Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia D-ribozy, polegajacy na prowadzeniu hodowli wytwarzajacego D-riboze drobnoustroju, nalezacego do rodzaju Baciilus, odznaczajacego sie brakiem zdolnosci wytwarzania zarodników lub posiadaja¬ cego wysoka zdolnosc utleniania 2-dezoksy-D-glu- kozy, badz posiadajacego obie (te cechy, a takze wykazujacego brak transketolazy lub/oraz 3-epi- merazy D-ribulozofosforanoweg, na pozywce zawie¬ rajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu wraz z substancjami odzywczymi, nizbednymi dla wzro¬ stu danego szczepu w celu wytwarzania i groma¬ dzenia D-iribozy przez ten szczep, a nastepnie wy¬ odrebnienie nagromadzonej w ten sposób D-ribo¬ zy z brzeczki hodowlanej.Jako skladnik kwasów (nukleinowych, D-riboza wystepuje we wszystkich organizmach, a produkt redukcji D-ribozy, rifbitól, znajduje sie .w witami¬ nie B2 i w rifoitolowym kwasie teichoinowyim, kitó- ry jest skladnikiem scian komórkowych.Z tych wzgledów jest to zwiazek o duzym zna¬ czeniu fizjologicznym. Co wiecej, D-riboza oraz jej pochodne wzbudzaly dotad duze zainteresowanie jako substancje wyjsciowe w syntezie witaminy B2 i zawierajacych kwasy nukleinowe dodatków spozywczych, a zatem opracowanie przemyslowej metody wytwarzania D-ribozy stalo sie niezwykle pozadane^ Konwencjonalne sposoby wytwarzania D-ribozy obejmuja metody ekstrakcji tego zwiazku z pro- 2& duktów naturalnych oraz metody syntetyczne, w których jako substancje wyjsciowe wykorzystuje sie tfuran, D-glukoze itip. Istnieja równiez wzmian¬ ki o wytwarzaniu D-ribozy na drodze fermenta¬ cyjnej, ale wydajnosc procesu fermentacji jest wy¬ jatkowo niska. Wymienione siposoiby nie sa w pel¬ ni zadowalajace jako metody wyttwairzania D-ribo¬ zy na skale przemyslowa.Wytwarzanie D-ribozy polegajace na zastosowa¬ niu drobnoustrojów Baciilus dotyczy opisów Sa- sajima i Yoneda, wedlug tego sposobu,' wytwarza¬ jacy D-rilboze mikroorganizm rodzaju 'Baciilus, zu¬ zywajacy przy wzroscie L-tyrozyne, L-tryptofan i L-fenylloalanine hoduje sie na pozywce, zawiera¬ jacej L-tyrozyne, L-itryptofan i L-fenyloalataine w ilosciach przekraczajacydh ok. 100v/md. Wedlug in¬ nego sposobu stosuje sie odznaczajace sie brakiem transketolazy szczepy rodzaju Baciilus, Shi 5 i Shi 7 lub wykazujacy brak 3-epimerazy D-ribulo- zofosforanowej szczep rodzaju Baciilus, Gluc 34.Pierwsza z tych metod opisano w opisie patento¬ wym brytyjskim nr 1 25'5 254, a diruga w Agricul- tuiral and Biological Chemistry, 35, str. 509 (1971).Co do szczepów zastosowanych w pierwszej z me¬ tod, to nie podano jednak w sposób wyrazny cze¬ stotliwosci, z jaka wytwarzaja one zarodniki, zdol¬ nosci utleniania 2-dezoksyHD-glukozy, czy tez ak¬ tywnosci transketolazy i 3-epimerazy D-ribuilozo- fosforanowej (w dalszej czesci opisu enzym ten na¬ zywa sie epimeraza). 95 02695 026 Wystepowanie zdolnosci wytwarzania zarodników w tych szczepach wydaje sie jednak oczywiste, poniewaz wiadomo, ze wytwarzanie zarodników jest jedna ze znamienmycih cech drobnoustrojów rodzaju iBacillus, jak -równiez w swietle zasady, wedlug której brak wzmianki o wytwarzaniu za¬ rodników przy opasie dotyczacym drobnoustrojów rodzaju Bacillus, oznacza, ze dany drobnoustrój jesit zdalny do wytwarzania zarodników (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, wydanie 7, 61Q C1&7).Ponadto, te znane szczepy posiadaja bardzo nie¬ wielka aktywnosc ultleniania 2-dezoksy-D-glukazy, co wynika z pomiarów aktywnosci sposobem, po¬ danym w dalszej czesci opisu. Wspomniana aktyw¬ nosc enzymatycznaUych szczepów wynosi 0,01—0,62 mmoli/min na mg proteiny.IW wymienionym opracowaniu przyznaje sie ró¬ wniez, ze ilosc D-,ribozy, otrzymanej opisanymi sposobami wynosi,, w najlepszym przypadku, za¬ ledwie 35,3 mg/mll.W tabeli przytoczono dane, dotyczace zdolnosci utleniania 2-dezoksy-iD-glukozy, mierzcinej dla omawianych szczepów za pomoca opisanego dalej sposobu, oraz najwieksza ilosc D-ribozy, nagroma¬ dzonej w brzeczce z wylzej wymienionych hodowli.Tabela Brytyjski opis pa¬ tentowy nr 1BI55254 AgricuH- turad and Biological Chemi- sftry 35, 500 (1071) < Mikroorganizm Badillus pu- milus No. 503 Bacillus pu- milus No. 537 Bacillus pu- milus No. 558 Bacillus sub- tilis No. 429 Bacillus sub¬ tilis No. 483 Badillus spe- cies Shi 5 Bacillus spe- eies Shi 7 Bacilus spe- cies Gluc 34 Zdol¬ nosc u- tlenia- nia 2-dezo- ksy-D- -gluko¬ zy (|i mole/ min) mg pro¬ teiny 0,0jl 0,02 0,vOl aoi f0,01 ¦'0,01 I0i,02 0,01 Nagro¬ madzo¬ na D- -riboza (mg/ ml) 28,5 ,5 29,3 '¦ 2as 29,5 28,4 ,3 24,8.W celu opracowania wydajnego sposobu wy¬ twarzania D-ribozy, wykorzystujacego bakterie ro- 40 45 50 55 60 65 dzaju Bacillus, podjeto intensywne badani^, w wy¬ niku których udalo sie stwierdzic, ze mutanty ro¬ dzaju Bacillus, które odznaczaja sie jednoczesnie brakiem transketolazy lub/oraz epimerazy i bra¬ kiem zdolnosci wytwarzania zarodaiików, jak ró¬ wniez/lub wysoka aktywnoscia utleniania 2-dezo- ksy-D-glukozy, posiadaja niezwykle : rozwinieta zdolnosc gromadzenia D-ribozy. ; , Sposób wytwarzania D-ribozy na jcjft?oc|ze hodo¬ wli Bacillus subtilis w srodowisku zawierajacym zródlo przyswajalnego wegla oraz azotu i sub¬ stancje odzywcze, niezbedne dla wzrostu mikro¬ organizmu, przy czym wymieniony mikroorganizm wytwarza i akumuluje D-riboze, która nastepnie wyodrebnia sie z brzeczki fermentacyjnej, wedlug wynalazku polega na tym, ze-v hodowli poddaje sie mutant Bacillus subtilis, taki jak Bacillus sub¬ tilis nr 057 (IFO 13565), Bacillus subtilis nr 941 (IFO 1C573), Bacillus subtilis nr 1054 (IFO 13586), Bacillus subtilis nr 1067 (IFO 13588), lub Bacillus subtilis nr 1097 (IFO 13621), Ponizej przedstawiono sposób wytwarzania mu¬ tantów o odpowiedniej aktywnosci transketolazo- wej.Podczas naswietlania promieniami ultrafioleto¬ wymi stosuje sie nizej podana procedure. Szczep macierzysty hoduje sie w temperaturze 37°fc w ciagu kilku dni na agarze ziemniaczanym, zawie¬ rajacym 20,0% ziemniaka, 2,0!% D-glukozy, 0,04 m M MnCl2 oraz 2,0fyo agaru i umieszcza w lodówce na kilka dni. Wytworzone w ten sposób zarodniki zbiera sie i wprowadza do sterylizowanej, desty¬ lowanej wody do wytworzenia zawiesiny, zawie¬ rajacej w 1 ml okolo .5X'3W)a zarodników, która ogrzewa sie w ciagu 10 minut w temperaturze 80°C. Plytke Petriego z 5, ml otrzymanej zawiesi¬ ny zarodników poddaje sie nastepnie naswietlaniu lampa ultrafioletowa (15 W), umieszczona na wy¬ sokosci 30 cm nad plytka. Zawiesine zarodników miesza sie lagodnie co pól minuty. W danym za¬ kresie — zazwyczaj 4^-6 min, %5 ml zawiesiny zarodników wprowadza sie do 4,5 ml sterylizowa¬ nej, destylowanej wody i dodatkowo rozciencza do otrzymania zawiesiny, zawierajacej w 1 ml okolo 2X103 zarodników.Podczas stosowania N-metylo-N'-nitro-N-nitro- zoguanidyny jako czynnika mutagennego stosowa¬ no nizej podana procedure. Szczep macierzysty wzrastal w temperaturze 37°C w ciagu nocy w pozywce, zawierajacej 1% sorbitu, 1,0% peptonu, 0,2% ekstraktu drozdzy i 0,2% NaCl. Komórki zbierano przez odwirowanie i przemywano dwu¬ krotnie 0,01 M buforem tris-HCl o pH=7,5,:. po czym wytwarza z nich zawiesine w tym samym buforze, zawierajacym N-metylo-N^nitro-N-nitrozo- guanidyny w stezeniu 300 jig w ml z otrzymaniem zawiesiny komórek o gestosci optycznej 10 przy dlugosci fali 650 nm, która inkubuje sie w tempe¬ raturze 30°C w ciagu 30 minut. Inkubowana za¬ wiesine komórek rozciencza * sie do otrzymania za¬ wiesiny, zawierajacej w 1 ml okolo 20100 zdolnych do zycia komórek. ml .rozcienczonej zawiesiny zarodników lub rozcienczona zawiesine, komórek, otrzymana po¬ wyzej, wlewa sie na plytke, zawierajaca pozyw¬ ke agarowa. Po jednym lub dwóch dniach inku-95 026 6 bacji wytworzone kolonie powtarza sie zarówno w zmodyfikowanym srodowisku Spizizen'a, zawiera¬ jacym 1% sorbitu, 0,4% (NH4)jS04, l,4%jK2HP04, 0,8% KH2P04f 0,2% MgS04-7H20, 0,004*/o bioty- ny, 0,6% tiaminy, 0,01087% kwasu szikimowego oraz 2,0%, agaru, jak i srodowisku, zawierajacym wy¬ zej wymienione skladniki oprócz kwasu szikimo-- wego. Nastepnie plytki utrzymuje sie w tempe¬ raturze 37°C w ciagu dwóch lub 3 dni. Kolonie, które wzrastaly w kompletnym srodowisku wy¬ dzielono. Mutanty, wymagajace kwasu mlekowego, przenoszono do zmodyfikowanego, kompletnego srodowiska Spizizen'a, zawierajacego 2,0% zródla wegla. Jako zródlo wegla stosowano sorbit, D-glu- konian, L-arfokioze, D-riboze, pirogronian lub L- glutaminian. Probówke testowa inkubowano w temperaturze 37PC na wstrzasaczu. Rozwój okre¬ slono po dwóch dniach hodowania pomiarem ge¬ stosci optycznej przy dlugosci fali 650 nm. Muta¬ nty, nie wzrastajace na D-glukonianie, L-arabino- zde i D-ribozie, wyizolowano jako mutanty, wyma¬ gajace transketolazy.Ponizej przedstawiono sposób wytwarzania mu¬ tantów o odpowiedniej zdolnosci utleniania 2-de- zoksy-D-glukozy.Wytwarza sie zawiesine zarodników lub zawie¬ sine komórek, która poddaje sie naswietlaniu pro¬ mieniami ultrafioletowymi i dzialaniu Nimetylo- -N^nitro-N-nitrozoguanidyny sposobem opisanym powyzej. 10 ml rozcienczonej zawiesiny zarodni¬ ków lub rozcienczonej zawiesiny komórek wlewa sie na plytke z analogiczna pozywka agarowa, jak opisano powyzej. Po jednym lub dwóch dniach inkubacji w temperaturze 37°C wytw?orzone ko¬ lonie zeskrobuje sie. Aktywnosc utleniania 2-de- zoksy-D-glukozy okreslono próba, przedstawiona ponizej.Ponizej przedstawiono sposób wytwarzania mu¬ tantów o odpowiedniej czestotliwosci wytwarzania zarodników.Wywarza sie zawiesine zarodników lub zawiesi¬ ne komórek, która poddaje sie naswietlaniu pro¬ mieniami ultrafioletowymi i dzialaniu N-metylo- N'-ntro-N-nitrozoguanidyny sposobem, opisanym powyzej." 10 ml rozcienczonej zawiesiny zarodni¬ ków lub rozcienczonej zawiesiny komórek wlewa sie na plytke z analogiczna pozywka agarowa, jak opisano powyzej. Po jednym lub dwóch dniach in- kubowania w temperaturze 37°C plytki umieszcza sie w chlodnym pomieszczeniu i inkubuje dwa dni.Pólprzezroczyste kolonie zbiera sie jako mutanty o odpowiedniej czestotliwosci wytwarzania zarod¬ ników.Sposobem wedlug wynalazku mozna wytwarzac D-riboze w ilosci 65—70 mg/ml.W prowadzonych dotad badaniach sposobów wy¬ twarzania D-ribozy za pomoca drobnoustrojów nie zajmowano sie zaleznoscia wydajnosci D-ribozy od zdolnosci wytwarzania zarodników.Oprócz zwiekszenia wydajnosci D-ribozy, jakie mozna osiagnac, stosujac sposób wedlug wynalazku, ma on jeszcze te zalete, ze jako wynik braku zdol¬ nosci tworzenia zarodników nie wymaga klopo¬ tliwego usuwania zarodników oraz pozwala na la¬ twe wydzielenie produktu.Uzywany w opisie termin „brak zdolnosci wy¬ twarzania zarodników" oznacza, ze jezeli obliezy sie calkowita ilosc zywych organizmów w danej populacji oraz ogólna sume zarodników za pomo- » ca opisanej nizej metody analogicznej do opisanej w Journal of General and Applied Microbiology, 16, ostatni wiersz str. 430 do 5 wiersza str. 431 (1953), to iloraz sumy zarodników i calkowitej ilosci zdolnych do zycia organizmów (tzw. czestotliwosc ; wytwarzania zarodników — „sporulation freauen- cy ) nie przekracza 10-4.Z kultury, bakteryjnej na skosie pobiera &\a plyn za pomoca petelki z drutu platynowego i przenosi do 5 ml zmodyfikowanej pozywki ^Scha¬ effera (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 54, 704 (1965$, zawierajacej 1,0% D-glukozy, 0,8% bulionu odzywczego Difco, 0,01% kwasu szikimowego, M 0,025% MgS04-7H2Q, 0,1% KC1, 10~«M FeClg-6H20, -»M Ca€l2-2H20 i 10-5M MnCl2«4H20, z czego CaCl2-2H20 i MnCl2-4H20 poddano uprzednio ste¬ rylizacji. * . Przed sterylizacja pozywke zobojetnia sie do 2J pH = 7,0. Po trzydniowej inkubacji w temperaturze 37°C, hodowle podzielono na dwie porcje po 2,5 ml, z których jedna ogrzewano w temperaturze 80°C przez 30 minut. Zarówno nieogrzewana czesc hodowli (calkowita ilosc komórek zdolnych do zy- cia), jak i czesc ogrzewana (ilosc zarodników) od¬ powiednio rozcienczono i naniesiono na zmodyfi¬ kowana pozywke Schaeffera, otrzymana przez do¬ danie 2% agaru do zmodyfikowanej pozywki Schaeffera, wyzej opisanej. Zdolne do zycia ko- mcrki liczono po dwudniowym okresie inkubacji w temperaturze 37°C. Wartosc czestotliwosci wy¬ twarzania zarodników badanego szczepu otrzymu¬ je sie przez ilosc komórek, zdolnych do zycia w w danej populacji. 40 W opisie, brak transketolazy lub epimerazy oz¬ nacza, ze jezeli za pomoca nastepujacej metody, opisanej w Journal of Biological Chemistry 223, 1009 (1956) Archives of Biochemistry and Biophy- 45 sics, 74, 306 (1958) oraz ibid. 74, 31*5 (1970, mierzy sie stopien utlenienia zredukowanej formy dwu- nukleotydu nikotynamido-adeninowego (NADH) i oblicza sie pewna aktywnosc enzymatyczna dla ekstraktu komórkowego (A), otrzymanego wedlug nizej podanego przepisu, to wartosc ta nie prze- 50 kracza 0,01 ^moli/min/mg proteiny.(I). Sposób przygotowania ekstraktu komórko- wego (A). Hodowamy na skosie szczep, którego ak¬ tywnosc traroskeitoUazy lufo epfrnerazy ima zostac M oznaczona, szczepi sie na pozywce (pH«7,0)), za¬ wieraj aceg 2,0% sonbaitu, 04% L-glultamkiianu so¬ dowego, 0,1%| KHgSlO^ Q,3% Kg$POly 0,5% (NH^O^ 04% MgSO^ELO, 0„ 0,001% ZnS04-TH^O, 0,0!Q1% MnS04-4-6H20, 100— 60 -^1000 [Ag/1 biotyny, 100—3000 ug/1 chlorowodorku tiaminy i 100 pig/ml kwasu szikimowego, a zaszcze¬ piona pozywke inkubuje sie, wstrzasajac, w tempe¬ raturze 32^37° przez 24 godziny. Otrzymany bulion z hodowla odwirowuje sie w celu zebrania komórek, OT które z toalei, przemywa sie dwukrotnie 0,0(1 M7 buforowym roztworem chlorowodorku tristfhydro- kis5to€rtylo)a|mi(noirneltainu (pH=7,5), zawierajacym 0,001 IM merkajptoetalnolu i zawiesza sie ponownie w takim samyim buforze, lotrzymujac zawiesine, komórek o absorpcji 10 przy 660 ran. Do zawiesi- ny dodaje sie nastepnie lizozym bialka kurzego w ilosci, dajacej stezenie 50 pg/mil, pozostawia w temperaturze 37° na przeciag 33—90 minut i*po zakonczeniu reakcji uklaid odwirowuje sie. Otrzy¬ many, unoszacy sie* na powierzchni plyn stosuje sie jako wyzej wspomniany ekstrakt komórkowy (II). 1. Roztwory do oznaczania aktywnosci trans- ketolazy. Roztwór reakcyjny A: i(l,il imil). 20 umoli t D-'riboizo-5-fosforanu, 0J5 ^mola NADH, wystarcza- jaca ilosc epimerazy i ketol-izoimerazy D-óbozo-5- -fosforanowej, 0,66 jednostki dehydrogenazy a-gli- cerofosforanowej, i0,413 jjumoli pirofosforanu tiaimi- ny i 40 plmoli (buforowego roztworu chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (pH=7,5).'Roztwór reakcyjny B: (0,*89 ml). 20 ^jumoli MigCl2, 0,43 |xmoli piirofosforainu tiaminy, 40 jjumoli roztwo¬ ru buforowego chlorowodorku trisl(hydroksymety- lo)aiminometanu (ipH=7,5) i 10 ^1 roztworu enzy¬ mu.(II). 2. Roztwory do oznaczania aktywnosci epi¬ merazy. Roztwór reakcyjny A: (0„9 (ml). 20 pjmoli D-ribozo-5-fosforanu, 20 jiimoli MgiCi2, 0,43 ]jumola pirofosforanu tiaminy, dostateczna iilosc transke- tolazy i 40 jimoli roztworu buforowego chlorowo¬ dorku itriisi(hydlroksyimelty;lo)ammomeJta^nui(pH=7,5).Roztwór reakcyjny B: (1,09 nil), 0,5 fjimola iNADH, 0,66 jednostki dehydrogenazy a-g!Ucerofosforanowej, zawierajacej dostateczna ilosc izomierazy ,tiiozo- fosforalnoweij\, dostateczna ilosc transketolazy, keto 1-izomerazy D-ribozo-5-fosforanowej i 60 jjumoli roztworu buforowego chlorowodorku /tris metylo)aiminomeltanu (jpH=7,5).(III). 1. Sposób oznaczania aktywnosci transketo¬ lazy. Kalzdy roztwór reakcyjny poddaje sie inku¬ bacji w temperaturze 30°(C przez 10 iminut, nastep¬ nie roztwory miesza sie ze soba (calkowita obje¬ tosc 2 imH). Zmiane absorpcji przy 340 mim mierzo¬ no za pomoca Gilford Muiltiple iSample Absorban- ce Recorder 2000 (Gilford Instrument Laboratories Inc., USA) w (temperaturze 30°C.(III). 2. Sposób oznaczania aktywnosci epimera- zy. Roztwór reakcyjny A poddaje sie inkubacji w temperaturze 30°C przez 30 iminut, a roztwór re¬ akcyjny B inkubuje sie w temperaturze 30°C przez miniut. Roztwory te miesza sie ze soba i do mie¬ szaniny dodaje sie 10 |«m roztworu enzymu (cal¬ kowita objetosc 2 nil). Zmiane absorpcji przy 340 nm mierzono ta sama imeitoda, co w [przypadku transketolazy.(IV) Sposób obliczania aktywnosci enzymu. Akty¬ wnosc enzymu (^imol/irnih/mig proteiny) w roztwo¬ rze enzymu wyraza sie nastepujacym wzorem: -A?340/min S -d-E - p w którym —* AE 340/imim oznacza predkosc spadku calkowitej absorpcji zmieszanych roztworów re¬ akcyjnych przy 340 nm w ciagu 1 minuty, V ozna¬ cza calkowita objetosc roztworu (2 ml), jest mo- i 026 8 lowym wspólczynnikiem ekstynkcji NADH. przy 340 nm X6,2l2 om^/inimoH), vd oznacza dlugosc drogi . swiatla §1 cm),, E oznacza objejtosc roztworu enzy¬ mu i(0,01 ml)* a p oznacza ciezar proteiny w roztwo- rze enzymu (img/mll)j W lapisie, iwyisoka zdolnosc utleniania 2^dezoksy- -D-glukozy oznaczaj ize kiedy dla ekstraktu ko¬ mórkowego (B), otrayimainego wedlug sposobu, po¬ danego w dalszej czesci opisu, mierzy sie stopien redukcji utlenionej formy idwunukleotyldu mikoty- namido-adeninowego (NAD+) za pomoca roztwo¬ ru reakcyjnego do oznaczania zdolnosci utlenia¬ nia 2-dezoksy-(D-g,lufcazyi, .którego sklad zostanie równiez podany w dalszej czesci opisu i na pod- stawie uzyskanych danych oblicza sie aktywnosc enzymatyczna wspomnianego ekstraktu wedlug przytoczonego poprzednio wzoru, wyrazajacego ak¬ tywnosc transketolazy ilub epimerazy, to znalezio¬ na wartosc mie jest mniejsza o)d 0,05 ^mola, na mi- ao nute na miligram proteiny, lecz nie wieksza od 1,00 jjumola na minute na miligram proteiny.(I). Sposób przygotowania ekstraktu komórkowe¬ go (B). Hodowany na skosie szczep, którego zdol¬ nosc utleniania 2-dezoksy-D-glukozy ma zostac oznaczona, szczepi sie na pozywce, zawierajacej 0,15% sorbitu, 0,65% L-glutaminianu sodowego, 0,1% KH2P04, 0,3% K2HP04, 0,1% Na2S04, 0,01% MgS04. •7H20, 0„0004% foiotyny, 0,0003%, chlorawodorku tiaiminy i 0,01% kwasu szikimowego, a nastepnie poddaje sie inkubacji, wstrzasajajc przy tempera¬ turze 37°C w ciagu 20 godzin. Z bulionu wyodrebnia sie komórki za pomoca wirowania, przemywa sie je dwukrotnie Q,01 M roztworem buforowym chlo¬ rowodorku tris(hydroksymietylo)aminometanu IflpH^ 3* =7,5) zawierajacego 0,001 iM imerkaptoetanolu i po¬ nownie zawiesza w takim samym buforze, aby otrzymac zalwiesine o absporpcfli dO0 przy 650 nm. Zawiesine poddaje sie dzialaniu rozdrabniacza ultradzwiekowego i()Ilnsonater, prod. Kubota Iron ** Works, Ltd., Japan) przy 160 W w ciagu 10 mi¬ nut, co powoduje irozerwainie komórek. Osad usu¬ wa sie przez odwirowanie. Górna wairStwa ciekla jest ekstraktem komórkowym (iB).(II). Roztwór reakcyjny do oznaczania zdolnosci 45 utleniania 2-dezoksy-D-glukozy. 1,2 md 1 M roz¬ tworu buforowego chlorowodorku tris-l(hydroksy- 1 metylo)aminometanu MnS04-4-6H20, 0,2 ml 20 mM NaD~, 'Q,2 ml 1 M 2-dez'ofcsyHD-iglukozy i 0J2 ml ekstraktu komórko- 50 wego (fi), temperatura reaiktcji 30°C.W sposobie tyim sitosuje sie za'te!m taki szczep rodzaju Baciilus, który odznacza sie jednoczesnie brakiem transketolazy lub/oraz epimerazy i bra¬ kiem zdolnosci wytwarzania zarodników, jak rów- * niez wysoka zdolnoscia utleniania 12-d'ezoksy-iD-glu- kozy. Tego rodzaju szczepy latwo otrzymac z dro¬ bnoustrojów rodzaju BacilllluSi, takich jak Baciilus brevis, Baciilus cereus, Baciilus ciircuilans, Baciilus coaigulans, Baciilus lichelniiformis, Baioilluis mega- w teriulm1, Baciilus mesentericus, Baciilus punillus, Baciilus suibtilis, etc. przez naswietlanie szczepu macierzystego takim promieniowaniem,, jak nad¬ fioletowe, promienie X, promienie gamma lub po¬ dobne, lub przez poddanie szczepów macierzystych 65 dzialaniu chemicznych substancji mutagennych, ta-I 95 026 i30 kich (jaik N-metyloH^-nitaa-lN-^^ iperyt azotowy,, dwumetylosyMo#enek, imetainosui- fonian etyllu, eite, Mdzma oczsrwi&rie najpierw otrzy- mac szczep* pozbawiony lransketoteuzy lub/oraz epirazy i spowodowac dalsza jego mutacje z wy- 5 tworzeniem szczepu, óctaaczajacego sie brakiem zdolhosici wytwaraainda; zarodników lub/oraz wyso¬ ka zdoflooscia uttenLalnda 2Hdezofcsy-D-glutazy, lub tez mozna odwrócic kolejnosc procesu w celu otrzymania pozajdajnieigomutanta. *o Liczby nastepujace po IFO, stosowane iw tym opisie oznaczaja numery wpisu w Institute for Fer- mentaltion^ Osaka, w Japonii. Przy omawianiu sub- stainicji odzywczych, stosowanych jako skladniki po¬ zywek do hodowUi drobnoustorojów wedlug wyna¬ lazku, jako zródlla weglla stosuje sie imiedzy inny¬ mi, D-i#lukoze, D-tfruktoze, D-mannoze, sorbdJtol, D- -mannitol, sacharoze, melase, hydrolizaty skrobi, skrobie, kwas 'Octowy i etandl.Jafleo zródla azotu stasuje sie naturalne zródla azotoiwe, takie jak maniok kukurydziany, odpady bawelniane, wyciag z drozdzy, drozdize suszone, maczke rybna, wyciag z miesa, pepton etc, azoto¬ we zwiazki nieorganiczne, 'takie jak wodiny roz- ^ twór amoniaku, gazowy amoniak, siairczajn amono¬ wy, chlorek amonu, wegiel amonowy, fosforan amonowy, azotan sodowy, etc, oraz takie omganicz- ne zwiazki azotowe, jak mocznik, aminokwasy, etc.W skflad pozywki wchodza takze, oprócz wymienio¬ nych zródel wegla i azotu,, rózne (metale, witaminy, aminokwasy i inne substancje, które moga miec istotne znaczenie dla wzrostu danego droibnoustro- ju, przy czyim proporcje tych skladników sa zmien¬ ne.Hodowfle prowadzi sie w warunkach tlenowych, np. na wyttrzasarce lub w zanurzeniu, stosujac rozpryskiwanie i mieszanie. Temperature inku¬ bacji dobiera sie w zakresie od 20° do 45°C w za¬ leznosci od temiperatuiry najbardziej korzystnej 40 dla wzrostu danego drobnoustroju oraz gromadze¬ nia D-ribozy. Odczyn pH pozywki ma najczesciej wartosc od 5 do 9.W celu %utrzymania wartosci pH w optymalnym zakresie podczas okresu hodowli, mozna dodawac 45 od czasu do czasu takie subsftancje neutralizujace, jak kwas solny, kwas siarkowy, /wodny roztwór amcniaku, gazowy amoniak, wodiny roztwór wo¬ dorotlenku sodowego, weglan wapniowy, wapno gaszone, etc. Znaczna ilosc D-ribozy zbiera sie w 50 pozywce zwykle po uplywie 2 do 5 dni. Tak na¬ gromadzona D-rifooze mozna latwo wyodrebnic np. w nastepujacy sposób. Brzeczke z hodowla przesa¬ cza sie najpierw lub odwirowuje, przy czym latwo udaj'e sie oddzielic komórki. Przesacz odsala sie ^ nastepnie i odbarwia za pomoca zywicy jonowy¬ miennej i wegla aktywnego, a nastepnie zageszcza.Do zageszczonego roztworu dodaje sie rozpusz¬ czalnik organiczny,, taki jak etanol, co powoduje wytracenie krysztalów D-ribozy. Niezaleznie od eo wyboru sposobu wyodrebniamia D-ribozy proces ten daje sie przeprowadzic bez trudnosci.Nastepujace przyklady maja na celu daJlsza ilu¬ stracje wynalazku, nie ograniczaja jednak jego za¬ kresu. Procenltowosci podane w niniejszym opisie •* wyrazaja stosunek diezanu do objetosci wszedzie tam, gdzie nie zaznaczono, ze jest inaczej.Przyklad I. iHodowile nie zawierajacego transketolazy i pozbawionego zdolnosci wytwarza¬ nia zarodników mutanta Bacillllus subtilis nr 957 (IFO 135(65) otrzymanego z Bacillus subtilis IFO 3026 przez dzialanie NHmetyilo-(N1^niiltro-lNHniltrozo- guanidyny (iNTC), (aktywnosc taranisketolazy: poni¬ zej 0,01 n»mola/min/m(g proteiny, czestotliwosc wy¬ twarzania zarodników: '3X10-5), zaszczepiono na ,1 pozywka, zawierajajcej 2:,0°/t sorbitu, 2,0%* na- moku kukurydzianego, 0,2P/&{ jednowodorolfosiforanu potasowego, 100 4* g/nil tyrozyny i 100 \i g/ml fe¬ nyloalaniny, a zaszczepiona pozywke inkuibowano przy temperaturze 36^ w iciagu 24 godzin. Cala otrzymana hodowle przeniesiono do 100 1 pozywki, zawierajacej 15,Oe/oj D^glukozy, 1,0% suszonych drozdzy, 0,5% siarczanu amonowego, 2,0% weglanu wapniowego, 50 \i g/ml tjrylptofanu, 50 \jl g/mil ty¬ rozyny i 50 p, g/ml fenyloailaniiiny, na której ho¬ dowle te prowadzono przy temperaturze 36°C w ciagu 60 godzin, przy czym nagromadzenie D- -ribozy wynioslo 6(2 mg/lmll. IZ /tej, zawierajacej D- riboze brzeczki fermentacyjnej usunieto komórki przez odsaczenie, a przesacz za/geszczono do polo¬ wy pierwotnej objetosci. Do (tego roztworu dodano etanol w ilosci, równej 1/4 objetosci rozltworu i usu¬ nieto wytracony osad. Pozostalosc poddanio proce¬ sowi odsalania na kationowych i anionowych zy¬ wicach j omcwymiennyeh, a nastepnie odbarwiono na kolumnie z wegflem akitywnylm. Z brzeczki przez zageszczenie i dodainle poczwórnej objetosci eta¬ nolu wyodrebniono 4,6 kig farystailicTmiej D-rdfoozy.P rz y k l a d II. Hodowle nie zawierajacego epi¬ merazy i pozbawionego zdolnosci wytwarzania za¬ rodników mutanta BacMus sulbtills nr 941 (IFO 13573), Otrzymanego z Bacilllus subtilis IFO 3026 przez naswietlenie promieniami nadfioletowymi (aktywnosc epimerazy: ponizej 0,01 ^mola/min/mg •proteiny, iczesltotlliwosc wytwarzania zarodników 7X10_&), prowadzono wedlug sposobu, opisanego w przykladzie I, co dalo nagromadzenie D-ribozy w ilosci 65 mgyimtl.,W sposób, opisany w przykladzie I, z brzeczki fermentacyjnej wyodrebniono 4,3 kg krystalicznej D-ribozy.Przyklad III. Hodowle mutanta jBacillus subtilis nr 1054 i(IFO 135)86), nie zawieraijacegio epi¬ merazy i odznaczajacego sie wysoka zdolnoscia utileniania 2-dezoksy-D^glukozy {akltywnosc epi¬ merazy: ponizej 0,01 ^jmdla/imin/mg proteiny, zdol¬ nosc utleniania 2-dezoksy-D-glukozy: 0,31 fumola/ min/mig proteiny), otrzymanego z Bacilluis subtilis IFO 3026 przez poddanie tego szczepu dzialaniu N- - mietylo-N^nitro-iN-nitrozoguanidyny, prowadzono wedlug sposobu, zbMonego do opisanego; w przy¬ kladzie I, co dalo najgromadze(nie D-riibozy w ilosci 65,7 img/imtt.W sposób, .opisany w przykladzie I, z brzeczki wyodrebniono 5,1 kg D-rdbotzy.Przyklad IV. Hodowle mutamta Baeillus subtilis nr 1067 (IFO 13588), nie zawierajacego transketolazy i odznaczajacego sie wysoka zdol¬ noscia utleniania 2-dezoksy-D-glukozy (aklty^wmosc transketolazy: ponizej 0,01 |imoilaymini/m| fflftftfiny,95 026 11 12 zdolnosc utleniania 2-detztoksy-iD-iglukozy: 0,a3 [imo- latoin/mg proteiny), otrzymanego z Bacillus sub¬ tilis IFO 3026 przez poddanie tego szczepu dziala¬ niu NHmefcylonWHniito-N^ prawa- dzkwro sposobem, analogicznym do opisanego w przykladzie I, oo dalo [nagromadzenie D-ribozy w ilosci 66,5 mg/nil. Z brzeczki w sposób, ojrtsamy w przykladzie I, wyodrebniono 5,3* kg D-ribozy.¦P r z y k l a d V. Hodowile mutanta Baciillus sub- tilis nr 1097 ', nie zawierajacego (trans- ketolazy pozbawionego zdolnosci wytwarzania za¬ rodników i, odznaczajacego sie wysoka zdolnoscia utleniania 2^dezoksy-D-gHukozy (aktywnosc trans- ketolazy: ponizej 0,01 fjumOla/imin/mg proteiny, cze^fcotlliwtosc wytwarzania zarodników: 3X10~7, zdolnosc v utleniania 2-dczoksy-£-glukozy: 0,29 fjimola/min/mg proteiny), otrzymanego z Bacillus subtilis IFO 3026 przez naswietlanie promieniowa¬ niem nadifioleitowyim, prowadzono w sposób, ana¬ logiczny do opisanego w przykladzie I, co dalo nagromadzenie D-rabazy w brzeczce w ilosci 70,5 mgyknll. Z (brzeczki w sposób, opisany w przykladzie I, wyiodirejbndono 5,4 kg krystalicznej D-riibozy. PL