JPS63105690A - トレハロ−ズジミコ−ル酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、トレハローズジミコール酸の製造法に関し、
さらに詳細には、微生物を用いたトレハローズジミコー
ル酸の製造法に係わる。

トレハローズジミコール酸は、結核菌のコードファクタ
ーとして知られており、微生物性アジュバントでたんば
く質に対する免疫反応を促進する化合物である（Ｇｒａ
ｎｇｅｒ＋Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、＋Ｉｍｍｕｎｏ１．＋Ｖ
ｏｌ。

１１６、阻４Ｂ２．１９７６）　　。

〔従来技術１発明が解決しようとする問題点〕従来、ト
レハローズジミコール酸は、結核菌から抽出、精製され
ている。しかしながら、結核菌は病原菌であり、かつ、
生育増殖速度の極めて遅い菌であり、この菌を用いてト
レハローズジミコール酸を工業的に生産することは不可
能に近い。

本発明者は、トレハローズジミコール酸の工業的生産を
可能ならしめるために、トレハローズジミコール酸を生
産し、非病原菌であり、生育増殖速度が速く、メタノー
ルなどの合成物質をも資化し得る微生物の取得を目的と
した。

〔問題を解決するための手段２作用〕 本発明者は、トレハローズジミコール酸を工業的な生産
を可能とするために、トレハローズジミコール酸を菌体
内に含有し、非病原菌で、生育増殖速度が速く、合成物
質をも資化し得る微生物を見出すべく鋭意研究を重ねた
結果、非病原菌で、生育増殖速度が速く、メタノールを
も資化し得る新菌種であるミコバクテリウム　メタノリ
カがトレハローズジミコール酸を含有することを見出し
、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ミコバクテリウム属に属しメタノ
ールを資化し、かつ、トレハローズジミコール酸を生産
する細菌を培養して菌体を得、得られた菌体からトレハ
ローズジミコール酸を分離回収することを特徴とするト
レハローズジミコール酸の製造法である。

本発明に用いられる細菌は、ミコバクテリウム属に属し
、炭素源として少なくともメタノールを資化しろる細菌
であれば特に制限はないが、本発明者が発見した新菌種
であるミコバクテリウムメタノリカに属する菌株が好ま
しい。この新菌種はその菌学的性質によれば、ミコバク
テリウム属に属する細菌とみられるが、ミコバクテリウ
ム属に属する公知の菌種と比較した場合に種々の点で相
違があり、新菌種と断定され、ミコバクテリウム　メタ
ノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｔａｎｏｌ
ｉｃａ）と命名された。

この新菌種に属する細菌のうち代表的な菌株であるミコ
バクテリウム　メタノリカＢＴ−８４（微工研菌寄第８
８２３号）、同ＢＴ−１４３（微工研菌寄第８８２４号
）、同Ｐ−２３（微工研菌寄第８８２５号）、同Ｐ−２
６（微工研菌寄第８８２６号）および同Ｐ−８５（微工
研菌寄第８８２７号）のそれぞれの菌学的性質を示す。

菌学的性質 （１）顕微鏡的形態 肉汁液体培地および肉汁寒天培地で３７℃で３日間培養
した。

■　細胞の形状および大きさ 通常は短桿菌。幅０．５〜０．８μ、長さ１〜３μ。■
型の分裂細胞が認められる。

■　運動性　　　　なし。

■　胞子の有無　　生産されない。

■　ダラム染色　　ダラム陽性 ■　抗酸性　　　　陽性 （２）各種の培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養　３７℃で３日間培養。

中程度の生育を示す。

コロニーの形状：外形は円形、大きさは２〜３ｍ、隆起
は半球状、構造は均質１表面は粗面２辺縁は波状１色は
黄白色で光沢なし、透明度は不透明、硬度はバク−質。

■　メタノール含有寒天平板培養 ３７℃で３日間培養。

肉汁寒天平板培養と同じ。

■　肉汁寒天斜面培養 ３７℃で３日間培養。

接種線に一様に中程度な生育を示す。

隆起は中程度２表面は粗面１辺縁は波状。

色は黄白色で光沢なし、透明度は不透明。

硬度はバター質。

■　メタノール含有寒天斜面培養 ３７℃で３日間培養。

肉汁寒天斜面培養と同じ。

■　肉汁液体培養　３７℃で３日間培養。

白クリーム色の菌環を形成する。また、皮膜を形成する
。

■　ペプトン水液体培養　３７℃で３日間培養。

肉汁液体培養と同じ。

■　メタノール含有液体培養 ３７℃で３日間培養。旺盛に生育する。

白クリーム色の菌環を形成する。また、皮膜を形成する
。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養 ２０℃で４週間培養。

生育する。しかし、ゼラチン液化性はない。

■　リドマスミルク培養　３７℃で４週間培養。

生育し、培養液はアルカリに変化（ｐＨ６，８→ｐＨ８
，３）するが、ペプトン化はしない。

［相］　１坏小川培地培養　３７℃で３日間培養。

旺盛に生育する。集落性状はスムースであある。

ＯＨＡ培地（塩酸ヒドロキシルアミン５００μｇ／ｍｌ
添加１％小川培地）培養 ３７℃で５日間培養。

旺盛に生育する。

＠　　ＰＡＳ培地（パラアミノサリチル酸ナトリラム２
■／　ｍ　Ａ添加１％小川培地）培養３７℃で７日間培
養。

旺盛に生育し、培地が黒変する。

Ｐ−２３株のみ培地の黒変はみられない。

■　ピクリン酸培地（０，２％ピクリン酸添加変法５ａ
ｕｔｏｎ寒天培地）培養 ３７℃で２週間培養。

旺盛に生育し、培地が赤褐色となる。

Ｐ−２３株のみ培地が赤褐色にならない。

＠　　ＰＮＢ培地（パラニトロ安息香酸５００μｇ／ｍ
β添加１％小川培地）培養 ３７℃で７日間培養。

旺盛に生育する。

＠　　ＥＢ培地（エタンブトール５μｇ／ｒｎβ添加１
％小川培地）培養 ３７℃で７日間培養。

旺盛に生育する。

（３）生理学的性質 ■　硝酸塩の還元 硝酸塩を亜硝酸塩に還元する。

■　ＭＲテスト　　　　　　陰性 ■　ＶＰテスＩ・　　　　　　陰性 ■　インドールの生成　　　陰性 ■　硫化水素の生成　　　　陽性 ■　でんぷんの加水分解　　陰性 ■　窒素源の利用 アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、およびペプトンを窒素
源として利用する。

■　色素の生成　　　　　　生成しない。

■　ウレアーゼ　　　　　　陽性 ［相］　カタラーゼ　　　　　　陽性 ■　アンモニアの生成　　　生成する。

＠　脱窒反応　　　　　　　陰（’１ ０　オキシダーゼ反応　　　陰性 ■　Ｃ）−Ｆテスト　　　　　陰性 ［相］　生育の範囲 ｐｌ＋５〜９の範囲で生育する。ｐＨＧ〜８が好ましい
。

５℃、４３℃で生育しない。２５〜４０℃が好ましい。

［相］　酸素に対する態度　　　好気性（以下余白） ［相］　耐塩性 ３重量％ＮａＣ１含有培地で旺盛に生育する。

６重量％ＮａＣ１含有培地で、ＢＴ−８４，ＢＴ−１４
３株は弱く生育するが、Ｐ−２３，Ｐ−２６，Ｐ−８５
株は生育しない。

［相］　ビタミン要求性　　　　なし ■　光発色試験　　　　　　陰性 ■　暗発色試験　　　　　　陰性 ［相］　ツイーン８０水解試験　　陰性［相］　ミコー
ル酸の含有　　　陽性 ［相］　ＧＣ（グアニン＋シトシン）含量ＢＴ−８４６
６，２ｍｏ１％ ＢＴ−１４３６６，２ｍｏ１％ Ｐ−２３６７，２ｍｏ１％ Ｐ−２６６６，８ｍｏ１％ Ｐ−８５６８，７ｍｏ１％ ［相］　主要な菌体脂肪酸組成物 直鎖脂肪酸　　　　Ｃ＋６ｔ。

モノ不飽和脂肪酸　Ｃｌ６１１＋　　Ｃ＋ａ＋＋１０メ
チル脂肪酸　　１０−ｍｅｔｈｙｌ　Ｃ＋９＋。

■　キノンタイプ　　　メナキノン　ＭＫ−９（Ｈｚ）
［相］　細胞壁の構造　　　ｍｅｓｏ−ジアミノピメリ
ン酸を含有する。

［相］　分離源　　　　　　土壌 バージイズ　マニュアル　オン　デターミネイティブ　
バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）第８版〔編集者ブソキャナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ）
　＋ギボンズ（Ｇｉｂｂｏｎｓ）　＋コワン（Ｃｏｗａ
ｎ）　＋ホルト０（ｏｌｔ）、　　リストン（Ｌｉｓｔ
ｏｎ）　＋ムレー（Ｍｕｒｒａｙ）　−ニイヴン（Ｎｉ
ｖｅｎ）、ラヴイン（Ｒａｖｉｎ）およびスタニイア（
Ｓｔａｉｎｉｅｒ）　：ウィリアムス　アンド　ゥィル
キンス社（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、　
（１９７４））によると、これらの菌株は、桿菌であり
、運動性がなく、ダラム陽性であり、抗酸性であり、ミ
コール酸を含有し、好気的であることから、ミコバクテ
リウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属するもの
と判断した。このことは、ＧＣ含量。

菌体脂肪酸組成、キノン・タイプおよび細胞壁の構造の
点からも支持される。

しかしながら、ミコバクテリウム属に属する公知の菌種
と比較すると、メタノールをはじめとする各々の炭素源
の資化性、炭素化合物からの酸の生成、耐塩性、生育温
度などの点から一致するものは見当たらない。また、ミ
コバクテリウム属に属する細菌でメタノール資化能を有
する細菌は見出されてはおらず、この新菌種が最初であ
る。

実験方法は前記のバージイズ　マニュアルおよび医科学
研究所学友全編［細菌学実習提要Ｊ　（１９５８）に従
った。

また、メタノール含有寒天平板培地、メタノール含有寒
天斜面培地として次の組成のものを使用した。すなわち
、（Ｎ■＊）ｚｓＯａ　３ｇ、　Ｋｌ（２ＰＱ４１，４
ｇ。

Ｎａ２ＨＰＯａ　２．１ｇ、　ＭｇＳＯ４４ＨｚＯ０，
２ｇ、　ＣＣａＣ１２４ｔ（ｚＯ３０，ＦｅＣｂＨｓＯ
ｔ・ＸＨｔ０３０ｗ、　ＭｎＣ１ｚ・４ＬＯ５ｗＺｎ５
Ｏａ・７Ｈｚ０５ｍｇ＋　Ｃｕ５Ｑｓ−５ＨｔＱ　０．
５ｑおよびディフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製寒天（バントア
ガー　Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）１５ｇを純水ＩＣに溶解
し、これをｐ）ｌ　７．１に調整し１ｋｇ　／　ｃＪＧ
で２０分間殺菌したのち、メタノール１０ｇを無菌的に
添加し、平板培地あるいは斜面培地を形成し、また、メ
タノール含有液体培地としては、前記の培地において、
寒天を添加しないものを用いた。

分離源の土壌からのこの新菌種に属する細菌の分離は、
前記のメタノール含有寒天平板培地を用い常法で行った
。

本細菌（本発明で使用される細菌　以下同様）の培養に
使用する培地は、本細菌が資化し得る炭素源を少なくと
も含有していることを要し、さらに適量の窒素源および
無機物などを含有する培地ならば合成培地および天然培
地のどちらでもよい。

炭素源としては、本細菌が資化しうる炭素源であれば特
に制限はないが、メタノール、エタノールなどの合成炭
素源を好適に使用しうるが、その他の炭素源−たとえば
、グルコース、フラクトース、ソルビトール、マンニト
ールおよびイノシトールなどの糖類、糖蜜、ペプトンお
よび酵母エキスなどの糖含有物などの天然物、また、こ
はく酸などの有機酸なども使用することができる。これ
らのうち、工業用の醗酵原料としては、メタノ−ルが最
も好ましい。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素
源の種類により適宜選択される。たとえば、培養液のメ
タノールの濃度は６重量％以下が好ましく、菌の生育お
よび増殖の良好さからは３重量％以下が好ましい。

窒素源としては、たとえば、アンモニウム塩。

硝酸塩などの無機窒素化合物および／または、たとえば
、尿素、コーン・ステイープ・リカー、カゼイン、ペプ
トン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用
いられる。

また、無機成分としては、たとえば、カルシウム塩、マ
グネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、りん酸塩、
マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩。

モリブデン塩、コバルト塩、はう素化合物およびよう素
化合物が用いられる。

培養条件は、温度２０〜４２°Ｃ１好ましくは２５〜４
０℃、ｐＨ５〜９．好ましくは６〜８である。このよう
な条件で好気的に培養を行う。これらの条件をはずれて
培養した場合には、本細菌の増殖は悪くなるが、これら
の条件をはずして培養することを妨げない。

また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通
常は、０．５〜２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通
気量を調節したり、攪拌したり、酸素を使用したり、ま
た、培養槽内の圧力を高めるなどの手段が採用される。

また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれで
もよい。

窒素源としてアンモニウム塩を使用した場合には、培養
期間中にアンモニアが菌体生成のために消費されて培養
液のｐＨが低下する。この場合に、培養液のｐＨを所定
の値に保つために、アンモニア。

苛性カリ、苛性ソーダなどのアルカリを添加することが
好ましい。

このようにして、細菌を培養したのち、菌体を培養液か
ら分離する。分離には通常の固液分離手段が採用される
。たとえば、培養液そのものをそのまま遠心分離すると
の手段、培養液中に本細菌よりも大きい他の微生物の細
胞を濾過助剤として加えたり、あるいは、プレコートす
ることにより培養液から菌体を濾過分離するとの手段、
培養液に種々の凝集剤を加えて菌体を凝集させてこれを
濾過あるいは遠心分離により培養液から菌体を分離する
との手段、培養液のｐＨを５以下にすることにより、あ
るいは、ｐＨを５以下にしさらに５０−１００℃で加熱
することにより菌体を凝集させ、これを濾過あるいは遠
心分離にかけ菌体を分離するとの手段などを適用しうる
。分離された菌体は、そのまま、もしくは乾燥された後
、トレハローズジミコール酸の分離１回収、精製が行わ
れる。

菌体からのトレハローズジミコール酸の分離。

回収、トレハローズジミコール酸の精製は常法によって
行われる。

たとえば、培養液から遠心分離によって回収された湿菌
体そのまま、もしくは乾燥菌体にクロロホルム・メタノ
ール（２：１容量比）の混合溶媒をを加えてホモジナイ
ズし、これに少量の水を加えて静置して層分離させる。

クロロホルム・メタノール層を分取し、濃縮する。濃縮
物をクロロホルム・メタノール（２：１容量比）の混合
溶媒に溶解し、シリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ）　
Ｇ　（ＡＮＡＬＴＥＣＨ社製）の薄層にスポットし、ク
ロロホルム・メタノール・アセトン・酢酸（９０：１０
：６：１容量比）の混合溶媒で展開する。薄層を風乾し
、ヨードを反応させ、Ｒｆ　Ｏ，１９〜０．２６のトレ
ハローズジミコール酸を含むシリカゲルを剥ぎ取り、こ
れからクロロホルム・メタノール（２：１容量比）の混
合溶媒を用いてトレハローズジミコール酸を溶出させる
。この操作を数回繰り返して精製を行う。

また、精製をより効率よく行うために、クロロホルム・
メタノール（２：１容積比）の混合溶媒による抽出物を
、たとえば、シリカゲルおよびフロリジルならびにハイ
ポーラスポリマーのような多孔性樹脂などを用いたカラ
ムクロマトグラフィにかける方法も有効である。

菌体から得られたトレハローズジミコール酸の同定、定
量には、一般に薄層クロマトグラフィお　　　　　　　
゛よびトレハローズジミコール酸を糖とミコール酸とに
分解したのち、この両者をガスクロマトグラフィおよび
質量分析などによって分析することによっておこなわれ
る。

〔実施例〕

実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。なお
、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１ 純水１１あたり、ＪＨｚＰＯ４１，４ｇ、　（ＮＨ４）
ｚｓＯ４３ｇ、ＮａＪＰＯ４２，１ｇ　＋Ｍｇ５Ｏｎ、
−７ＨｚＯＯ，２ｇ　＋　ＦｅＣＪｓＯｔ・ｘＬｏ　３
０　ｍｇ、ＣａＣ１ｇ・２Ｈｚ０３０　■、ＺｎＳ’Ｏ
４−７０２０５ｗ、Ｍｎｃｌｚ・４ＨｚＯ５ｎｗおよび
ＣｕＳＯ４・５ＨｚＯＯ，５■およびメタノール８ｒｎ
ｌを溶解し、ｐＩ（７，１に調整した培地（培地Ｂ）３
００−を１１容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分
間殺菌した。培地Ｂを用いて３０℃で３日間前培養され
たミコバクテリウム　メタノリカ　ＢＴ−８４の培養液
を培地Ｂに１容量％接種し、３０℃で回転振とう培養を
行った。　培養開始後、４８時間で培養液中のメタノー
ル濃度はＯ，０Ｏｈｔ％以下となった。

この培養液を遠心分離し、菌体０．４５ｇ　（乾物換算
）を得た。この菌体からクロロホルム・メタノール（２
：１容量比）の混合溶媒で抽出し、この抽出液からシリ
カゲル薄層を用いてトレハローズジミコール酸を精製し
て０．８■を取得した。

実施例２ 純水Ｈあたりグルコース５ｇ、ペプトン５ｇおよび酵母
エキス５ｇを溶解し、ｐＨ７，０に調整した培地（ＰＹ
Ｇ培地）３００ｍＡを１７！容三角フラスコに入れ、１
２０℃で２０分間殺菌した。ＰＹＧ培地を用いて３０℃
で３日間前培養したミコバクテリウムメタノリカＢＴ−
１４３の培養液をＰＹＧ培地を入れたＩβ容三角フラス
コに１容量％接種し、３０℃で回転振とう培養を行った
。３６時間培養を行い、得られた培養液を遠心分離し、
菌体０．６ｇ　（乾物換算）を得た。この菌体からクロ
ロホルム・メタノール（２：１容量比）の混合溶媒で抽
出し、この抽出液からシリカゲル薄層を用いてトレハロ
ーズジミコール酸を精製し、１■を取得した。

〔発明の効果〕

本発明によりトレハローズジミコール酸を安全に、しか
も、効率よく工業的に生産することが可能となった。

特許出願人三菱瓦斯化学株式会社 代表者　長野　和書

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ミコバクテリウム属に属しメタノールを資化し、かつ、
   トレハローズジミコール酸を生産する細菌を培養して菌
   体を得、得られた菌体からトレハローズジミコール酸を
   分離回収することを特徴とするトレハローズジミコール
   酸の製造法