JPH0346107B2

JPH0346107B2 -

Info

Publication number: JPH0346107B2
Application number: JP57035452A
Authority: JP
Inventors: Takayasu Sonoyama; Bunji Kageyama; Shigeo Yagi
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1982-03-05
Filing date: 1982-03-05
Publication date: 1991-07-15
Also published as: KR900009051B1; JPS58162296A; KR840004167A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は２−ケト−Ｌ−グロン酸の生産に関し
特に２−ケト−Ｄ−グルコン酸を培地中に蓄積す
ることなく、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸よ
り２−ケト−Ｌ−グロン酸を微生物的に得る製造
方法に係る。本発明者らは、さきに２，５−ジケト−Ｄ−グ
ルコン酸より２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成し得
る多くの微生物（２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌
株（）と称する）を見い出し之を使用する２−
ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法を発明した。（特
公昭50−21559号、特公昭53−25033号、および特
公昭56−15877号公報参照）。（）はいずれも原
料２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸より主生成物
２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成するほか副生成物
として２−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成する。こ
の不所望な２−ケト−Ｄ−グルコン酸を培地中に
蓄積させない為に混合培養法を発明した。（特公
昭54−19468号公報参照）今回、本発明者らはコリネバクテリウム属に属
する（）を通常の方法で変異処理し、変異した
（）の中より５−ケト−Ｄ−グルコン酸に生育
せずＤ−グルコン酸に生育する変異株（この変異
株を５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株
（）と称する）を誘導し、この変異株（）が
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸より２−ケト−
Ｄ−グルコン酸を生成しない性質を有することを
見い出した。また（）を培養し２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸と接触させると不所望な２−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸を培地中に実質的に蓄積する
ことなく２−ケト−Ｌ−グロン酸が蓄積すること
を見い出し、この知見にもとづいて冒頭の特許請
求の範囲にその要旨を記載した通りの発明を完成
した。すなわち、本発明によればコリネバクテリウム
属に属する２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株
（）より誘導した５−ケト−Ｄ−グルコン酸代
謝欠損変異株（）またはその処理物に、２，５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸またはその塩類を含む
培地と接触させて培地中に２−ケト−Ｌ−グロン
酸を蓄積させ、これを採取することを特徴とする
２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法が提供され
る。（）より（）を効率よく得るには、紫外線
照射、Ｘ線照射などの処理を施すか、Ｎ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（N.T.
G.）、アクリフラビン、エチルメタンスルフオン
酸などの変異誘導剤に接触させる方法が採られ
る。変異処理を施した（）を適当な濃度に希釈
するか、再度培養後適当な濃度に希釈し、希釈液
の１部（0.5〜１ml）を0.5〜２％のＤ−グルコン
酸を含む最少寒天培地（生育に必要なビタミン、
微量元素を含む）に塗布し生育させる。生育した
菌の集落を0.5〜２％の５−ケト−Ｄ−グルコン
酸を含む最少寒天培地に転写し（レプリカ法）、
５−ケト−Ｄ−グルコン酸培地に生育しない集落
を選択する。選択された変異株は５−ケト−Ｄ−
グルコン酸の代謝活性を失つているかもしくは親
株（）の1/10以下に低下している（この様にし
て得られた変異株を５−ケト−Ｄ−グルコン酸代
謝欠損変異株（）と称する）。（）を培養し
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸と接触させたと
ころ得られたすべての（）は２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸を実質的に生成することなく２−ケト−
Ｌ−グロン酸を生成することが確認された。上記
の方法で得られた（）の例として、（）であ
るコリネバクテリウム・スピーシーズ
（Corynebacterium sp.FERM−P2770，ATCC
No.31090）の変異株（微工研条寄FEPM−BP−
108）や、（）であるコリネバクテリウム・スピ
ーシーズ（Corynebacterium sp.FERM−
P2687，ATCC No.31081）の変異株（微工研条
寄FEPM−BP−107）などがあげられる。

【表】上記の事実、すなわち、５−ケト−Ｄ−グルコ
ン酸代謝能を欠損させることによつて２−ケト−
Ｄ−グルコン酸産生能を欠損あるいは著しく弱化
させ得た事実は、コリネフオーム・グループ（バ
ージーズ・マニユアル・オブ・デタミナテイブ・
バクテリオロジー第８版の定義による）に属す
るすべての２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌に関し
て共通のことである。（）の培養にあたつて使用される培地として
は特別な制限はない。たとえば、炭素源としては
グルコース、シユークロース、グリセリン、廃糖
蜜など糖類や多価アルコールを使用し、窒素源と
しては一般的に用いられる窒素化合物、たとえ
ば、コーン・ステイープ・リカー、ペプトン、肉
エキスやアンモニウム塩、硝酸塩などが使用され
る。無機塩類（たとえばカルシウム、マグネシウ
ム、カリウム、亜鉛、マンガン、鉄などの塩類）
や目的物質の生成を促進する因子などを添加して
もよい。培地組成は、用いる菌株の特性や原料
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の使用量やその
他の条件により異なる。原料の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸として
は、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸塩の水溶液
を用いることも出来るし、あるいは、エルウイニ
ア属、グルコノバクター属（ここに言うグルコノ
バクター属とは、バージーズ・マニユアル・オ
ブ・デタミナテイブ・バクテリオロジー第８版
に準拠するもので同第７版に於けるアセトバクタ
ー属、アセトモナス属、グルコノバクター属を含
む）に属する、Ｄ−グルコースより２，５−ジケ
ト−Ｄ−グルコン酸を生産する能力を有する微生
物を培養して得られる発酵液の過除菌液あるい
は、薬剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）によ
る殺菌処理液を用いることも出来る。２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の添加条件
は、菌株や培地条件により異なるが、普通１〜10
％の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を１度にあ
るいは、少量ずつ間欠的に添加する。２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の添加時期
は、培養開始時に添加するかもしくは、菌の生育
が終了する前後10時間以内に添加することが望ま
しい。培養時間は、原料の２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸の添加条件により異なるが、普通２，５−
ジケト−Ｄ−グルコン酸添加後24時間〜96時間培
養し、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸が消失し
た時点を培養の終点とする。発酵液中の２−ケト−Ｌ−グロン酸、２−ケト
−Ｄ−グルコン酸や２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸は、一般的な糖類及びその関連物質を分析す
る手段により分離、定量し得る。たとえば、ガス
クロマトグラフイー、ペーパークロマトグラフイ
ー、薄層クロマトグラフイーなどが用いられる。
これらは、その目的に応じて種々使い分けられ
る。以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明
する。実施例１（２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造） (1) 種培地Ｄ−グルコース 1.0％バクト・イーストエキストラクト（Difco）
0.5％バクト・ペプトン（Difco） 0.5％第１リン酸カリウム（KH₂PO₄） 0.1％硫酸マグネシウム（MgSO₄・7H₂O） 0.02％（10％NaOHにてPH７〜7.2に調整し500ml容三
角フラスコに50ml宛分注し115℃、20分間滅菌
する。） (2) 本培養培地Ｄ−グルコース 1.0％コーン・ステイープ・リカー（CSL） 3.0％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.02％（10％NaOHにてPH７〜7.2に調整し500ml容三
角フラスコに50ml宛分注し115℃、20分間滅菌
する。） (3) ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸カルシウム
水溶液の調整粉末の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸カル
シウムを5.0％の水溶液にし、この水溶液を予
め滅菌された過器で過除菌する。 (4) ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発酵液の調
製エルウイニア・プンクタータ（FERM−
P5452，ATCC No.31626）を、種培地（１％
Ｄ−グルコース、５％CSL、0.1％KH₂PO₄、
0.02％MgSO₄・7H₂O、0.5％炭酸カルシウム
（CaCO₃）、PH6.8〜7.0、500ml三角フラスコに
50ml分注、115℃、20分間滅菌）に１白金耳植
菌し28℃で８〜11時間振盪培養する。（振幅71
mm、270r.p.m.、以下同じ）。この種培養液45ml
を455mlの２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発
酵培地（20％Ｄ−グルコース、３％CSL、0.1
％KH₂PO₄、6.3％CaCO₃、PH6.8〜7.0、115℃、
20分間滅菌）に加えて予め滅菌された１発酵
槽で28℃、17〜30時間、600Nml／分の通気下
で1740r.p.m.の撹拌を行いながら発酵する。
（２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸19W／Ｖ
％）。この発酵液を遠心分離機で菌体を除去し、
その上清を予め滅菌された過器で過除菌す
る。これを２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸発
酵液とする。 (5) 分析方法２−ケト−Ｌ−グロン酸、２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸の定量は、ガスクロマトグラフイー及
びペーパークロマトグラフイーを使用する。ガスクロマトグラフイーの実施条件カラム：シリコンガム SE52（５％）キヤリアーガス：ヘリウムカラムの温度：160℃〜210℃ サンプル：トリメチルシリル化ペーパークロマトグラフイーの実施条件担体：東洋紙No.50 展開液：フエノール：ギ酸：水＝75：４：25 発色：AHF溶液（アニリン0.93ｇとフタール
酸1.66ｇを水飽和ｎ−ブタノール100mlに溶
解したもの）を噴霧、105℃で２分間処理し
て発色させる。 (6) ２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造第１表に掲げる２−ケト−Ｌ−グロン酸生産
菌株あるいは、５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝
欠損変異株を(1)の種培地に１白金耳植菌し、28
℃で24時間振盪培養したのち、この種培養液、
５mlを(2)の本発酵培地に植菌し振盪培養した。この本発酵培地に対し２，５−ジケト−Ｄ−
グルコン酸液（(3)あるいは(4)）を培養開始時又
は培養開始後16時間で最終濃度が２％になるよ
うに添加し、48時間培養した。得られた培養液
を(5)のガスクロマトグラフイーで２−ケト−Ｌ
−グロン酸及び２−ケト−Ｄ−グルコン酸を定
量し、第２表の結果を得た。５−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸代謝欠損変異株（）の培養液から
は、２−ケト−Ｄ−グルコン酸は検出されなか
つた。さらにフエノール：ギ酸：水＝75：４：
25を使用して、ペーパークロマトグラフイーを
行ない、２−ケト−Ｄ−グルコン酸の検出を行
なつたが、５−ケト−Ｄ−グルコン酸代謝欠損
変異株（）の培養液から２−ケト−Ｄ−グル
コン酸は検出されなかつた。

【表】実施例２（変異微生物（）の誘導） (1) 液体培地バクト・ビーフエキストラクト（Difco） 1.0％バクト・ペプトン（Difco） 1.0％ NaCl 0.5％（PH7.2、50ml／500ml容三角フラスコ、115℃、
20分間滅菌） (2) 最少寒天培地 NH₄Cl 0.5％ NH₄NO₃ 0.1％ Na₂SO₄ 0.2％ MgSO₄・7H₂O 0.1％ CaCO₃ 0.0001％ KH₂PO₄ 0.3％ K₂HPO₄ 0.1％微量元素液（注１） 0.1％ビタミン液（注２） 0.1％寒天 2.0％（PH7.2、115℃、15分間滅菌）（注１）微量元素数（１中次の成分を含む） Na₂B₄O₇・10H₂O 88mg （NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O 37mg FeCl₃・6H₂O 970mg ZnSO₄・7H₂O 8.8mg CuSO₄・5H₂O 270mg MnCl₂・4H₂O 72mg （注２）ビタミン液（１中次の成分を含む）チアミン 1.0mg パントテン酸 10mg ニコチン酸アミド 10mg ビオチン 0.1mg (3) Ｄ−グルコン酸、５−ケト−Ｄ−グルコン酸
溶液Ｄ−グルコン酸ナトリウム、５−ケト−Ｄ−
グルコン酸ナトリウムを各々10％水溶液にしPH
を6.8〜7.2であることを確認後、過除菌して
調製した。 (4) 変異誘導法コリネバクテリウム・スピーシーズ
（Corynebacterium sp. FERM−Ｐ 2770）あ
るいは、コリネバクテリウム・スピーシーズ
（Corynebacterium sp. FERM−Ｐ 2687）を
各々(1)の液体培地に１白金耳植菌し、28℃、８
時間振盪培養した。之に予め無菌過された
0.2％のＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン溶液を最終濃度0.02％になるよう
に加え30分間培養を継続し、遠心分離
（10000r.p.m.15分）したのち菌体を集め、３回
無菌生理食塩水で洗菌し、無菌生理食塩水10ml
に懸濁させた。この懸濁液１mlを(1)の培地に植
菌し15時間、28℃で振盪培養した。この培養液
を無菌生理食塩水で生菌が10²〜10³個／mlにな
るように希釈した。次にこの希釈液を(3)のＤ−
グルコン酸水溶液と(2)の最少寒天培地を１：９
に加えた平板培地に0.5〜１ml塗布し３〜５日
間28℃で培養した。生育した菌（第３表のＤ−グルコン酸培地に
生育する株(1)）の集落を(3)の５−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸水溶液と(2)の最少培地を１：９に加え
た平板培地にビロード布等でレプリカした。こ
れを３〜５日間培養したのち先のＤ−グルコン
酸培地に生育するが５−ケト−Ｄ−グルコン酸
培地に生育しない菌の集落をＤ−グルコン酸培
地に釣菌したうえ生育させた。この選択された変異株（第３表の５−ケト−
Ｄ−グルコン酸培地に非生育の株(2)）を５−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸１％を含む(1)の培地に植菌
し24時間28℃で振盪培養した。この培養液を実
施例１で記載したペーパークロマトグラフイー
にて５−ケト−Ｄ−グルコン酸を定量しこの菌
株(2)が５−ケト−Ｄ−グルコン酸を資化してい
ないことを確認した。この５−ケト−Ｄ−グルコン酸を資化してい
ないことを確認された変異株（第３表の５−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸非資化株(3)）を、実施例
１、(2)記載の培地に１白金耳植菌し20時間培養
後、実施例１、(3)記載の２，５−ジケト−Ｄ−
グルコン酸カルシウム水溶液を最終濃度1.0％
になるように加え、さらに24時間培養した。こ
の培養液をペーパークロマトグラフイーによつ
て含有２−ケト−Ｄ−グルコン酸および２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸を定量し第３表の結果を得
た。このようにしてコリネバクテリウム・スピ
ーシーズ（FERM−Ｐ 2770）を変異処理し
生育させた84520株より５−ケト−Ｄ−グルコ
ン酸代謝欠損変異株308株、コリネバクテリウ
ム・スピーシーズ（FERM−Ｐ 2687）の変
異処理株29100株より11株の５−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸代謝欠損変異株を得た。

【表】実施例３（菌体懸濁液および抽出液による２−ケト−Ｌ
−グロン酸の生成） (1) 種培養：実施例１、(1)の種培地に、コリネバクテリウ
ムsp.FERM−Ｐ 2770（）あるいは、その菌
株より誘導した変異株FERM−BP 108（）
をそれぞれ、１白金耳ずつ植菌し、28℃で24時
間振盪培養した。 (2) 本培養：実施例１、(2)の培地（ただし、消泡剤として
ポリプロピレングリコールＰ−2000を0.01％含
有する）500mlを滅菌済１容発酵槽に入れ、
(1)で得た種培養液50mlを植菌し、1740r.p.m.の
撹拌、600Nml／分の通気下に、28℃、16時間
の培養を行つた。 (3) 菌体懸濁液の調製： (2)で得た培養液を遠心分離（15000r.p.m.、
20分）して菌体をあつめ、生理食塩水で２回洗
浄した。この洗菌済菌体を、0.05Mトリス・バツフア
ー（PH7.5）にOD₆₆₀ｎｍ＝12となるように懸濁
した。 (4) 菌体抽出液の調製：上記(3)で得た洗菌済菌体を、0.05Mトリス・
バツフアー（PH7.8）に、OD₆₆₀ｎｍ＝100とな
るように懸濁し、これをフレンチ・プレス（圧
力：1000Kg／cm²）にかけ菌体を破砕した。この
破砕液から遠心分離（20000G、30分間）によ
つて菌体（菌体および破片）を除去したのち、
上澄液を、0.05Mトリス・バツフアー（PH7.5）
に対して透析（15時間）し、これを菌体抽出液
とした。 (5) 懸濁液(3)による２−ケト−Ｌ−グロン酸の生
成懸濁液(3)８mlを２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸カルシウム溶液（実施例１(3)によつて調製
したもの）２mlと混合し、この混合物を30℃で
15時間振盪反応させた。反応完了後、遠心分離
（15000G、15分間）によつて、菌体を除去し、
上澄液中の２−ケト−Ｌ−グロン酸および２−
ケト−Ｄ−グルコン酸を実施例１(5)項に記載の
ガスクロマトグラフイによつて定量し、次の第
４表に示す結果を得た。

【表】 (6) 抽出液(4)による２−ケト−Ｌ−グロン酸の生
成抽出液(4)0.5mlを、75μmolesの２，５−ジケ
ト−Ｄ−グルコン酸カルシウムおよび
15μmolesのNADPH（還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド燐酸）を含む2.5ml
の0.1Mトリスバツフアー（PH7.5）に加え、こ
れを30℃で16時間反応させた。この反応液の定
量結果を次の第５表に示す。

【表】上記第４および第５表に示した結果から、菌体
懸濁液(3)および菌体抽出液(4)を用いた反応によつ
て２−ケト−Ｌ−グロン酸が生成することが確認
された。なお両反応において、親株の２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸生産菌（FERM−Ｐ 2770）から得られ
た処理物はいずれも２−ケト−Ｌ−グロン酸とと
もに２−ケト−Ｄ−グルコン酸を併産するもので
あつたのに対し、変異株（）の処理物は２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸のみを生産し、２−ケト−Ｄ−
グルコン酸を併産しないものであつた。

Claims

【特許請求の範囲】１コリネバクテリウム属に属する２−ケト−Ｌ
−グロン酸生産菌株（）より誘導した５−ケト
−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株（）またはそ
の処理物に、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸ま
たはその塩類を含む培地と接触させて培地中に２
−ケト−Ｌ−グロン酸を蓄積させ、これを採取す
ることを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製
造方法。２前記変異株（）が２−ケト−Ｄ−グルコン
酸を実質上生産しないものであることを特徴とす
る特許請求の範囲１に記載の方法。