DK174267B1 - Fremgangsmåde til oprensning af 2-keto-L-gulonsyre - Google Patents

Description

DK 174267 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til oprensning af 2-keto-L-gulonsyre, en forbindelse der er nyttig som mellemprodukt til syntese af L-ascorbinsyre.

Der kendes forskellige fremgangsmåder til fremstilling af L-ascorbinsyre ud fra 2-keto-L-gulonsyre, bl.a. en fremgangsmåde ved hvilken man underkaster 2-keto-L-gulonsyre 5 forestring med metanol ved hjælp af diazometan, dimethylsulfat eller lignende forbindelser, hvorefter man omsætter esteren med methylat i methanol til dannelse af det tilsvarende natriumsalt, efterfulgt af nedbrydning af natriumsaltet med saltsyre (Progress af Vitaminology, Second Series, Compiled by Japan Vitamin Academy (1960), side 123-124); eller en fremgangsmåde ved hvilken man lader en mineralsk syre indvirke på 2-10 keto-L-gulonsyre i nærværelse af et inert opløsningsmiddel og et overfladeaktivt stof for derved direkte at enolisere 2-keto-L-gulonsyre til dannelse af L-ascorbinsyre (japansk patentpublikationnr. 48-15931). Disse reaktioner til syntese af L-ascorbinsyre kan i alle tilfælde forløbe ved, at man bruger 2-keto-L-gulonsyre som fri syre eller som et metalsalt såsom natriumsaltet eller calciumsaltet. I tilfælde af at man bruger et metalsalt, 15 bliver den mængde af mineralsk syre og den mængde alkali som man skal bruge til neutralisering større end ellers, og en kompliceret proces bliver nødvendig til ffaskillel-se af det som biprodukt dannede salt, hvorved man uundgåeligt får en nedsættelse af udbyttet af L-ascorbinsyre. Til fremstilling af L-ascorbinsyre på en industrielt fordelagtig måde må det derfor foretrækkes at bruge det syntetiske mellemprodukt 2-keto-L-gulon-20 syre i form af den fri syre. I det følgende vil den fri syre 2-keto-L-gulonsyre i nogle tilfælde blive betegnet 2K.GA.

Ved en generel gennemgang af de hidtil kendte teknikker ud fra synspunkter som ovenfor anført viser det sig, at der foreligger adskillige fremgangsmåder til fraskillelse af 2-keto-L-gulonsyre indeholdt i gæringssupper, nemlig fremgangsmåder til fraskillelse af 25 natriumsaltet af 2KGA (de japanske patentpublikationer nr. 52-66684,52-66685 og 53-62894) såvel som fremgangsmåder til fraskillelse af 2KG A. Som eksempler på de kendte fremgangsmåder kan følgende nævnes.

I ' 2 DK 174267 B1

(1) En fremgangsmåde til fraskillelse af 2KGA som består i, at man underkaster gærings-suppen filtrering, og derefter koncentrering til udfældning af calciumsaltet af 2-keto-L-gu lonsyre, hvorpå man fraskiller calciumsaltet, behandler det med svovlsyre for at fjerne gipsen, koncentrerer opløsningen, og derefter fraskiller det 2KG A, som udskiller sig (US

5 patentskrifter nr. 2.421.611 og 2.421.612).

(2) En fremgangsmåde til fraskillelse af2KGA, ved hvilken man underkaster gæringssuppen filtrering, behandler filtratet med en kationbytterharpiks (i H-foim), koncentrerer det behandlede filtrat til udfældning af 2KGA, og derefter fraskiller det udfældede 2KGA (japansk patentpublikation nr. 41-5907).

10 3) En fremgangsmåde til fraskillelse af 2KGA, som omfatter følgende processer: Gæringssuppen underkastes filtrering, og filtratet føres gennem en "Amberlite"® 200 harpiks (H-form), hvorefter man laden effluenten passere gennem ''Amberlite”® XE-168, så at 2KGA kan adsorberes på harpiksen. Eluering af 2KGA udføres derefter ved hjælp af IN ammoniakvand og eluatet koncentreres under nedsat tryk. Til koncentratet sættes 15 den aktiveret trækul foT at affarve det, og det resulterende materiale behandles med "Amberiite"®-200 for at regulere pH-værdien til ca. 1,5. Til opløsningen sættes der calciumhydroxid for at regulere pH-værdien til 6,0-6,5 og den underkastes derefter filtrering. Filtratet behandles på ny med "Amberlite"®-200 harpiks for at regulere pH-værdien til ca. 1,5 og man lader derefter 2KGA blive adsorberettil "Amberlite"® XE-168 20 efterfulgt af eluering deraf med O, IN ammoniakvand. Eluatet behandles derefter med "Amberlite"® IR-200 (H-form) for at fjerne ammoniak og koncentreres derefter under nedsat tryk til fraskillelse af2KGA (japansk patentpublikation nr. 51-40154).

Det er den foreliggende opfindelses formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til fraskillelse af 2KGA med højt udbytte fra en gæringssuppe i en form med en så høj kvalitet, at 25 den med fordel kan bruges til syntese af L-ascorbinsyre.

3 DK 174267 B1

Under henvisning til dette formål skal de ovennævnte kendte teknikker til fraskillelse af 2KGA diskuteres nærmere.

Fremgangsmåde (1) omfatter komplekse processer såsom udfældning og separation af et calciumsalt, udfældning og separation af gips og desuden udfældning og separation af 5 2KGA foruden filtrering af gæringssuppen, og udbyttet bliver derfor lavt. Eftersom opløseligheden af calciumsaltet er høj, bliver viskositeten af den fremkomne opløsning høj, når man lader calciumsaltet blive udfældet ved koncentrering i høj grad, og denne høje viskositet resulterer i ringe krystalvækst, så der kun fremkommer fine krystaller, hvilket gør det bemærkelsesværdigt vanskeligt at fraskille krystallerne. Da den gips, der 10 stadig er tilbage i opløst tilstand i filtratet, udfældes ved koncentrering, hæmmes fraskil-lelsen af krystaller af 2KGA, hvilket uundgåeligt bevirker nedsættelse af produktets kvalitet. Den ovenfor beskrevne metode (1) kan derfor ikke anses for at være industrielt fordelagtig.

Da gæringssuppen ved metode (2) indeholder forskellige urenheder, herunder uopløseli-15 ge urenheder såsom cellerester og metalioner, er blot filtrering af gæringssuppen og behandling med en kationbytterharpiks (i H-formen) ikke tilstrækkelig til at ijeme disse urenheder, og opløsningens viskositet stiger, så at krystalvæksten inhiberes, hvorved der kun fremkommer fine krystaller, så at fraskillelsen af krystallerne bliver bemærkelsesværdigt vanskelig, hvilket gør fremgangsmåden uegnet, fordi kvaliteten og udbyttet af 20 krystaller nedsættes. Metode (2) kan derfor heller ikke anses for at være industrielt fordelagtig.

Metode (3) fordrer foruden filtrering af gæringssuppen og behandlingen med "Amberlite"®-200 (H-form) alt for komplicerede processer, således at den aldrig kan anses som anvendelig på industrielt fordelagtig måde.

1 i 25 I betragtning af omstændigheder som de ovennævnte har nærværende opfindere foretaget undersøgelser med henblik på at finde frem til en fremgangsmåde til udskillelse af 4 DK 174267 B1 2KGA med høj kvalitet og i højt udbytte fra en gæringssuppe indeholdende 2KGA eller et vandopløseligt salt deraf, og som resultat kom de frem til, at det var særdeles vigtigt og afgørende, at man ved udfældningen af 2KGA holdt indholdet af anioniske urenheder på et sådant niveau, at de ikke oversteg en given mængde, og dette har så ført til den 5 foreliggende opfindelse.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til oprensning af 2-keto-L-gulonsyre eller et vandopløseligt salt deraf, og den er ejendommelig ved, at man bringer en vandig deka-tioniseret opløsning af 2-keto-L-gulonsyre eller et vandopløseligt salt deraf, som indeholder en sur urenhed hvis surhed er højere end surheden af 2-keto-L-gulonsyre, i kon-10 takt med en anionbytterharpiks, hvorpå man lader 2-keto-L-gulonsyren eller detvandoplø-selige salt deraf udfælde fra den behandlede opløsning, i hvilken mængden af sur urenhed er reduceret til en mængde på 30% eller derunder ved adsorption.

Som eksempler på egnede vandopløselige salte af 2-keto-L-gulonsyre nævnes natriumsaltet, kaliumsaltet og calciumsaltet.

15 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan man som vandig opløsning af 2KGA eller et vandopløseligt salt deraf, som skal bringes i kontakt med en anionbytterharpiks og som i det følgende i nogle tilfælde for enkelthedens skyld vil blive betegnet "udgangsopløs-ningen”, fx bruge en gæringssuppe indeholdende 2KG A eller et vandopløseligt salt deraf, vundet ved den fremgangsmåde der er angivet i ueksamineret japansk offentliggjort 20 patentansøgning nr. 62-228288 (europæisk patentpublikation nr. 0221707), som er et mikrobielt gæringsprodukt, eller en vandig opløsning indeholdende 2KGA eller et vandopløseligt salt deraf vundet ved den fremgangsmåde, der er beskrevet i Progress of Vitaminology, Second Series, Compiled by Japan Vitamin Academy (1960), side 121, hvilken fremgangsmåde er en syntetisk proces. Rensningsmetoden ifølge den foreliggen-25 de opfindelse kan med særlig fordel anvendes på en gæringssuppe.

5 DK 174267 B1 Gæringssuppen indeholder forskellige urenheder, herunder uopløselige urenheder såsom cellerester, organiske salte såsom salte med organiske syrer eller aminosyrer, samt fx. forskellige uorganiske salte og pigmenter. Blandt disse urenheder elimineres de uopløselige urenheder såsom cellerester eller tungt opløselige salte såsom calciumoxalat og 5 calciumfosfat fortrinsvis i form af på i og for sig kendte måder som fx centrifugering og/eller filtrering. Metalioner og andre kationiske urenheder fjernes ved dekationisering fortrinsvis ved, at man bringer dem i kontakt med en kationbytterharpiks (i H-form).

Navnlig foretrækkes det at gæringssuppen underkastes filtrering eller centrifugering for at fjerne uopløselige urenheder og tungt opløselige salte, hvorefter den udgangsopløs-10 ning som vindes ved, at filtratet bringes i kontakt med en kationbytterharpiks derpå bringes i kontakt med en anionbytterharpiks.

Som fremgangsmåde til at bringe udgangsopløsningen i kontakt med en anionbytterharpiks og med en kationbytterharpiks nævnes herdels kolonnemetoden og dels portionsme-toden, idet den førstnævnte er den, der foretrækkes til udøvelse af den foreliggende 15 opfindelse i industriel målestok.

I det følgende beskrives ionbytterharpikser, som kan bruges ved den foreliggende opfindelse.

Som anionbytterharpiks kan der bruges en hvilken som helst stærkt, moderat eller svagt basisk anionbytterharpiks; i almindelighed foretrækkes det at anvende svagt basiske 20 anionbytterharpikser og eksempler på disse er "Diaion" WA-30 (OH-form), WA-21 (OH-form) PA-318 (OH-form), PA-412 (OH-form); fremstillet af Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., "Amberlite"® IRA-35 (OH-form), "Amberlite"® IRA-94 (OH-form); fremstillet af Rohm & Haas Co., USA, "Dowex"® 66 (OH-form) og "Dowex"® MWA-1 (OH-form); fremstillet af Dow Chemical Co., USA.

Ϊ ' 6 DK 174267 B1

Som kationbytterharpikser kan der bruges enten stærkt sure eller svagt sure kationbytter-harpikser og i almindelighed foretrækkes de førstnævnte; eksempler herpå er bl.a. "Am-berlite"® 200C (H-form); fremstillet af Rohm & Haas Co., USA, "Diaion" SKIB (H-form), PK216 (H-form); fremstillet af Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., "Dowex"® 5 50W (H-form), "Dowex® 88 (H-form) og MSC-1 (H-form); fremstillet af Dow Chemi cal Co., USA.

I det følgende vil den opløsning, som er blevet bragt i kontakt med en anionbytterharpiks (OH-form) og de anioniske urenheder blive betegnet som henholdsvis "behandlet opløsning" og "AI". AI og mængdeandelen deraf i 2KGA betegner i det følgende "R" og defi-10 neres på følgende måde.

En gæringssuppe indeholdende 2-keto-L-gulonsyre underkastes filtrering eller centrifugering. Den resulterende vandige opløsning af 2KGA eller et vandopløseligt salt deraf dekationiseres med en kationbytterharpiks (H-form) til frembringelse af udgangsopløsningen. Udgangsopløsningen underkastes en neutraliserende titrering for at bestemme 15 syrens ækvivalens, der er defineret som den totale syreækvivalens-koncentration (TA, udtrykt som g-eq/1). Den samme opløsning underkastes HPLC for at bestemme mængden af 2KGA og på basis heraf beregnes syreækvivalens-koncentrationen af 2KGA (2KGA, g-eq/1). Ækvivalenten af AI (AI udtrykt i g-eq/1) og andelen af AI i 2KGA udtrykkes på følgende måder: 20 AI = TA-2KGA (g-eq/1)

AI

R =_x 100(%)

2KGA

R angiver således ækvivalentandelen af en sur urenhed i forhold til 2KGA.

• j DK 174267 B1 7 I almindelighed er værdien af R 30% eller derover for den vandige opløsning, der vindes ved, at man underkaster en gæringssuppe indeholdende 2K.G A eller et vandopløseligt salt deraf filtrering eller centrifugering for at fjerne uopløselige urenheder såsom cellerester samt tungt opløselige salte. Ifølge den foreliggende opfindelse kan gæringssuppen 5 selv bruges som udgangsopløsning. Værdien afR forden behandlede opløsning indstilles til at være ca. 30% eller derunder ved, at man bringer udgangsopløsningen i kontakt med en anionbytterharpiks.

Værdien afR for gæringssuppen er i almindelighed omkring 40-70%. Den sure urenhed indeholder en sådan, hvis surhed er højere end surheden af 2K.GA i en mængde på 50-10 90% i forhold til værdien af R. I henhold til den foreliggende opfindelse bør den sure urenhed, hvis surhed er højere end surheden af 2KGA, absorberes ved kontakt med anionbytterharpiksen.

I det følgende forklares nærmere den mængde af anionbytterharpiksen, som skal bruges ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Mens mængden af harpiksen 15 varierer med sådanne betingelser som værdien af R i udgangsopløsningen, omfanget af udgangsopløsningen og den anvendte harpiks' anionbytterkapacitet, er det i almindelighed ønskeligt at fx en udgangsopløsning, hvis R-værdi er omkring 30-200, bringes i kontakt med en svagt basisk anionbytterharpiks ("Diaion" WA-30 (OH-form), ionbytter-kapacitet 1,5 (meq/ml) eller derover), så at Al-ækvivalenten kan være omkring 2-5 (g-20 eq/1 harpiks) regnet på en mængde på 1 liter harpiks. 1 øvrigt gælder det, at desto mindre værdien af R er i den behandlede opløsning, desto højere bliver udbyttet af 2KGA ved udfældningsprocessen. Hvis imidlertid værdien afR kommer ned på ca. 10% eller derunder, adsorberes 2KGA på en anionbytterharpiks til nedsættelse af udbyttet af 2KG A under kontakt med harpiksen, og derfor foretrækkes det i almindelighed at værdien afR ligger 25 mellem 10% og 25%.

8 DK 174267 B1 I tilfælde af at man bruger en udgangsopløsning, hvis R-værdi er under ca. 30%, kan R nedsættes ved, at man bringer udgangsopløsningen i kontakt med en anionbytterharpiks, så at der kan opnås 2KGA-krystaller med højere krystalrenhed end ellers.

Den på denne måde vundne behandlede opløsning kan om nødvendigt underkastes en 5 affarvningsbehandling ved hjælp af aktiveret trækul eller en affarvende harpiks.

I henhold til oprensningsmetoden ifølge den foreliggende opfindelse kan 2KGA eller et vandopløseligt salt deraf med høj renhed skilles i højt udbytte fra en vandig opløsning af 2KGA eller det vandopløselige salt deraf og indeholdende sure urenheder ved hjælp af et mindre antal behandlingstrin end tilfældet er ved de konventionelle fremgangsmåder.

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil i det følgende blive beskrevet mere udførligt under henvisning til nogle referenceeksempler, forsøg og eksempler. Den i disse anvendte gæringssuppe er den, der frembringes ved den fremgangsmåde, der er beskrevet i nedenstående referenceeksempler.

Referenceeksempel 1 15 I en Sakaguchi-kolbe med en kapacitet på 2 liter blev der anbragt 500 ml af et fordyrkningsmedium indeholdende 2,0% glukose, 1,0% pepton, 1,0% tørgær, 2,0% kaliumcar-bonat og 0,01% "Actocol" (antiskumningsmiddel fremstillet af Takeda Chemical Industries, Ltd.), og mediet blev dampsteriliseret ved 120°C i 20 minutter. Denne Sakaguchi-kolbe blev podet med 2-keto-L-gulonsyre-producerede mikroorganismer, nemlig af 20 stammen ΤΗ 14-86 af Pseudogluconobacter saccharoketogenes (IFO 14466, FERM BP-1128) og dyrkningen udførtes ved 28°C i 3 dage under frem- og tilbagegående rystning (85 slag pr. minut) til frembringelse af en forkultur-suppe.

1 en gæringsbeholder med en kapacitet på 50 liter blev der anbragt 30 liter udsædsmedium (pH 6,5) indeholdende 3,0% glukose, 1,0% CSL, 0,5% tørgær, 0,05 natriumtiosul- 9 DK 174267 B1 fat, 0,1% ferrosulfat, 2,0% calciumcarbonat og 0,03 "Actocol" og mediet blev dampsteriliseret ved 125°C i 30 minutter. 500 ml af den på den ovenfor beskrevne måde fremstillede forkultursuppe blev overført til denne gæringsbeholder og blev inkuberet i 3 dage ved 30°C under et indre tryk på 1,0 kg/cm2G under luftning med 30 liter pr.

5 minut og under omrøring ved 200 opm til frembringelse af en udsædskultur-suppe.

På den anden side blev Bacillus megaterium IFO 12108 podet i 500 ml af ovennævnte forkulturmedium som var til stede i en Saltaguchi-kolbe med en kapacitet på 2 liter, og denne kultur blev inkuberet ved 28°C i 2 dage under frem- og tilbagegående rystning (85 spm) til frembringelse af en udsædskultur-suppe af Bacillus megaterium.

10 I en gæringsbeholder med en kapacitet på 200 liter blev der anbragt 65 liter af et dyrkningsmedium indeholdende 3 kg L-sorbose (steriliseret i forvejen), 7 kg calciumcarbonat, 2 kg CSL, 300 g tørgær, 300 g ammoniumsulfat, 500 g natriumtiosulfat, 100 g ferrosulfat, 30 g ''Actocol" og vand. Mediet blev dampsteriliseret ved 125°C i 30 minutter. Til denne gæringsbeholder blev der overført 10 liter af ovennævnte udsædskultur-15 suppe af stammen ΤΉ 14-86 af Pseudogluconobacter saccharoketogenes og 500 ml af udsædskulturopløsningen af bakterien Bacillus megaterium IFO 12108, og inkuberingen blev sat i gang ved 30°C underet indre tryk på 1,0 kg/cm2G og med luftning på 801/min. under omrøring ved 200 opm.

Endelig blev 15 kg L-sorbose opløst i vand, så der fremkom 30 liter opløsning. Denne 20 opløsning blev dampsteriliseret ved I20°C i 20 minutter. Til opløsningen sattes der kontinuerligt en vandig opløsning af sorbose, begyndende 6. time efter igangsætning af inkubering og således, at hele rumfanget var tilsat i løbet af 36 timer.

Efter fuldførelse af tilsætningen af sorbose blev inkuberingen gennemført i yderligere 28 timer under ovennævnte betingelser. Ved denne inkubering i i alt 70 timer blev der 25 opnået en gæringssuppe indeholdende 2-keto-L-gulonsyre.

10 DK 174267 B1

Referenceeksempel 2 I en gæringsbeholder med en kapacitet på 200 liter blev der anbragt 100 liter gæringsmedium indeholdende 11,5% L-sorbose (steriliseret på forhånd), 0,3% tørgær, 3,0% CSL, 0,1% natriumtiosulfat, 0,2% ferrosulfat og 1,0% calciumcarbonat, og det hele blev 5 dampsteriliseret ved 125°C i 30 minutter. Til denne gæringsbeholder blev der overført 10 liter udsædskultur-suppe af stammen Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86. Idet gæringssuppens pH-værdi blev reguleret med 20%s natriumhydroxid blev inkuberingen gennemført i 4 dage ved 30°C under luftning med 80 1/min. og under et indre tryk på 1,0 kg/cm2G under omrøring (200 opm) til frembringelse af en gæringssup-10 pe indeholdende 2-keto-L-gulonsyre.

Referenceeksempel 3 I en Sakaguchi-kolbe med en kapacitet på 2 liter blev der anbragt 500 ml af et forkulturmedium indeholdende 2,0% glukose, 1,0% pepton, 1,0% tørgær, 2,0% calciumcarbonat og 0,01% "Actocol" (antiskumningsmiddel fremstillet af Takeda Chemical Industries, 15 Ltd.), og mediet blev dampsteriliseret ved 120°C i 20 minutter. Denne Sakaguchi-kolbe blev podet med den 2-keto-L-gulonsyreproducerende mikroorganismestamme Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86 (IFO 14466, FERM HP-1128) og der gennemførtes dyrkning ved 28°C i 3 dage under frem- og tilbagegående rystning (85 spm) til frembringelse af en forkultursuppe.

20 I en gæringsbeholder med en kapacitet på 500 liter blev der anbragt 360 liter udsædskul-turmedium (pH 6,5) indeholdende 3,0% glukose, 1,0% CSL, 0,5% tørgær, 0,05 natrium-tiosulfat, 0,1% ferrosulfat, 2,0% calciumcarbonat og 0,03% ''Actocol1' og mediet blev dampsteriliseret ved 125°C i 30 minutter.

En liter af den på den ovenfor beskrevne måde fremstillede forkultursuppe blev overført 25 til denne gæringsbeholder og der blev inkuberet i 3 dage ved 30°C under et indre tryk på 11 DK 174267 B1 1.0 kg/cm2G under luftning med 180 1/min. og omrøring ved 200 opm til f rembringelse i af en udsædskultursuppe.

På den anden side blev Bacillus megaterium IFO 12108 podet i en Sakaguchi-kolbe med en kapacitet på 2 liter og indeholdende 500 ml af ovennævnte forkulturmedium, og den 5 blev inkuberet ved 28°C i 2 dage under frem- og tilbagegående rystning (85 spm) til frembringelse af en udsædskultursuppe med Bacillus megaterium.

I en gæringsbeholder med en kapacitet på 50 liter blev der anbragt 30 liter af ovennævnte forkulturmedium og det blev dampsteriliseret ved 125°C i 30 minutter. Til denne gæringsbeholder blev der overført 500 ml af ovennævnte forkultursuppe af stammen 10 Bacillus megaterium IFO 12108 og den blev inkuberet ved 28°C under et indre tryk på 1.0 kg/cm2G og luftning med 15 1/min. under omrøring (250 opm) til opnåelse af en udsædskultursuppe af Bacillus megaterium.

I en gæringsbeholder med en kapacitet på 6 m3 blev der anbragt 2200 liter af et medium indeholdende 108 kg L-sorbose (steriliseret for forhånd), 252 kg calciumcarbonat, 72 15 kg CSL, 10,8 kg tørgær, 10,8 kg ammoniumsulfat, 1,8 kg natriumtiosulfat, 3,6 kg ferro-sulfat, 1,0 kg "Actocol" og vand. Mediet blev dampsteriliseret ved 125°C i 30 minutter.

Til denne gæringsbeholder blev der overført 350 liter af ovennævnte udsædskultursuppe af Pseudogluconobacter saccharoketogenes ΤΗ 14-86 og 20 liter af udsædskultursuppen af den bakterie, der skal dyrkes sammen med Pseudogluconobacter, nemlig Bacillus 20 megaterium IFO 12108, og inkuberingen blev sat i gang ved 30°C under et indre tryk på 1.0 kg/cm2G under luftning med 1800 1/min. og omrøring ved 90 opm.

Endvidere blev 540 kg L-sorbose opløst i vand, så der fremkom 1000 liter opløsning.

Opløsningen blev dampsteriliseret ved 120°C i 20 minutter og derefter sat til gæringsbeholderen fra den 6. time efter igangsætningen af inkuberingen og således at hele rumfan-25 get blev tilsat i løbet af 36 timer.

12 DK 174267 B1

Efter fuldførelse af tilsætningen af sorbose blev inkuberingen gennemført i yderligere 30 timer under de ovennævnte betingelser. Ved inkuberingen i i alt 72 timer blev der vundet en gæringssuppe indeholdende 2-keto-L-gulonsyre i en mængde på 142 g/1.

Referenceeksempel 4 5 Under et indre tryk på ca, 0 kg/cm2G i gæringsbeholderen blev der sat inkubering i gang på samme måde som beskrevet i referenceeksempel 3. Det indre tryk hævedes med gæringens fremadskriden, så det til sidst var 1,0 kg/cm2G, og inkuberingen udførtes i 66 timer til frembringelse af en gæringssuppe indeholdende samme mængde 2-keto-L-gulonsyre som beskrevet i referenceeksempel 3.

10 Forsøg

Til 60 liter af den på den i referenceeksempel 1 beskrevne måde vundne gæringssuppe blev der sat svovlsyre til regulering af pH-værdien til 1,5, hvorefter uopløselige stoffer blev frafiltreret og filtratet førtes gennem en kolonne pakket med 5 liter "Amberlite"® 200C (H-form). Der fremkom en udgangsopløsning med et rumfang på 77,5 liter forenet 15 med en opløsning ekstruderet med vand, som indeholdt henholdsvis 8156 g (42,0 g-eq) 2KG A og 23,5 g-eq AI, og værdien af R var 56,0%. Denne udgangsopløsning blev opdelt i fem fraktioner og de blev behandlet på de nedenfor beskrevne måder til fraskillelse af 2KGA.

(1) Den første fraktion: 4,0 liter af udgangsopløsningen (indeholdende 421,0 g 2KGA) 20 blev under omrøring koncentreret under nedsat tryk ved 39-41 °C indtil den havde en styrke på 75% v/r (vægt/rumfang, dvs. forholdet mellem enheder af faststof og af væske som mellem gram og milliliter) med hensyn til 2KGA, efterfulgt af afkøling til 5°C i løbet af 12 timer. Krystallerne skiltes fra moderluden ved hjælp af en centrifuge (Koku-san Enshinki Corp., type H-l 10A, 3000 opm), og de blev vasket ved sprøjtning med 80 25 ml vand med en temperatur på 5°C. Moderludens viskositet var 65 centipoise (ved 20°C) 13 DK 174267 B1 og dens pH-værdi var 0,4. De våde krystaller blev tørret ved 30°C under nedsat tryk til frembringelse af 388,2 g af et første udbytte af krystaller. Den mængde 2KGA, som var indeholdt i nævnte første krystaludbytte var 332,6 g og renheden deraf regnet på anhydri-det (i det følgende blot omtalt som renheden), var 93,3%. Moderluden og vaskevæskeme 5 blev forenet og blandingen koncentreredes under nedsat tryk ved 39-41°C under omrøring, indtil den var 55% v/r med hensyn til indhold af 2KGA, og derefter blev der afkølet til 5°C i løbet af 12 timer. Derpå blev krystallerne skilt fra moderluden ved hjælp af den ovenfor omtalte centrifuge og krystallerne blev vasket ved at blive sprøjtet med 20 ml vand med en temperatur på 5°C. Moderludens viskositet var 320 centipoise (ved 10 20°C) og dens pH-værdi var 0,1. De våde krystaller blev tørret ved 30°C under nedsat tryk og der vandtes herved 37,8 g af et næste udbytte af krystaller. Den mængde 2KGA der var til stede i andet krystaludbytte var 29,9 g og renheden deraf var 85,9%. Første krystaludbytte og andet krystaludbytte blev forenet. Udbyttet ved fældning og krystallernes renhed var henholdsvis 86,1% og 92,6%.

15 (2) Anden fraktion: 27,2 liter af udgangsopløsningen (indeholdende 2,862 g 2KGA) førtes gennem en kolonne pakket med 1,7 liter "Diaion" WA-30 (OH-formen). Der vandtes en behandlet opløsning med et rumfang på 30,6 liter forenet med den med vand udtrukne opløsning og den indeholdt 2,860 g (14,7 g-eq) 2KGA og 4,30 g-eq AI og værdien af R var 29,3%. Derefter blev der udtaget 4,50 liter af den behandlede opløsning 20 (indeholdende 421,0 g 2KGA) og den blev behandlet på lignende måde som beskrevet under (1) ovenfor til frembringelse af 373,8 g af et første krystaludbytte (indeholdende 331,7 g 2KG A med renhed 96,8 0. Moderludens viskositet var 30 centipoise (ved 20°C) og dens pH-værdi var 0,9. Der vandtes endvidere 52,1 g af et andet kiystaludbytte (indeholdende 43,8 g 2KGA med renhed 91,70. Moderludens viskositet var 60 centipoi-25 se (ved 20°C) og dens pH-værdi var 0,7. Første og andet krystaludbytte blev forenet. Udbyttet ved udfældning og krystalrenheden var henholdsvis 89,2% og 96,2%.

(3) Tredje fraktion: 22,1 liter af udgangsopløsningen (indeholdende 2326 g 2KGA) blev behandlet med "Diaion" WA30 (OH-form) på lignende måde som beskrevet under (2) 14 DK 174267 B1 ovenfor og der vandtes 25,5 liter behandlet opløsning med et indhold på 2303 g (11,9 g-eq) 2KGA og 2,86 g-eq AI, og værdien af R var 24,0%. Derefter blev der udtaget 4,66 liter af den behandlede opløsning (indeholdende 421,0 g 2KGA) og den blev behandlet på lignende måde som beskrevet under (1) ovenfor til frembringelse af 365,0 g af et 5 første krystaludbytte (indeholdende 328,8 g 2KGA med renhed 98,3%). Moderludens viskositet var 15 centipoise (ved 20°C) og dens pH-værdi var 1,1. Derefter blev der opnået 63,5 g af et andet krystaludbytte (indeholdende 54,7 g 2KGA med renhed 94,2%). Moderludens viskositet var 32 centipoise (ved 20°C) og dens pH-værdi var 1,0. Første krystaludbytte og andet kiystaludbytte blev forenet. Udbyttet ved udfældning og 10 krystalrenheden var henholdsvis 91,1 % og 97,7%.

(4) Fjerde fraktion: 13,6 liter af udgangsopløsningen (indeholdende: 1,431 g 2KG A) blev behandlet med "Diaion" WA30 (OH-form) på lignende måde som beskrevet under (2) ovenfor til frembringelse af 17,0 liter behandlet opløsning, og den indeholdt 1,374 g (7,08 g-eq) 2KGA og 0,885 g-eq AI, og værdien af R var 12,5%. Derefter blev der udta- 15 get 5,21 liter af den behandlede opløsning (indeholdende 421,0 g 2KGA) og den blev behandlet på lignende måde som beskrevet under (1) ovenfor til frembringelse af 357,4 g af et første kiystaludbytte (indeholdende 327,1 g 2KGA med renhed 100%). Moderludens viskositet var 10 centipoise (ved 20°C) og dens pH-værdi viste sig at være 1,4. Derefter vandtes der 74,6 g af et andet krystaludbytte (indeholdende 66,5 g 2KGA med 20 enhed 97,2%). Moderludens viskositet var 19 centipoise (ved 20°C) og dens pH-værdi var 1,3. Første krystaludbytte og andet krystaludbytte blev forenet. Udbyttet ved udfældningen og krystallernes renhed var henholdsvis 93,5% og 99,7%.

(5) Femte fraktion: 6,80 liter af udgangsopløsningen (indeholdende 715,6 g 2KG A) blev behandlet med "Diaion" WA30 (OH-form) på lignende måde som beskrevet under (2) 25 ovenfor til frembringelse af 10,2 liter behandlet opløsning som indeholdt 566,8 g (2,92 g-eq) 2KGA og 0,162 g-eq AI, og værdien af R var 5,55%. Derefter blev der udtaget 7,58 liter af den behandlede opløsning (indeholdende 421,2 g 2KGA) og den blev behandlet på lignende måde som beskrevet under (1) ovenfor til frembringelse af 355,0 g af et - DK 174267 B1 15 første krystaludbytte (indeholdende 324,3 g 2KGA med renhed 100%). Moderludens viskositet var 7 centipoise (ved 20°C) og dens pH-værdi viste sig at være 1,4. Desuden blev der opnået 87,9 g af et næste krystaludbytte (indeholdende 78,4 g 2KGA med renhed 97,5%). Viskositeten af moderluden var 11 centipoise (ved 20°C) og dens pH-værdi var 5 1,3. Første krystaludbytte og andet krystaludbytte blev forenet. Udbyttet ved udfældning var 95,6% og krystallernes renhed var 99,5%.

Disse resultater er sammenfattet i omstående tabel 1.

Tabel 1

Fraktion Udgangs- Behandling med an- Behandlet Udfældning2) opløsning ionbytterharpiks opløsning krystal- R, behandlet udbytte, R, udbytte, renhed, % mængde1) % % % % 10 første 56,0__-__-__-__86,1 92,6 anden 56,0 4,85 99,9 29,3 89,2 96,2 tredje 56,0 3,94 99,0 24,0 91,1 97,7 fjerde 56,0 2,42 96,0 12,5 93,5 99,7 femte__56,0 1,21 79,2__5,6 95,6 99,5 15 Note1) Mængden af Al i den tilførte udgangsopløsning pr. 1 liter anionbytterhar piks (OH-form); enhed; AI g-eq. pr. liter harpiks

Note2) Udbyttet af udfældningen af det første krystaludbytte forenet med det andet krystaludbytte samt anhydridets krystalrenhed

Som det ses af den første del af tabel 1, så var fraskillelsen af krystallerne fra moderlu-20 den særdeles vanskelig og udbyttet af udfældningen og krystalrenheden var bemærkelsesværdigt lave, når der vandtes krystaller af 2KG A ved koncentrering af den udgangsopløs- 16 DK 174267 B1 ning, der var fremstillet ved filtrering af gæringssuppen og påfølgende behandling af filtratet med en kationbytterhaipiks i H-formen. I de sidste fire kolonner af tabel 1 er vist de resultater, som blev opnået, når udgangsopløsningen blev behandlet med en anionbyt-terharpiks (i OH-formen) til delvis fjernelse af AI, efterfulgt af koncentrering for at lade 5 2KGA krystallisere. I anden, tredje og fjerde fraktion ses det, at desto mindre mængde udgangsopløsning der blev behandlet med en anionbytterharpiks, desto mindre var forholdet mellem AI og 2KGA, hvilket viser, at fraskilleligheden af krystaller fra AI blev forbedret hvilket resulterede i øgning af udbyttet af udfældningen og krystallernes renhed.

Som det ses i den femte kolonne af tabellen gik andelen af AI i den behandlede opløsning 10 i forhold til 2KGA yderligere ned, når der blev brugt endnu mindre mængde udgangsopløsning, men når den blev behandlet med en anionbytterharpiks, blev en del af den dannede mængde 2KGA adsorberet på harpiksen, således at det samlede udbytte der opnåedes ved behandlingen med anionbytterharpiksen og den påfølgende udfældning gik ned.

15 Af det foregående ses det, at når en udgangsopløsning med en høj andel af AI i forhold til 2KGA koncentreres som den er for at muliggøre at 2KGA krystalliserer derfra, så bliver fraskillelsen af krystallerne fra moderluden særdeles vanskelig og desuden bliver udbyttet af udfældningen og krystallernes renhed lavere; det er derfor uønskeligt at bruge en sådan fremgangsmåde i industriel målestok. Det er imidlertid klart, at når udgangs-20 opløsningen behandles med en anionbytterharpiks i OH-formen i en sådan grad, at der ikke sker noget væsentligt adsorptionstab af 2KGA, og også når blandingsforholdet mellem AI og 2KGA kontrolleres til i almindelighed ikke at overstige ca. 30% af førstnævnte, fortrinsvis ti 1 at kun at være 20% eller demnder, så kan der fraskilles 2KGA i høj kvalitet og med højt udbytte.

25 Eksempel 1 7,0 liter gæringssuppe (indeholdende 1,006 g 2KGA) vundet på den i referenceeksempel 1 beskrevne måde blev filtreret for at fjerne uopløselige stoffer, hvorefter 8,45 liter af 17 DK 174267 B1 filtratet kombineret med vaskevæske blev ført gennem en kolonne pakket med 6,0 liter " Amberlite"® 200C (H-form) til dannelse af 16,0 liter udgangsopløsning kombineret med den opløsning som var behandlet med vand. I udgangsopløsningen var der 922,8 g (4,75 g-eq) 2KGA og 2,54 g-eq AI til stede og R-værdien var 53,5% 12,84 liter af denne 5 udgangsopløsning blev opdelt i to portioner og portionerne blev behandlet på følgende måde.

(1) 6,42 liter af udgangsopløsningen (indeholdende 370,0 g 2KGA) førtes gennem en kolonne pakket med 0,35 liter "Diaion" WA-30 (OH-formen; 2,91 g-eq/1 harpiks som AI) til frembringelse af 7,12 liter af en behandlet opløsning kombineret med den opløs- 10 ning som var udtrukket med vand. I den behandlede opløsning fandtes der 368,0 g (1,90 g-eq) 2KGA og 0,370 g-eq AI og R-værdien var 19,5%. Denne behandlede opløsning blev under omrøring koncentreret under nedsat tryk ved 39-41°C, så der fremkom et rumfang med en koncentration på ca. 70% v/r 2KGA for at gøre det muligt for 2KGA at blive udfældet, hvorefter der blev afkølet til 5°C i 12 timer under omrøring. Ved hjælp 15 af samme centrifuge som anvendt i de foran beskrevne forsøg blev krystallerne skilt fra moderluden og vasket med sprøjtning af 70 ml vand med en temperatur på 5°C. De våde krystaller blev tørret ved 30°C under nedsat tryk til frembringelse af 304,3 g af et første krystaludbytte. Indholdet af 2K.GA i dette første kiystaludbytte var 277,8 g og deres renhed var 99,9%. Moderluden forenet med vaskevæskeme blev koncentreret under 20 nedsat tryk ved 3941 °C indtil koncentrationen var ca. 50% v/r 2KGA for herved at gøre det muligt for 2KGA at blive udfældet; derefter blev der afkølet til 5°C under omrøring i 12 timer. Ved hjælp af samme centrifuge som anvendt i de foran beskrevne forsøg blev krystallerne skilt fra moderluden og vasket ved at der blev sprøjtet 20 ml vand med en temperatur på 5°C derpå. De våde krystaller blev tørret under nedsat tryk ved 30°C og der 25 vandtes 68,1 g af et andet krystaludbytte indeholdende 61,1 g 2KGA med en renhed på 98,1%.

(2) 6,42 liter af udgangsopløsningen (indeholdende 370,0 g 2KGA) blev på lignende måde som beskrevet ovenfor under (1) koncentreret for at bevirke udfældning, hvorefter 18 DK 174267 B1 krystallerne blev fraskilt til udfældning af 2KGA. Det første krystaludbytte androg 329,4 g (indeholdende 284,2 g 2KGA med en renhed på 94,1%) og det andet krystaludbytte androg 33,8 g (indeholdende 27,0 g 2KGA med en renhed på 86,2%).

Eksempel 2 5 40 liter af den på den i referenceeksempel 2 beskrevne måde vundne gæringssuppe blev underkastet filtrering ved hjælp af et keramisk filter (Toshiba Ceramics Ltd.), "Membra-lox"® multi-type media P19 XL, 750 mm, 0,2 pm) for at fjerne uopløselige stoffer og efterlade 56 liter klart filtrat. 8,35 liter af filtratet blev udtaget og ført gennem en kolonne pakket med 5,5 liter "Diaion" SKIB (H-form) til frembringelse af 19,4 liter udgangs-10 opløsning kombineret med den opløsning, der var udtrukket med vand. Udgangsopløsnin gen indeholdt 848,0 (4,37 g-eq) 2KGA og 2,54 g-eq AI, og R-værdien viste sig at være 58,1%. 18,3 liter af udgangsopløsningen blev opdelt i to portioner og portionerne behandledes på følgende måde.

(1) 9,15 liter af udgangsopløsningen (indeholdende 400,0 g 2KGA) blev ført gennem en 15 kolonne pakket med 0,30 liter "Diaion" PA318 (OH-form; 3,99 g-eq/1 harpiks som AI) og der fremkom 9,75 liter behandlet opløsning, hvori der var indeholdt 399,0 g (2,06 g-eq) 2KG A og 0,493 g-eq AI, og R-værdien var 24,0%. Denne behandlede opløsning blev på lignende måde som beskrevet i eksempel 1 (1) underkastet koncentrering for at bevirke udfældning og fraskillelse af krystaller til udvinding af 2KGA. Det første udbytte af 20 krystaller androg 325,2 g indeholdende 296,5 g 2KGA med en renhed på 99,6%; og det andet udbytte af krystaller androg 83,4 g indeholdende 75,0 g 2KGA med en renhed på 98,3%.

(2) 9,15 liter af udgangsopløsningen, indeholdende400,0 g 2KGA, blev på lignende måde som beskrevet i eksempel 1(1) underkastet koncentrering for at bevirke udfældning og 25 fraskillelse af krystaller til udvinding af 2KGA. Det første udbytte af krystaller androg a 19 DK 174267 B1 352,0 g med et indhold på 304,0 g 2KGA med en renhed på 93,9%, mens det andet udbytte af krystaller androg 44,6 g og indeholdt 35,2 g 2KGA med en renhed på 85,2%.

20 DK 174267 B1

Eksempel 3

Til 1820 liter af den på den i referenceeksempel 3 beskrevne måde vundne gæringssuppe blev der sat svovlsyre til regulering af pH-værdien til 1,5, hvorefter uopløselige stoffer fjernedes ved filtrering ved hjælp af et tromlefilter af Oliver-type (Daiki Gum Industries 5 Co. Ltd., filterareal 4,5 m2) som var for-coated med 40 kg "Hyflo Super Cell"® og 20 kg "Standard Super Cell"® til frembringelse af 2160 liter filtrat forenet med en opløsning udtrukket med vand.

Filtratet, 1400 liter, førtes gennem en kolonne (35 x 220 cm) pakket med "Diaion" PK216 (H-form, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) til frembringelse af 1710 liter 10 af udgangsopløsningen kombineret med en opløsning udtrukket med vand. Udgangsopløs- ningen indeholdt 136,8 kg (705 g-eq) 2KGA og 419 g-eq AI og R-værdien var 59,5%.

Denne udgangsopløsning blev behandlet til udvinding af 2KGA på følgende måde.

(1) 800 liter af udgangsopløsningen (indeholdende 64,0 kg 2KGA) blev koncentreret under omrøring og nedsat tryk ved 38-41°C indtil den fik en koncentration af 2KGA på 15 75% v/r, hvorefter den afkøledes til 5°C i 12 timer. Krystallerne blev skilt fra moderlu den ved hjælp af en centrifuge (Matsumoto Kikai Works, type KM-30) med et filtermedium i form af en nylon-sigtedug, og krystallerne blev vasket ved sprøjtning med 7,0 liter vand med en temperatur på 5°C. De våde krystaller blev tørret ved 30°C under nedsat tryk til frembringelse af 59,5 kg af et første krystaludbytte. Den mængde 2KGA der var 20 indeholdt i dette første krystaludbytte androg 51,3 kg og renheden var 93,8%. Moderluden og vaskevæskeme blev forenet og blandingen blev koncentreret under nedsat tryk ved 38-41°C under omrøring indtil mængden af 2KGA blev 55% v/r, hvorpå der blev afkølet til 5°C i løbet af 12 timer. Derpå blev krystallerne skilt fra moderluden ved hjælp af centrifugen med et filtermedium i form af en nylon-sigtedug og de fraskilte krystaller 25 vaskedes ved sprøjtning med 0,5 liter vand med en temperatur på 5°C. De våde krystaller blev tørret ved 30°C under nedsat tryk til frembringelse af 4,50 kg af et næste 21 DK 174267 B1 krystaludbytte. Den mængde 2K.GA der var indeholdt i det andet krystaludbytte var 3,50 kg og renheden deraf var 82,4%.

(2) 800 liter af udgangsopløsningen (indeholdende 64,0 kg 2KGA) førtes gennem en kolonne (3,02 g-eq som AI for hver liter harpiks) pakket med 65 liter "Diaion" PA-412 5 (OHform). Der fremkom en udgangsopløsning med et rumfang på 910 liter kombineret med den opløsning som var udtrukket med vand, og den indeholdt 63,4 kg (327 g-eq) 2KGA og 70,2 g-eq AI, og R-værdien var 21,3%. Derefter blev udgangsopløsningen behandlet på lignende måde som beskrevet ovenfor under (1) til frembringelse af 53,8 kg af det første udbytte af krystaller indeholdende 48,8 kg 2KGA med en renhed på 10 99,1%; og 10,4 kg af det andet krystaludbytte, indeholdende 9,30 kg 2KGA med en renhed på 98,0%.

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til oprensning af 2-keto-L-gulonsyre eller vandopløselige salte deraf, kendetegnet ved, at man bringer en vandig dekationiseret opløsning af 2-5 keto-L-gulonsyre eller det vandopløselige salt deraf, indeholdende en sur urenhed, hvis surhed er højere end surheden af 2-keto-L-gulonsyre, i kontakt med en anionbytterhar-piks, hvorefter man udfælder 2-keto-L-gulonsyren eller dens vandopløselige salt fra den behandlede opløsning, i hvilken mængden af sur urenhed er reduceret til en mængde på 30% eller derunder ved adsorption.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at dekationiseringen af den vandige opløsning af 2-keto-L-gulonsyre eller det vandopløselige salt deraf er sket ved, at den er blevet bragt i kontakt med en kationbytterharpiks.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den vandige opløsning af 2-keto-L-gulonsyre eller det vandopløselige salt deraf indeholder den sure 15 urenhed i en mængde på 30% eller derover, fortrinsvis 30-200, regnet som ækvivalent mængde i forhold til 2-keto-L-gulonsyre.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at mængden af sur urenhed i den behandlede opløsning er 10-25%, regnet som ækvivalent mængde i forhold til 2-keto-L-gulonsyre.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at der som anionbyttterharpiks bruges "Diaion" WA-30 (OH-form), "Diaion" WA-21 (OH-form), "Diaion" PA-412 (OH-form), “Diaion” PA-318 (OH-form), "Amberlite"® IRA-35 (OH-form), "Amberlite"® IRA-94 (OH-form), "Dowex"® 66 (OH-form), eller "Dowex"® MWA-1 (OH-form). DK 174267 B1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at kationbytterharpiksen var en stærkt sur kationbytterharpiks.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at der som kationbytterharpiks blev brugt "Amberlite"® 200C (H-form), "Diaion" SKIB (H-form), “Diaion” PA-318 (OH- 5 form), "Dowex"® 50W (H-form), "Dowex"® 88 (H-form) eller "Dowex"® MSC-1 (H-form).

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den vandige opløsning af 2-keto-L-gulonsyre eller det vandopløselige salt deraf indeholdende den sure urenhed i en mængde på 30-200%, regnet som ækvivalent mængde urenhed i forhold til mængden 10 af 2-keto-L-gulonsyre, bringes i kontakt med en svagt basisk anionbytterharpiks hvis bytterkapacitet er 1,5 meq/ml eller derover, så at ækvivalentmængden af den sure urenhed bliver omkring 2-5 g-eq/1 harpiks pr. liter harpiks.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at det vandopløselige salt af 2-keto-L-gulonsyre er natriumsaltet, kaliumsaltet eller calciumsaltet.