JPS6391088A - ２−ケト−ｄ−グルカル酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、飼料のカルシウム強化助剤、洗剤のピルグー
、セメントの可塑剤および糖代謝研究用の試薬として有
用な、式（１）で示される２−ケト−Ｄ−グルカル酸の
醗酵法による製造法に関する。

ＣＯ０１１ ■ −Ｏ １−Ｉ　ＣＯＨ ＨＣＯＨ 噛 ｃ　ｏ　ｏ　＋ｉ 従来の技術 ２−ケト−Ｄ−グルカル酸の製造法としては、これまで
グルコースの化学的酸化により合成されるＤ−グルカル
酸にシュードモナス・アエルギノーサを作用させ、微生
物酸化により２−ケト−Ｄ−グルカル酸を得る方法（チ
ェコスロバキア特許、Ｃ９２２２，５７７（１９８４年
２月１日））が知られているにすぎない。

発明が解決しようとしている問題点 しかし、前記の方法においては、原料であるＤ−グルカ
ル酸を化学的酸化により合成するという工作が必要とさ
れ、また収率的にも工業技術として満足すべきものでは
ない。

本発明者らは微生物による単糖類の酸化機構を研究中、
土壌資料より分離した細菌、５２６−２１株、５２６−
２２株および５２６−４２株をＤ−グルコース、　Ｄ−
フラクトースやその他の単糖類を炭素源とする培地で培
養すると、その培養液中に著量の２−ケトーＤ−グルカ
ル酸が生成蓄積されることを見出した。また、前記生産
菌の分類学的研究を行ない、これらがシュードモナス属
の新菌株であることを知り、鋭意研究の結果、本発明を
完成するに至った。

すなわち、本発明は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−ソルビットまたはＤ−マンニ
ットを２−ケトーＤ−グルカル酸に酸化する能力を有し
、ンユードモナス属に属する細菌またはその処理物を、
該化合物に接触させて２−ケトーＤ−グルカル酸を生成
蓄猜仕しめ、これを採取することを特徴とする２−ケト
ーＤ−グルカル酸の製造法を提供するものである。

本発明者らが見出した３菌株の分類学的性状は、次の通
りである。

（ａ）形態 （１）桿菌。０．３〜０．５Ｘ０．７〜１．４．ｃｚｍ
ｏ（２）多形性は認められない。

（３）運動性があり、２本以上の極鞭毛を有する。

（４）胞子を形成しない。

（５）グラム陰性。

（６）非抗酸性。

（ｂ）生育の状態 （１）肉汁寒天平板培養二生育中程度。円形、金縁、平
滑、乳白色の集落を形成する。

（２）肉汁寒天斜面培養：生育中程度。糸状、平滑、乳
白色。

（３）肉汁液体培養：生育中程度。沈澱を生じる。

（４）肉汁ゼラヂン穿刺培養二上部のみ生育するが、ゼ
ラチンを液化しない。

（５）リドマスミルク：酸性化するが、凝固、分解は認
められない。

（ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元は微弱。

（２）脱窒反応は陰性。

（３）メチルレッド（ＭＲ）テストは弱陽性。

（４）フォーゲス・プロスカラエル（ｖｐ）テストは弱
陽性。

（５）インドールを生成しない。

（６）硫化水素を生成しない。

（７）デンプンの加水分解は陰性。

（８）クエン酸の利用性は陰性。

（９）アンモニウム塩を窒素源として利用できる。

（１０）色素の生成は認められない。

（１１）ウレアーゼ陽性。

（１２）オキシダーゼ陽性。

（１３）カタラーゼ陽性。

（１４）１５〜３６℃で生育し、至適生育温度は３０℃
付近。ｐＨ５、５〜８．７で生育し、至適生育り［目よ
６　０〜７．５゜ （１５）好気的。

（１６）ヒユー・ライフマンのＯＦテストは酸化的。

（１７）Ｌ−アラビノ・−ス、Ｄ−キンロース、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガ
ラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロースから
微弱に酸を生成するが、ガスは生成しない。Ｄ−ソルビ
ット、Ｄ−マンニット、イノジット、グリセリン、デン
プンから酸、ガスを生成しない。

（ｄ）その他の性質 （１）ＤＮＡのグアニンとシトシン含量は約６７モル％
である。

（２）イソプレンユニット数１０のユビキノンを有する
。

（３）グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生
成しない。

（４）生育にチアミン、リボフラビン、パントテン酸を
必須に要求し、ビオチン、カザミノ酸により生育を促進
される。

以上の分類学的性状を、バーノーズ・マニュアル・オブ
・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ
’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃＩ３　ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１巻（１９８４年
）に照合してみると、これらの菌株はいずれも、グラム
陰性、極鞭毛を有する運動性（１菌で、好気性、オキン
ダーゼ陽性であることから、シュードモナス属の細菌種
と考えるのが妥当である。生育にビタミン、アミノ酸を
要求すること、ＤＮＡのグアニンとシトシンの含量が６
７モル％であることから、この属のセクション■に分類
される。また、イソプレンユニット数ｌＯのユビキノン
を有することから、このセクションのシュードモナス・
ディミニコータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｉｍｉｎ
ｕｔａ）及びシュードモナス・ベシキュラリス（Ｐ　ｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）に近
縁な種と考えられる。しかしながら、鞭毛の着生数、糖
の資化性等で、前記２菌種と異なり、シュードモナス属
の既知種の中に該当するものを見出すことができず、こ
の属の新菌種とみなさざるを得ない。そこでこれら３菌
株をシュードモナス・ツルボッキジダンス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　５ｏｒｂｏｓｏｘｉｄａｎｓ）と命名し
、昭和６１年（１９８６年）４月１１日に財団法人発酵
研究所（ＩＦＯ）に、また昭和６１年（１９８６年）４
月２６日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（ＦＲＩ）に寄託した。３菌株の分離番号と菌株保存機
関の受託番号は次の通りである。

分離菌株番号　ＦＲＩ受託番号　　ＩＦＯ受託番号５２
６−２１　　ＦＥＲＭ　Ｐ−８７５０１ＦＯ１４５０１
５２６−２２ＦＥＲＭ　Ｐ−８７５１１ＦＯ１４５０２
５２６−４２ＦＥＲＭ　Ｐ−８７５２１Ｆ０１４５０３
本発明に用いられる菌株は前記したこれらの菌株は勿論
のこと、例えば、これらの菌株を紫外線やＸ線照射した
り、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ンにニトロソグアニジン）、メチルメタンスルホン酸、
ナイトロジェンマスタードの様な変異誘起剤で処理して
得られる変異昧も有利に用いられる。

本発明に用いられる糖類はＤ−グルコース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ツルヒツトおよびＤ−マ
ンニットであるが、以下、これらを「原料糖類」と称す
ることらある。

原料糖類を使うに当たっては、各々を単独で使用するこ
とは勿論、２種またはそれ以上の混合物として使用する
ことも出来る。さらにンヨ糖、糖蜜にインベルターゼを
働かせて得られる転化糖等も原料糖類として有利に利用
することができる。

本発明においては、原料糖類を含有する培地に前記の菌
を培養してもよく、また原料糖類に前記の菌体処理物を
作用させてもよい。

本発明で用いられる「菌体処理物」とは、前記の菌を培
養して得られる培養物の洗浄菌体、アセトンパウダー、
ポリアクリルアミドゲルまたはに一カラギーナン包括固
定化菌体などをいう。

原料糖類を培地に加えるに際しては、使用全量を培養当
初から培地に添加してもよいし、全量を何回かに分けて
、または連続的に培養液に加えてらよい。

原料糖類と前記の微生物とを接触させて行なう反応にお
ける反応液中の原料糖類の濃度は、培地に対して１〜３
０％（冑／ｖ）、好ましくは５〜２０％（★／Ｖ）であ
る。

原料糖類と菌体処理物とを接触させる方法としては、例
えば、菌体処理物に原料糖類、２−（Ｎ−モルフォリノ
）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｌ衝液（１（６，５，０
、５Ｍ）およびＣａ　ＣＯ＊を加え、水で希釈して三角
フラスコ中で振盪させる方法が挙げられる。

原料糖類と前記の微生物の処理物を接触させて行なう反
応における反応液中の原料糖類の濃度は、０．１〜１０
％（ｗ／ｖ）である。微生物の処理物の量は、処理前の
乾燥菌体量として１〜３０　ｕ／ｍＱである。反応液の
ｐ＋−ｔは、約５．５〜７．５に調整され、反応温度は
、約２０〜４０℃、反応時間は約１−１００時間である
。

前記の微生物の培養に用いられる培地は、該菌株が利用
し得る栄養源を含むものなら液状でら固体状でもよいが
、大量のらのを得る時には液体培地を用いるのが好まし
い。

該培地には、通常微生物の培養に用いられる炭素源、窒
素源、無機塩類、有機酸塩及び微行１栄養素が用いられ
る。

炭素源としては前記の原料糖類がそのまま使用されつる
が、その他の補助炭素源として、例えば、グリセリン、
ショ糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜等が使用できる。

窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類（例えば、
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等）、コーンスヂーブリ力−（
以下ＣＳＬと称することもある）、ペプトン、肉エキス
、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、綿実粕、尿素等の無
機または有機の窒素含有物が挙げられる。また無機塩類
としてはカリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシ
ウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛、銅及び燐酸の塩
類が用いられる。

微量栄養素としては前記の菌の生育必須因子であるパン
トテン酸、チアミン、リボフラビンは勿論のこと、生育
及び２−ケトーＤ−グルカル酸生成に促進的効果を示す
ビオチン、フラビンモノヌクレオヂド（以下ＦＭＮと称
することもある）、その他のビタミン類、し−ンステイ
ン、Ｌ−グルタミン酸、チオ硫酸ナトリウム等が化合物
として、または、それらを含むものとして天然物を適宜
加えられる。

培養の手段は、静置培養でも、振盪培養あるいは通気撹
拌培養法等の手段を用いてもよい。大量の処理には、い
わゆる深部通気撹拌培養によるのが望ましい。

培養条件は、勿論菌株の種類、培地の組成、その他によ
っても異なり、要するに目的物が最も効率よく生産され
る様に個々の場合に応じて選択すればよい。例えば、培
養温度は２５〜３５℃にて行うのがよく、培地のｐ■Ｉ
は５〜９程度が望ましい。以上の様な条件下で１０〜１
２０時間培養または反応することにより２−ケトーＤ−
グルカル酸が最高濃度に蓄積されろ。なお、この場合目
的物の生成に伴ってｐＨが低下するのが一般的であるの
で、適当な塩基性物質、例えば苛性ソーダ、苛性カリ、
アンモニアを添加して常に微生物の２−ケトーＤ−グル
カル酸生成に最も適したｐＨに保持するのもよく、また
培地中に適当な緩衝剤を添加しておいて最適のｐ　Ｉ（
力筒を持される様にするのもよい。

この様にして培養液中または反応液中に生成し蓄積した
２−ケトーＤ−グルカル酸は、その性状を利用したそれ
自体公知の手段で分離精製することができる。２−ケト
ーＤ−グルカル酸は遊離の酸として分離してらよく、例
えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウ
ム等の塩として分離してもよい。

分離の方法としては目的を阻害しないかぎり、いかなる
ものでもよいが、例えば必要に応じて反応生成物から一
過、遠心分離あるいは活性炭処理等を行って、菌体を除
去した後、この溶液をそのまま濃縮し、析出する結晶を
濾取し、さらに再結晶さけて目的物を取り出す方法、溶
媒抽出法、クロマトグラフィー法、塩析法などを単独で
、あるいは適宜組み合わせ、また反復して利用すること
もできる。

２−ケトーＤ−グルカル酸が遊離型で得られる場合はこ
れを適宜の方法によって、例えば、ナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、アンモニウム等の塩にしてもよく、ま
た塩として得られる場合は、これを適宜の方法によって
遊離型あるいは他の塩にかえてもよい。

本発明の方法によって得られる目的物が２−ケトーＤ−
グルカル酸であることは、例えば元素分析、融点、旋光
度、赤外線スペクトル等の物理化学的諸性質の測定によ
って同定された。

反応液、培養液中に生成した２−ケトーＤ−グルカル酸
の定量は、スルホン化ポリスチレンゲル充填カラム（島
津製作所製、５ＣＲ−１０１Ｈカラム、７．９ｍｍｘ　
３０ｃｍ）を用いる高速液体クロマトグラフィー法（移
動ｆｉ］：ｐ８２．２の希硫酸、流量＋　０　、５　ｍ
Ｑ／　ｍｉｎ、検出器：示差屈折計）で行ない、標準品
としては、後記する参考例に示した様に、クルハネク・
ミロス（Ｋｕｌｈａｎｅｋ　Ｍｉｌｏｓ）等のヂエコス
ロバキア特許　Ｃ９２２２，５７７（１９８４年）に準
じ、シュードモナス・アエルギノーサ（ＩＦＯ３４４８
）を用いて、Ｄ−グルカル酸から調製した２−ケトーＤ
−グルカル酸を用いた。

実施例 以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。なお培地の％は特に記載のない限り重量
／容量％（〜Ｖ／Ｖ％）を示す。

参考例 ペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、Ｄ−グルコー
ス１．０％およびＫｔｌ（ＰＯ，Ｏ，１％からなる培地
（以下、ＰＹＧ培地と称することもある）の３０ｍ１２
を２００−容の三角フラスコに分注し、１２０℃で２０
分間蒸気滅菌を行なった。このフラスコに、ＰＹＧ培地
に２．０％の寒天を加えて作成した斜面培地上で２８℃
、２日間生育させたシュードモナス・アエルギノーサ　
（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　
Ｉ　Ｆ　０　３４４８の新鮮な菌体−白菌耳を植菌した
。３０℃で一昼夜回転振盪（２００ｒｐｍ）培養し、種
培養液とした。

Ｄ−グルカル酸・モノカリウム塩（シグマ社製）の５％
（Ｗ／Ｖ）水溶液を、あらかじめｌ）Ｈを７．０にＮａ
０Ｉ４で調整し、０．４５ミクロンのフィルターを用い
てろ過除菌し、１％（Ｗ／Ｖ）になるようにＰＹＧ培地
に添加した。この培地２０ｍ（２を含む２００ｍｆ２容
の三角フラスコに、前記の種培養液１ｍＱを移植し、３
０℃で２４時間振盪培養した。斯くして得られた培養液
には９．０２次９／ｍ（ｌの２−ケトーＤ−グルカル酸
が高速液体クロマトグラフィーで認められた。培養液５
９０ｍＣから遠心分離によって除菌し、５８０ｍＱの上
清液を得た。上清液はアンバーライトカチオン交換樹脂
ＩＲ１２０Ｂ（Ｈ”型、米国ローム・アンド・ハース社
製、２００　ｌｌ１１２）カラムを流下さけ、１５０ｍ
ｃの脱イオン水でカラムを洗浄し、カチオン除去した後
、活性炭（７０ｍ＆）カラムを通し、５０ｍＣの脱イオ
ン水でカラムを洗浄して、脱色した。通過液７８０Ｈ７
をＣａ（ＯＨ）ｔでｐＨを６．５に調製し、ろ過によっ
て白蜀を除いた後、減圧下において約２０−にまで濃縮
した。

濃縮液には白色の無定型結晶が生じる。この結晶をガラ
スフィルター上に集め、少量の冷水、メタノールおよび
エチルエーテルで洗浄し、減圧下に乾燥し、５．０４ｇ
の２−ケトーＤ−グルカル〜シカルシウム・３．５水塩
を得た。この結晶の分析値は下記に示すとおりである。

融点：１５２〜１５７℃（分解） 元素分析値（Ｃ，Ｉ−（、Ｏ，Ｃａ−３，５１−（，０
８％）：理論値：Ｃ；２３．３０．Ｈ，４，２４゜Ｃａ
；１２．９６ 測定値：Ｃ；２３．１５．Ｈ；４．１８゜Ｃａ；１４．
００ 比旋光度：［α］ｔ５−＋９．Ｑ°（ｃｍ１．０７５゜
Ｏ，ＩＮＨＣＩ） 赤外部（ＩＲ）吸収スペクトル；主な吸収を示す波数（
ｃｍ　’）３５９０，３５００．３４００〜２７注） ００（ｂｒ）　　　、１６５０．１６００，１４３０．
１３８０．１３６０，１３００，１２５０．１２４０．
１２２０４１２５．１０９５，１０６５．＋０４０゜＋
００５，９９５．９５５，９００，８４０，８００゜７
６５．７２５ 注）ただしｂｒはブロードを表わす。

実施例１ Ｄ−グルコース２．０％、ペプトン１．０％、乾燥酵母
１．０％およびＣａ　ＣＯ３２、０％からなる種培地２
０ｍ（！を２００ｍＣ容の三角フラスコに分注し、あら
かじめ１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。このフラスコ
に、Ｄ−ソルビトール２．５％、ペプトン１．０％、酵
母エキス１．０％、Ｃａ　ＣＯ３０。

２％および寒天２．０％からなる斜面培地上て２８°Ｃ
，４日間生育した。シュードモナス・ツルボッキンダン
ス　５２６−２１株（ＦＥｆｌＭ　　Ｐ　−８７５０、
ＩＦＯ１４５０１）の菌体−白金耳を植菌し、３０℃で
２日間振盪（２００ｒｐｍ）培養し、種培養液を得た。

種培地と同組成の培地２００ｍＱをＩＱ容の三ｆｆ＋フ
ラスコに分注し、上記と同様に滅菌し、このフラスコに
種培養液１０１を移植後、３０℃で３日間振盪培養を行
なった。

得られた培養液には、！６．２π９／ｍＱの２−ケｉＤ
−グルカル酸が生成していた。

この培養液１３５０ｍＱを遠心分離（７，００Ｏｒｐｍ
、１０分）して菌体を含む沈澱物を除き、上ｌＷ１３０
０ｍＣを得た。上清を４℃に冷却後、３日間静置すると
、無定形の２−ケトーＤ−グルカル酸カルシウム塩結晶
が生しる。生成した結晶をガラスフィルター（Ｎｏ、　
３　）上に集め、少量の冷水、メタノールおよびエチル
エーテルで洗浄し、五酸化リン上で減圧下に乾燥した。

斯くして、１２．５ｇの２−ケトーＤ−グルカル酸ジカ
ルノウム・３水塩を得た。得られた結晶の分析値は下記
に示すとおりである。

融点：１５１〜１５５°Ｃ（分解） 元素分析値（ＣｅＨ−ＯａＣａ・３．５ＨｚＯＸ％）理
論値：Ｃ；２３．３０．　［１，４，２４゜Ｃａ；１２
．９Ｂ 測定値：Ｃ；２２．７５．Ｈ；３．８２゜Ｃａ；１１．
８８ 比旋光度、［αコ２５＝＋５．７°（ｃｍ０．９９８゜
Ｏ，ＩＮＨＣＩ） 赤外１（ＩＲ）吸収スペクトル：主な吸収を示す波数（
ｃｍつ３５９０，３５００．３４００〜２７注） ００（ｂｒ）　　　、ｌ６５０．ｌ６００，１４３０．
１３８０、＋３６０．１３００．＋２５０．１２４０．
＋２２０．１１２５．ｌ０９５，１０６５，１０４０゜
１００５．９９５，９５５，９００，８４０，８００゜
７６５．７２５ 注）ただしｂｒはブロードを表わす。

この結晶標品と標準品は同一の赤外スペクトル（第１図
および第２図）を示した。また、高速液体クロマトグラ
フィー法での保持時間（９，４分）および２１４ｎｍに
おける紫外部吸収と示差屈折強度との比（約１．０）は
標準品と同じであった。さらに薄層クロマトグラフィー
ではフェノール：蟻酸；水（７５＋５：２５）の溶媒と
セルロースプレート（メルク社製）を用いて、両標品を
室温で３時間展開すると、同じ０．２０のＲＩ′値を示
した。また両者は硝酸銀試薬では黒褐色の、０−フェニ
レンジアミン試薬では黄色の、アニリンフタル酸試薬で
は黄色の同じ呈色を示した。

以上の結果からシュードモナス　ツルボッキンダンス　
５２６−２１株のグルコース代謝産物を２−ケトーＤ−
グルカル酸であると同定した。

実施例２ 前記実施例１で示したと同じ方法で、ンユードモナス　
ソルホソキンダンス５２６−２１１ｉ（ＦＩＩ、ＲＭ　
　Ｐ−８７５０、ＩＰＯＩ４５０１）、５２６−２２株
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８７５１、ＩＦｏ　　１４５０２）
、および５２６−４２株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８７５２、
ＩＦＯ１４５０３）の種培養液を調製した。Ｃ５Ｌ２．
０％、乾燥酵＠０５％、硫酸アンモニウム０．５％、チ
オ硫酸ソーダ０．０５％、硫酸鉄０．２％、ＣａＣＯ３
３，０％、からなる培地（ｐＨ６，５）に第１表に示し
た原料糖類（５％）を別途滅菌して添加（２、醗酵培地
を作成した。この醗酵培地２５ｍ（２を含む２００ｖ２
容の三角フラスコに１．２５＋＋＋Ｑの種培養液を移植
し、３０°Ｃて３日間振盪培養した。培養液を０．３Ｎ
硫酸で希釈し、その遠心上清について高速液体クロマト
グラフィーで２−ケトーＤ−グルカル酸を定量した。こ
の結果を第１表に示す。

第１表　２−ケトーＤ−グルカル酸の生成量発明の効果 本発明はンユードモナス属に属し、Ｄ−グルコース等を
２−ケト−■）−グルカル酸に酸化する能力を有する微
生物を用いる方法により、２−ケトーＤ−グルカル酸を
収率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた結晶標品の赤外部吸収ス
ペクトルを、第２図は、参考例で得られた標準品の赤外
部吸収スペクトルをそれぞれ表わす。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノ
   ース、Ｄ−ソルビットまたはＤ−マンニットを２−ケト
   −Ｄ−グルカル酸に酸化する能力を有し、シュードモナ
   ス属に属する微生物またはその処理物を、Ｄ−グルコー
   ス、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ソルビッ
   トまたはＤ−マンニットに接触させて２−ケト−Ｄ−グ
   ルカル酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
   とする２−ケト−Ｄ−グルカル酸の製造法。