JPS62228288A - 醗酵法による２−ケト−ｌ−グロン酸の製造法 - Google Patents

醗酵法による２−ケト−ｌ−グロン酸の製造法

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JPS62228288A
JPS62228288A JP61251130A JP25113086A JPS62228288A JP S62228288 A JPS62228288 A JP S62228288A JP 61251130 A JP61251130 A JP 61251130A JP 25113086 A JP25113086 A JP 25113086A JP S62228288 A JPS62228288 A JP S62228288A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 軌泉北Ａ杜皿生顎 本発明は、Ｌ−アスコルビン酸合成の中間体として有用
な２−ケト−Ｌ−グロン酸の、醗酵法による製造法、お
よびこの製造法に用いるシュードグルコノバクター属菌
に関する。
従来の技術 Ｌ−アスコルビン酸合成の中間体として宜用な２−ケト
−Ｌ−グロン酸は、工業的に確立されたいわゆるライヒ
シュタイン法［ヘルベチ力・キミ力・アクタ（Ｈｅｌｖ
ｅｔｉｃａ　　Ｃｈｉｍｉｃａ　　Ａｃｔａ）第Ｌ巻、
３１１頁、（１９３４）コによって生産されてきた。し
かし、この方法は工程数も多く、条令の溶媒を必要とし
現代の工業技術として満足すべき乙のではない。また一
方でライヒンユタイン法に代イつる方法として、主に微
生物を使った方法がいくつか提案されてきている。例え
ばグルコースを微生物的に酸化して５−ケト−Ｄ−グル
コン酸を生成什しめ、これを化学的、または微生物的に
還元してＬ−イドン酸とし、これをまた微生物的に酸化
して２−ケト−Ｌ−グロン酸を得る方法［米国特許第２
，４２１，６１１号］さらにはグルコースを微生物的に
酸化して、２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸とし、これ
をさらに微生物的、化学的に２−ケト−Ｌ−グロン酸に
する方法［特公昭３１−１４４９３．特公昭５３−２５
０３３．特公昭５Ｇ−１５８７７、特公昭５９−３５９
２０］が検討されてきた。
発明が解決しようとしている問題点 しかしこれらの方法に用いられる化学的還元工程即ち、
前者の５−ケト−Ｄ−グルコン酸のＬ−イドン酸への一
元と後者の２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の２−ケト
−Ｌ−グロン酸への還元は立体特異性に問題があり、そ
れぞれ前者ではＤ−グルコン酸、後者では２−ケト−Ｄ
−グルコン酸を副生じ収率の低下をきたす。また前記の
還元を微生物で行う場合は、還元エネルギー源として余
分の糖質を微生物に供給せねばならずやはり収率の低下
をもたらすものである。この点し一ソルボースを出発原
料とする場合は酸化工程のみで２−ケト−Ｌ−グロン酸
を製造することができる。
事実この方向をとる試みがグルコノバクタ−属。
シュードモナス属、セラチア属、アクロモバクター属お
よびアルカリ土類金属の細菌を用いてなされている。［
バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング
　（Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　ａｎｄＢ　ｉｏ
ｅｎｇｉｎ’ｅｅｒｉｎｇ）第１４巻、７９９頁、（１
９７２）。
特公昭４１−１５９．特公昭４１−１６０．米国特許第
３，０４３，７４９号、特公昭４９−３９８３８、中国
微生物学報、第２０巻、第２４６頁（１９８０）および
第２１巻、第１８５頁（１９８１）コしかしこれまでに
公表された菌株の成績は充分な収率が得られていず、工
業的に利用されるには程遠いものであった。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、この様な事情に鑑み、工業的に有ｆｌＩ
な２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造法につき種々研究を行
った結果、和歌両県の土壌資料から分離した細菌、に５
９１ｓ株、滋賀県の土壌資料から分離した細菌、１２−
５株、１２−１５株、１２−４株および２２−３株が従
来の知見を晶かに上溜る収率でＬ−ソルボースを２−ケ
ト−■７−グロン酸に変換し、また分類学的研究の結果
、これまでに知られない新しい細菌であることを見い出
し、本発明を完成するにいたった。
すなわち、本発明は、（１）シュードグルコノバクタ−
属に属し、Ｌ−ソルボースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に
酸化する能力を有する微生物またはその処理物を、Ｌ−
ソルボースに接触させて２−ケ１−ＩＬ−グロン酸を生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸の製造法、（２）シュードグルコノバ
クタ−属に属し、Ｌ−ソルボースを２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸に酸化する能力を有する微生物をし一ソルボースに
接触させて２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成蓄積せしめる
に際し、バチルス属、シュードモナス属、プロテウス属
、シトロバクター属、エンテロバクタ−嘱、エルウィニ
ア属、キサントモナス属、フラボバクテリウム属、ミク
ロコツカス属またはエシェリヒア属に属する微生物のう
ち少なくと６１種を存在させることを特徴とずろ２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸の製造法、および（３）好気性細菌で
、補酵素Ａの存在下に生育するシュードグルコノバクタ
−・サッカロケトゲネスである。
前記５菌株のうちに５９１ｓ；Ｉ　２−５両画株の分類
学的性状は次の通りである。
（ａ）形　態 （１）桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０．７〜
１．４μｍ０ （２）細胞の多形性は認められない。
（３）運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を存する。
（４）胞子を形成しない。
（５）ダラム陰性。
（６）非抗酸性。
（ｂ）生育の状態 （ｉ）肉汁寒天平板培養：殆ど生育しない。酵母エキス
添加肉汁寒天平板培養では円形。
金縁、平滑、乳白色。
（２）酵母エキス添加肉汁寒天斜面：生育中程度、糸状
、平滑、乳白色。
（３）酵母エキス添加肉汁液体培養：生育中程度、培地
全体を均一に混濁する。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養二上部のみ微弱に生育。ゼ
ラチンは液化しない。
（５）リドマスミルク−酸性化する。凝固する。
（ｃ）生理学的性質 （１）硝酸の還元は微弱であるが陽性。
（２）脱窒反応は認められない。
（３）メチルレッド（ＭＲ）テストは陽性。
（４）フォーゲス・プロスカラエル（ＶＰ）テストは陰
性。
（５）インドールを生成しない。
（６）硫化水素を生成しない。
（７）デンプンを加水分解しない。
（８）クエン酸の利用性は陰性。
（９）アンモニウム塩を利用する。
（１０）色素の生成は認められなし）。
（１１）ウレアーゼを生成する。
（１２）オキシダーゼは陽性。
（１３）カタラーゼは陽性。
（１４）１６〜３６°Ｃで生育し、至適生育温度は２４
〜３４°（：’ｏｐＨ５，５〜８．７で生育し、至適生
育ｐＨは６．０〜７．５゜（１５）好気性。
（１６）ヒユー・ライフソンのＯＦテストで糖の分解は
酸化的。
（Ｌ）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マン
ノース、麦芽糖、シヨ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−マ
ンニトール、グリセロールから酸を生成するが、 ガスは生成されない。
Ｄ−ソルビトール、イノントール、デンプンから酸、ガ
スの生成は認められない。
（ｄ）その他の性質 （１）エタノールから微弱ではあるが酢酸を生成する。
（２）ビオチン、チアミン、リボフラビンおよび補酵素
Ａ（以下ＣｏＡと称することらある）を生育に要求する
。
（３）グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生
成する。
（４）Ｄ　Ｎ　Ａのグアニン＋シトシン含量は６７±１
モル％。
（５）イソプレンユニット数１０のユビキノン（ＣｏＱ
　＋　ｏ）を有する。
（６）し−ソルボースから著量の２−ケト−Ｌ−グロン
酸を生成する。
（７）ストレプトマイシンに耐性を有する。
ついで１２−１５１Ｊｅの分類学的性状は以下の通りで
ある。
（ａ）形　態 （１）桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０、　７
〜１．４μｍ０ （２）細胞の多形性は認められない。
（３）運動性を何し、２〜４本の極鞭毛を有す（４）胞
子を形成しなし１゜ （５）ダラム陰性。
（６）非抗酸性。
（ｂ）生育の状聾 （１）肉汁寒天平板培養：殆ど生育しない。酵母エキス
添加肉汁寒天平板培養では円形。
金縁、平滑、乳白色。
（２）酵母エキス添加肉汁寒天斜面：生育中程度、糸状
、平滑、乳白色。
（３）酵母エキス添加肉汁液体培養：生育中程度、培地
全体を均一に’６７、、Ｅする。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養二上部のみ微弱に生育。ゼ
ラチンは液化しない。
（５）リドマスミルク：酸性化するｈ＜　凝固り、　す
い。
（ｃ）生理学的性質 （１）硝酸の還元は陰性。
（２）脱窒反応は認められない。
（３）メチルレッド（ＭＲ）テストは陽性。
（４）フォーゲス・プロスカラエル（ＶＰ）テストは陰
性。
（５）インドールを生成しない。
（６）硫化水素を生成しない。
（７）デンプンを加水分解しない。
（８）クエン酸の利用性は陰性。
（９）アンモニウム塩を利用する。
（１０）色素の生成は認められない。
（１１）ウレアーゼを生成する。
（１２）オキシダーゼは陽性。
（１３）カタラーゼは陽性。
（１４）２３〜３２℃で生育し、至適生育温度は２８〜
３２℃。ｐＨ６，０〜７．５で生育し、至適生育１）　
Ｉ−１は６．５〜７，１０（１５）好気性。
（１６）ヒユー・ライフソンのＯＦテストで糖の分解は
酸化的。
（Ｌ）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マン
ノース、麦芽糖、ンヨｕ、乳Ｍ、トレハロース、グリセ
ロールから酸を生成するが、ガスは生成されない。
Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、イノシトール、
デンプンから酸、ガスの生成は認められない。
（ｄ）その他の性質 （１）エタノールから微弱ではあるが酢酸を生成する。
（２）ビオチン、チアミン、リボフラビンおよびＣｏＡ
を生育に要求する。
（３）グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生
成する。
（４）Ｄ　Ｎ　Ａのグアニン＋シトシン含量は６７±１
モル％。
（５）イソプレンユニット数１０のユビキノン（ＣＯＱ
ＩＯ）を有する。
（６）Ｌ−ソルボースから著量の２−ケト−Ｌ−グロン
酸を生成する。
（７）ストレプトマイシンに耐性を有する。
また１２−４株の分類学的性状を記載すると次の通りで
ある。
（ａ）形　態 （１）桿菌。細胞の大きさは０．３〜０，５×０．７〜
１．４μｍ。
（２）細胞の多形性は認められない。
（３）運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を有する。
（４）胞子を形成しない。
（５）ダラム陰性。
（６）非抗酸性。
（ｂ）生育の状態 （＋）肉汁寒天平板培養：微少コロニーとしてのみ生育
し、充分な観察はできない。酵母エキス添加肉汁寒天平
板培養では円形。
金縁１平滑、乳白色。
（２）酵母エキス添加肉汁寒天斜面：生育中程度、糸状
、平滑、乳白色。
（３）酵母エキス添加肉汁液体培養：生育中程度、培地
全体を均一に混濁する。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培ａ：上部のみ微弱に生育。ゼ
ラチンは液化しない。
（５）リドマスミルク：酸性化するが凝固しない。
（ｃ）生理学的性質 （１）硝酸の還元は陰性。
（２）脱窒反応は認められない。
（３）メヂルレッド（ＭＲ）テストは陽性。
（４）フォーゲス・プロスカラエル（ＶＰ）テストは陰
性。
（５）インドールを生成しない。
（６）硫化水素を生成する。
（７）デンプンを加水分解しない。
（８）クエン酸の利用性は陰性。
（９）アンモニウム塩を利用する。
（１０）色素の生成は認められない。
（１１）ウレアーゼを生成する。
（１２）オキシダーゼは陽性。
（１３）カタラーゼは陽性。
（１４）１６〜３６℃で生育し、至適生育温度は２４〜
３４℃。ｐＨ５，５〜８．２で生育し、至適生育ｐＨは
６．０〜７．５゜（１５）好気性。
（１６）ヒユー・ライフソンのＯＦテストで糖の分解は
酸化的。
（Ｌ）　Ｌ−アラビノース、Ｄ−キンロース、Ｄ−グル
コース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マ
ンノース、麦芽糖、シヨ糖、乳糖、トレハロース、グリ
セロールから酸を生成するが、ガスは生成されない。
Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、イノシトール、
デンプンから酸、ガスの生成は認められない。
（ｄ）その他の性質 （＋）エタノールから微弱ではあるが酢酸を生成する。
（２）ビオヂン、ヂアミンおよびリボフラビンとＣｏＡ
またはパントテン酸を生育に要求する。
（３）グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生
成する。
（４）Ｄ　Ｎ　Ａのグアニン十ノドシン含量は６７±１
モル％。
（５）イソプレンユニット１１０のユビキノン（ＣｏＱ
ｌｏ）を有する。
（６）Ｌ−ソルボースから著量の２−ケト−Ｌ−グロン
酸を生成する。
（７）ストレプトマイシンに耐性を有する。
さらに２２−３株の分類学的性状は次の通りである。
（ａ）形　態 （＋）桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０．７〜
１．４μｍ０ （２）細胞の多形性は認められない。
（３）連動性を存し、２〜４本の極鞭毛を有する。
（４）胞子を形成しない。
（５）ダラム陰性。
（６）非抗酸性。
（ｂ）生育の状態 （１）肉汁寒天平板培養：微少コロニーとじてのみ生育
し、充分な観察はできない。酵母エキス添加肉汁寒天平
板培養では円形。
金縁、平滑、乳白色。
（２）酵母エキス添加肉汁寒天斜面：生育中程度、糸状
、平滑、乳白色。
（３）酵母エキス添加肉汁液体培養：生育中程度、培地
全体を均一に混濁する。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：上部のみ微弱に生育。ゼ
ラチンは液化しない。
（５）リドマスミルク：酸性化するが凝固しない。
（ｃ）生理学的性質 （１）硝酸の還元は微弱であるが陽性。
（２）脱窒反応は認められない。
（３）メチルレッド（ＭＩＺ）テストは陽性。
（４）フォーゲス・プロスカラエル（ＶＰ）テストは陰
性。
（５）インドールを生成しない。
（６）硫化水素を生成しない。
（７）デンプンを加水分解しない。
（８）クエン酸の利用性は陰性。
（９）アンモニウム塩を利用する。
（１０）色素の生成は認められない。
（Ｉｌ）ウレアーゼを生成する。
（１２）オキシダーゼは陽性。
（１３）カタラーゼは陽性。
（１４）　１６〜３８℃で生育し、至適生育温度は２４
〜３４℃。ｐＨ５，５〜８，７で生育し、至適生育ｐＨ
は６．０〜７，８゜（１５）好気性。
（１６）ヒユー・ライフソンのＯＦテストで糖の分解は
酸化的。
（Ｌ）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マン
ノース、麦芽糖、シヨ糖、乳糖、トレハロース、グリセ
ロールから酸を生成するが、ガスは生成されない。
Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、イノシトール、
デンプンから酸、ガスの生成は認められない。
（ｄ）その他の性質 （１）エタノールから微弱ではあるが酢酸を生成する。
（２）ヒオヂン、チアミンおよびリボ′フラビンとＣｏ
Ａまたはパントテン酸を生育に要求する。
（３）グリセロールからハイドロオキシアセトンを生成
する。
（４）Ｄ　Ｎ　Ａのグアニン＋シトンン含量は６７±１
モル％。
（５）イソプレンユニット数１０のユビキノン（ＣｏＱ
ｌｏ）を有する。
（６）Ｌ−ソルボースから著ｍの２−ケト−Ｌ−グロン
酸を生成する。
（７）ストレプトマイシンに耐性を有する。
以上土壌分離細菌５味の分類学的諸性質を、バーシーズ
・マニュアル・オブ・デタミネーティブ俸バクテリオロ
ノー　　（Ｂ　ｅｒｇｅｙ’　ｓ　　　ｍａｎｕａｌｏ
ｒＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）　　第８版（１９７４年）およびバーノーズ・
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロノ
ー（Ｂｅｒ　−ｇｅｙ’ｓ　　ｍａｎｕａｌ　　ｏｒＳ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第
１０（１９８４年）に照合してみると、５菌株即ち、Ｋ
５９１ｓ株、＋２−５株、＋２−１．５株。
１２−４株と２２−３株は、ダラム陰性、極鞭毛を存す
る運動性桿菌で、好気性、オキシダーゼ陽性であること
からシュードモナス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細
菌種と一応は考えられる。生育因子を要求すること、Ｄ
ＮＡのグアニンとシトシンとの総含量が６７±１モル％
であること、キノン系はイソプレンユニット［１０のユ
ビキノンであることから、この属のセクション■のＲＮ
Ａグループ■に属するシュードモナス・ディミニュタ　
（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｉｍｉｎｕｔａ）、シュ
ードモナス・ベシキュラリス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　　ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）に類似している。
しかしながらエタノールから微弱ながらも酢酸を生成す
ること、グリセロールからジハイドロオキシアセトンを
生成することはシュードモナス属菌の性質とは異なる。
これらの性質は、グルコノバクタ−（Ｇ　１ｕｃｏｎｏ
−ｂａｃｔｅｒ）　　属菌種のそれである。しかしまた
これ等５菌株はオキシダーゼテストが陽性であること、
ｐｌ−１４，５では生育できないこと、糖（力源）を含
まない酵母エキス添加肉汁培地またはペプトン−酵母エ
キス培地でよく生育出来ること、ＤＮＡグアニンとシト
シンとの総含量が６７±１モル％であること等の性質は
グルコノバクタ−属の菌種のそれとは異なる。
従って、これら５菌株即ち、Ｋ５９１ｓ株、１２−５株
、１２−１５１末、１２−４株と２２−３株は既知の属
に該当するものを見い出だすことが出来ず新しい属の新
菌種とみなさざるを得ない。そこでに５９１ｓ株、＋２
−５＋７８，１２−１５株、１２−４株と２２−３株の
５菌株はシュードグルコノバクター・サツ力ロケトゲネ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓａｃｃ
ｈａｒｏｋｅｔｏｇｃｎｅｓ）と命名された。
ここでこれ等５菌株の栄養要求性について触れると、Ｋ
５９１ｓｒＪｅ、１２−５株およびｌ　２−．１５株は
ＣｏＡを生育に要求する珍しい性質を存している。これ
ら３株のＣｏＡ要求性はノくントテン酸によって代替す
ることは出来ない。一方１２−４株と２２−３株はＣｏ
Ａ存在下においてもノくントテン酸存在下においてら生
育出来る。
以下、これらのシュードグルコノバクタ−・サツ力ロケ
トゲネスを酸化菌と称することらある。
本発明に用いられる菌株は上記した５菌株は勿論のこと
、例えば、５菌株を紫外線やＸ線照射しり＃）　、Ｎ　
−メチル−Ｎ　’−二トローＮ−ニトロソグアニジンに
トロソグアニジン）、メチルメタンスルホン酸、ナイト
ロジエンマスタードの様な変異誘起剤で処理して得られ
る変異株も有利に用いられる。その例としてシュードグ
ルコノバクタ−・ザッカロケトゲネスに５９１ｓからニ
トロソグアニジン処理に上って誘導されたＴ１１１４−
８６株を挙げることができる。ＴＨ＋４−８６株はＬ−
ソルボースから２−ケト−Ｌ−グロン酸生成能が増強さ
れている他は、親株であるに５９１ｓ株と同じ分類学的
性質を示した。
上記シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスに
５９１ｓ株、１２−５株およびＴＭ０１−８６株は、昭
和６０年（１９８５年）９月１９日に、シュードグルコ
ノバクタ−・サツ力ロケトゲネス１１−１５株、＋２−
４株および２２−３株は、昭和６０年（１９８５年）１
２月１６日にＩＦｏ　　１４４６４ＪＦｏ　　１４４６
５．　　ＩＦＯ１４４６６、１ＦＯ１４４８２，ＩＦＯ
１４４８３、および［Ｆｏ、１４．４８４としてそれぞ
れ寄託され、またシュードグルコノバクタ−・サッカロ
ケトゲネスに５９１ｓ株、Ｉ　２−５株およびＴＨＩ　
４−８６株は、昭和６０年ＩＯ月７日に、シュードグル
コノバクタ−・サッカロケトゲホス１２−１５株、Ｉ　
２−４株および２２−３株は昭和６０年１２月２０日に
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）
に受託番号ＦＥＲＭＰ−８４８１，ＦＥＲＭ　　Ｐ−８
４８０，ＦＥＲＭ　　Ｐ−８４７９，ＦＥｆｌＭ　　Ｐ
−８５７７、ＦＥＲＭ　　Ｐ−８５７６およびＦＥＲＭ
　　Ｐ’−８５７８としてそれぞれ寄託され、該寄託が
ブダペスト条約に基づく寄託に切換えられて、下記に示
す受託番号として同研究所に保管されている。
本発明においては、Ｌ−ソルボースを含有する培地に前
記の菌を培養してもよく、またＬ−ソルボースに前記の
菌の菌体処理物を作用させてもよい。
本発明で用いられる「菌体処理物」とは、前記の閑を培
養して得られる培養物の洗／′Ｐ菌体、アセトンパウダ
ー、ポリアクリルアミドゲルまたはに一カラギーナン包
括固定化菌体などをいう。
原料のし一ソルボースを培地に加えるに際し、使用全量
を培養当初から培地に添加してもよいし、全量を何回か
に分けて、または連続的に培養液に加えてもよい。
Ｌ−ソルボースと前記の微生物とを接触させて行う反応
における反応液中のし一ソルボースの濃度は、培地に対
して３〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは５〜２５％（ｗ
／ｖ’）である。
し−ソルボースと菌体処理物とを接触させる方゛　法と
しては、たとえば、菌体処理物に■７−ソルボース、２
−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｌ新
液（＋）Ｈ６，５，０，５Ｍ）およびＣａＣＯ３を加え
、水で希釈して三角フラスコ中で振盪させる方法が挙げ
られろ。
Ｌ−ソルボースと前記の微生物の処理物を接触させて行
なう反応における反応液中のし一ソルボースの濃度は、
ｏ、ｔ〜ｔｏ％（ｗ／ｖ）、好ましくは０３〜３％（ｗ
／　ｖ）である。微生物の処理物の量は、処理前の乾燥
菌体量として１〜３０　ｍｇ／　ｍ１２である。反応液
のｐＩ（は、約５．５〜７．５に調整され、反応温度は
、約２０〜４０℃１反応時間は約１〜１００時間である
。
本発明においてシュードグルコノバクタ−属細菌をＬ−
ソルボースを含有する液体培地に培養し、２−ケト−Ｌ
−グロン酸を培養液中に生成蓄積せしめろ場合に、本酸
化菌シュードグルコノバクター属細菌を単独で培養する
よりも、本酸化菌とは別種の細菌を混在させると、２−
ケト−Ｌ−グロン酸の蓄積量が顕著に増加する。
混在させる菌としては、例えば、バチルス属。
シュードモナス属、プロテウス属、シトロバクター属、
エンテロバクタ−属、エルウィニア属、キサントモナス
属およびフラボバクテリウム属等に属する閑が挙げられ
、さらに具体例として下記に示す菌が挙げられる。
バチルス・セレウス　（Ｈ３ａｃｉｌｌｕｓ　　　ｃｅ
ｒｅｕｓ）ＩＦＯ３１３１ バチルス・リケニホルミス　（Ｉ３ａｃｉｌｌｕｓ　　
ｌｉｃｈｅ−ｎｉｆｏｒｍｉｓ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏｌ　２
２０１バチルス・メガテリウム　（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ
　　ｍｅｇａｔｅ−ｒｉｕｍ）　　Ｔ　Ｆ　ＯＩ　２１
０８バヂ／Ｉｚス−プミルス　（Ｂａｃｔｌｌｕｓ　　
ｐｕｍｉｌｕｓ）ＩＦＯ１２０９０ バチルス・アミロリケファシエンス　（Ｂ　ａｃｉｌｌ
ｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ４ａｃｉｅｎｓ）　　Ｉ　Ｆ
　Ｏ３０２２バチルス・ズブチリス　（Ｂ　ａｃｉｌｌ
ｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＦＯ１３７１９ バチルス・サーキュランス　（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　　
ｃｉｒｃｕ−１ａｎｓ）　　Ｉ　Ｆ　０　３９６７ シユードモナス・トリホリ　（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　ｔｒｉ−ｆｏｌｉｉ）　　ｒＦｏ　　１２０５６シ
ユードモナス・マルトフィリア（ｒ’　ｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）　　Ｔ　Ｆ　Ｏｌ　２
０９２プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓ
　　１ｎ−ｃｏｎｓｔａｎｓ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏｌ　２９
３０シトロバクタ−・フロインディ　（Ｃ１ｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ）　　［ＦＯ１３５４４工：
／　５−０バクター・クロアカ　（Ｅ　ｎｔｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏ３３２０エル
ウイニア・ハーピコラ　（Ｅ　ｒｗｉｎｉａ　　ｈｅｒ
ｂｉ−ｃｏｌａ）　　ＩＦＯＩ　２６８６ キザントモナス・ビシ　（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　　
ｐｉｓｉ）ｒｈｏ　　１３５５６ キザントモナス・シトリ　（Ｘ　ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
　　ｃｉｔｒｉ）［ＦＯ３８３５ フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｐ　ｌａ
ｖｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ　　ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉ
ｃｕｍ）　　Ｉ　Ｆ　０ミクロコツカス・パリアンス　
（Ｍ　１ｃｒｏｃｏｃｃｕｓｖａｒｉａｎｓ）　　Ｉ　
Ｆ　０　３７６５エシエリヒア・コリ　（Ｅ　５ｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ　ｉ）［Ｆｏ　　３３６Ｂ これらの菌のいずれかを適当な培地に、２０°Ｃ〜４０
℃で１日から４日間培養して得られる培養液を混合菌の
種培養液として、用いることができる。
その移植ｍは通常、酸化菌（シュードグルコノバクタ−
属）のそれのｌ／１０から１／１０００とするのが望ま
しい。この程度の移植量で混合菌を酸化菌と混合培養す
ると、酸化菌の生育が促進され、それにつれて、酸化菌
単独培養の場合より、より高濃度のし一ソルボースが、
より短い時間で２−ケト−Ｉ７−グロン酸に酸化される
。混合菌として用いられろ細菌は、本発明の原料である
し一ソルボースや生産物である２−ケト−Ｌ〜グロン酸
の資化性が無いかまたは微弱な菌であることが望ましい
。その他の培養条件は、酸化菌の単独培養と特に変わる
ところはない。
前記の微生物の培養に用いられる培地は、該菌株が利用
し得る栄養源を含むものなら液状でも固体状でもよいが
、大量のものを得る時には液体培地を用いるのが好まし
い。
該培地には、通常微生物の培養に用いられる炭素源、窒
素源、無機塩類、有機酸塩及び微量栄養素が用いられる
。炭素源としては原料であるし一ソルボースがそのまま
使用されうろが、その他の補助炭素源として、例えば、
グルコース、グリセリン。
ンヨ糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜等が使用できる。
窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類（例、硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等）、コーンスヂーブリ力−（以下
ＣＳＬと弥することもある）、ペプトン、肉エキス、酵
母エキス、乾燥酵母、大豆粉、綿実粕、尿素等の無機ま
たは有機の窒素含有物が挙げられる。また無機塩類とし
てはカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム
、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛、銅及び燐酸の塩類が
用いられる。
微量栄養素としては前記の菌の生育必須因子であるＣｏ
Ａ、パントテン酸、ビオチン、ヂアミン。
リボフラビンは勿論のこと、生育及び２−ケト−Ｌ〜グ
ロン酸生成に促進的効果を示すフラビンモノヌクレオチ
ド（以下ＦＭＮと称することもある）。
フラビンアデニンジヌクレオヂド（以下ＦＡＤと称する
ことらある）、その他のビタミン類、Ｌ−システィン、
Ｌ−グルタミン酸、ヂオ硫酸ナトリウム等が化合物とし
て、または、それらを含むものとして天然物を適宜加え
られる。
培養の手段は、静置培養でも、振盪培養あるいは通気撹
拌培養法等の手段を用いてもよい。大量の処理には、い
わゆる深部通気撹拌培養によるのが望ましい。
培養条件は、勿論菌株の種類、培地の組成、その他によ
っても異なり、要するに目的物か最も効率よく生産され
る様に個々の場合に応じて選択すればよい。例えば、培
養温度は２５〜３５°Ｃにて行うのがよく、培地のｐＨ
は５〜９程度が望ましい。
以上の様な条件下で１０〜１２０時間培養または反応す
ることにより２−ケト−Ｌ−グロン酸が最高濃度に蓄積
される。尚この場合目的物の生成に伴ってＩ）Ｈが低下
するのが一般的であるので、適当な塩基性物質、例えば
苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニアを添加して常に微生
物の２−ケト−Ｌ−グロン酸生成に最も適したｐ）ｌに
保持するのもよく、また培地中に適当な緩衝剤を添加し
ておいて最適のｐｌ（が維持される様にするのもよい。
この他、前記の酸化菌とは別種の細菌の滅菌培養物を培
地成分として有効に利用することもできる。利用できる
菌としては、例えば、バチルス属。
シュードモナス属１シトロバクタ−属、エシェリヒア属
およびエルウィニア属に属する菌が挙げられ、さらに具
体例として下記に示す閑か挙げられる。
バチルス・セレウス　（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒ
ｅｕｓ）ＩＦＯ３１３１ バチルス・ズブチリス　（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ）［ＦＯ３０２３ バチルス・プミルス　（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｕｍ
ｉｌｕｓ）ｒＦｏ　　　１２０８９ バチルス・メガテリウム　（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　　ｍ
ｅｇａｔｅ−ｒｉｕｍ）　　ＩＦＯ１２１０８ バチルス・アミロリケファシェンス　（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）　　Ｉ　Ｆ　
Ｏ３０２２シユードモナス・トリホリ　（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　　ｔｒｉ−ｆｏｌｉｉ）　　ＩＦ’０　１
２０５６シトロバクター・フロインディ　（Ｃ１Ｌｒｏ
ｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ）　　Ｔ　ＦＯＩ　２６
８１エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　
ｃｏｌＤ［ＦＯ３４５６ エルウィニア・ハービコラ　（Ｅ　ｒｗｉｎｊａ　　ｈ
ｅｒｂｉ−ｃｏｌａ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏｌ　２６８　にれ
らの細菌を、これらが生育しうる培地に、２０℃〜４０
℃で２日から４日間培養し、得られる培養液を滅菌し、
これを本酸化閑の培地に０．５〜５．０％（ｖ／ｖ）の
割合で加え、酸化菌の生育を促進させることもできる。
この様にして培養液中または反応液中に生成し蓄積した
２−ケト−Ｌ−グロン酸は、その性状を利用したそれ自
体公知の手段で分離精製することができる。２−ケト−
Ｌ−グロン酸は遊離の酸として分離してもよく、例えば
、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム等
の塩として分離してもよい。
分離の方法としては目的を阻害しないかぎり、いかなる
ものでもよいが、例えば必要に応じて反応生成物からｊ
！ｒ過、遠心分離あるいは活性炭処理等を行って、菌体
を除去した後、この溶液をそのまま濃縮し、析出する結
晶を濾取し、さらに再結晶させて目的物を取り出す方法
、溶媒抽出法、クロマトグラフィー法、塩析法などを単
独で、あるいは適宜組み合わせ、また反復して利用する
こともできる。
２−ケト−Ｌ−グロン酸が遊離型で得られる場合はこれ
を適宜の方法によって、例えば、ナトリウム、カリウム
、カルシウム、アンモニウム等の塩にしてもよく、また
塩として得られる場合は、これを適宜の方法によって遊
離型あるいは他の塩にかえてもよい。
本発明の方法によって得られる目的物か２−ケト−Ｌ−
グロン酸であることは、例えば元素分析。
融点、旋光度、赤外線スペクトル等の物理化学的諸性質
の測定によって同定された。
反応液、培養液中に生成した２−ケト−Ｌ−グロン酸の
定量は、スルホン化ポリスチレンゲル充填カラム（品用
製作所製、５ｅｎ−１０１１Ｔカラム、７　、９＋ｎｍ
Ｘ　３０ｃｍ）を用いる高速液体クロマトグラフィー法
（移動相：ｐＨ２，２の希硫酸、流量；　０　、　５　
ｍ（！／ｍｉｎ、検出器：示差屈折計）で行ない、標孕
品としては２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウムｌ水塩の
結晶を使用した。また２−ケト−Ｌ−グロン酸の検出は
薄層クロマトグラフィー法で行なった。セルロースプレ
ート（メルク社製、米国）にサンプルをスポットし、フ
ェノール：水：ギ酸（７５：２５　：５）の溶媒で室温
、３時間展開後、プレートを乾燥し発色させると、２−
ケト−Ｌ−グロン酸は、硝酸銀試薬では黒褐色の、０−
フェニレンジアミン試薬では黄色の、アニリンフタル酸
試薬では桃色のスポットを［値０．３０付近に与えるこ
とにより検出された。
実施例 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体−的に説明す
る。なお培地の％は、重量／容量％を示す。
実施例！ グルコース２．０％、ペプトン１．０％、乾燥酵母１．
０％、ＣａＣＯ３２，０％からなる種培地２０ｍ１２を
２００ｍ（！容三角フラスコに分注し、１２０℃で２０
分間蒸気滅菌した。このフラスコに第１表に示す斜面培
地に２８℃、４日間生育させたシュードグルコノバクタ
−・サッカロケトゲネスに５９１ｓ株（ＩＦ’０１４４
６４．ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１３０）の菌体１白金耳を
植菌し、３０°Ｃで２日間振盪（２０Ｏｒｐｍ）培養し
た。得られた培養液２ｍ（を上記と同じ種培地を含むフ
ラスコに移植し同じ条件で培養し種培養液を得た。
Ｃ９Ｌ２．０％、乾燥酵母０．５％、硫安０．５％。
Ｎａ、Ｓ、ｏ３０．０５％、硫酸第１鉄０．２％、Ｃａ
ｃＯａ　　４．０％、Ｌ−ソルボース１０．０％（別滅
菌）からなる発酵培地２５ｍ１２を２００ｍ１２容の三
角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した
。この発酵培地を含む三角フラスコに上記種培養液１．
２５ｍ１２を移植し、３０℃で３日間振盪培養した。こ
の様にして得られた発酵液は高速液体クロマトグラフィ
ー法で定量すると６０．５ｍｇ／ｍＱの２−ケト−Ｌ−
グロン酸を含んでいた。
（モル変換収率：５６．１％）この発酵液１０１００Ｏ
を遠心分離して、菌体等の残渣を除き、９８０ｍＱの上
清を得た。この上清をアンバーライトｌＲ１２０（ロー
ム・アンド・ハース社製、米国、Ｉ−Ｉ型。
５００　ｍＱ）カラムに通し、カラムを約３００ｍＣの
脱イオン水で洗浄した。通過液と洗液を合せて、活性炭
（５００ｍρ）カラムを通過させ、ついで約３００ｍ１
２の脱イオン水で洗浄し、脱カチオンと脱色を行った。
この通過液と洗液の合計１６００ｍ１２を苛性ソーダで
ｐｒ−ｔｅ、ｓに調整した後、５０℃で約７０ｍＱ迄減
圧下、濃縮した。この濃縮液を５°Ｃに２４時間放置す
ると無色柱状の結晶を生じた。
生じた結晶を濾取し、少量の冷メタノールで洗浄後、室
温、減圧下に五酸化燐上で乾燥して３７゜５ｇの２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸モノナトリウム・１水塩を得た。得ら
れた結晶の分析値は融点：１４７〜１５５℃（分解） 元素分析値（Ｃｅ　Ｈｓ　Ｏ７Ｎ　ａ−１−１２０）理
論値：Ｃ，３０，７８％；Ｈ，４，７４％測定値：Ｃ，
３０，９４％、ＩＩ、４．８５％比旋光度：［α］−２
３，３°（Ｃ＝１．０．水）で、高速液体クロマトグラ
フィーの保持時間と薄層クロマトグラフィーのＲｆ値と
ｃｎは標準品のものと一致した。
実施例２ 第１表に示す斜面培地で生育したシュードグルコノバク
タ−・サツ力ロケトゲネスに５９１ｓ株の菌体ｌ白金耳
を第２表に示す完全培地５ｍｆｆを含む試験管（１６ｍ
ｍＸ　１６０ｍｍ）に植菌し、３０℃で２日間振盪培養
した。この培養液１ｍ１２を同じ培地５ｍｆ２を含む試
験管に移植し、４時間振盪培養した。
得られた培養液５ｍ１２を無菌的に５°Ｃで１５分間遠
心分＃ｆｆ１（１２，００Ｏｒｐｍ）して集菌し、次い
で１０ｍＱのトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ６，５，０
，０５Ｍ）に懸濁し、再び遠心分離（１２，００Ｏｒｐ
ｍ）した。これを２回繰り返して得た洗浄菌体を１ｍｇ
／ｍ（！のニトロソグアニジンを含む上記緩衝液５ｍ１
２に懸関し、３０℃で２時間振盪して変異剤処理した。
この処理液を５℃で１５分間遠心分離（１２゜００　Ｏ
ｒｐｍ）Ｌ、て菌体を集め、ｌｏｍ（２のトリスマレイ
ン酸緩衝液で上記と同じ様に２回洗浄して、ニトロソグ
アニジン処理菌体を得た。これを０．８５％の食塩水で
適当に希釈して、１５＋ｎ＋２の完全培地（固型）を含
むプレート（直径９　ａｍ）に撒き、２８℃で５日間培
養しコロニーを生成させた。生じたコロニーを計数し、
無処理のものと比較すると、このニトロソグアニノン処
理による菌の死滅率は９０．４％であった。また完全培
地プレート上のコロニーを第３表に示す最小培地プレー
トにレプリカし、２８℃で３日間培養後、栄養要求変異
株の出現頻度を調べると約６．６％であった。
以上の様に変異剤処理した完全培地プレート上のコロニ
ーを新しい完全培地プレートに一枚当り１２株の割合で
約２ｃｍの長さに画線移植した。
２８°Ｃて２日間培養後、生育した菌体ｌ白金耳をし一
ソルボース７．０％（別滅菌）、乾燥酵母１．０％、ペ
プトン１．０％、塩化第１鉄Ｏ９１％およびＣａＣＯ３
３，０％からなる培地（ｐＨ６，５）３ｍＱを含む試験
管に移植し、３０℃で４日間振盪培養した。この条件下
で親株に５９１ｓ株の２倍程度の２−ケト−Ｌ−グロン
酸生成能を有するＴ　Ｈｌ　４−８６株　（ＩＦ’０　
１４４６６、ＦＥＩ’（Ｍ　　ＢＰ−１１２８）が、Ｌ
−ソルボース酸化能増強株として選択された。
第１表　　斜面培地（ｇ／Ｃ） Ｄ−ソルビトール　　　２５ ペプトン　　　　　　　ｌＯ 酵母エキス　　　　　　ｌＯ Ｃａ　ＣＯ３２ 寒天　　　　２０ ｐＨ７，０ 第２表　　完全培地（ｇ／　（１） Ｄ−ソルビトール　　　　２５ ペプトン　　　　　　　　１０ 酵母エキス　　　　　　　　１０ ｐトｔａ、５（固型培地では寒天２０ｇを加えろ。）第
３表　　最小培地　　　（ｇ／ｅ） ショ糖　　　　　　　　　　５ に、ｌｌＯ４３ ＫＨ，Ｐｏ、　　　　　　　　　１ （Ｎ　Ｈ、）ｔ　Ｓ　０．　　　　　　　ｌＮａＣ１１ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，ｌ ＭｎＣ１，・ｎＨ，００、００２ し一グルタミン酸ナトリウム　０．　１Ｌ−システィン
　　　　　　０．　１ ＣｏＡ　　　　　　　　　　　　Ｏ，００２ＦＭＮ　　
　　　　　　　　　Ｏ，００２チアミン　　　　　　　
　　０．００２ビオヂン　　　　　　　　　　ｏ、ｏｏ
ｔｐＨ７，０（固型培地では寒天２０ｇを加える。）実
施例３ シュードグルコノバク多−・サッカロケトゲネスに５９
１ｓ株から実施例２で誘導された変異株Ｔ　１１１４−
８６株を第１表の斜面培地に２８℃で４日間生育させた
。この斜面培地から菌体ｌ白金耳を実施例１の種培地２
０ｍ１２を含む２００ｍ１２容の三角フラスコに接種し
、３０℃で２日間振盪培養した。
グルコース３．０％、ペプトン１．０％、乾燥酵母１．
０％およびＣａＣＯ３２，０％からなる培地２００ｍ１
２を１＆容三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間
蒸気滅菌した。この三角フラスコに上記培養液２０ｍｄ
を移植し、２８℃で２日間振盪ｂ％　？ニー　　１．１
ｆｔ　ｋＮ　ｇ　’ａ　ｆｙ　２”Ｌ　　ｆ−−一方、
第１表の斜面培地で２８℃、２日間生育させたバチルス
・メガテリウムＩＰ０　１２１０８株の菌体１白金耳を
、シヨ糖４．０％、綿実粕４゜０％、に２１（Ｐｏ、　
　０．６５％、ＫＨ２ＰＯ，０゜５５％、硫安０．０５
％、ＮａＣｌ　　０．０５％、硫酸マグネシウム０．０
５％およびパントテン酸カルシウム０．０５％からなる
培地（ｐｒ（７、０）２０ｍ１２を含む２００ｍ（容三
角フラスコ（１２０℃、２０分間蒸気滅菌）に接種し、
３０℃で３日間培養した。得られた培養液は＋２０’Ｃ
，２０分間蒸気滅菌して、冷所に保存し、バチルス・メ
ガテリウムの滅菌培養物として下記する醗酵培地の１成
分として使用した。Ｌ−ソルボース１２．５％（１２０
°（：、１５分別滅菌）、硫安０．５％、Ｋｌ−ｒ、Ｐ
ｏ。
００３％、ＮａｔＳ、０３−５Ｈ，ＯＯ，０５％。
硫酸マグネシウム０．０５％、Ｆ　ｅＳ　Ｏ４・７１−
１ｔＯＯ，１％、ＭｎＳ　（１・４　ｔｌｔｏ　　５　
ｔｔｇ／ｍＱ、、チアミン５μｇ／ｍＬビオチン０．Ｉ
μｇ／ｍＱ、Ｆ’ＭＮＯ。
Ｉ　ｕｇ／ｍＱ、ＣａＣ０＋＋　　５．０％および上記
バチルス・メガテリウムの滅菌培養物４．０％（Ｖ／　
Ｖ）からなる酵母培地３りを５ａ容醗酵槽に入れ、１２
０°Ｃ，３０分間蒸気滅菌した。この醗酵槽に前記の種
培養液３００ｍＣを移植し、３２℃１通気２．４Ｑ／ｍ
ｉｎ撹拌ｇ　ｏ　ｏ　ｒｐｍの条件下で３日間培養した
。
この様にして得られた醗酵液には１０２．Ｏｍｇ／ｍＱ
の２−ケト−ローグロン酸が含まれていた。（モル変換
収率：　７５．７％）この醗酵液ｔＣを実施例１と同じ
方法で分離精製し、２−ケト−Ｌ−グロン酸モノナトリ
ウムｌ水塩の結晶７３．２ｇを採取した。
実施例４ シュードグルコノバクタ−・サッカロケトゲホス１２−
５株（ＩＦＯ１４４０５，ＦＥＲＭＢＰ−１１２９）を
実施例Ｉと同じ方法で培養して種培養液を得た。Ｌ−ソ
ルボース濃度を１２゜５％から９．０％に変えた実施例
３の醗酵培地２０ｍＣを２００ｍｆ２容三角フラスコに
分注し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。このフラス
コに上記種培養液１．５ｍｊを移植し、３２℃で２日間
振盪培養したところ７３　、　２ｍｇ／ｍ１２の２−ケ
ト−Ｌ−グａン酸が培養液中に生成した。（モル変換収
率ニア５４％） 実施例５ シュードグルコノバクタ−・サッカロケトゲホス１２−
４株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１３１，ＩＦ’０１４４８
３）、＋２−１５株（ＦＥＲＭ　　ｌ３Ｐ−１１３２、
ＩＦｏ　　１４４８２）および２２−３株（ＦＥｒｔＭ
　ＢＰ−１１３３，ＩＦＯ１４４８４）を実施例４と同
じ方法でそれぞれ３日間振盪培養したところ、１２−４
株では５２．１ｍｇ／ｍ（１（モル変換収率：５３．７
％）、１２−１５株では４８　、７　ｍｇ／ｍｌ２（モ
ル変換収率二５０．２％）、２２−３株では６９　、３
　ｍｇ／ｍ１２（モル変換収率ニア１゜４％）の２−ケ
ト−ローグロン酸がそれぞれ培養液中に生成した。
実施例６ Ｌ−ソＪｌ、Ｊ−ス１．０％（別滅菌）、ペプトン０゜
５％および酵母エキス０．５％からなる培地（ｐＨ７，
０）２５ｍｇを２００ｍρ容三角フラスコに分注し、１
２０℃、１５分間蒸気滅菌した。このフラスコに第１表
に示す斜面培地で２８℃、４日間生育したシュードグル
コノバクタ−・サツ力ロケトゲネスＴ　ＨＩ　４−８６
株の菌体ｌ白金耳を植菌し、３０℃で２日間振盪培養し
て種培養液を得た。
Ｌ−ソルボース５．０％（別滅菌）、ペプトン１．０％
、酵母エキス０．５％およびＣａＣ０：＋２．０％から
なる培地（ｐｔＩ　７　、０）２５ｍＱを２００ｍＱ容
三角フラスコに分注し１．１２０℃、１５分間蒸気滅菌
した。このフラスコに上記した種培養液１．０ｍ（ｌを
移植し、３０℃で２日間振盪培養した。
得られた培養液５００ｍ１２を２０分間室温で静置後、
デカントして沈澱物を除き、ついで室温。
１．０００ｒｐｍの低速で５分間遠心分離して、主にＣ
ａ　ＣＯ３からなる沈澱物を除き菌体懸濁液を得た。
これをさらに５℃で１０分間遠心分離（６，０００ｒｐ
ｍ）　Ｌ、て菌体を集め、約１００ｍ（７の冷食塩水（
０゜８５％）で２回洗浄、５°Ｃで遠心分離（６，ＯＯ
Ｏｒｐｍ）　して洗浄菌体を得た。これを３５ｍｄの冷
食塩水（０，８５％）に懸濁して、洗浄菌体懸濁液とし
ナー− この洗浄菌体懸濁液４ｍ０．にＬ−ソルボース３００ｍ
ｇ、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ
）緩衝液（ｐ［−１６，５，０，５Ｍ）０．５ｍＱとＣ
ａＣＯ５１８０ｍｇを加え、水で総量をＩｏｍ（！とじ
、ｌ００ｍρ容三角フラスコ中で３０°Ｃ１２４時間振
盪しながら反応させた。この様にして得られた反応液中
には２４　、６　ｍｇ／ｍ１２の２−ケト−ローグロン
酸が生成していた。（モル変換収率ニア６．０％）実施
例７ シュードグルコノバクタ−・サッカロケトゲネスに５９
１ｓ株、１２−５株と’Ｉ’　Ｈ１４−８６株を各々第
１表に示す斜面培地で２８℃、４日間生育さＵｏた。一
方第４表に示す混合菌は同じ斜面培地で２８６Ｃ，２日
間成育させた。各々の菌体１白金耳を実施例１に示す種
培地２０ｍＣを含む２００ｍ（容三角フラスコに植菌し
３０℃で２日間振盪（２００ｒｐｍ）培養し、各々の種
培養液を得た。
Ｃ９Ｌ２．０％、乾燥酵母０．３％、硫酸アンモニウム
０．５％、Ｎａ、Ｓ、０３−５Ｔ１．ＯＯ，０５％、硫
酸第１鉄０，２％、ＣａＣ０，５，０％お上びＬ−ソル
ボース１５．０％（別滅菌）からなる醗酵培地２５ｍ（
！を２００ｍｄ容三角フラスコに分注し、１２０℃で２
０分間蒸気滅菌した。
この醗酵培地を含む三角フラスコに前記したシュードグ
ルコノバクタ−・サヅカロケトゲネス（酸化菌）の各菌
株の種培養液１．５ｍＮを植菌、３０°Ｃで５日間振盪
培養しこれを純粋培養とした。
一方混合培養とする場合には酸化菌の植菌と同時に前記
した混合液の種培養液０．１ｍＱをそれぞれ植菌し３０
℃で５日間振盪培養した。
得られｊこ培養液中に生成した２−ケト−Ｌ−グロン酸
量を高速液体クロマトグラフィーで測定し、その結果を
第４表にまとめた。
混合菌の共存により２−ケト−Ｌ−グロン酸の生成量が
増加した。
第４表　混合培養による２−ケト−Ｌ−グロン酸の生成
（ｍｇ／ｎ＋Ｑ）表中、カッコ内の数字はモル変換収率
（％）を表す。
実施例８ グルコース２，０％、ペプトン１．０％、乾燥酵［＋、
Ｏ％およびアクトコール（消泡剤、底円薬品工業製）０
．０１％からなる前培養培地５００ｍσを２Ｑ容の坂ロ
フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。
第１表に示す斜面培地に２８℃で４日間生育させたシュ
ードゲルコバくフタ−・サッカロケトゲホスＴ１１１４
−８６株の菌体をｌＯｍ（２の滅菌水に懸濁し全量を坂
ロフラスコに植菌し、２８℃、３日間往復振盪（８５ｓ
ｐｍ）培養して前培養液を得た。
グルコース３，０％、Ｃ９Ｌｌ、θ％、乾燥酵母０．５
％、チオ硫酸ナトリウム０．０５％、硫酸第一鉄０．１
％、炭酸カルシウム２．０％およびアクトコール０．０
３％からなる種培養培地＋２０（２（ｐＩ−Ｉ　６　、
　５　）を２００σ容の醗酵槽に仕込み、１２５℃で３
０分間蒸気滅菌した。この醗酵槽に上記した前培養液１
．８Ｑを移植し、撹拌１２　Ｏｒｐｍ通気１００　（！
／ｍｉｎ、内圧１　、０　ｋｇ／ｃｍ”Ｇ　、　３０℃
一方、第１表に示す斜面培地に２８°Ｃ，２日生育させ
た混合菌バチルス・メガテリウムＩＦ○１２１０８株の
菌体ｌ白金耳を上記前培養培地５００ｍＩ２を含む２ａ
容坂ロフラスコに植菌して、２８℃、２日間往復振盪（
８５ｓｐｍ）培養して前培養液を得た。前培養培地と同
じ組成の培地３０ｇを５０ρ容の醗酵槽に入れ１２０℃
で２０分間蒸気滅菌した。この醗酵槽に混合菌の前培養
液５００ｍσを植菌し、撹拌１２０　ｒｐｍ、通気３０
（／ｍｉｎ、内圧１　、０　ｋｇ／ｃｍ２Ｇの条件下で
３０°Ｃ，２日間培養して混合菌の種培養液を得た。
Ｌ−ソルボース１５．０％（別に滅菌して加えた）、炭
酸カルシウム５．０％、Ｃ５Ｌ２．０％、乾燥酵母０．
２％、硫酸アンモニウム０．３％、ヂオ硫酸ナトリウム
０．０５％、硫酸第−鉄０．１％。
アクトコール０．０３％からなる醗酵培地１０００Ｑを
２ｍ’容醗酵槽に仕込み、１２５°Ｃて３０分間蒸気滅
菌した。この醗酵槽に前記したシュードグルコノバクタ
ー・サツ力口ケトゲネスＴＨ１４ス・メガテリウムＩＦ
ＯＩ２１０８株の種培養液１０（を移植し、撹拌１１０
ｒｐｍ９通気９００１２／ｍｉｎ、内圧０　、５　ｋｇ
／ｃｍ’Ｇ　、温度３０℃で培養した。
４０間培養後得られた培養液中には、１２３．１ｍｇ／
　ｍＱの２−ケト−Ｌ−グロン酸が含まれていた。
（モル変換収率ニア６．１％） 実施例９ 実施例８の前培養培地２０ｍ（２を２００ｖ２容三角フ
ラスコに分注し、１２０℃で３０分間蒸気滅菌した。第
１表に示す斜面培地に２８℃で４日間生育させたシュー
ドグルコノバクター・サツ力ロケトゲネスＴＨ１４−８
６の菌体ｌ白金耳を上記フラスコに植菌し、３０℃で２
日間振盪培養した。
得られた培養ｆＬ２０ｍ１２を同じ培地２００ｍ１２を
含む１＆容三角フラスコに移植し、３０℃で２日間振盪
培養してＴ　Ｈ１４−８６株の種培養液を得た。
前培養培地２０ｍ１２を含む２０ＯｍＣ容三角フラスコ
に、斜面培地に２８°Ｃで２日間生育させたバチルス・
メガテリウムＩＦＯＩ２１０８株の菌体１白金耳を植菌
し、２８℃で２日間振盪培養して、混合菌の種培養液を
得た。
Ｌ−ソルボース３．０％（別滅菌して加えた）。
Ｃ５Ｌ２．０％、乾燥酵母０．２％、硫酸アンモニウム
０，３％、ヂオ硫酸ナトリウム０１０５％、硫酸第−鉄
０．１％、アクトコール０．０２％および炭酸カルシラ
９．０％からなる醗酵培地の３１２分を２．　１１２に
調製し、１２０℃で３０分間蒸気滅菌し、予め滅菌しな
５Ｑ容の醗酵槽に仕込んだ。
この醗酵槽に前記したＴ　ＨＩ　４−８６株の種培養液
３００ｍ１２と混合菌の種培養液４ｍ１２を移植し、３
０°Ｃ９通気２．４Ｑ／ｍｉｎ、撹拌８００　ｒｐｍの
条件で培養を開始した。
一方ソルボース５１０ｇを水で溶解して８００ｍＱとし
、１２０℃で２０分間蒸気滅菌したソルボース溶液を、
培養６時間目から連続的に醗酵槽に加え、３６時間で全
量添加した。ソルボース添加終了後さらに２８時間前記
条件下で培養し、合計７０時間培養した。この様にして
得られた培養液中には１６３　、５　ｍｇ／ｍ１２の２
−ケト−Ｌ−グロン酸が蓄積していた。（モル変換収率
ニア５．８％）発明の効果 本発明の、ソニートグルコノバクター属に属し、Ｌ−ソ
ルボースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に酸化する能力を有
する微生物を用いる方法により、２−ケト−Ｌ−グロン
酸を収率よく製造することができる。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）シュードグルコノバクター属に属し、Ｌ−ソルボ
    ースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に酸化する能力を有する
    微生物またはその処理物を、Ｌ−ソルボースに接触させ
    て２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成蓄積せしめ、これを採
    取することを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造
    法。
  2. （２）シュードグルコノバクター属に属し、Ｌ−ソルボ
    ースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に酸化する能力を有する
    微生物をＬ−ソルボースに接触させて２−ケト−Ｌ−グ
    ロン酸を生成蓄積せしめるに際し、バチルス属、シュー
    ドモナス属、プロテウス属、シトロバクター属、エンテ
    ロバクター属、エルウィニア属、キサントモナス属、フ
    ラボバクテリウム属、ミクロコッカス属またはエシェリ
    ヒア属に属する微生物のうち少なくとも１種を存在させ
    ることを特徴とする特許請求第１項記載の製造法。
  3. （３）好気性細菌で、補酵素Ａの存在下に生育するシュ
    ードグルコノバクター・サッカロケトゲネス。
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