여 반응하고, 4번 위치의 OH기가 L-리보형인 것은 인식하지 못하고 반응하지 않는다.

(e) 기질 특이성이, D-아라비톨, 에리트리톨, D-만니톨, D-소르비톨의 순서이다.

(2) 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 미생물이, Penicillium sp. KU-1(수탁 번호 NITE BP-1156)인 상기 (1)에 기재된 폴리올 산화 효소.

(3) 상기 폴리올 산화 효소가, 밀기울을 배지로 하여 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 미생물을 배양하여 얻어진 것인 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 폴리올 산화 효소.

본 발명은 이하의 (4) 내지 (7)에 기재된 희소당의 생산 방법인 것을 요지로 한다.

(4) D-만니톨에, 상기 (1) 내지 (3) 어느 하나에 기재된 폴리올 산화 효소를 작용시켜, D-만노오스로 산화하는 것을 특징으로 하는 D-만노오스의 생산 방법.

(5) D-아라비톨에, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 폴리올 산화 효소를 작용시켜, D-릭소오스로 산화하는 것을 특징으로 하는 D-릭소오스의 생산 방법.

(6) D-소르비톨에, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 폴리올 산화 효소를 작용시켜, L-굴로스로 산화하는 것을 특징으로 하는 L-굴로스의 생산 방법.

(7) 에리트리톨에, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 폴리올 산화 효소를 작용시켜, L-에리트로오스로 산화하는 것을 특징으로 하는 L-에리트로오스의 생산 방법.

본 발명에 의해 하기의 효과가 얻어진다.

1. 희소당에 대하여 기질 특이성이 높은 폴리올 산화 효소를 제공할 수 있다.

2. D-아라비톨, 에리트리톨, D-만니톨, D-소르비톨에 대한 기질 특이성이 높은 폴리올 산화 효소를 제공할 수 있다.

3. 일반적인 분석 방법인 액체 크로마토그래피나 가스 크로마토그래피 등에 비해, 간편, 신속, 정확, 소형, 나아가서는 저비용이 되고, 희소당과 관련된 임상 진단이나 식품 분석, 환경 오염의 측정 등에 유용하다.

4. 희소당을 효율적으로 제조할 수 있다.

5. 본 효소는 일단계의 반응에 의해, 또한 산화 반응의 불가역 반응이므로 거의 100 %의 수율로 희소당의 대량생산이 가능하게 이루어지는 것으로 기대된다.

6. 본 폴리올 산화 효소를 이용함으로써 이하의 당류의 특이적 제조 방법을 제공할 수 있다.

a. D-아라비톨을 원료로 하여 D-릭소오스를 제조하는 방법,

b. 에리트리톨를 원료로 하여 L-에리트로오스를 제조하는 방법,

c. D-만니톨을 원료로 하여 D-만노오스를 제조하는 방법,

d. D-소르비톨을 원료로 하여 L-굴로스를 제조하는 방법

도 1은 폴리올 산화 효소 생산균(A주 또는 B주)의 산화 효소의 반응을 나타낸다.
도 2는 D-글루코오스 산화 효소 생산균(C주)의 산화 효소 반응을 나타낸다.
도 3은 C주의 PDA 배지에서의 형태를 나타낸다.
도 4는 D-소르비톨을 기질로 하는 본 효소 반응 생성물의 HPLC 분석을 나타낸다.
도 5는 기질에 의한 효소 유도 생산의 검토 결과를 나타낸다.
도 6은 밀기울 입자의 거칠기가 효소 생산성에 미치는 영향을 나타낸다.
도 7은 조효소액(粗酵素液) 중에서의 효소의 안정성을 나타낸다.
도 8은 TOYOPEARL Butyl-650M 컬럼 크로마토그래피를 나타낸다.
도 9는 TOYOPEARL DEAE-650M 컬럼 크로마토그래피를 나타낸다.
도 10은 Hiprep Q XL 컬럼 크로마토그래피를 나타낸다.
도 11은 HiLoad 16/10 Superdex 200 grade 컬럼 크로마토그래피를 나타낸다.
도 12는 Native-PAGE(좌측)와 SDS-PAGE(우측)를 나타낸다.
도 13은 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 사용한 분자량의 산출 결과를 나타낸다.
도 14는 본 효소의 온도 안정성을 나타낸다.
도 15는 본 효소의 pH 안정성을 나타낸다.
도 16은 본 효소의 반응 최적 온도를 나타낸다.
도 17은 본 효소의 반응 최적 pH를 나타낸다.
도 18은 폴리올(D체)의 구조식과 기질 인식 부위를 나타낸다.
도 19는 D-아라비톨에 대한 본 효소의 작용을 나타낸다.
도 20은 D-소르비톨에 대한 본 효소에 의한 반응을 나타낸다.
도 21은 18S rDNA의 구조와 목적 증폭 부위를 나타낸다.
도 22는 PCR 후의 아가로스겔 전기 영동의 사진을 나타낸다.
도 23은 PCR 증폭 단편에서의 얼라인먼트(alig㎚ent) 검색을 나타낸다.
도 24는 폴리올 생산균의 현미경 사진을 나타낸다.

본 발명은, 하기 (a)로부터 (e)의 성질에 의해 특정되는 페니실륨(Penicillium)에 속하는 미생물 유래의 폴리올 산화 효소에 관한 것이다.

(a) 안정 pH는 pH 6.0 이상이며, 반응 최적 pH는 7.0으로부터 9.0이다.

(b) 작용 온도는 50°C 이하이며, 반응 최적 온도는 40°C이다.

(c) 분자량이 약 113 kDa이다.

(d) 폴리올의 2번 위치와 3번 위치의 OH기가 L-에리트로형의 구조를 특이적으로 인식하여 반응하고, 4번 위치의 OH기가 L-리보형인 것은 인식하지 못하고 반응하지 않는다.

(e) 기질 특이성이, D-아라비톨, 에리트리톨, D-만니톨, D-소르비톨의 순서이다.

본 발명의 폴리올 산화 효소는, D-아라비톨, 에리트리톨, D-만니톨, D-소르비톨에 대한 기질 특이성이 현저하며 희소당의 제조 또는 희소당의 검출 등에 유용하다. 특히, D-만니톨로부터 D-만노오스, D-아라비톨로부터 D-릭소오스, D-소르비톨로부터 L-굴로스, 에리트리톨로부터 L-에리트로오스의 제조에 유용하다.

본 발명의 산화 효소는, 일본 카가와켄 미키쵸 이케노베 공민관에서 채취한 토양으로부터 얻은 균주 KU-1에 유래하는 것으로서, 이하에서 상세하게 설명하는 바와 같이, 이 균주는 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 균주인 것이 판명되었다. 이 균주 Penicillium sp. KU-1은, 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터(지바켄 키사라즈시 카즈사카마타리2-5-8)에 수탁 번호 NITE P-1156로서 헤이세이 23년(2011년) 10월 26일에 국내 기탁되어 있고, 거기로부터 입수 가능하다. 금번 국제 출원을 행하는 데 있어서, 원기탁(NITE P-1156)을 상기 원기탁을 한 국제 기탁 당국에 2012년 10월 16일에 이관 청구를 하고, 2012년 10월 25일에 상기 국제 기탁 당국으로부터 원기탁에 대한 수탁증(NITE BP-1156)이 발행되었다. 본 발명의 상기 폴리올 산화 효소를 발생하는 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 균주 Penicillium sp. KU-1을 이하의 기재에 있어서 A주로 칭하는 경우도 있다.

이미 알려진(이하에서, 기지(旣知)라고 하는 경우가 있음) 폴리올 산화 효소로서 스트렙토마이세스(Streptmyces) 속이 생산하는 소르비톨 산화 효소나 크실리톨 산화 효소를 예로 들 수 있지만, D-소르비톨을 기질로 하는 이들의 효소 반응에서는 D-글루코오스가 생산되는 것이 밝혀지고 있다. 한편, 페니실륨(Penicillium) 속이 생산하는 효소는, D-소르비톨로부터는 (L-)굴로스, D-아라비톨로부터는 (D-)릭소오스가 생산되는 것이 강하게 시사되고 있다. 현재, L-굴로스는 L-소르보스로부터 이성화 효소를 사용하여 생산되고 있다. 그리고, D-릭소오스는 D-글루코오스로부터 D-아라비톨, D-크실로오스와 다단계의 반응을 거쳐 생산되고 있다. 또한, 이성화 효소를 사용한 반응이므로, 생산되는 D-릭소오스의 수율은 낮다. 그 점에 있어서 본 효소는 일단계의 반응으로, 또한 산화 반응이 불가역 반응이므로, 거의 100%의 수율로 이들 희소당의 대량생산이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 효소는 희소당의 새로운 생산계로의 이용이 기대되는 것이다.

이하에서 본 발명의 산화 효소에 대하여 설명한다.

[1. 미생물의 단리]

l. 실험 방법

1.1 시약

배지에 사용한 Potato Dextrose Agar(PDA)는 Bection, Dickinson and Company에서 제조한 것을 사용하였다.

1.2 배지 조성 및 배양 조건

다양한 장소에서 채취한 토양 약 1 g에 약 5 ml의 물을 첨가하고, 토양 현탁액을 작성하였다. 그 상청액을 100배로 희석한 것을 PDA 배지에 50μl 도포하고, 28°C에서 배양했다. 거기로부터 형성된 콜로니 중에서, 사상균으로 여겨지는 균주를 동일한 배지에 접종하고, 28°C에서 배양하고 균주를 단리하였다.

2. 결과 및 고찰

본 학교의 건물 내와 그 주변을 중심으로 하는 카가와현내, 현외에서는 오사카부내의 공원 등으로부터 토양을 채취하였다. 그것으로부터 사상균으로 여겨지는 139주의 균주의 단리를 행하였다. 채취한 토양에 따라 박테리아가 중심인 것과, 많은 사상균의 콜로니를 확인할 수 있었던 것 등 다양한 형태가 확인되므로, 채취 장소에 따라 토양 미생물의 종류가 상이한 것이 밝혀졌다. 또한, 사상균보다 박테리아 쪽이 생육 속도가 빠르기 때문에, 배지 전체에 박테리아가 퍼지고, 사상균의 단리가 곤란한 것이 있었다. 이를 방지하기 위하여, 암피실린 등의 항생 물질을 첨가한 배지에서 배양을 행함으로써 양호한 효율의 사상균의 단리가 가능한 것으로 여겨진다.

[신규 산화 효소의 스크리닝]

토양으로부터 단리한 사상균을 밀기울 배지에서 배양하고, 배지 중에 산화 효소를 분비 생산하는 사상균의 스크리닝을 행하였다.

1. 실험 방법

1.1 시약

배지로서 사용한 밀기울 배지의 밀기울은 JA 카가와에서 구입한 것, Potato Dextrose Broth(PDB)는 Bection, Dickinson and Company에서 제조한 것을 사용하였다. 완충액은 인산 칼륨 완충액(pH 7)을 사용하고, 인산 수소 이칼륨, 인산 이수소 칼륨 모두 와코 순약공업 가부시키가이샤에서 제조한 것을 사용하였다. 기질로서 사용한 당류의 D-글루코오스, D-만니톨, D-소르비톨은 나카라이테크스 가부시키가이샤에서 제조한 것, D-플락토오스, D-갈락토오스, D-만노오스는 와코 순약공업 가부시키가이샤에서 제조한 것, 알리톨, D-타가토오스, D-프시코스, D-알로오스는 카가와 대학 희소당 센터로부터 얻은 것을 사용하였다. 기질로서 사용한 아미노산인, 크레아틴, 크레아티닌은 와코 순약공업 가부시키가이샤에서 제조한 것, L-오르니틴, L-시트르린, γ-아미노 부티르산은 SIGMA-ALDRICH CO.에서 제조한 것을 사용하였다. 산화 효소 측정에 사용한 퍼옥시다제(ABTS)는, 각각 와코 순약공업 가부시키가이샤에서 제조한 것을 사용하였다.

1.2 배지 조성 및 배양 조건

PDB 5ml에 단리한 균체를 접종하고, 1주일 28°C에서 진탕 배양했다. 200ml용 삼각 플라스크에 밀기울 6 g, 물 15 ml를 부가하여 혼합하고, 오토클레이브(autoclave)로 멸균한 것을 밀기울 배지로서 사용하였다. 작성한 밀기울 배지에 액체 배양한 균체를 배양액마다 전체량을 더하여, 28°C에서 배양했다. 배양 2주일 후에 이하에서 설명한 방법으로 추출액을 조제하고, 산화 효소 활성 측정에 사용하였다.

1.3 배지 추출액의 조제

균체를 생육시킨 밀기울 배지에 10 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)을 20 ml 부가하여 침지하고, 얼음 상에서 1시간 정치한 후, 거즈를 사용하여 압착했다. 그 후 4°C, 12,000 r.p.m으로 18분 원심분리에 의해 미립자를 제거하고, 이것을 조추출액(粗抽出液)으로 하였다.

1.4 1차 스크리닝에 사용한 기질

1차 스크리닝은 효율성을 고려하여 당 혼합 용액과 아미노산 혼합 용액을 사용하였다. 각 기질은 최종 농도 0.5 M이 되도록 조정하였다. 혼합 용액의 조합은 표 2에 나타내었다. 1차 스크리닝으로 활성이 검출된 조추출액은, 0.5 M의 각 기질을 단독으로 사용하여 2차 스크리닝을 행하여, 기질을 특정하였다.

1.5 산화 효소 활성 측정 방법

산화 효소의 활성 측정 방법은 퍼옥시다제법을 이용하였다. D-글루코오스 산화 효소를 예로 들면, 퍼옥시다제법의 원리는 하기와 같다.

[화학식 1]

이 방법은, 산화 반응에 의해 생기는 과산화 수소를 비색정량(比色定量)함으로써 활성을 측정한다. 기질과의 산화 반응에 의해 생성된 과산화 수소와 퍼옥시다제가 반응하면, ABTS의 산화 반응이 촉매되어 산화형의 ABTS가 생긴다. 산화형 ABTS는 청색을 나타내므로, 육안으로 또는 420 ㎚의 흡광도를 측정함으로써 산화 효소 활성을 검출할 수 있다. 활성 측정은 밀기울 배지로부터 추출한 조추출액을 사용하였다. 산화 효소 활성 측정을 위한 반응액 조성은, 표 3에 나타내었다. 또한, 컨트롤 군으로서, 기질 대신 물을 첨가하고 반응액도 마찬가지로 작성하였다. 실온에서 반응시킨 후, 색이 나타나는지의 유무를 육안에 의해 확인하고, 색이 나타난 반응액에 첨가한 조추출액에 산화 효소 활성이 있는 것으로 판단하였다.

1M의 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)	5㎕
퍼옥시다제(10 units/ml)	10㎕
10mM ABTS	10㎕
기질 혼합 용액	10㎕
조추출액	10㎕
H2O	55㎕
total 100㎕

2. 결과 및 고찰

산화 효소의 스크리닝을 행한 결과, 산화 효소를 생산하고 있는 것으로 여겨지는 사상균을 3주 발견하였다. 그 중의 2주는 폴리올 산화 효소를 생산하는 미생물이며, 미키쵸 이케노베 공민관에서 채취한 주(이하, A주로 함)와 오사카부 모리구치시내의 공원으로부터 채취한 주(이하, B주로 함)였다. A주와 B주는 양쪽 다 폴리올 산화 효소를 생산하지만, A주의 산화 효소는 D-소르비톨과 D-만니톨을 기질로 하고, 알리톨에는 반응성을 나타내지 않았는데 대하여, B주의 효소는 D-소르비톨, D-만니톨, 알리톨의 모두를 기질로 하는 점에서 상이하였다. 또한, 양쪽 효소 모두 알도오스나 케토오스에는 반응하지 않았으므로 폴리올에 기질 특이성을 나타내는 것이 밝혀졌다. 이들 효소의 퍼옥시다제법에 의한 효소 반응을 도 1에 나타내었다. 지금까지 보고되고 있는 폴리올 산화 효소의 종류는 적다. 그러나, 기질 특이성이 상이한 2주의 폴리올 산화 효소를 발견할 수 있었으므로, 자연계에 폴리올 산화 효소를 생산하는 미생물은 의외로 널리 분포되어 있을 가능성을 고려할 수 있고, 나머지 1주는 오사카부 히가시오사카시의 토양으로부터 채취한 주(이하 C주로 함)이며, 이 주는 D-글루코오스 산화 효소를 생산하고 있고, 다른 단당에는 반응하지 않고 D-글루코오스에 높은 기질 특이성을 나타내는 산화 효소였다. 단리된 사상균의 형상으로부터, C주는 Aspergillus niger로 여겨진다. A. niger는 기질 특이성이 높은 D-글루코오스 산화 효소를 생산하는 것으로 이미 알려져 있고, 이 효소의 퍼옥시다제법에 의한 효소 반응을 도 2에, C주를 PDA 배지로 배양한 것을 도 3에 나타내었다.

[2. A주가 생산하는 폴리올 산화 효소의 생산 조건의 검토]

액체 배양에서의 효소 생산의 유무나, 기질의 첨가에 의한 효소 생산의 유도 생산의 유무 등 A주가 생산하는 폴리올 산화 효소의 생산 조건에 대하여 검토를 행하였다.

1. 실험 방법

1.1 공시균(共試菌)

폴리올 산화 효소 생산균인 A주를 사용하였다.

1.2 시약

배지로서 사용한 Yeast extract 는 나카라이테크스 가부시키가이샤에서 제조한 것을 사용하였다.

1.3 배지 조성 및 배양 조건

멸균수 5 ml에 균을 현탁하고, 현탁액 1 ml를 (1) PDB 와 (2) Yeast extract, 만니톨, D-소르비톨을 각각 0.5% 부가한 액체 배지 각 100 ml에 접종 한 후, 28°C에서 진탕 배양했다.

1.4 조효소 용액의 조제

배양 후 2일째부터, 각 배양액으로부터 500μl씩 빼낸 것을, 12000 r.p.m., 4°C, 10분간 원심분리한 후, 상청액을 회수하고, 10 mM의 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 투석했다. 이것을 조효소 용액으로 하였다.

1.5 효소 활성 측정 방법

상기 반응 용액 조성에 있어서, D-소르비톨을 기질로서 사용한 반응을 행하고, ABTS의 색깔이 나나타는 것을 육안에 의해 측정하여 활성의 유무를 조사하였다.

2. 결과 및 고찰

액체 배양을 행하고, 배양 후 2일째부터 10일째까지 조효소 용액의 효소 활성 측정을 행하였으나, (1) PDB와 (2) Yeast extract, D-만니톨, D-소르비톨을 각각 0.5% 부가한 액체 배지 중 어디에서도 효소 활성은 검출되지 않다. 이로써, 이 효소는 밀기울 배지 등의 고체 배지에 있어서 양호하게 생산되는 효소이며, 또한, 기질에 의한 유도 생산은 일어나지 않는 것이 시사되었다. 사상균은 일반적으로 액체 배양보다 고체 배양 쪽이 다양한 효소를 생산하는 것으로 알려져 있고, 이 효소도 예외는 아니었다고 여겨진다.

[3. D-소르비톨을 기질로 하는 반응 생산물의 HPLC 해석]

D-소르비톨을 기질로 하여 효소 반응을 행하고, 그 반응 생성물의 해석을 HPLC를 사용하여 행하였다.

1. 실험 방법

1.1 공시균

폴리올 산화 효소 생산균인 A주를 사용하였다.

1.2 시약

HPLC 샘플의 탈염 처리에 사용한 앰버라이트는 오르가노가부시키가이샤에서 제조한 것을 사용하였고, 다이아 이온은 미쓰비시화학 가부시키가이샤에서 제조한 것을 사용하였다.

1.3 배지 조성 및 배양 조건

전술한 것과 동일한 방법으로 행하였다.

1.4 효소 용액의 조제

전술한 것과 동일한 방법으로 행하였다.

1.5 효소 반응

표 4에 나타낸 조성으로 조추출액과 D-소르비톨을 24시간 실온에서 반응시켜, 자비(煮沸)에 의해 반응을 정지시켰다. 반응이 진행됨에 따라 용존 산소가 감소하는 것으로 여겨지므로, 피펫을 사용하여 반응액 중에 공기를 주입하였다. 또한, 반응 용액을 혼합한 후 바로 자비하여 반응을 정지시킨 것과, 열처리한 조효소 용액으로 마찬가지로 24시간 반응시킨 것을 컨트롤 군으로 하였다.

1.6 탈염 처리, 해석

효소 반응을 자비로 중단시킨 후, 미립자를 제거하기 위해 13,000 r.p.m.으로 10분 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 거기에 다이아 이온과 앰버라이트를 1:2의 비율로 혼합한 것을 소량 첨가하여 1시간 정치하고, 반응액의 탈염을 행하였다. 이 상청액을 회수하고, 13,000 r.p.m.으로 5분 원심분리한 후, 0.22㎛의 필터(Ultrafree-MC)에 넣어 6000 r.p.m.으로 5분 원심분리했다. 필터를 통과한 용액을 전량 회수하고, HPLC 전용 튜브(샘플 컵 IA)에 거품이 들어가지 않도록 주입하였다. 오토샘플러에 의해 해석을 행하였다.

1.7 HPLC의 조건

GL-C611 컬럼 크로마토그래피(히타치 화성 공업 가부시키가이샤)를 사용하고, 10^-4 M 수산화나트륨 수용액을 이동상으로 하고, 시차 굴절계에 의해 검출을 행하였다.

2. 결과 및 고찰

D-소르비톨을 기질로 하여 24시간 효소 반응을 행하고, 그 반응 생성물의 HPLC를 사용하여 해석을 행하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 21분 부근에서 컨트롤 군의 반응액에는 존재하지 않는 피크가 확인되었다. 이는, 희소당인 굴로스의 용출 시간과 일치한다. 또한, 9분 부근의 피크는 염 등이 존재하는 것을 고려할 수 있고, 20분 부근의 피크는 이도오스의 용출 시간과 일치하지만, 컨트롤 군에도 동일한 피크가 확인되므로, 효소 반응에 유래하는 물질이 존재하는 것을 고려할 수 있다. 그리고, 28분 부근의 피크는, 기질로서 사용한 D-소르비톨이다.

이 결과에 의해, A주가 생산하는 효소와 D-소르비톨의 반응 생성물은 희소당인 굴로스인 것이 강하게 시사되었다. 또한, 광학 활성에 대한 측정은 행하고 있지 않지만, 기질이 소르비톨인 것을 고려하면, 구조적으로 생성물은 L-굴로스인 것으로 여겨진다. 그러나, 산화 반응은 불가역적 반응임에도 불구하고, 반응 24시간 후에 생성된 (L-)굴로스는 약 3%로 미량이었다. 이는, 조효소 용액을 사용한 점과 반응 용액 중의 산소 농도가 불충분한 점이 원인인 것으로 여겨진다.

[4. 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 균주(A주) 유래 폴리올 산화 효소의 생산 조건의 검토]

액체 배양에서의 효소 생산의 유무나, 기질의 첨가에 의한 효소 생산의 유도 생산의 유무 등, 페니실륨(Penicillium) 속 유래 폴리올 산화 효소를 조효소 용액를 더욱 효율적으로 취득할 수 있는 방법을 검토하였다.

1. 실험 방법

1.1 공시균

폴리올 산화 효소 생산하는 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 균주(A주)를 사용하였다.

1.2 배지 조성 및 배양 조건

1) 액체 배지

멸균수 5 ml에 균을 현탁하고, 현탁액 1 ml를 (1) PDB와 (2) Yeast extract, D-만니톨, D-소르비톨을 각각 0.5% 부가한 액체 배지 각 100 ml에 접종한 후, 28°C에서 진탕 배양했다.

2) 기질에 의한 효소 유도 생산의 검토

PDB 배지로 28°C, 3일간 진탕 배양한 본균을 5 ml씩 D-만니톨 비첨가 배지와 D-만니톨 첨가 배지에 각각 접종하고, 28°C에서 정양(靜養) 배양했다.

밀기울	20g
H2O	40ml
500ml용 삼각 플라스크 1개당

밀기울	20g
2% D-만니톨 수용액	40ml
500ml용 삼각 플라스크 1개당

3) 밀기울 입자의 거칠기가 효소 생산성에 미치는 영향

하기 조성의 밀기울 배지를, 밀기울 배지에 대한 당의 첨가와 동일한 방법으로 균을 접종하고, 배양했다. 밀기울와 물의 비율을 표 7 및 표 8에 나타내었다.

밀기울	20g
H2O	40ml
500ml용 삼각 플라스크 1개당

밀기울	20g
H2O	30ml
500ml용 삼각 플라스크 1개당

1.3 효소 용액의 조제

1) 액체 배지

배양 후 2일째부터, 각 배양액으로부터 500μl씩 빼낸 것을, 12,000 r.p.m., 4°C, 10분간 원심분리한 후, 상청액을 회수한 것을 10 mM의 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 투석했다. 이것을 조효소 용액으로 하였다.

2) 기질에 의한 효소 유도 생산의 검토

전술한 것과 동일한 방법으로 조효소 용액을 취득하였다. 다만, 완충액은 10 mM의 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 변경하였다.

3) 밀기울 입자의 거칠기가 효소 생산성에 미치는 영향

기질에 의한 효소 유도 생산의 검토와 동일한 방법으로 추출을 행하여 조효소 용액을 취득하였다.

1.4 효소 활성 측정 방법

1) 액체 배지

상기 반응액 조성으로, D-만니톨을 기질로서 사용한 반응을 행하고, ABTS의 색깔을 나타내는 것을 육안에 의해 측정하여 활성의 유무를 조사하였다.

2) 기질에 의한 효소 유도 생산의 검토

본 효소 활성의 측정은 상기와 마찬가지의 퍼옥시다제법을 이용하여 420 ㎚의 흡광도의 상승을 측정함으로써 행하였다. 효소 반응은 D-만니톨을 첨가함으로써 개시시키고, 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-2010을 사용하여 30°C의 반응 조건 하에서 10분간의 시간 변화로 흡광도를 측정했다. 반응은 표 9와 같이 반응액이 총량 1 ml로 되도록 조제하였다. 1 unit는, 흡광도 420 ㎚에 있어서 1분간에 흡광도가 1 상승하는 효소량으로 정의하였다.

1M의 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)	50㎕
퍼옥시다제(10 units/ml)	100㎕
10mM ABTS	100㎕
0.5M D-만니톨	100㎕
조효소 용액	100㎕
H2O	550㎕
total 1ml

3) 밀기울 입자의 거칠기가 효소 생산성에 미치는 영향

밀기울 배지에 대한 당의 첨가와 동일한 방법으로 측정을 행하였다.

2. 결과 및 고찰

1) 액체 배지

배양 후 2일째부터 10일째까지 조효소 용액의 효소 활성 측정을 행하였으나, 어느 액체 배지에 있어서도 효소 활성은 검출되지 않았다. 이 결과에 의해, 이 효소는 밀기울 배지 등의 고체 배지에 있어서 양호하게 생산되는 효소인 것이 시사되었다. 또한, 액체 배지와 고체 배지에서의 생육 속도는 같거나 또는 액체 배지 쪽이 빠르기 때문에, 효소 생산 조건은 균사 생장에 의존하고 있지 않은 것이 시사되었다.

2) 기질에 의한 효소 유도 생산의 검토

배양 후 6일째부터 18일째까지 조효소 용액의 추출과 효소 활성 측정을 행하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 효소 활성에 큰 차이가 관찰되지 않으므로, 이 효소는 기질의 첨가에 의한 효소 발생의 유도는 일어나지 않는 것이 시사되었다. 또한, 밀기울에는 만니톨 등 유도원(誘導源)이 되는 당이 포함되어 있으므로, 기질을 밀기울 배지에 더 첨가해도 그 이상의 유도는 관찰할 수 없을 가능성도 부정할 수 없다.

3) 밀기울 입자의 거칠기가 효소 생산성에 미치는 영향

배양 후 6일째부터 12일째까지의 조효소 용액의 추출과 효소 활성을 측정하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이 결과에 따르면, 피크 시에는 2.6배의 차이가 관찰되어 입자가 미세한 밀기울을 사용한 본 균의 배양 쪽이 효소를 양호하게 생산할 수 있다 것이 밝혀졌다. 또한, 효소 활성의 피크는 배양 후 9일째 부근에 나타났다. 이러한 결과를 감안하여, 입자가 미세한 밀기울 배지로 9일간 배양 한 것으로부터 추출한 조효소 용액을 사용하여 본 효소의 정제를 시도했다.

[5. 조효소 용액을 사용한 효소 안정성의 검토]

정제에 앞서, 조효소액 중에서의 본 효소의 안정성에 대하여 검토를 행하였다.

1. 실험 방법

1.1 공시균 폴리올 산화 효소 생산하는 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 균주(A주)를 사용하였다.

1.2 시약

유안 분획에 사용한 황산암모늄은 나카라이테크스 가부시키가이샤에서 제조한 것을 사용하였다.

1.3 배지 조성 및 배양 조건

500ml용 삼각 플라스크에 밀기울 20 g과 물 40 ml를 더하여 스패튤라(spatula)로 잘 혼합하고, 면전(棉栓)을 하고 오토클레이브로 멸균한 것을 밀기울 배지로서 사용하였다. 여기에, PDB로 3일간 진탕 배양한 것을 5 ml 접종하고, 28°C에서, 10일간 정치 배양했다.

1.4 효소 용액의 조제

전술한 것과 동일한 방법으로 조추출액을 취득하였다. 다만, 완충액은 10 mM의 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 변경하였다. 조추출액의 절반은 조효소 용액으로 하여 얼음 위에서 정치 0시간, 5시간 후, 24시간 후의 잔존 효소 활성을 측정하였다. 나머지는 유안 염석에 의해 50∼70 % 포화 유안 획분을 조제하고, 마찬가지로 얼음 위에서 정치 0시간 후, 5시간 후, 24시간 후의 잔존 효소 활성을 측정하였다.

1.5 효소 활성 측정 방법

전술한 것과 동일한 방법으로 행하였다.

2 결과 및 고찰

효소 활성을 측정한 결과를 도 7과 표 10에 나타내었다.

조효소 용액을 얼음 위에서 5시간 정치한 후의 잔존 효소 활성은 약 5%이며, 24시간 후에는 완전히 실활했다. 그러나, 유안 염석에 의해 조제한 50∼70 % 포화 획분은, 얼음 위에서 24시간 정치된 후에도 잔존 활성이 60%였다. 이러한 사실로부터, 조효소 용액 중에는 높은 프로테아제 활성이 존재하고, 유안 분획에 의해 어느 정도 프로테아제를 제거할 수 있는 것이 시사되었다.

[6. 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 미생물 유래의 폴리올 산화 효소의 정제]

1. 실험 방법

1-1 공시균

폴리올 산화 효소 생산하는 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 균주(A주)를 사용하였다.

1-2 배지 조성 및 배양 조건

500ml용 삼각 플라스크에 밀기울 20 g과 물 30 ml를 부가하여 혼합하고, 면전을 하고 오토클레이브로 멸균한 것을 밀기울 배지로서 사용하고, 28°C에서 9일간 배양했다.

1.3 효소 활성 측정 방법

본 효소 활성의 측정은 상기와 마찬가지의 퍼옥시다제법을 이용하여 420 ㎚의 흡광도의 상승을 측정함으로써 행하였다. 효소 반응은 D-만니톨을 첨가함으로써 개시시켰고, 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-2010을 사용하여 30°C의 반응 조건 하에서 10분간의 시간 변화로 흡광도를 측정하였다. 반응은 표 11과 같이 반응액이 총량 1 ml로 되도록 조제하였다. 1 unit는, 흡광도 420 ㎚에 있어서 1분간에 흡광도가 1 상승하는 효소량으로 정의하였다.

1M의 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)	50㎕
퍼옥시다제(10 units/ml)	100㎕
10mM ABTS	100㎕
0.5M D-만니톨	100㎕
조효소 용액	100㎕
H2O	550㎕
total 1ml

1.4 단백질 정량

단백질의 정량으로는 브래드포드(Bradford)법에 기초하여, 나카라이테크스 가부시키가이샤에서 제조한 프로테인어세이 CBB 용액을 사용하여 행하였다. 검량선의 작성에는 표준 단백질로서 소혈청 알부민을 사용하였다. 흡광도의 측정에는 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-3200을 사용하였다.

1.5 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)

SDS-PAGE는, 분리 겔 15%, 농축 겔 4%로 되도록 조정하고, Lae㎜li의 방법에 따라 행하였다. 분자량 마커는 SIGMA사에서 제조한 Protein Marker Low Range를 사용하였다.

1.6 Native-PAGE와 활성 염색

Native-PAGE는, 분리 겔 15%, 농축 겔 4%로 되도록 조정하고 Davis법에 따라 행하였다. 활성 염색은, 영동 후 겔을 물로 세정한 후, 차광 상태에서 표 11에 나타낸 것과 동일한 조성의 용액에 침지함으로써 행하였다.

1.7 효소 정제

효소 정제는, (1)∼(4)에서는 모두 얼음 위 또는 4°C에서 행하였다. 또한, 완충액은 10 mM의 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)을 사용하였다.

(1) 조효소 용액의 조제

배양 후의 배지에 완충액을 60 ml 부가하여 잘 혼합하고, 얼음 위에서 1시간 이상 정치한 후, 거즈를 사용하여 압착하여, 배지 중의 효소를 추출하였다. 이것을 4°C, 800 r.p.m.으로 10분 원심분리에 의해 미립자를 제거하고, 이것을 조효소 용액으로 하였다.

(2) 50∼70 % 포화 황산암모늄 분획

조효소 용액에 황산암모늄을 우선 50% 포화로 되도록 더하여, 용해한 후 4°C에서 3시간 교반하였다. 이것을 4°C, 8,000 r.p.m.으로 10분 원심분리했다. 이 상청액을 회수하고 70% 포화로 되도록 황산암모늄을 부가하여 용해하고, 4°C에서 하룻밤 교반하였다. 이것을 4°C, 8,000 r.p.m.으로 10분 원심분리하고, 황산암모늄으로 40% 포화로 한 완충액으로 침전을 용해시켰다.

(3) TOYOPEARL Butyl-650M 컬럼 크로마토그래피

황산암모늄으로 40% 포화로 한 완충액으로 평형화한 TOYOPEARL Butyl-650M 컬럼(φ2.0 cm×8.0 cn)에 제공했다. 컬럼은 황산암모늄으로 40% 포화로 한 인산 칼륨 완충액 100 ml로 세정하고, 효소는 완충액 중의 황산암모늄 포화 농도를 30%, 20%를 각 100 ml씩으로 단계적인 변화에 의해 용출하고, 활성이 있는 획분을 회수하였다. 회수한 획분에 포함되어 있는 황산암모늄을 완충액으로 4°C에서, 하룻밤 투석에 의해 제거하였다. 여기서의 흡광도 420 ㎚의 상승은 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-3200을 사용하여, 시간 변화에 의한 측정은 행하지 않고 반응 개시로부터 1분 후의 1점에서의 흡광도의 값을 측정하였다.

(4) TOYOPEARL DEAE-650M 컬럼 크로마토그래피

완충액으로 평형화한 TOYOPEARL DEAE-650M 컬럼(φ1.0 cm×5.0 cm)에 제공했다. 컬럼은 50 ml의 완충액으로 세정하고, 효소는 완충액 중의 염화 나트륨 농도를 0 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM를 각 50 ml씩으로 단계적인 변화에 의해 용출하고, 활성이 있는 부분을 회수하였다. 회수한 획분에 포함되어 있는 염화 나트륨을 완충액으로 4°C에서, 하룻밤 투석에 의해 제거하였다. 여기에서도, 흡광도 420 ㎚의 상승은 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-3200을 사용하여, 시간 변화에 의한 측정은 행하지 않고, 반응 개시로부터 1분 후의 l점에서의 흡광도의 값을 측정하였다.

(5) Hiprep Q XL 컬럼 크로마토그래피

Amicon Ultra-15(Millipore사 제조)를 사용하여 약 1 ml로 농축한 후, 200 ml의 완충액으로 평형화한 Hiprep Q XL(GE Healthcare)에 제공했다. 효소는 완충액 중의 염화 나트륨 농도를 0∼0.5 M로 직선적 농도 구배가 되도록 함으로써 용출하고, 활성이 있는 획분을 회수하였다. 회수한 획분에 포함되는 염화 나트륨을 완충액으로 4°C에서, 하룻밤 투석에 의해 제거했다. 여기서의 흡광도 측정도 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-3200을 사용하여, 반응 개시로부터 1분 후의 흡광도의 값을 측정하였다.

(6) HiLoad 16/10 Superdex 200 prep grade 컬럼 크로마토그래피

0.15 M의 NaCl을 첨가한 완충액 200 ml로 평형화한 HiLoad 16/10 Superdex 200 prep grade GE Healthcare에 제공했다. 여기서의 흡광도 측정은 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-300을 사용하여, 반응 개시로부터 5분 후의 흡광도의 값을 측정하였다.

2. 결과 및 고찰

폴리올 산화 효소의 정제는 TOYOPEARL Butyl-650M 컬럼 크로마토그래피(소수(疏水) 컬럼 크로마토그래피), TOYOPEARL DEAE-650M 컬럼 크로마토그래피(약 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피), Hiprep Q XL 컬럼 크로마토그래피(강 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피), Hiroad 16/10 Superdex 200 prep grade 컬럼 크로마토그래피(겔 여과 컬럼 크로마토그래피)의 순서로 행하였다.

TOYOPEARL Butyl-650M 컬럼 크로마토그래피의 용출 패턴을 도 8에 나타내었다. 30% 포화 황산암모늄에서 1개의 활성의 피크가 인정되므로, 이들 활성이 있는 7∼12까지의 프랙션을 함께 투석한 후, 다음 컬럼 크로마토그래피에 사용하였다. 또한, 20% 포화 황산암모늄으로 변경하여 얼마 되지 않은 45번째 부근의 프랙션에서도 작은 활성 피크를 확인할 수 있었다. 이는 30% 포화 황산암모늄에서 다 용출되지 않았던 효소가 용출된 것으로 여겨진다.

TOYOPEARL DEAE-650M 컬럼 크로마토그래피의 용출 패턴을 도 9에 나타내었다. 100 mM 염화 나트륨으로 용출된 8∼22까지의 프랙션과 150 mM로 용출된40∼52까지의 프랙션에서 2개의 활성의 피크가 인정되었지만, 비활성(比活性)을 비교한 바, 8∼22까지의 프랙션 쪽이 높기 때문에, 이들 프랙션을 함께 투석한 후, Amicon Ultra-15(Millipore사 제조)를 사용하여 약 1 ml로 농축하고, Hiprep Q XL 컬럼 크로마토그래피에 사용하였다. 2개의 피크가 확인되었으므로, 이소자임(isozyme)이나 상이한 효소가 존재하는 것으로 여겨진다.

다음으로, 사용한 Hiprep Q XL 컬럼 크로마토그래피에서는 도 10과 같은 용출 패턴이 되어, 1개의 활성 피크가 인정되었다. 높은 활성이 확인된 프랙션 89∼97의 획분을 함께 투석한 후, Amicon Ultra-15(Millipore사 제조)를 사용하여 약 1 ml로 농축하고, HiLoad 16/10 Superdex 200 prep grade 컬럼 크로마토그래피에 제공하기로 했다. HiLoad 16/10 Superdex 200 prep grade 컬럼 크로마토그래피에서는 도 11에 나타낸 바와 같은 용출 패턴이 되었다. 또한, 정제 과정을 통해 280 ㎚의 흡광도에 의한 단백질의 정량은 Hiprep Q XL 컬럼 크로마토그래피로부터 행하였다. 이는, 조효소 용액에 갈색 색소가 포함되어 있고, TOYOPEARL DEAE-650M 컬럼 크로마토그래피까지 샘플이 착색하고 있기 때문이다. 정제표는 표 12에 나타내었다. 정제한 결과, 수율은 약 0.1%, 정제 배율은 약 3.0배였다.

[7. 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 균주(A주) 유래의 폴리올 산화 효소의 다양한 성질의 해석]

폴리올 산화 효소의 다양한 성질을 전술한 방법에 의해 얻어진 정제 효소 용액을 사용하여 해석하였다.

1. 실험 방법

1.1 순도의 검정

Native-PAGE를 행하고, 활성 염색과 GBB 염색을 각각 행함으로써, 순도의 검정을 행하였다.

1.2 분자량과 서브 유닛 구조의 검토

전술한 바와 같이, 정제의 최종 단계에서 HiLoad 16/10 Superdex 200 Prep grade 컬럼 크로마토그래피(겔 여과 컬럼 크로마토그래피)를 사용하였으므로, 분자량의 산출도 동시에 행하였다. 분자량 마커에는, SIGMA사에서 제조한의 GELFILTRATION MOLECULAR WEIGHT MARKERS의 Cytochrome c, Carbonicanhydrase, Albumin, Alcohol dehydrogenase를 사용하여 효소의 분자량을 측정하였다. 또한, 정제 효소의 SDS-PAGE의 결과로부터, 서브 유닛 구조의 검정을 행하였다.

1.3 온도 안정성의 검토

반응액 조성은 표 11과 거의 동일한 조성으로 하였다. 10°C, 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C에서 검정을 행하였다. 기질은 D-만니톨을 사용하였고, 30°C의 조건하의 반응에 의해 생기는 흡광도 420 ㎚의 상승을 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-2810을 사용하여 측정하였다. 반응액의 총량이 1 ml로 되도록 조제하고, 420 ㎚에 있어서 흡광도가 1분간에 1.0 상승하는 효소량을 1 unit으로 정의하였다.

1.4 pH 안정성의 검토

각 pH의 완충액이 최종 농도 0.1 M이 되도록 효소와 혼합하고, 얼음 위에서 15시간 정치한 후, 잔존 효소 활성을 측정하였다. 각 완충액은 pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0에는 구연산 완충액, pH 6.0, 7.0, 8.0에는 인산 칼륨 완충액, pH 8.0, 9.0에는 글리신 NaOH 완충액, pH 8.0, 9.0, 10.0에는 Tris-HCl 완충액을 사용하였다. 활성은 D-만니톨을 기질로 하여, 30°C의 조건 하에서의 반응에 의해 생기는 흡광도 420 ㎚의 상승을 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-2010을 사용하여 측정하였다. 또한, 반응액 중의 효소 중에는 안정성을 시험하기 위해 부가한 각 pH의 완충액이 포함되어 있다. 반응은 모두 통일한 pH로 행하기 위하여, 반응액에는 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)을 통상의 반응액 조성보다 좀 많을 정도로 더하여, 반응이 pH 8.0의 조건 하에서 안정되도록 했다(표 13).

1M의 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)	100㎕
퍼옥시다제(10 units/ml)	100㎕
10mM ABTS	100㎕
0.5M D-만니톨	100㎕
효소 용액	100㎕
H2O	550㎕
total 1ml

1.5 반응 최적 온도의 검토

반응액 조성은 온도 안정성의 검정과 동일한 조성으로 하였다. 10°C, 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C에서 10분간의 흡광도 420 ㎚의 상승을 각각 측정하였다. 흡광도의 측정에는 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-3208을 사용하였다.

1.6 반응 최적 pH의 검토

반응액 조성을 표 14에 나타내었다. 각 pH의 완충액은, pH 안정성의 검정와 동일한 것을 사용하였다. 반응액을 총량 1 ml이 되도록 조제하고, 반응 용액 중의 완충액 농도는 최종 농도 50 mM이 되도록 조제하였다. 활성은 30°C의 조건 하에서 반응에 의해 생기는 흡광도 420 ㎚의 상승을 히타치에서 제조한 분광 광도계 U-2010을 사용하여 측정하였다. 또한, 반응 용액 중에 효소인 퍼옥시다제가 포함되어 있다. 이 퍼옥시다제에 의한 pH의 영향을 받지 않도록 하기 위하여, 통상보다 퍼옥시다제를 좀 많게 부가하였다.

퍼옥시다제(10 units/ml)	100㎕
10mM ABTS	100㎕
0.5M D-만니톨	100㎕
효소 용액	100㎕
각 완충액 50mM 1ml중

2 결과 및 고찰

본 효소의 다양한 성질을 검토한 바, 하기와 같은 결과를 얻을 수 있었다.

2.1 순도의 검정

도 12에 나타낸 바와 같이, Native-PAGE로 대략 1개의 단백질 밴드가 검출되고, 그 위치는 활성 염색으로 확인할 수 있었던 밴드의 위치와 일치하였다. 이 결과에 의해, 본 효소는 대략 균일하게 정제되었던 것이 시사되었다. 그러나, 대략 균일하게 정제되어 있음에도 불구하고, 정제 배율이 3배로 극히 낮았던 것은 프로테아제의 영향 등에 의해 정제 과정에서의 실활이 원인인 것으로 여겨진다. 그러므로, 본 효소의 정제에는 프로테아제 저해제를 사용하는 등의 방법이 필요한 것으로 여겨진다.

2.2 분자량과 서브 유닛 구조의 검토

도 13에 나타낸 바와 같이, 본 효소의 분자량은 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에서는 약 113 kDa로 산출되고, SDS-PAGE에서는 약 50 kDa와 60 kDa의 위치에 2개의 밴드가 검출되었다. 이러한 결과로부터, 본 효소는 분자량 약 50 kDa와 60 kDa의 서브 유닛으로 구성되는 헤테로다이머 효소인 것이 시사되었다. 기지의 폴리올 산화 효소에서 헤테로다이머 효소에 대한 보고는 없기 때문에, 이 효소의 신규성이 높다고 말할 수 있다.

2.3 온도 안정성의 검토

10°C∼60°C에 있어서, 각각의 안정성을 시험한 바, 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 효소는 30°C 이하에서 안정적인 것이 밝혀졌다. 또한, 40°C에서는 잔존 활성이 약 80%이지만, 50°C 이상에서는 완전히 실활했다.

2.4 pH 안정성의 검토

pH 2.0∼10.0에 있어서, 효소 활성을 측정한 바, 도 15에 나타낸 바와 같이, pH 6.0 이상에서 안정되었다. 또한, pH 9.0에서의 Tris-HCl 완충액에서의 효소 활성이 현저하게 높고, 동일한 pH 9.0의 글리신-NaOH 완충액과 비교하여도 약 2배의 차이가 있었다. 이것을 보면, Tris-HCl 완충액이 본 효소 활성에 어떤 영향을 미치고 있는 것이 시사되었다.

2.5 반응 최적 온도의 검토

10°C∼60°C에 있어서, 도 16에 나타낸 바와 같이 효소 활성을 측정한 바, 40°C가 반응 최적 온도인 것을 알 수 있었다.

2.6 반응 최적 pH의 검토

도 17에 나타낸 바와 같이, pH 2.0∼10.0에 있어서, 각각의 효소 반응액으로 반응을 측정한 바, pH 8.0이 반응 최적 pH인 것을 알 수 있었다. 또한, pH 6.0 이하에서는 전혀 활성이 인정되지 않았다. 또한, pH 안정성의 검토와 마찬가지로, pH 8.0에서의 Tris-HCl 완충액에서의 효소 활성이 현저하게 높고, 동일한 pH 8.0의 글리신-NaOH 완충액과 비교하여도 약 2배의 차이가 있었다. 이것을 보면, Tris-HCl 완충액이 본 효소 활성에 어떤 영향을 미치고 있는 것이 시사되었다. 또한, pH 9.0에서 급격한 활성의 저하를 관찰할 수 있었다. 이는, 퍼옥시다제를 통상의 반응액 조성보다 많이 더하여, 퍼옥시다제에 의한 pH의 영향을 방지하고자 했지만, 퍼옥시다제 활성은 pH 9.0 이상에서 급격하게 저하되므로, 역시 그 영향을 받은 것으로 여겨진다.

2.7 본 산화 효소와 기지의 산화 효소의 다양한 특성의 비교

본 효소와 기지의 폴리올 산화 효소나 밀기울 배지에서 특이적으로 생산되는 산화 효소의 효소학적, 단백질 화학적 다양한 성질을 비교하였다.

기지의 폴리올 산화 효소의 다양한 성질과 본 효소의 다양한 성질을 표 15에 나타내었다. 본 효소는 다른 폴리올 산화 효소에 비해 매우 분자량이 크고, 온도 안정성이 낮다. 또한, 헤테로다이머 효소라는 보고예는 지금까지는 없었다. 이러한 점은 결과적으로 본 효소의 신규성을 더욱 강하게 지지하는 것이다. 또한, 기지의 밀기울 배지에서 특이적으로 생산되는 산화 효소의 다양한 성질과 본 효소의 다양한 성질을 표 16에 나타내었다. pH 안정성이나 반응 최적 온도는 유사하지만, 기지의 폴리올 산화 효소와 비교했을 때와 마찬가지로, 온도 안정성이 다른 산화 효소보다 낮다. 그러나, 본 효소와 같은 페니실륨(Penicillium) 속균 유래의 글루타치온 산화 효소와 글리세롤 산화 효소에서는, 헤테로다이머 효소이며, 이 때문에, 분자량이 크다는 점에서 유사하다. 이러한 사실로부터, 페니실륨(Penicillium) 속균은 밀기울 배양에 있어서 다른 균종에 비해 많은 헤테로다이머 효소를 균체 외에 분비 생산하는 것은 아닐까 여겨진다. 또한, 페니실륨(Penicillium) 속균 유래의 글리세롤 산화 효소에서는, 이 효소는 세포 표면에 결합되어 있는 효소이므로, 효소 추출 시에 계면활성제를 완충액에 첨가함으로써, 효소 활성이 매우 높아진다고 보고되어 있다.

[8. 효소의 기질 특이성]

1 기질 특이성

부분 정제 효소를 사용하여 측정한 본 효소의 기질 특이성은 이하에 나타내는 표 17과 같이 되었다. 검정한 폴리올 중, D-아라비톨, 에리트리톨, D-만니톨, D-소르비톨의 순으로 활성이 높고, 그 외의 폴리올에서는 높은 활성은 관찰되지 않았다.

폴리올 D체의 구조를 도 18에 나타내었다. 검정한 모든 폴리올에서 구조를 비교한 바, 활성이 높은 4개의 폴리올에서 공통 구조가 확인되었다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 본 효소는 피셔의 구조식으로 나타냈을 때, 2번 위치와 3번 위치의 OH기가 오른쪽을 향한 L-에리트로형을 특이적으로 인식하고 있는 것이 시사되었다. 그러나, 이 구조는, 활성이 낮은 리비톨, 알리톨, D-탈리톨에도 관찰된다. 활성이 높은 4개와 이들의 구조를 비교하면, 그 차이는 4번 위치의 OH기가 오른쪽을 향한 L-리보형의 구조인 것을 알 수 있다. 이러한 사실로부터 본 효소는 4번 위치의 OH기가 L-리보형의 구조를 인식할 수 없기 때문에, 이들 리비톨, 알리톨, D-탈리톨에서는 산화 반응이 일어나지 않는 것으로 여겨진다. 기질 특이성, 기질 인식 기구 모두 종래에 보고되어 있는 폴리올 산화 효소와는 상이한 것이며, 본 효소가 신규 산화 효소이다.

2 HPLC에 의한 반응 생성물의 검정

폴리올 산화 효소의 반응 생성물을 HPLC에 의해 해석했다. 그 결과, D-만니톨, D-아라비톨, D-소르비톨을 기질로 했을 때의 생성물이 판명되었다. 에리트리톨은, 4탄당이며, 생성물의 판별이 현단계에서는 곤란하므로 이번에는 해석하지 않았다. D-만니톨로부터는 만노오스의 생산이 확인되었다. 광학 활성에 대해서는 측정하지 않았지만, 기질이 D-만니톨인 것을 생각하면 구조적으로 생성물은 D-만노오스인 것으로 생각된다.

D-아라비톨을 기질로 했을 때의 효소 반응액의 HPLC 분석 결과로부터, D-아라비톨로부터의 생성물이 릭소오스인 것이 판명되었다. 여기서도 생성물의 광학 활성은 측정하고 있지 않지만, 구조적으로 반응 생성물은 D-릭소오스인 것으로 생각된다. 그 반응 구조식을 도 19에 나타내었다. 지금까지 보고되어 있는 폴리올 산화 효소에서는 D-아라비톨의 1번 위치의 수산기가 산화를 받아 D-아라비노스가 생성되고 있었다. 여기서는 스트렙토마이세스(Streptmyces) 속이 생산하는 소르비톨 산화 효소를 예로 들었다. 한편, 본 효소에서는 D-아라비톨의 6번 위치의 수산기의 산화를 촉매하고, 희소당 D-릭소오스를 생성하는 것이 시사되었다. 여기서, HPLC 결과에 있어서 D-아라비톨의 피크의 직전에 1개의 피크를 관찰할 수 있지만, 효소 반응 전에도, 어느 기질에 있어서도 확인되므로 이 피크는 균체 유래의 당 이외의 성분인 것으로 여겨진다.

다음으로, D-소르비톨을 기질로 했을 때의 반응 생성물의 HPLC 해석 결과로부터, D-소르비톨로부터는 굴로스의 생성이 확인되었다. 여기서도 광학 활성에 대해서는 측정하고 있지 않지만, D-소르비톨로부터 생성되고 있으므로, 구조적으로 L-굴로스가 생성되고 있는 것으로 생각된다. 그 반응 구조식을 도 20에 나타내었다. 여기서도 기지의 폴리올 산화 효소인 소르비톨 산화 효소를 예로 든다. 앞서 D-만니톨, D-아라비톨을 기질로 했을 때의 결과와 합하여, 본 효소는 폴리올의 6번 위치의 수산기를 산화하는 효소인 것으로 여겨진다. 지금까지 보고되어 있는 폴리올 산화 효소로 6번 위치의 수산기를 산화하는 효소는 보고되어 있지 않았고, 다시 한 번 본 효소가 신규의 산화 효소인 것이 시사되었다.

여기서, 본 효소가 폴리올의 6번 위치의 수산기의 산화를 촉매한다는 점에서, 이번 HPLC 해석을 행하지 않은 에리트리톨를 기질로 한 산화 반응을 예상했다. 에리트리톨의 6번 위치의 수산기가 산화를 받으면 L-에리트로오스가 생성될 것으로 예상된다. 이러한 사실로부터 본 효소의 산화 반응에 의해, D-릭소오스, L-굴로스, L-에리트로오스의 3개의 희소당이 생성되는 것이 강하게 시사되었다.

이들 희소당의 종래의 생산 방법을 조사한 바, D-릭소오스는 D-글루코오스로부터 D-아라비톨, D-크실로오스로 다단계의 반응을 거쳐, 생산되고 있다(비특허 문헌 2). 또한, 이성화 효소이기 때문에, 생산되는 D-릭소오스가 높은 수율로 얻어진다고는 말하기 어렵다. L-굴로스도 L-소르보스로부터 이성화 효소를 사용함으로써 생산되고 있다. L-에리트로오스는 에리트리톨을 글루코노박터(Gliconobacter) 속의 균주의 세포막 외표층에 존재하는 막결합형 메소-에리트리톨 탈수소산소로 산화 발효함으로서 L-에리트룰로오스를 생성한 후, 이성화 효소를 사용하여 L-에리트로오스를 생산하고 있었다. 이와 같이, 이들 희소당의 생산은 다단계의 반응계를 포함할 뿐만 아니라, 이성화 효소를 사용하는 반응이므로, 100 %의 수율은 바랄 수 없었다. 이 점에 있어서 본 효소는 1단계의 반응으로, 또한 산화 반응의 불가역 반응이므로, 거의 100 %의 수율로 이들 희소당의 대량생산이 가능하게 될 것으로 기대된다.

[9. 폴리올 산화 효소 생산균의 동정(同定)]

폴리올 산화 효소 생산균의 동정을 행하기 위하여, 18S rDNA의 서열을 결정하는 것을 목표로 했다. 18S rDNA는 진균류의 미생물에 특이적으로 관찰되는 구조이며, 방선균이나 박테리아에서는 존재하지 않는 구조이다. 이 18S rDNA의 구조를 도 21에 나타내었다.

1. 실험 방법

1.1 프라이머(primer)의 작성

이번에 작성한 프라이머의 염기 서열을 표 18에 나타내었다.

(1) 18S_F1 프라이머의 작성은, Byssochlamys spp. 동정을 위한 유전자 지표의 평가(비특허 문헌 3, 4)를 참고로 하여 행하였다.

(2) 18S_F2, 및 ITS_R1 프라이머는, 가부시키가이샤 벡스의 홈 페이지(http: //www.bexnet.co.jp/product/microbialprimer. html)를 참고하여 작성하였다.

18S_F1은 18S rDNA의 하류에 있는 넓은 진균류에 공통되는 배열의 영역에, 18S_F2는 ITS 영역에 들어가기 직전의 18S rDNA의 배열의 영역에, ITS_R1은 5.8S 중간 정도에 위치하는 영역에 상동적인 서열이 되도록 작성하였다(도 21).

1.2 PCR 및 시퀀스 반응

(1) 게놈의 조정 방법

1) 액체 배양한 균체를 유발에 넣어 액체 질소를 더하고 갈아서 으깨어 마이크로 튜브로 옮겼다.

2) 600μl의 2% CTAB soln.을 더하여, 전도 혼화(混化)했다.

3) 65°C로 가열하고 히트 블록에 튜브를 옮겨, 30분간 가온하고, 12,000 r.p.m.으로 10분 원심분리했다.

4) 상청액을 회수하고, 거기에 등량(equal amount)의 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)을 더하여, 5분간 천천히 교반한다.

5) 12,000 r.p.m.으로 15분간 원심분리한 후, 상부의 수상(水相)을 회수하였다.

6) 4), 5)를 한번 더 반복하고, 수상을 새로운 튜브로 옮긴다.

7) 1∼1.5 vol.의 1% CTAB soln.을 더하여, 전도 혼화한 후, 1시간 실온에서 정치하고, 8,000 r.p.m.으로 10분간 원심분리했다.

8) 상청액을 버리고, 400μl의 1M CsCl를 더하여, 완전히 용해시켰다.

9) 800μl의 100% 에탄올을 더하여, 전도 혼화한 후, -20°C에서 20분 이상 정치하고, 12,000 r.p.m.으로 5분간 원심분리했다.

10) 상청액을 버리고, 침전에 400μl의 70% 에탄올을 더하여, 12,000 r.p.m.으로 5분간 원심분리했다.

11) 상청액을 버리고, 침전을 진공 건조기로 풍건(風乾)하고, 20μl의 TE 버퍼에서 용해하고, 37°C에서 1시간 처리하였다.

12) 페놀과 클로로포름을 100μl씩 첨가하고, 12,000 r.p.m.으로 10분간 원심분리하고, 상청액을 회수하였다.

13) 등량의 클로로포름을 더하여, 12,000 r.p.m.으로 10분간 원심분리하고, 상청액을 회수하였다.

14) 에탄올 침전을 행하고, 12,000 r.p.m.으로 10분간 원심분리하고, 원심분리한 후, TE 버퍼 30μl로 용해했다.

(2) PCR

18S_F1 프라이머와 ITS_R1 프라이머를 사용하고, (1)에서 얻어진 폴리올 산화 효소 생산균의 게놈 DNA를 템플레이트로 하여 PCR를 행하였다. PCR의 조건은 95°C에서 3분 변성시킨 후, 95°C, 50°C, 75°C를 33 사이클 행하였다. 표 19에 기재된 PCR 반응액을 사용하였다.

(3) 시퀀스 반응

PCR에 의해 증폭된 단편을 전기 영동한 후, 겔 추출을 행하였다. 그 후, 각각의 프라이머를 사용하여 시퀀스 반응을 행하였다(도 21). 시퀀스 반응의 조건은 95°C, 50°C, 75°C를 25 사이클 행하였다. 표 20에 시퀀스 반응액의 조성을 나타낸다.

2. 결과 및 고찰

PCR 후, 아가로스겔로 전기 영동한 결과, 목적 사이즈 단편의 증폭이 확인되었다(도 22). 그러므로, 본 균이 진핵의 사상균인 것이 판명되었다.

시퀀스 반응 후 해석을 행한 결과, 18S_F1을 사용한 시퀀스 반응으로 250 bp, ITS_R1을 사용한 반응으로 180 bp의 염기 서열이 밝혀졌다. 또한, (2) 18S_F2의 시퀀스 반응에 의해 159 bp의 서열이 결정되었다. 각각의 해석의 결과, 폴리올 산화 효소 생산균의 PCR 증폭 단편의 전체 길이는 해독할 수 없었다. 그러나, 각각에서 얻어진 서열과 상동성이 높은 균을 검색한 바, 18S_F1 프라이머를 사용하여 얻어진 250 bp는 94%의 상동성으로 페니실륨(Penicillium) 속(도 23), 93%로 아스페르길루스(Aspergillus) 속과 상동성이 관찰되었다. ITS_R1 프라이머를 사용하여 얻어진 180 bp에서는 90%로 페니실륨(Penicillium) 균과 상동성이 관찰되었다(도 23). 또한 18S_F2를 사용하여 얻어진 159 bp에서는 100 %의 상동성으로 페니실륨(Penicillium) 속과 염기 서열이 일치하였다(도 23). 따라서, 본 균이 페니실륨(Penicillium)속 균인 것이 강하게 시사되었다.

도 24에 폴리올 산화 효소 생산균의 사진과 광학 현미경(×1000)에서의 사진을 나타낸다. 이들의 형태로부터도, 본 균이 페니실륨(Penicillium) 속인 것이 시사되었다.

지금까지 보고되어 있는, 미생물이 생산하는 폴리올의 산화 효소에 있어서, 균체외 효소는 거의 보고되지 않았다. 그 점에서도 본 효소가 신규성이 높은 효소인 것으로 여겨진다.

[산업상 이용가능성]

본 발명은, 신규한 폴리올 산화 효소를 제공하는 것이며, 특히, 희소당에 대하여 기질 특이성을 가지는 것을 특징으로 한다. 희소당은 자연계에는 존재하지 않거나 또는 미량밖에 존재하지 않는 당이다. 그 생산기술이나 생리적 작용, 화학적 성질 등에 대해서는 밝혀지지 않은 점이 많지만, 최근 몇몇 희소당에 대해서는 대량생산 기술의 확립과 함께, 그 생리 활성이 규명되어, 감미료, 농약, 시약, 공업 재료 등 넓은 분야에서의 실용화가 기대되고 있다. 본 발명의 폴리올 산화 효소의 제공은 이러한 산업계의 기대에 부응하는 것으로서, 희소당의 계측, 그것의 효율적인 생산 방법의 새로운 전개에 유용한 수단이 된다.

독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 NITEBP-1156 20111026

Claims (7)

1. Penicillium sp. KU-1(수탁번호 NITE BP-1156)로 이루어지는 미생물을 밀기울 배지에서 배양하여, 얻어지는 배양물로부터 분자량이 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에서 113kDa으로 산출되며, 하기 (a)로부터 (e)에 기재된 성질에 의해 특정되는 폴리올 산화 효소 활성을 가진 단백질을 회수하여,
   D-만니톨, D-아라비톨, D-소르비톨, 에리트리톨로부터 선택되는 당 알코올에 작용시켜, 대응하는 D-만노오스, D-릭소오스, L-굴로스, L-에리트로오스로부터 선택되는 알도오스를 생성시키는, D-만노오스, D-릭소오스, L-굴로스, L-에리트로오스로 부터 선택되는 알도오스를 생산하는 방법:
   (a) 안정 pH는 pH 6.0 이상이며, 반응 최적 pH는 7.0으로부터 9.0이고,
   (b) 작용 온도는 50°C 이하이며, 반응 최적 온도는 40°C이고,
   (c) 분자량이 113 kDa이고,
   (d) 기질 특이성은 폴리올의 2번 위치와 3번 위치의 OH기가 L-에리트로형의 구조를 특이적으로 인식하여 반응하고, 4번 위치의 OH기가 L-리보형인 것은 인식하지 못하고 반응하지 않고,
   (e) 작용은 D-만니톨, D-아라비톨, D-소르비톨, 에리트리톨로부터 선택되는 당 알코올을 산화하고, 대응하는 D-만노오스, D-릭소오스, L-굴로스, L-에리트로오스로부터 선택되는 알도오스를 생성함.
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