Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia D-ribozy, polegajacy na prowadzeniu hodowli wytwarzajacego D-riboze drobnoustroju nalezacego do rodzaju Bacillus, odznaczajacego sie brakiem zdolnosci wytwarzania zarodników lub posiadaja¬ cego wysoka zdolnosc utleniania 2-dezoksy-D-glu- kozy, badz posiadajacego obie te cechy, a takze wykazujacego brak transketolazy lub/oraz 3-epime- razy D-ribulozofosforanowej, na pozywce, zawie¬ rajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu wraz z substancjami odzywczymi, niezbednymi dla wzro¬ stu danego szczepu, w celu wytwarzania i groma¬ dzenia D-ribozy przez ten szczep, a nastepnie wy¬ odrebnienia w ten sposób D-ribozy z brzeczki ho¬ dowlanej.Jako skladnik kwasów nukleinowych, D-riboza wystepuje we wszystkich organizmach, a produkt redukcji D-ribozy, ribitol, znajduje sie w witami¬ nie B2 i w ribitolowym kwasie teichomowym, któ¬ ry jest skladnikiem scian komórkowych.Z tych wzgledów jest to zwiazek o duzym zna¬ czeniu fizjologicznym. D-riboza oraz jej pochodne wzbudzaly dotad duze zainteresowanie jako sub¬ stancje wyjsciowe w syntezie witaminy B2 i za¬ wierajacych kwasy nukleinowe dodatków spozyw¬ czych, a zatem opracowanie przemyslowej metody wytwarzania D-ribozy stalo sie niezwykle poza¬ dane.Konwencjonalne sposoby wytwarzania D-ribozy obejmuja metody ekstrakcji tego zwiazku z pro- 215 duktów naturalnych oraz metody syntetyczne, w których jako substancje wyjsciowe wykorzystuje sie furan, D-glukoze itp. Istnieja równiez wzmian¬ ki o wytwarzaniu D-ribozy na drodze fermenta¬ cyjnej, ale wydajnosc procesu fermentacji jest wyjatkowo niska. Wymienione sposoby nie sa w pelni zadowalajace jako metody wytwarzania D-ri¬ bozy na skale przemyslowa.Sposobów wytwarzania D-ribozy, polegajacych na zastosowaniu drobnoustrojów Bacillus, dotyczy wczesniejsze opacowanie Sasajima i Yoneda opi¬ sujace sposób, w którym wytwarzajacy D-riboze mikroorganizm rodzaju Bacillus, zuzywajacy przy wzroscie L-tyrozyne, L-tryptofan i L-fenyloalanine hoduje sie na pozywce zawierajacej L-tyrozyne, L-tryptofan i L-fenyloalanine w ilosciach prze¬ kraczajacych ok. 100 y/ml, oraz sposób, w którym stosuje sie odznaczajace sie brakiem transketolazy szczepy rodzaju Bacillus, Shi 5 i Shi 7 lub wyka¬ zujacy brak 3-epimerazy D-ribulozofosforanowej szczep rodzaju Bacillus, Gluc 34.Pierwsza z tych metod opisano w patencie bry¬ tyjskim nr 1255 254, a druga w Agricultural and Biological Chemistry, 35, str. 509 (1971).Co do szczepów, zastosowanych w pierwszej z metod, to nie podano jednak w sposób wyrazny czestotliwosci, z jaka wytwarzaja one zarodniki, zdolnosci utleniania 2-dezoksy-D-glukozy, czy tez aktywnosci transketalazy i 3-epimerazy D-ribulo- 9180191801 zofosforanowej (w dalszej czesci opisu enzym ten nazywa sie epimeraza).Wystepowanie zdolnosci wytwarzania zarodni¬ ków w tych szczepach wydaje sie jednak oczy¬ wiste, poniewaz wiadomo, ze wytwarzanie zarod¬ ników jest jedna ze znamiennych cech drobno¬ ustrojów rodzaju Bacillus, jak równiez w swietle zasady, wedlug której brak wzmianki o wytwa¬ rzaniu zarodników przy opisie, dotyczacym drob¬ noustrojów rodzaju Bacillus oznacza, ze dany drob¬ noustrój jest zdolny do wytwarzania zarodników (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, wydanie 7, 613 (1957).Ponadto, znane szczepy posiadaja bardzo nie¬ wielka alct^wnosc --utleniania 2-dezoksy-D-glukozy, co wynilfa^z pomiarów aktywnosci sposobem, po¬ danym w dalszej czesci opisu. Wspomniana aktyw¬ nosc .en^a^oafyeena tych szczepów wynosi 0,01—0,02 mmoli/min^Tia mg proteiny.W wymienionym opracowaniu przyznaje sie rów¬ niez, ze ilosc D-ribozy, otrzymanej opisanymi me¬ todami wynosi, w najlepszym przypadku, zaledwie ,3 mg/ml.W tabeli przytoczono dane, dotyczace zdolnosci utleniania 2-dezoksy-D-glukozy, mierzonej dla o- mawianych szczepów za pomoca opisanego dalej sposobu, oraz najwieksza ilosc D-ribozy, nagroma¬ dzonej w brzeczce z wyzej wymienionych ho¬ dowli.Tabela Brytyjski opis patentowy nr 1 255 254 Agricultural and Biological Chemistry 35, 509 (1971) Mikroorganizm Bacillus No 503 Bacillus No 537 Bacillus No 558 Bacillus No 429 Bacillus No 483 Bacillus Shi 5 Bacillus Shi 7 Bacillus Gluc 34 pumilus pumilus pumilus subtilis subtilis species species species Zdolnosc utleniania 2-dezoksy- -D-glukozy (u mole/min.) mg proteiny 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,01 Nagro¬ madzona D-riboza (mg/ml) 28,5 ,5 29,3 ¦ 26,5 29,5 28,4 ,3 24,8 W celu opracowania wydajnego sposobu wy¬ twarzania D-ribozy, wykorzystujacego bakterie ro¬ dzaju Bacillus, podjeto intensywne badania, w wy¬ niku których udalo sie stwierdzic, ze szczepy rodzaju Bacillus, a zwlaszcza ich mutanty, które odznaczaja sie jednoczesnie brakiem transketolazy lub/oraz epimerazy i brakiem zdolnosci wytwa¬ rzania zarodników, jak równiez/lub wysoka aktyw¬ noscia utleniania 2-dezoksy-D-glukozy, posiadaja niezwykle rozwinieta zdolnosc gromadzenia D-ri¬ bozy.Sposób wytwarzania D-ribozy wedlug wynalaz ku na drodze hodowli Bacillus pumilus w srodo¬ wisku, zawierajacym zródlo przyswajalnego wegla oraz azotu i substancje odzywcze niezbedne dla wzrostu mikroorganizmu, przy czym wymieniony mikroorganizm wytwarza i akumuluje D-riboze, która nastepnie wyodrebnia sie z brzeczki fermen¬ tacyjnej, polega na tym, ze hodowli poddaje sie mutant Bacillus pumilus, taki jak Bacillus pumi¬ lus nr 911 (IFO 13566), Bacillus pumilus nr 1027 (IFO 13585) lub Bacillus pumilus nr 1083 (IFO 13620).Ponizej przedstawiono sposób wytwarzania mu¬ tantów o odpowiedniej aktywnosci transketolazo- wej.Podczas naswietlania promieniami ultrafioleto¬ wymi stosuje sie nizej podana procedure. Szczep macierzysty hoduje sie w temperaturze 37°C w ciagu kilku dni na agarze ziemniaczanym, zawie¬ rajacym 20,0% ziemniaka, 2,0% D-glukozy, 0,04 m M MnCl2 oraz 2,0% agaru i umieszcza w lodówce na kilka dni. Wytworzone w ten sposób zarodniki zbiera sie i wprowadza do sterylizowanej, desty¬ lowanej wody do wytworzenia zawiesiny, zawie¬ rajacej w 1 ml okolo 5X108 zarodników, która ogrzewa sie w ciagu 10 minut w temperaturze 80°C. Plytke Petriego z 5 ml otrzymanej zawiesiny zarodników poddaje sie nastepnie naswietlaniu lampa ultrafioletowa (15 W) umieszczona na wy¬ sokosci 30 cm nad plytka. Zawiesine zarodników miesza sie lagodnie co pól minuty. W danym za¬ kresie — zazwyczaj 4—6 min., 0,5 ml zawiesiny zarodników wprowadza sie do 4,5 ml sterylizowa¬ nej, destylowanej wody i dodatkowo rozciencza do otrzymania zawiesiny, zawierajacej w 1 ml okolo 2X103 zarodników.Podczas stosowania N-metylo-N'-nitro-N-nitrozo- guanidyny jako czynnika mutagennego stosowano nizej podana procedure. Szczep macierzysty wzra¬ stal w temperaturze 37°C w ciagu nocy w pozyw¬ ce, zawierajacej 1% sorbitu, 1,0% peptonu, 0,2% ekstraktu drozdzy i 0,2% NaCl. Komórki zbierano przez odwirowanie i przemywano dwukrotnie 0,01 M buforem tris-HCl o pH = 7,5, po czym wytwa¬ rzano z nich zawiesine w tym samym buforze, zawierajacym N-metylo-N^nitro-N-nitrozoguanidy- ne w stezeniu 300'/tg w ml z otrzymaniem zawie¬ siny komórek o gestosci optycznej 10 przy dlu¬ gosci fali 650 mm, która inkubuje sie w tempe¬ raturze 30°C w ciagu 30 minut. Inkubowana za¬ wiesine komórek rozciencza sie do otrzymania za¬ wiesiny, zawierajacej w 1 ml okolo 2000 zdolnych do zycia komórek. ml rozcienczonej zawiesiny zarodników lub rozcienczonej zawiesiny komórek, otrzymanej po- 55 wyzej, wlewa sie na plytke, zawierajaca pozywke agarowa. Po jednym lub dwóch dniach inkubacji wytworzone kolonie powtarza sie zarówno w zmo¬ dyfikowanym srodowisku Spizizen'a, zawierajacym 1% sorbitu, 0,4% (NH4)2S04, 1,4% K2HP04, 0,6% 60 KH2P04, 0,02% MgS04 '• 7H20, 0,004% biotyny, 0,6% tiaminy, 0,0087% kwasu szikirhowego oraz 2,0% agaru, jak i srodowisku, zawierajacym wyzej wy¬ mienione skladniki oprócz kwasu szikimowego.Nastepnie plytki utrzymuje sie w temperaturze 65 37°C w ciagu dwóch lub 3 dni. Kolonie, które 40 45 505 wzrastaly w kompletnym srodowisku, wydzielono.Mutanty, wymagajace kwasu mlekowego, przeno¬ szono do zmodyfikowanego, kompletnego srodowi¬ ska Spizizen'a, zawierajacego 2,0% zródla wegla.Jako zródlo wegla stosowano sorbit, D-glukonian, L-arbinoze, D-riboze, pirogronian lub L-glutami- nian. Probówke testowa inkubowano w tempera¬ turze 37°C na wstrzasaczu. Rozwój okreslano po dwóch dniach hodowania pomiarem gestosci op¬ tycznej przy dlugosci fali 650 mm. Mutanty, nie wzrastajace na D-glukonianie, L-arabinozie i D-ri- bozie, wyizolowano jako mutanty, wymagajace transketolaze.Ponizej przedstawiono sposób wytwarzania mu¬ tantów o odpowiedniej zdolnosci utleniania 2-de- zoksy-D-glukozy.Wytwarza sie zawiesine zarodników lub zawie¬ sine "komórek, która poddaje sie naswietlaniu pro¬ mieniami ultrafioletowymi i dzialaniu N-metylo- -N'-nitro-N-nitrozoguanidyny sposobem, opisanym powyzej. 10 ml rozcienczonej zawiesiny zarodni¬ ków lub rozcienczonej zawiesiny komórek wlewa sie na plytke z analogiczna pozywka agarowa, jak^opisano powyzej. Po jednym lub dwóch dniach inkubacji w temperaturze 37°C wytworzone kolo¬ nie zeskrobuje sie. Aktywnosc utleniania 2-dezok- sy-D-glukozy okreslono próba, przedstawiona po¬ nizej.Ponizej przedstawiono sposób wytwarzania mu¬ tantów o odpowiedniej czestotliwosci wytwarzania zarodników.Wytwarza sie zawiesine zarodników lub zawie¬ sine komórek, która poddaje sie naswietlaniu, pro¬ mieniami ultrafioletowymi i dzialaniu N-metylo- -N'-nitro-N-ritrozoguanidyny sposobem, opisanym powyzej. 10 ml rozcienczonej zawiesiny zarodni¬ ków lub rozcienczonej zawiesiny komórek wlewa sie na plytke z analogiczna pozywka agarowa, jak opisano powyzej. Po jednym lub dwóch dniach inkubowania w temperaturze 37°C plytki umiesz¬ cza sie w chlodnym pomieszczeniu i inkubuje dwa dni. Pólprzezroczyste kolonie zbiera sie jako mu¬ tanty o odpowiedniej czestotliwosci wytwarzania zarodników.Sposobem wedlug wynalazku mozna wytwarzac D-riboze w ilosci 65—70 mg/ml.W prowadzonych dotad badaniach sposobów wy¬ twarzania D-ribozy za pomoca drobnoustrojów nie zajmowano sie zaleznoscia wydajnosci D-ribozy od zdolnosci wytwarzania zarodników.Oprócz zwiekszenia wydajnosci D-ribozy, jakie mozna osiagnac, stosujac sposób wedlug wynalaz¬ ku, ma on jeszcze te zalete, ze jako wynik braku zdolnosci tworzenia zarodników nie wymaga klo¬ potliwego usuwania zarodników i pozwala na latwe wydzielenie produktu.Uzywany w opisie termin „brak zdolnosci wy¬ twarzania zarodników" oznacza, ze jezeli obliczy sie calkowita ilosc zywych organizmów w danej populacji oraz ogólna sume zarodników za pomoca opisanej nizej metody, analogicznej do opisanej w Journal ol General and Applied Microbiology, 16, ostatni wiersz str. 430 do 5 wiersza str. 431 (1970), to iloraz sumy zarodników i calkowitej ilosci, zdolnych do zycia organizmów (tzw. czesto- 801 _ 6 tliwosc wytwarzania zarodników — „sporulation freauency") nie przekracza 10—4.Z kultury bakteryjnej na skosie pobiera sie plyn za pomoca petelki z drutu platynowego i przenosi do 5 ml zmodyfikowanej pozywki Schaeffer'a (Pro- ceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 54, 704 (1965) zawie¬ rajacej 1,0% D-glukozy, 0,8% bulionu odzywczego Difco, 0,01% kwasu szikimowe^o, 0,025% MgS04 • • 7HgO, 0,1% KC1, 10-6 M FeCl3 •¦ 6H20, 10~* M CaCl2 • 2H20 i 10-s M MnCl2 • 4H20, z czego CaCl2 * 2H20 i MnCl2 * 4H20 poddano uprzednio • sterylizacji.Przed sterylizacja pozywke zobojetniono do war¬ tosci pH = 7,0. Po trzydniowej inkubacji w tem¬ peraturze 37CC, hodowle podzielono na dwie por¬ cje po 2,5 ml, z których jedna ogrzewano w tem¬ peraturze 80°C przez 30 minut. Zarówno nieogrze- wana czesc hodowli (calkowita ilosc komórek, zdol- nych do zycia), jak i czesc ogrzewana (ilosc za¬ rodników) odpowiednio rozcienczono i naniesiono na zmodyfikowana pozywke Schaeffer'a, otrzymana przez dodanie 2% agaru do zmodyfikowanej po¬ zywki Schaeffer'a, wyzej opisanej. Zdolne do zy¬ cia komórki liczono po dwudniowym okresie in¬ kubacji w temperaturze 37°C. Wartosc czestotli¬ wosci wytwarzania zarodników badanego szczepu otrzymuje sie przez ilosc komórek, zdolnych do zycia w danej populacji.W opisie, brak transketolazy lub epimerazy ozna¬ cza, ze, jezeli za pomoca nastepujacej metody, opi¬ sanej w Journal of Biological Chemistry 223, 1009 (1956), Archives of Biochemistry and Biophysics, 74, 306 (1958) oraz ibid. 74, 315 (1958), mierzy sie stopien utlenienia zredukowanej formy dwunukleo- tydu nikotynamido-adeninowego (NADH) i oblicza sie pewna aktywnosc enzymatyczna dla ekstraktu komórkowego (A), otrzymanego wedlug nizej po¬ danego przepisu, to wartosc ta nie przekracza 40 0,01 ^moli/min/mg proteiny.(I) Sposób przygotowania ekstraktu komórkowe¬ go (A) Hodowany na skosie szczep, którego aktywnosc transketolazy lub epimerazy ma zostac oznaczona, 45 szczepi sie na pozywce (pH = 7,0), zawierajacej 2,0% sorbitolu, 0,1% L-glutaminianu sodowego, 0,1% KH2S04, 0,3% K2HP04, 0,5% (NH4)2S04, 0,1% MgS04 • 7H20, 0,001% FeS04 • 7H20, 0,001% ZnS04 • 7HfOi 0,001% MnS04 • 4—6H20, 100—4000 50 ^g/1 biotyny, 100—3000 //g/l chlorowodorku tiaminy i 100 [ig/ml kwasu szikimowego, a zaszczepiona pozywke inkubuje sie, wstrzasajac, w tempera¬ turze 32—37°C przez 24 godziny. Otrzymany bu¬ lion z hodowla odwirowuje sie w celu zebrania 55 komórek, które z kolei, przemywa sie dwukrot¬ nie 0,01 M buforowym roztworem chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (pH = 7,5), za¬ wierajacym 0,001 M merkaptoetanolu i zawiesza sie ponownie w takim samym buforze, otrzymujac 60 zawiesine komórek o absorpcji 10 przy 650 mm.Do zawiesiny dodaje sie nastepnie lizozym bialka kurzego w \losci, dajacej stezenie 50 ^g/ml, pozo¬ stawia w temperaturze 37°C na przeciag 30—$0 minut i po zakonczeniu reakcji uklad odwirowuje $5 sie. Otrzymany, unoszacy sie na powierzchni plyn91801 8 stosuje sie jako wyzej wspominany ekstrakt ko¬ mórkowy (A).(II) 1. Roztwory do oznaczania aktywnosci trans¬ ketolazy. Roztwór reakcyjny A:(1,11 ml): /umoh D-ribozo-5-fosforanu, 0,5mola NADH, wystarczajaca ilosc epimerazy i ketol-izomerazy D-ribozo-5-fosforanowej, 0,66 jednostki dehydroge- nezy a-glicerofosforanowej, 0,43 ^moli pirofosforanu tiaminy i 40 ^moli buforowego roztworu chloro¬ wodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (pH = = 7,5).Roztwór reakcyjny B (0,89 ml): ^moli MgCl2, 0,43 ^moli pirofosforanu tiami¬ ny, 40 ^moli roztworu buforowego chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (pH = 7,5) i 10^ 1 roztworu enzymu.(II) 2. Roztwory do oznaczania aktywnosci epi¬ merazy.Roztwór reakcyjny A (0,9 ml): amoli D-ribozo-5-fosforanu, 20 //moli MgCl2, 0,43 /*mola pirofosforanu tiaminy, dostateczna ilosc transketolazy i 40 jumoli roztworu buforowego chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (pH = 7,5).Roztwór reakcyjny B (1,09 ml): 0,5 ^mola NADH, 0,66 jednostki dehydrogenazy a-glicerofosforanowej, zawierajacej dostateczna i- losc izomerazy triozofosforanowej, dostateczna ilosc transketolazy, ketolizomerazy D-ribozo-5-fosforano- wej i 60 /umoli roztworu buforowego chlorowodor¬ ku tris(hydroksymetylo)aminometanu (pH = 7,5).(III) 1. Sposób oznaczania aktywnosci transke¬ tolazy.Kazdy roztwór reakcyjny poddaje sie inkubacji w temperaturze 30°C przez 10 minut, nastepnie roztwory miesza sie ze soba (calkowita objetosc 2 ml). Zmiane absorpcji przy 340 nm mierzono za pomoca Gilford Multiple Sample Absorbence Recorder 2000 (Gilford Instrument Laboratories Inc., USA) w temperaturze 30°C.(III) 2. Sposób oznaczania aktywnosci epimerazy.Roztwór reakcyjny A poddaje sie inkubacji w temperaturze 30°C przez 10 minut, a roztwór re¬ akcyjny B inkubuje sie w temperaturze 30°C przez minut. Roztwory te miesza sie ze soba i do mieszaniny dodaje sie 10 jlcI roztworu enzymu (calkowita objetosc 2 ml).Zmiane absorpcji przy 340 nm mierzono ta sama metoda, co w przypadku transketolazy.(IV) Sposób obliczania aktywnosci enzymu.Aktywnosc enzymu (^mol/min/mg proteiny) w roztworze enzymu wyraza sie nastepujacym wzo¬ rem: -zJE 340/min X ^XdXEXp w którym —Z|e 340/min oznacza predkosc spadku calkowitej absorpcji zmieszanych roztworów reak¬ cyjnych przy 340 nm w ciagu 1 minuty, V ozna¬ cza calkowita objetosc roztworu (2 ml), Z jest mo¬ lowym wspólczynnikiem ekstynkcji NADH przy 340 nm (6,22 cm2//*mol), d oznacza dlugosc drogi swiatla (1 cm), E oznacza objetosc roztworu enzy¬ mu (0,01 ml), a p oznacza ciezar proteiny w roz¬ tworze enzymu (mg/ml).W opisie wysoka zdolnosc utleniania 2-dezoksy- -D-glukozy oznacza, ze kiedy dla ekstraktu ko¬ mórkowego (B), otrzymanego wedlug sposobu, po¬ danego w dalszej czesci opisu, mierzy sie stopien redukcji utlenionej formy dwunukleotydu nikoty- namido-adeninowego (NAD+) za pomoca roztworu reakcyjnego do oznaczania zdolnosci utleniania 2-dezoksy-D-glukozy, którego sklad zostanie rów¬ niez podany w dalszej czesci opisu i na podstawie uzyskanych danych oblicza sie aktywnosc enzy¬ matyczna wspomnianego ekstraktu wedlug przy¬ toczonego poprzednio wzoru, wyrazajacego aktyw¬ nosc transketolazy lub epimerazy, to znaleziona wartosc nie jest mniejsza od 0,05 /*mola na mi- nute na miligram proteiny, lecz nie wieksza od 1,00 /miola na minute na miligram proteiny.(I) Sposób przygotowania ekstraktu komórkowe¬ go (B).Hodowany na skosie szczep, którego zdolnosc utleniania 2-dezoksy-D-glukozy ma zostac ozna¬ czona, szczepi sie na pozywce, zawierajacej 0,5% sorbitolu, 0,65% L-glutaminianu sodowego, 0,1% KH2P04, 0,3%K2HPO4, 0,l%Mn2SO4, 0,01% MgSQ4 • • 7H20, 0,0C04% biotyny, 0,0003% chlorowodorku tiaminy i 0,01% kwasu szikimowego, a nastepnie poddaje inkubacji, wstrzasajac przy temperaturze 37°C w ciagu 20 godzin. Z bulionu wyodrebnia sie komórki za pomoca wirowania, przemywa sie je dwukrotnie 0,01 M roztworem buforowym chloro- wodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (pH = = 7,5), zawierajacego j0,001 M merkaptcetanolu i ponownie zawiesza w takim samym buforze, aby otrzymac zawiesine o absorpcji 100 przy 650 nm.Zawiesine poddaje sie dzialaniu rozdrabniacza ul- 3- tradzwiekowego (Insonater, prod. -Kubota Iron Works, Ltd., Japan) przy 160 W w ciagu 10 mi¬ nut, co powoduje rozerwanie komórek. Osad usu¬ wa sie przez odwirowanie. Górna warstwa ciekla jest ekstraktem komórkowym (B). 40 (II) Roztwór reakcyjny do oznaczania zdolnosci utleniania 2-dezoksy-D-glukozy. 1,2 ml 1 M roztworu buforowego chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (pH = 8,0), 0,2 ml 0,1 mM MnS04 • 4—6H20, 0,2 ml 20 mM NAD-, 45 0,2 ml 1 M 2-dezoksy-D-glukozy i 0,2 ml ekstraktu komórkowego (B); temperatura reakcji 30°C.W sposobie tym stosuje sie zatem taki szczep rodzaju Bacillus, który odznacza sie jednoczesnie brakiem transketolazy lub/oraz epimerazy i bra- 50 kiem zdolnosci wytwarzania zarodników, jak rów¬ niez wysoka zdolnoscia utleniania 2-dezoksy-D-glu¬ kozy. Tego rodzaju szczepy latwo otrzymac z drob¬ noustrojów rodzaju Bacillus, takich jak: Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus 55 coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megete- rium, Bacillus mesentericum, Bacillus pumilus, Ba¬ cillus subtilis, etc. przez naswietlanie szczepu ma¬ cierzystego takim promieniowaniem, jak nadfiole¬ towe, promienie X, promienie gamma lub podobne, lub przez poddanie szczepów macierzystych dzia- 60 laniu chemicznych substancji mutagennych, takich jak N-metylo-Ni-nitro-N-nitrozoguanidyna, iperyt azotowy dwumetylosulfotlenek, metanosulfonian e- tylu, etc. Mozna oczywiscie najpierw otrzymac szczep, pozbawiony transketolazy lub/oraz empi- 65 razy i spowodowac dalsza jego mutacje z wytwo-91 9 Tzeniem szczepu, odznaczajacego sie brakiem zdol¬ nosci wytwarzania zarodników lub/oraz wysoka zdolnoscia utleniania 2-dezoksy-D-glukozy, lub tez mozna odwrócic kolejnosc procesu w celu otrzy¬ mania pozadanego mutantu.Liczby nastepujace po IFO stosowane w tym opisie oznaczaja numery wpisu w Institute for Fermentation, Osaka w Japonii.Przy omawianiu substancji odzywczych, stoso¬ wanych jako skladniki pozywek do hodowli drob¬ noustrojów sposobem wedlug wynalazku, jako zródla wegla stosuje sie miedzy innymi, D-gluko- ze, D-fruktoze, D-mannoze, sorbit, D-mannitol, sa¬ charoze, melase, hydrolizaty skrobi, kwas octowy i metanol.Jako zródla azotu stosuje sie naturalne zródla azotu, takie jak namok kukurydzy, odpady bawel¬ niane, wyciag z drozdzy, drozdze suszone, maczka rybna, wyciag z miesa, pepton, etc, azotowe zwiaz¬ ki nieorganiczne, takie jak wodny roztwór amo¬ niaku, gazowy amoniak, siarczan amonowy, chlo¬ rek amonu, wegiel amonowy, fosforan amonowy, azotan sodowy, etc, oraz takie organiczne zwiazki azotowe, jak mocznik, aminokwasy, etc. W sklad pozywki wchodza takze, oprócz wymienionych zró¬ del wegla i azotu, rózne metale, witaminy, amino¬ kwasy i inne substancje, które moga miec istotne znaczenie dla wzrostu danego drobnoustroju, przy czym proporcje tych skladników sa zmienne.Hodowle prowadzi sie w warunkach tlenowych, np. na wstrzasarce lub w zanurzeniu, stosujac rozpryskiwanie^ mieszanie. Temperature inkuba¬ cji dobiera sie w zakresie od 20° do 45°C w za¬ leznosci, od temperatury najbardziej korzystnej dla wzrostu danego drobnoustroju oraz gromadzenia D-ribozy. Odczyn pH pozywki ma najczesciej war¬ tosc od 5 do 9. W celu utrzymania wartosci pH w optymalnym zakresie podczas okresu hodowli, mozna dodawac od czasu do czasu takie substan¬ cje neutralizujace, jak kwas solny, kwas siarkowy, wodny roztwór amoniaku, gazowy amoniak, wodny roztwór wodorotlenku sodowego, weglan wapnio¬ wy, wapno gaszone, etc.Znaczna ilosc D-ribozy zbiera sie w pozywce zwykle po uplywie 2 do 5 dni.Tak nagromadzona D-riboze mozna latwo wy¬ odrebnic np. w nastepujacy sposób. Brzeczke z ho¬ dowla przesacza sie najpierw lub odwirowuje, przy czym latwo udaje sie oddzielic komórki.Przesacz odsala sie nastepnie i odbarwia za po¬ moca zywicy jonowymiennej i wegla aktywnego, a nastepnie zageszcza.Do zageszczonego roztworu dodaje sie rozpusz¬ czalnik organiczny, taki jak etanol,, co powoduje wytracenie krysztalów D-ribozy. Niezaleznie od wyboru sposobu wyodrebniania D-ribozy proces ten daje sie przeprowadzic bez trudnosci.Nastepujace przyklady maja na celu dalsza ilu¬ stracje wynalazku, nie ograniczajac jednak jego zakresu.Procentowosci podane w niniejszym opisie wy¬ razaja stosunek ciezaru do objetosci wszedzie tam, gdzie nie zaznaczono, ze jest inaczej.Przyklad I. Nie zawierajacy transketolazy i pozbawiony zdolnosci wytwarzania zarodników 801 mutant Bacillus pumilus No 911 (IFO 13566), otrzy¬ many z Bacillus pumilus IFO 12113 przez naswiet¬ lenie promieniami nadfioletowymi (aktywnosc transketolazy: ponizej 0,01 //mola/min/mg proteiny, czestotliwosc wytwarzania zarodników tj. „Sporu- lation freauency": 2X10—8), zaszczepiono na 10 1 pozywki, zawierajacej 2,0% sorbitu, 2,0% namoku kukurydzy, 0,3% jednowodorofosforanu potasowe¬ go, 100 /u g/ml tyrozyny i 100 p g/ml fenyloalaniny, a zaszczepiona pozywke inkubowano przy tempe¬ raturze 36°C w ciagu 24 godzin. Cala otrzymana hodowle przeniesiono do 100 1 pozywki, zawiera¬ jacej 15,0% D-glukozy, 1,0% suszonych drozdzy, 0,5% siarczanu amonowego, 2,0% weglanu wapnio- wego, 50 [a, g/ml tryptafanu, 50 ju g/ml tyrozyny i 50 /u g/ml fenyloalaniny, na której hodowle te prowadzono w temperaturze 36°C w ciagu 60 go¬ dzin, przy czym nagromadzenie D-ribozy wynioslo 64 mg/ml. Z zawierajacej D-riboze brzeczki fer- mentacyjnej usunieto komórki przez odsaczenie, a przesacz zageszczono do polowy pierwotnej obje¬ tosci. Do roztworu dodano etanol w ilosci, równej 1/4 objetosci roztworu i usunieto wytracony osad.Pozostalosc poddano procesowi odsalania na ka¬ tionowych i aminowych zywicach jonowymien¬ nych, a nastepnie odbarwiono na kolumnie z weg¬ lem aktywnym.Odbarwiony roztwór zageszczono i dodano po¬ czwórna objetosc etanolu, otrzymujac 5,0 kg kry- stalicznej D-ribozy.Przy k-l a d II. Hodowle mutanta Bacillus pu¬ milus No 1027 (IFO 13585), niezawierajacego trans¬ ketolazy i odznaczajacego sie wysoka zdolnoscia utleniania 2-dezoksy-D-glukozy (aktywnosc trans- ketolazy: ponizej 0,01 p mola/min/mg proteiny, zdolnosc utleniania 2-dezoksy-D-glukozy: 0,28 jlc mola/min/mg proteiny), otrzymanego z Bacillus pumilus IFO 12092 przez naswietlenie promienia¬ mi nadfioletowymi, prowadzono w sposób analo- 40! giczny do opisanego w przykladzie I, co dalo na¬ gromadzenie D-ribozy w ilosci 63,2 mg/ml. Z brze¬ czki w sposób opisany w przykladzie I wyodreb¬ niono 4,8 kg krystalicznej D-ribozy.Przyklad III. Hodowle mutanta Bacillus pu- 45 milus No 1083 (IFO 13620), nie zawierajacego translaktozy i odznaczajacego sie brakiem zdol¬ nosci wytwarzania zarodników oraz wysoka zdol¬ noscia utleniania 2-dezoksy-D-glukozy (aktywnosc transketolazy ponizej 0,01 ^mola/min/mg proteiny, czestotliwosc wytwarzania zarodników: 4X10—fl, zdolnosc utleniania 2-dezoksy-D-glukozy: 0,34 ^mo- la/min/mg proteiny), otrzymanego z Bacillus pu¬ milus S-l (szczep ten wyodrebniono z gleby i zi¬ dentyfikowano jako Bacillus pumilus zgodnie z o- pisem Bargey's Manual of Determinative Bacterio- 55 logy pp. 620—622 (1957) przez naswietlanie pro¬ mieniowaniem nadfioletowym,'prowadzono w spo¬ sób analogiczny do opisanego w przykladzie I, co dalo nagromadzenie D-ribozy w brzeczce w ilosci 72,3 mg/ml. Z brzeczki w sposób opisany w przy- 60 kladzie I wyodrebniono 5,6 kg krystalicznej D-ri¬ bozy. PL