CN115927496A - 一种用酿酒酵母生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用酿酒酵母生产γ‑氨基丁酸的方法，该方法包括：步骤S1，在基础培养基中加入酿酒酵母菌种进行发酵，得到酵母乳，酿酒酵母为保藏编号为CCTCC NO：M2016418的酿酒酵母，基础培养基包括：YNB培养基、碳源和氮源；步骤S2，向酵母乳中加入谷氨酸底物进行转化，得到转化液，谷氨酸底物含有L‑谷氨酸、L‑谷氨酸钠中的一种或者两种；步骤S3，分离除去转化液中的酵母细胞，得到γ‑氨基丁酸粗液；步骤S4，将γ‑氨基丁酸粗液进行提纯，得到γ‑氨基丁酸产品。本申请通过采用特定的酿酒酵母完成菌体生长和γ‑氨基丁酸的转化，提升了γ‑氨基丁酸的转化率，得到的GABA生产成本低、应用面广。

Description

一种用酿酒酵母生产γ-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明涉及γ-氨基丁酸的生产方法技术领域，具体而言，涉及一种用酿酒酵母生产γ-氨基丁酸的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，简称GABA)又称4-氨基丁酸，是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，广泛存在于动植物的体内。在人体内，脑组织中的GABA含量最高，大约为0.1-0.6mg/克组织，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质。同时γ-氨基丁酸有许多重要的生理功能，如镇静、抗焦虑、抗抑郁、改善睡眠等。国内外GABA广泛应用于保健食品中，主要用于辅助睡眠。目前，我国的食品法规中，GABA有2处与食品相关，一是用作新资源食品，二是作为食品添加剂中用作合成各类香精的香料原料。γ-氨基丁酸的主要有三种制备方法：化学合成法、植物富集法和微生物转化法。

化学合成法是是最先工业化生产GABA的方法，有脱硫反应法、氨化水解法等多种方法，获得GABA速度快、得率高，成本低。但化学合成法都存在反应不易控制的控制，且如吡咯烷酮等原料为剧毒物质，存在环境污染问题，更不能添加到食品中。

植物富集法主要利用一些特定植物食物，例如茶叶和糙米，进行物理处理或发芽处理等，激发植物组织生长代谢或应激代谢，使植物本身的GABA大量增加。如对绿茶进行二氧化碳等处理后，其GABA含量可以达到2000～3000ppm。该方法原料安全可靠，没有毒副作用。然而该方法生产GABA产量和产品纯度很低，难以分离提取，无法获得高纯度的氨基丁酸产品，从而制约了进一步的工业发展。

微生物转化法是目前应用较多的工业生产方法，包括直接发酵法和全细胞转化法。相比化学合成法和植物富集法，生物转化法生产效率高，条件温和，环境友好，更适合GABA的工业化生产。直接发酵法是通过发酵培养可以产生GABA的微生物，然后从发酵液中分离纯化出GABA，但发酵液成分往往较为复杂，分离纯化方法使生产GABA的成本较高。全细胞转化法是利用微生物细胞，将L-谷氨酸及其钠盐转化为GABA，生产效率更高、转化体系成分更简单，有利于下游纯化GABA。常见转化菌种有大肠杆菌、乳酸菌(希氏乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌等)、酿酒酵母等。

人类食用酿酒酵母或用酿酒酵母加工的食物(如酒、面包、馒头等)已有几千年的历史，其安全性毋庸置疑。但截止目前采用酵母菌来生产GABA的转化率偏低，分离提纯比较困难，主要采用基因编辑的酿酒酵母，或酿酒酵母菌与乳酸菌联合产GABA。

申请号为200580046782.1的中国专利公开了一种异常毕赤酵母生产γ-氨基丁酸的发酵方法，其特征是方法步骤为：将异常毕赤酵母以0.4重量％的接种量接种于5重量％葡萄糖和1重量％谷氨酸的转化液中，45℃培养24h，得到150mg/100ml的γ-氨基丁酸。本专利中涉及的异常毕赤酵母在国内不允许添加到食品中。

申请号为201910488794.3的中国专利公开了一种用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法。通过醋酸锂快速转化法将构建了谷氨酸脱羧酶的重组质粒导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵母细胞。将所述重组酿酒酵母细胞在含L-谷氨酸的培养基中培养并转化，得到γ-氨基丁酸。本专利的酿酒酵母为基因工程菌，在食品中应用受限。

申请号为202110047700.6的中国专利申请公开了一种酿酒酵母以及提高酿酒酵母产γ-氨基丁酸的方法，通过培养、筛选获得产GABA酿酒酵母为发酵微生物，外源添加植物乳杆菌无细胞发酵上清液以提高GABA产量。

现有以酵母为菌种产GABA的技术中，多用酿酒酵母与乳酸乳球菌、乳酸链球菌等乳酸菌进行混合发酵、转化，混合发酵控制难道远大于单一菌种发酵，诸如不同菌种的比例、发酵培养基的调配、发酵过程控制等都是影响发酵及转化率稳定性的因素，且多菌种混合发酵，培养基成分更为复杂，微生物代谢产物多样，将极大提高GABA的后提取和纯化难度，增加生产成本。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种用酿酒酵母生产γ-氨基丁酸的方法，以解决现有技术中采用酿酒酵母生产γ-氨基丁酸转化率偏低、难以分离提纯的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用酿酒酵母生产γ-氨基丁酸的方法，该方法包括：步骤S1，在基础培养基中加入酿酒酵母菌种进行发酵，得到酵母乳，酿酒酵母为保藏编号为CCTCC NO：M2016418的酿酒酵母，基础培养基包括：YNB培养基、碳源和氮源；步骤S2，向酵母乳中加入谷氨酸底物进行转化，得到转化液，谷氨酸底物含有L-谷氨酸、L-谷氨酸钠中的一种或者两种；步骤S3，分离除去转化液中的酵母细胞，得到γ-氨基丁酸粗液；步骤S4，将γ-氨基丁酸粗液进行提纯，得到γ-氨基丁酸产品。

进一步地，步骤S1中发酵的温度为28～33℃，pH值为5.0～5.5，发酵时间为10～20h，优选发酵终点时酵母乳湿重大于150g/L。

进一步地，步骤S1的实施过程中持续向基础培养基中流加碳源和/或氮源，使基础培养基中的碳源质量含量维持在1～20g/L，和/或，氮源质量含量维持在1～10g/L；优选碳源为葡萄糖溶液、水解糖溶液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜中的任意一种或者多种，优选氮源为硫酸铵溶液和氨水中的任意一种或多种。

进一步地，步骤S2中转化的温度为20～55℃，pH值为3.0～6.0，转化时间为10～40h。

进一步地，谷氨酸底物流加进入酵母乳，优选酵母乳中谷氨酸的浓度维持在1～5g/L，进一步优选谷氨酸底物由谷氨酸发酵液或者谷氨酸母液提供。

进一步地，步骤S3中分离的方式为离心分离或板框压滤。

进一步地，步骤S4中提纯包括：步骤S41，对γ-氨基丁酸粗液进行膜过滤，得到γ-氨基丁酸原液；步骤S42，将γ-氨基丁酸原液进行树脂吸附、洗脱，得到γ-氨基丁酸洗脱液；步骤S43，将γ-氨基丁酸洗脱液浓缩至干物质含量为50～65％，得到γ-氨基丁酸浓缩液；步骤S44，将γ-氨基丁酸浓缩液进行结晶、干燥，得到γ-氨基丁酸产品。

进一步地，步骤S41的膜过滤采用陶瓷膜、有机膜、纳滤膜中的任意一种或者多种，优选膜过滤依次采用陶瓷膜、有机膜和纳滤膜进行，进一步优选膜过滤依次采用50～200nm的陶瓷膜、2000～10000Da的有机膜、150～500Da的纳滤膜实现。

进一步地，步骤S42中树脂吸附采用的树脂选自强酸型阳离子交换树脂或者大孔树脂，优选采用离子交换树脂900E、LX-1850、LX1860、LX-1890和LX21SS中的任意一种或者多种；优选采用浓度为0.1～1mol/L的氨水进行洗脱。

进一步地，步骤S44中结晶的溶剂为乙醇含量≥95％的食用酒精，优选结晶时γ-氨基丁酸浓缩液与溶剂的体积比为1:1～5。

应用本发明的技术方案，通过采用特定的酿酒酵母完成菌体生长和γ-氨基丁酸的转化，提升了γ-氨基丁酸的转化率，得到的γ-氨基丁酸粗液可以直接干燥制备成γ-氨基丁酸粗品，可以直接用于生产食品或者保健品；采用本申请的γ-氨基丁酸生产方法，得到的转化液中γ-氨基丁酸含量高，提纯工艺简便，可制备高纯度的γ-氨基丁酸产品。本申请中所涉及的原料或成分明确，或来源于食品加工的副产物，转化菌体明确，所得到的GABA生产成本低、应用面广。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

正如背景技术中所介绍的，现有技术中采用的酿酒酵母生产γ-氨基丁酸转化率偏低，γ-氨基丁酸产品提纯困难，为了解决该问题，本申请提供了一种用酿酒酵母生产γ-氨基丁酸的方法，该方法包括：步骤S1，在基础培养基中加入酿酒酵母菌种进行发酵，得到酵母乳，酿酒酵母为保藏编号为CCTCC NO：M2016418的酿酒酵母(以下称为酿酒酵母FX-2)，基础培养基包括：YNB培养基(无氨基酵母氮源培养基)、碳源和氮源；步骤S2，向酵母乳中加入谷氨酸底物进行转化，得到转化液，谷氨酸底物含有L-谷氨酸、L-谷氨酸钠中的一种或者两种；步骤S3，分离除去转化液中的酵母细胞，得到γ-氨基丁酸粗液；步骤S4，将γ-氨基丁酸粗液进行提纯，得到γ-氨基丁酸产品。

本发明没有采用乳酸菌与酵母菌进行混合发酵，而是通过采用特定的酿酒酵母完成菌体生长和γ-氨基丁酸的转化，提升了γ-氨基丁酸的转化率，得到的γ-氨基丁酸粗液可以直接干燥制备成γ-氨基丁酸粗品，可以直接用于生产食品或者保健品；采用本申请的γ-氨基丁酸生产方法，得到的转化液中γ-氨基丁酸含量高，提纯工艺简便，可制备高纯度的γ-氨基丁酸产品。本申请中所涉及的原料或成分明确，或来源于食品加工的副产物，转化菌体明确，所得到的GABA生产成本低、应用面广。

本申请采用的酿酒酵母FX-2，为现有已知酵母菌种，其拉丁文名为Saccharomycescerevisiae FX-2，于2016年保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO:M2016418。

在制备生产γ-氨基丁酸时，可采用适宜该品种菌体发酵的条件进行发酵，在发酵过程中，需要持续向环境中通入含有氧气的气体，比如空气，同时进行搅拌，使得培养基中的酿酒酵母获得充足的氧气，促进快速生长繁殖，同时排出发酵生成的二氧化碳。在本申请的一些实施例中，步骤S1中发酵的温度为28～33℃，pH值为5.0～5.5，发酵时间为10～20h，使菌种充分生长繁殖。优选发酵终点时酵母乳湿重大于150g/L，酿酒酵母菌种充分繁殖。

本申请采用的培养基均经过灭菌处理，灭菌方法可以采用现有技术的方法，比如过滤除菌、湿热灭菌，本申请不做限定。在本申请的一些实施例中，步骤S1的实施过程中持续向基础培养基中流加碳源和/或氮源，使基础培养基中的碳源质量含量维持在1～20g/L，氮源质量含量维持在1～10g/L，使培养基中的碳源或者氮源的浓度避免出现大幅波动，使菌种稳定生长保持稳定，防止由于碳源或者氮源含量过高出现反馈抑制；优选碳源为葡萄糖溶液、水解糖溶液、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜中的任意一种或者多种，优选氮源为硫酸铵溶液、氨水中的一种或多种。

在步骤S2中，酿酒酵母将L-谷氨酸或者L-谷氨酸钠转化为γ-氨基丁酸，该过程中继续保持通气和搅拌，转化的温度、pH值等环境条件可以与步骤S1相同，也可以根据现有技术进行调整，在本申请的一些实施例中，调整步骤S2中转化的温度为20～55℃，pH值为3.0～6.0，转化时间为10～40h，该条件下，γ-氨基丁酸转化率高，转化液中副产物少，尤其是在该发酵温度范围时，不仅γ-氨基丁酸转化效果好，而且转化液颜色较浅，便于后续提纯处理，制得的γ-氨基丁酸品相好。其中，pH值可以通过现有技术中酵母发酵过程中的pH值调节方法进行调节，比如加入酸、碱以及pH值缓冲剂，也可以通过调节谷氨酸和谷氨酸钠的比例进行调节。

谷氨酸底物可以一次性加入，也可以分批加入，加入前进行灭菌处理；谷氨酸底物可以依据现有技术配制，比如，纯品L-谷氨酸或L-谷氨酸钠制成水溶液。在本申请的一些实施例中，谷氨酸底物流加进入所述酵母乳，优选所述酵母乳中谷氨酸的浓度为1～5g/L，谷氨酸底物采用流加的方式加入，可以保持转化液中谷氨酸含量稳定，使酿酒酵母处在较为稳定的环境中，具有较高的转化效率，且副产物少。进一步优选谷氨酸底物由谷氨酸发酵液或者谷氨酸母液提供，其中谷氨酸母液为谷氨酸发酵液提取谷氨酸晶体后的残留液。采用谷氨酸发酵液或者谷氨酸母液作为谷氨酸底物，可以实现对谷氨酸发酵液或者残留液的充分利用，并且可以有效降低生产成本。

由于γ-氨基丁酸是酿酒酵母的代谢产物，大部分存在于转化液中，在步骤S3，将转化液中的酵母细胞除去，得到γ-氨基丁酸粗品，分离转化液中的酵母细胞可以采用现有的细胞分离手段，比如离心分离或板框压滤。干燥后的γ-氨基丁酸粗品中的成分对人类无害，可以直接用于调味品或者保健品生产。

为了获得高纯度的γ-氨基丁酸，可以对γ-氨基丁酸粗品进一步提纯，提纯方法可以从现有技术中进行选择。在本申请的一些实施例中，步骤S4中提纯包括：步骤S41，对γ-氨基丁酸粗液进行膜过滤，得到γ-氨基丁酸原液；步骤S42，将γ-氨基丁酸原液进行树脂吸附、洗脱，得到γ-氨基丁酸洗脱液；步骤S43，将γ-氨基丁酸洗脱液浓缩至干物质含量为50～65％，得到γ-氨基丁酸浓缩液；步骤S44，将γ-氨基丁酸浓缩液进行结晶、干燥，得到γ-氨基丁酸产品，通过以上的提纯处理，γ-氨基丁酸的纯度被大幅提高。

上述步骤S41中膜过滤使用的膜可以从现有技术中进行选择，比如选自陶瓷膜、有机膜、纳滤膜中的任意一种或者多种，可以选择一种膜多次进行过滤，也可以使用不同的膜依次进行过滤，在本申请的一些实施例中，膜过滤依次采用陶瓷膜、有机膜和纳滤膜进行；优选地，首先采用50～200nm的陶瓷膜进行一级过滤，取透过清液，然后采用2000～10000Da的有机膜进行二级过滤，仍然取透过清液，最后采用150～500Da的纳滤膜进行三级过滤，取截留液得到γ-氨基丁酸原液。其中三级过滤也可以采用电渗析、薄层层析、树脂等技术也可以达到相同或相似的效果。

上述步骤S42中选择能够有效吸附γ-氨基丁酸并且便于洗脱的各类树脂，并选择可以用于食品药品生产的洗脱剂进行洗脱，在本申请的一些实施例中，树脂吸附采用的树脂选自强酸型阳离子交换树脂或者大孔树脂，优选采用离子交换树脂900E、LX1860、LX-1850、LX-1890、LX21SS等，分离效果改善比较显著。对应地，优选采用浓度为0.1～1mol/L的氨水进行洗脱。

上述步骤S43中对γ-氨基丁酸洗脱液进行浓缩，可以从现有的浓缩手段中进行选择，比如多效蒸发，能够有效保持物料原效，不破坏分子结构，且节能效果显著。优选三效或四效蒸发，最高温度65～75℃，压力25～40kPa。

上述步骤S44将γ-氨基丁酸浓缩液进行溶解重结晶，可以进行一次或者多次，或者对结晶产物进行洗涤。在本申请的一些实施例中，结晶的溶剂为乙醇含量≥95％的食用酒精，结晶的溶剂为乙醇含量≥95％的食用酒精，优选结晶时γ-氨基丁酸浓缩液与溶剂的体积比为1:1～5，晶体再用食用酒精洗涤1～2次。对湿晶体进行脱水干燥，得到γ-氨基丁酸产品，在一些实施例中γ-氨基丁酸产品为白色晶体颗粒。

下面将结合实施例和对比例进一步说明本申请一种用酿酒酵母生产γ-氨基丁酸的方法的有益效果。

下面的实施例和对比例中所用的实验材料与设备的制造厂商名称如下：

以下实施例中使用的酵母均为酿酒酵母FX-2(保藏编号为CCTCC NO:M2016418)。

实施例1

(1)培养基配置：配置20g/L的YNB培养基、20g/L的硫酸铵溶液、50g/L葡萄糖溶液、50g/L的L-谷氨酸溶液，过滤除菌或湿热灭菌备用；

(2)发酵：每升硫酸铵溶液中加入100ml YNB溶液，接种酵母种子，保持通气和搅拌，温度控制在28℃，pH 5.0。向发酵罐中缓慢流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖含量维持在15～20g/L，发酵20h，发酵液菌体湿重156g/L，得到酵母乳。

(3)转化：继续保持通气和搅拌，向酵母乳中流加L-谷氨酸溶液，使转化液中的L-谷氨酸含量维持在1～2g/L，用1M的氢氧化钠溶液调节pH为6.0，温度20℃，转化40h，获得转化液，转化液中γ-氨基丁酸的含量为25.8g/L，转化液颜色为浅黄色。

(4)除菌体：将转化液采用5000rpm，离心10分钟除去酵母细胞，分离上清为含有GABA的粗液；

(5)膜过滤：将GABA粗液经三级膜过滤，一级膜为50nm陶瓷膜，取透过清液；二级膜为10000Da的有机膜，取透过清液；三级膜为150Da纳滤膜，取截留液获得GABA原液；

(6)树脂吸附：采用阳离子交换树脂LX1860吸附，用0.1％的氨水洗脱，收集洗脱液；

(7)浓缩：采用三效蒸发压力25Kpa，温度65℃，将洗脱液浓缩至干物质50％的浓度；

(8)结晶：70℃水浴，往浓缩液中按体积比1:5加入乙醇含量为95％的食用酒精，搅拌冷却至室温进行结晶，晶体再用乙醇洗涤1次；

(9)干燥：湿晶体干燥得到白色γ-氨基丁酸晶体颗粒，测的水分1.2％，γ-氨基丁酸98.5％。

实施例2

1)培养基配置：配制20g/L的YNB培养基、20g/L的硫酸铵溶液、50g/L水解糖溶液、50g/L的L-谷氨酸钠溶液，过滤除菌或湿热灭菌备用；

(2)发酵：每升硫酸铵溶液中加入100ml YNB溶液，接种酵母种子，保持通气和搅拌，温度控制在30℃，pH 5.2。向罐中缓慢流加水解糖溶液，使发酵液中的水解糖含量维持在10～15g/L，发酵15h，发酵液菌体湿重152g/L，得到酵母乳。

(3)转化：继续保持通气和搅拌，向酵母乳中流加L-谷氨酸钠溶液，使转化液中的L-谷氨酸钠含量维持在3～4g/L，加1M的盐酸调节pH为5.0，温度30℃，转化25h，获得转化液，转化液中γ-氨基丁酸的含量为31.1g/L，转化液颜色为浅黄色。

(4)除菌体：将转化液采用12000rpm，离心2分钟除去酵母细胞，分离上清为含有GABA的粗液；

(5)膜过滤：将GABA粗液经三级膜过滤，一级膜为50nm陶瓷膜，取透过清液；二级膜为5000Da的有机膜，取透过清液；三级膜为500Da纳滤膜，取截留液获得GABA原液；

(6)树脂吸附：采用阳离子交换树脂LX1850吸附，用1％的氨水洗脱，收集洗脱液；

(7)浓缩：采用三效蒸发将GABA原液浓缩至干物质60％的浓度；

(8)结晶：75℃水浴，往浓缩液中按体积比1:4加入乙醇含量为95％的食用酒精，搅拌冷却至室温进行结晶，晶体再用乙醇洗涤1次；

(9)干燥：湿晶体干燥得到白色γ-氨基丁酸晶体颗粒，测的水分0.8％，γ-氨基丁酸98.8％。

实施例3

(1)培养基配置：配置20g/L的硫酸铵溶液、50g/L甘蔗糖蜜溶液、50g/L的谷氨酸钠发酵液溶液，过滤除菌或湿热灭菌备用；

(2)发酵：向硫酸铵溶液中接种酵母种子，保持通气和搅拌，温度控制在33℃，pH5.5。向罐中缓慢流加甘蔗糖蜜溶液，使发酵液中的甘蔗糖蜜含量维持在5～10g/L，发酵10h，发酵液菌体湿重158g/L，得到酵母乳。

(3)转化：继续保持通气和搅拌，向酵母乳中流加谷氨酸发酵液溶液，使转化液中的L-谷氨酸含量维持在4～5g/L，用1M的盐酸调节pH为4.0，温度45℃，转化15h，获得转化液，转化液中γ-氨基丁酸的含量为32.0g/L，转化液颜色为黄色。

(4)除菌体：将转化液采用板框压滤除去酵母细胞，滤液为含有GABA的粗液；

(5)膜过滤：将GABA粗液经三级膜过滤，一级膜为50nm陶瓷膜，取透过清液；二级膜为2000Da的有机膜，取透过清液；三级膜为500Da纳滤膜，取截留液获得GABA原液；

(6)树脂吸附：采用阳离子交换树脂LX1890吸附，用5％的氨水洗脱，收集洗脱液；

(7)浓缩：采用三效蒸发将GABA原液浓缩至干物质65％的浓度；

(8)结晶：往浓缩液中按体积比1:3加入乙醇含量为95％的食用酒精，搅拌冷却至室温进行结晶，晶体再用乙醇洗涤2次；

(9)干燥：湿晶体干燥得到白色γ-氨基丁酸晶体颗粒，测的水分1.0％，γ-氨基丁酸98.3％。

实施例4

(1)培养基配置：配置20g/L的硫酸铵溶液、50g/L甜菜糖蜜溶液、50g/L的谷氨酸钠发酵母液溶液，过滤除菌或湿热灭菌备用；

(2)发酵：向硫酸铵溶液中接种酵母种子，保持通气和搅拌，温度控制在33℃，pH5.5。向罐中缓慢流加甜菜糖蜜溶液使发酵液中的甜菜糖蜜含量维持在1～5g/L，发酵15h，发酵液菌体湿重162g/L，得到酵母乳。

(3)转化：继续保持通气和搅拌，向酵母乳中流加谷氨酸发酵母液溶液，使转化液中的L-谷氨酸含量维持在2～3g/L，用1M的盐酸调节pH为3.0，温度55℃，转化10h，获得转化液，转化液中γ-氨基丁酸的含量为32.1g/L，转化液颜色为黄色。

(4)除菌体：将转化液采用板框压滤在0.3Mpa的压力下除去酵母细胞，滤液为含有GABA的粗液；

(5)膜过滤：将GABA粗液经三级膜过滤，一级膜为50nm陶瓷膜，取透过清液；二级膜为2000Da的有机膜，取透过清液；三级膜为300Da纳滤膜，取截留液获得GABA原液；

(6)树脂吸附：采用阳离子交换树脂LX1890吸附，用10％的氨水洗脱，收集洗脱液；

(7)浓缩：采用三效蒸发将GABA原液浓缩至干物质60％的浓度；

(8)结晶：往浓缩液中按体积比1:2.5加入乙醇含量为95％的食用酒精，搅拌冷却至室温进行结晶，晶体再用乙醇洗涤2次；

(9)干燥：湿晶体干燥得到白色γ-氨基丁酸晶体颗粒，测的水分0.6％，γ-氨基丁酸纯度为99.1％。

实施例5

与实施例2的不同之处在于：转化时的温度为20℃；转化液中γ-氨基丁酸的含量为28.9g/L，转化液颜色为浅黄色；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.2％，纯度为99.6％。

实施例6

与实施例2的不同之处在于：转化时的温度为55℃；转化液中γ-氨基丁酸的含量为32.5g/L，转化液颜色为黄色；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.3％，纯度为99.6％。

实施例7

与实施例2的不同之处在于：转化时的pH值为3；转化液中γ-氨基丁酸的含量为25.5g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.4％，纯度为99.1％。

实施例8

与实施例2的不同之处在于：转化时的pH值为6；转化液中γ-氨基丁酸的含量为30.2g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.3％，纯度为99.5％。

实施例9

与实施例2的不同之处在于：转化时间为40h；转化液中γ-氨基丁酸的含量为34.0g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.3％，纯度为99.4％。

实施例10

与实施例2的不同之处在于：转化时间为10h；转化液中γ-氨基丁酸的含量为24.7g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.2％，纯度为99.6％。

实施例11

与实施例1的不同之处在于：结晶时往浓缩液中按体积比1:1加入乙醇含量为95％的食用酒精；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.2％，纯度为99.7％。

实施例12

与实施例1的不同之处在于：结晶时往浓缩液中按体积比1:6加入乙醇含量为95％的食用酒精；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.4％，纯度为98.6％。

实施例13

与实施例1的不同之处在于：发酵时的温度控制为25℃，发酵液菌体湿重为134g/L；转化液中γ-氨基丁酸的含量为21.5g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.4％，纯度为98.7％。

实施例14

与实施例1的不同之处在于：发酵时的pH值为7，发酵液菌体湿重为112g/L；转化液中γ-氨基丁酸的含量为8.4g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.3％，纯度为52.3％。

实施例15

与实施例1的不同之处在于：发酵时间为25h，发酵液菌体湿重为159g/L；转化液中γ-氨基丁酸的含量为25.3g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.3％，纯度为99.0％。

实施例16

与实施例3的不同之处在于：发酵时间为8h，发酵液菌体湿重为110g/L；转化液中γ-氨基丁酸的含量为13.3g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.3％，纯度为98.2％。

实施例17

与实施例1的不同之处在于：转化时的温度为60℃；转化液中γ-氨基丁酸的含量为2.2g/L，转化液颜色为黄褐色；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.2％，纯度为45.4％。

实施例18

与实施例1的不同之处在于：转化时的温度为70℃；转化液中γ-氨基丁酸的含量为0.9g/L，转化液颜色为深褐色；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.4％，纯度为20.8％。

实施例19

与实施例4的不同之处在于：转化时的pH值为2.5；转化液中γ-氨基丁酸的含量为12.0g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.3％，纯度为98.6％。

实施例20

与实施例1的不同之处在于：转化时间为50h；转化液中γ-氨基丁酸的含量为26.2g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.3％，纯度为96.6％。

实施例21

与实施例1的不同之处在于：在膜过滤阶段，用薄膜层析代替采用纳滤的第三级过滤；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.2％，纯度为99.4％。

实施例22

与实施例1的不同之处在于：在膜过滤阶段，用电渗析代替采用纳滤的第三级过滤；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.3％，纯度为98.2％。

实施例23

与实施例1的不同之处在于：流加葡萄糖溶液的同时以流加的形式加入硫酸铵溶液，使发酵液中硫酸铵的含量维持在3～5g/L，发酵液菌体湿重为143g/L；转化液中γ-氨基丁酸的含量为25.0g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.2％，纯度为98.9％。

实施例24

与实施例3的不同之处在于：向酵母乳中流加L-谷氨酸溶液，使转化液中的L-谷氨酸含量维持在6～7g/L。转化液中γ-氨基丁酸的含量为13.2g/L，转化液颜色为黄色；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.8％，纯度为73.0％。

对比例1

与实施例1的不同之处在于：采用的酿酒酵母为CCTCC NO：M205127，发酵液菌体湿重为143g/L；转化液中γ-氨基丁酸的含量为1.8g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.3％，纯度为28.9％。

对比例2

与实施例1的不同之处在于：采用的酿酒酵母为CCTCC NO：M2021941，发酵液菌体湿重为144g/L；转化液中γ-氨基丁酸的含量为1.5g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.2％，纯度为26.5％。

对比例3

与实施例1的不同之处在于：采用的酿酒酵母为CCTCC NO：M2016418，发酵液菌体湿重为148g/L；转化液中γ-氨基丁酸的含量为2.0g/L；得到的γ-氨基丁酸晶体颗粒水分为0.2％，纯度为32.2％。

从以上的描述中，可以看出，通过采用特定的酿酒酵母完成菌体生长和γ-氨基丁酸的转化，提升了γ-氨基丁酸的转化率，得到的γ-氨基丁酸粗液可以直接干燥制备成γ-氨基丁酸粗品，可以直接用于生产食品或者保健品；采用本申请的γ-氨基丁酸生产方法，γ-氨基丁酸的转化率高，提纯工艺简便，可制备高纯度的γ-氨基丁酸产品。本申请中所涉及的原料或成分明确，或来源于食品加工的副产物，转化菌体明确，所得到的GABA生产成本低、应用面广。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用酿酒酵母生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤S1，在基础培养基中加入酿酒酵母菌种进行发酵，得到酵母乳，所述酿酒酵母为保藏编号为CCTCC NO：M2016418的酿酒酵母，所述基础培养基包括：YNB培养基、碳源和氮源；

步骤S2，向酵母乳中加入谷氨酸底物进行转化，得到转化液，所述谷氨酸底物含有L-谷氨酸、L-谷氨酸钠中的一种或者两种；

步骤S3，分离除去转化液中的酵母细胞，得到γ-氨基丁酸粗液；

步骤S4，将所述γ-氨基丁酸粗液进行提纯，得到γ-氨基丁酸产品。

2.根据权利要求1所述的生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S1中所述发酵的温度为28～33℃，pH值为5.0～5.5，发酵时间为10～20h，优选发酵终点时酵母乳湿重大于150g/L。

3.根据权利要求2所述的生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S1的实施过程中持续向所述基础培养基中流加碳源和/或氮源，使基础培养基中的碳源质量含量维持在1～20g/L，和/或，氮源质量含量维持在1～10g/L；优选所述碳源为葡萄糖溶液、水解糖溶液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜中的任意一种或者多种，优选所述氮源为硫酸铵溶液和氨水中的任意一种或多种。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S2中转化的温度为20～55℃，pH值为3.0～6.0，转化时间为10～40h。

5.根据权利要求4所述的生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述谷氨酸底物流加进入所述酵母乳，优选所述酵母乳中谷氨酸的浓度维持在1～5g/L，进一步优选所述谷氨酸底物由谷氨酸发酵液或者谷氨酸母液提供。

6.根据权利要求1所述的生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述分离的方式为离心分离或板框压滤。

7.根据权利要求1所述的生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S4中所述提纯包括：

步骤S41，对γ-氨基丁酸粗液进行膜过滤，得到γ-氨基丁酸原液；

步骤S42，将γ-氨基丁酸原液进行树脂吸附、洗脱，得到γ-氨基丁酸洗脱液；

步骤S43，将γ-氨基丁酸洗脱液浓缩至干物质含量为50～65％，得到γ-氨基丁酸浓缩液；

步骤S44，将γ-氨基丁酸浓缩液进行结晶、干燥，得到γ-氨基丁酸产品。

8.根据权利要求7所述的生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S41的所述膜过滤采用陶瓷膜、有机膜、纳滤膜中的任意一种或者多种，优选所述膜过滤依次采用陶瓷膜、有机膜和纳滤膜进行，进一步优选所述膜过滤依次采用50～200nm的陶瓷膜、2000～10000Da的有机膜、150～500Da的纳滤膜实现。

9.根据权利要求7所述的生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S42中所述树脂吸附采用的树脂选自强酸型阳离子交换树脂或者大孔树脂，优选采用离子交换树脂900E、LX-1850、LX1860、LX-1890和LX21SS中的任意一种或者多种；优选采用浓度为0.1～1mol/L的氨水进行洗脱。

10.根据权利要求7所述的生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤S44中所述结晶的溶剂为乙醇含量≥95％的食用酒精，优选所述结晶时所述γ-氨基丁酸浓缩液与所述溶剂的体积比为1:1～5。