DD259969A3

DD259969A3 - Verfahren zur herstellung von gluconsaeure mittels bakterien

Info

Publication number: DD259969A3
Application number: DD29215986A
Authority: DD
Inventors: Rolf Dueresch; Joerg Schmidt; Hans-Peter Richter; Wolfgang Babel; Uwe Iske; Mirko Jechorek; Dietmar Miethe; Werner Kochmann
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1986-07-04
Filing date: 1986-07-04
Publication date: 1988-09-14

Abstract

Durch die Erfindung wird die Oxidationsleistung der als Katalysator fuer die mikrobielle Glucoseoxidation verwendeten Bakterienbiomasse erhoeht. Dies wird durch phaenotypische Massnahmen bewirkt, die waehrend oder bei Beendigung der Wachstumsphase der Bakterien vorgenommen werden. Zu diesem Zweck werden die Bakterien mit Methanol oder Glucose geschockt oder dem Kultivierungsmedium, sofern es nicht Glucose, sondern z. B. Methanol oder Acetat ist, Gluconsaeure, Glucanat oder auch Glucose zugesetzt und/oder der p H-Wert in der Produktionsphase durch Titration konstant gehalten. Durch diese Massnahmen werden sowohl wesentlich hoehere Produktivitaeten und hoehere Saeure- bzw. Gluconatendkonzentrationen erreicht. Diese signifikante Steigerung der Prozesseffektivitaet wird darueberhinaus bei Verwendung geringer Zellkonzentrationen erreicht.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Gluconsäure- bzw. Gluconatlösung durch Oxydation von Glucose mit Hilfe von Bakterien.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die technische Herstellung von Gluconsäure bzw. Gluconaten, die gegenwärtig in großen Mengen in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie angewendet werden und in der Waschmittelherstellung oder als Industriereiniger auf Grund ihrer komplexbildenden Eigenschaften zum Einsatz kommen, erfolgt fast ausschließlich auf mikrobiellem Wege, wobei meist Stämme vonAspergillus niger, verwendet werden (J. H. Rehm: Industrielle Mikrobiologie, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1980).

Obwohl bekannt ist, daß verschiedene Acetobacter-, Gluconobacter- und Pseudomonasspezies in der Lage sind, Glucose zu Gluconsäure zu oxidieren (P. E. Milsom, J. L. Meers: Gluconic and Itaconic Acids. In Comprehensitive Biotechnology [Ed. M. Moo-Young], Vol.3 [ed. by C. L. Cooney, A. E. Humphrey], Pergamon Press, Oxford 1985, pp. 681-700), werden in technisch realisierten Verfahren lediglich Spezies der Gattung Gluconobacter benutzt.

Die technischen Prozesse werden diskontinuierlich, zweistufig durchgeführt. Alle haben den Nachteil, daß die Produzenten nur unter sterilen Bedingungen gewonnen werden können, auch während der Produktbildungsphase der Sterilität weitestgehend aufrechterhalten und als Substrat für die Erzeugung des Produzenten Glucose benutzt werden muß. Letzteres ist erforderlich, um die Produktbildungsleistung auf ein hohes Niveau zu heben.

Mit dem DD-WP 238067 ist ein kontinuierliches Verfahren unter Verwendung von Bacterien von Acinetobacter calcoaceticus bekannt, bei dem dies durch Verwendung eines Substratgemisches umgangen wird. Die ständig anwesende Glucose hält das Oxydationspotential des Produzenten hoch, ohne daß Glucose assimiliert wird. Sie kann maximaj zu Gluconsäure umgesetzt werden. Ein Nachteil dieses wie aller Verfahren, die mit neutrophilen Bakterien arbeiten, ist, daß der pH-Wert durch Titration mit Alkali- oder Erdalkalihydroxid zwischen 5 und 7, bevorzugt 7, gehalten werden muß, und — bei zweistufigem Betrieb — nur gegen Ende der Produktbildungsphase auf niedrigere Werte absinken darf, wie in der DE-AS 1817907 beschrieben. Das Verfahren gemäß DD-WP 236754 besitzt zwar diese Nächteile nicht, allerdings überschreitet die mögliche Produktivität des Gesamtprozesses (bei einer erreichbaren Gluconsäurekonzentration von 310g/l) einen Wert von 7g Säure/l · h nicht. Die in diesem Patent beschriebene Produktivität von 15g/l · h in einem Konzentrationsbereich bis 160g/l ist nur erreichbar, wenn eine Biomassekonzentration von 50g/l eingesetzt wird. Mit derartig hohen Biomassekonzentrationen sind allerdings mehrere Nachteile verbunden. So sinkt z. B. die auf Glucose bezogene Ausbeute bei hohen Zellkonzentrationen durch Veratmung/ Endoxydation der Glucose unter 90%. Es entsteht zusätzlicher Aufwand für die Erzeugung der Biomasse als Produzent und für die Abtrennung der Biomasse aus der gluconsäurehaitigen Fermentationslösung. Die damit verbundenen Kosten belasten den Prozeß signifikant.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Oxydationsleistung von Gluconsäureproduzenten zu steigern und damit die Produktivität von Verfahren zur mikrowellen Gluconsäureproduktion zu verbessern.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Kapazität von Bakterien zur Oxydation von Glucose zu Gluconsäure zu erhöhen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß die Oxydationsleistung der verwendeten Bakterienkulturen durch phänotypische Maßnahmen bei Beendigung oder während der Wachstumsphase erhöht wird.

Dabei wird vorteilhafterweise so verfahren,-daß zur Gluconsäureproduktion befähigte Bakterien der Gattungen Aceto- bzw. Gluconobacter sowie Acinetobacter während oder bei Beendigung der kohlenstofflimitierten Kultivierung zur Erzeugung des Produzenten über einen Zeitraum von 1 bis 15 Stunden mit Methanol in Konzentrationen von 1 bis 10 g/l oder mit Glucose bis zu 80 g/l geschockt werden, oder daß diesen Stämmen, sofern sie nicht auf Glucose kultiviert werden bzw. werden können, beim Wachstum auf anderen Kohlenstoffquellen, (wie z.B. Methanol oder Acetat), Gluconsäure, Glucanat bzw. auch Glucose in einer Konzentration zwischen 0,01 bis 0,5% zugesetzt wird. -

Diese Verfahrensweise zeichnet sich gegenüber dem durch das DD-WP 236754 repräsentierten Stand der Technik durch eine erhöhte spezifische Produktbildungskapazität aus. Im Falle von Acetobacter methanolicus können Produktivitäten von 26g/l · h im Bereich der Produktbildungsphase bis 100g Säure/l bzw. 17g/l · h im Bereich bis 200g Säure/l erreicht werden. Hervorzuheben ist dabei, daß diese hohen Produktivitäten bereits mit Biomassekonzentrationen im Bereich zwischen 0,5 bis 8g/l möglich sind und daß biszu 400g Gluconsäure pro Liter erreicht werden können bei einer „Überalles" Produktivitätvon 10g/l h, wodurch die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens erheblich verbessert wird.

Die auf diese Weise (d. h. durch Schocken oder Zugabe von Gluconsäure bzw. Glucose in das Wachstumsmedium) gesteigerte Produktivität kann weiter erhöht werden, indem der pH-Wert während der Produktbildungsphase konstant gehalten wird. Unter Nutzung der bei der Verwendung acidophiler Bakterien gegebenen Vorteile der unsterilen Prozeßführung sowohl in der Stufe der Biomasseerzeugung als auch der eigentlichen Produktion wird die Gluconsäureproduktion bevorzugt mit Acetobacter methanolicus durchgeführt und der pH-Wert zwischen 2,5 und 3,3 konstant gehalten, so daß Produktivitäten bis 400g Säure/l von 7 g/l · h erreicht werden. Bei Anwendung von nichtacidophilen Bakterien sollte ein pH-Wert von 4,5 nicht unterschritten werden. Durch Kombination von Schocken oder Glucose bzw. Gluconsäurezusatz am Ende der Wachstumsphase und Titration ist eine weitere Steigerung der Prozeßproduktivität möglich, die sich im Bereich bis 200g Säure/l auf 20g/l .· h und im Bereich bis 400g Säure/l auf 10g/l h beläuft.

Säureendkonzentrationen von 500 g/l können auf diese Weise erzeugt werden. Durch nachfolgende Beispiele soll die Erfindung näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1:

Acetobacter methanolicus wird in einem 101 Laborfermenter unter folgenden Bedingungen kultiviert:

Reaktorinhalt 4kg

Verweilzeit: 7h

pH-Wert: 4,0

gel. O₂-Konz.: §5% des Sättigungswertes

Substrat: Methanol, C-Iimitiert

Temperatur: 32°C

Rührerdrehzahl: 1 500 U/min

Nährlösungszusammensetzung: (bilanziert für 20g BTS/I)

NH₄CI 8g/I, K₂HPO₄2,4g/l, MgSO₄ · 7H₂O 1,6g/l, CuSO₄ 5H₂O 9,6mg/l, CoSO₄ · 5H₂O 2,4mg/l, MnSO₄ 4H₂O 18,8mg/l, H₃BO₃ 28mg/l, FeCI₂ · 7H₂O 16,8mg/l, CaCI₂ · 6H₂O 28,8mg/l, Na₂MoO₄ · 2H₂O 31,2mg/l, ZnCI₂ · 7H₂O 24mg/l

Nach Erreichen eines stationären kontinuierlichen Prozeßzustandes bei einer Biomassekonzentration von 19,5g/l und kohlenstofflimitierten Prozeßführung wird der Methanolgehalt im Fermentationsmedium auf 4,5g/l gestellt und über einen Zeitraum von 5 Stunden konstant gehalten. ·

Nach 5 Stunden Methanolschock wird die Biomasse geerntet, zentrifugiert und als Impfmaterial für die mikrobieile Gluconsäureproduktion verwendet.

Zu diesem Zweck werden in einen 121 Rührkesselreaktor 41 einer 15%igen Glucoselösung gegeben und mit Acetobacter methanolicus (Methanol geschockt) angeimpft, so daß sich eine Zelldichte von 6,5g/l ergibt. Die Produktsynthese wird bei folgenden Prozeßparametern durchgeführt:

Rührerdrehzahl: 800U/min

Temperatur: 32°C

Belüftungsrate: 50 l/kg · h

Eine Regelung des pH-Wertes während des Prozesses erfolgt nicht.

Die Zuführung von Glucose erfolgt so, daß ein aktueller Konzentrationsbereich von S10 S 30g/l eingehalten wird.. Folgende Ergebnisse werden im Vergleich zu ungeschockter Biomasse erhalten:

Reaktions	Säurekonzen-	85*	Produktivität	17*	spezifische	2,6*
zeit	tration	130*		10,8*		1,7*
		300*		7,5*	Produktbildungs	1,2*
IhI	/g/l/		/g/l-h/		rate
5	115	23	/g/g-h/
12	200	16,6	3,5
40	390	9,8	2,6
* Einsatz ungeschockter Biomasse		1,5

Die Zugabe der Glucose wird in den letzten 10 Stunden des Prozesses so geregelt, daß am Ende der Reaktion die Glucosekonzentration im Medium <0,1 % beträgt.

Beispiel 2:

Analog Beispiel 1 wird in einem 121 Rührkesselreaktor der Stamm Acetobactermethanolicus MB 58 kontinuierlich kultiviert. Anstelle von reinem Methanol als Substrat wird ein Mischsubstrat bestehend aus Methanol und Gluconat im Verhältnis 5:1 eingesetzt. Die so produzierte Biomasse wird wie in Beispiel 1 beschrieben zur mikrobiellen Glucoseoxidation in einem Laborfermenter eingesetzt. Die Zellkonzentration betrug 7,9g Γ¹. Folgende Werte wurden ermittelt:

Reaktions	Säurekonzen	Produktivität	spezifische
zeit	tration	/g/l-h/	Produktbildungsrate
IhI	/g/l/	20,6	/g/g-h/
5	103	15,5	2,6
10	155	13,0	1,9
20	260	9,5	1,6
40	380	1,2

Die auf Glucose bezogene Ausbeute betrug 93,2%, die Restglucosekonzentration im Medium <0,1 %.

Beispiel 3:

Analog Beispiel 1 wird in einem 121 Laborrührkesselreaktor der Stamm Acetobactermethanolicus MB 58 kontinuierlich auf dem Substrat Glucose kultiviert. Aus dem Ferrnentationsmedium wird in einer Laborzentrifuge Biomasse abgetrennt und wie in Beispiel 1 beschrieben 4I einer 15%igen Glucoselösung in einem 121 Laborfermenter angeimpft, die Konzentration im Medium beträgt 0,9g/l.

Folgende Werte wurden in der Phase der Produktbildung erreicht:

Reaktions- Säurekon- spezifische

zeit zentration Produktivität Produktbildungsrate

/h/ ' /g/l/ /g/I - h/ /g/g-h/

12	190
26	260
36	310

15,8

10,0

8,6

17,6

11,1

9,6

Die auf Glucose bezogene Ausbeute betrug 94,3%", die Restglucosekonzentration im Medium < 0,2%.

Beispiel 4:

Analog Beispiel 1 wird die Kultur Acetobacter methanolicus kontinuierlich kohlenstofflimitiert auf Methanol erzeugt, geerntet und nach Zentrifugation als Produzent für die Gluconsäuresynthese eingesetzt.

In Abweichung von Beispiel 1 wird während des Prozesses der Produktbildung (eingesetzte Biomassekonzentration 6,5 g/l) der pH-Wert des Fermentationsmediums bei 3,0 durch Titration mit 50% Natronlauge konstant gehalten.

Folgende Ergebnisse werden erhalten:

Reaktions- Säurekon- spezifische

zeit zentration* Produktivität Produktbildungsrate

lh/ /g/l/ g/l-h/ /g/g-h/

5	112
12	180
40	350
50	385
60	420
80	440

22,4 15,0 8,8 7,7-7,0 5,5

3,4 2,3 1,3 1,2 1,1 0,8

* berechnet auf freie Säure

Die auf Glucose bezogene Ausbeute beträgt 94,1 %.

Beispiel 5:

Analog Beispiel 1 wird Biomasse der Kultur Acetobacter methanolicus erzeugt und mit Methanol geschockt. Anschließend wird die so behandelte Biomasse analog Beispiel 4, d. h. unter Titration bei einem pH-Wert von 3,0, zur Produktbildung eingesetzt. Unter diesen Bedingungen werden folgende Ergebnisse erhalten:

Reaktions	Säurekon	Produktivität	spezifische
zeit	zentration*	/g/l · h/	Produktbildungsrate
IhI	/g/l/	25,0	Vg/g-h/
CJl	125	20,0	3,8
10	200	17,3	3,1
20	345	10,4	2,7
40	415	8,1	1,6
60	485	1,2

* berechnet auf freie Säure

Die auf Glucose bezogene Ausbeute beträgt 93,8%.

Beispiele:

Acinetobacter calcoaceticus ZIMET 11089 wird in einem Laborfermentor bei 30^cC gezüchtet, der pH-Wert von 6,8 wird durch Zugabe von NaOH bzw. HCI konstant gehalten. Die Gelöstsauerstoffkonzentration wurde größer 20% Sättigung eingestellt. Die kontinuierliche Kultivierung erfolgte auf Na-Acetat als Kohlenstoffquelle und einem Mineralsalzmedium folgender Zusammensetzung (in mg/l):

Ammoniumchlorid 3400

Kaliumhydrogenphosphat 310

Magnesiumsulfat χ 7H₂O 15

Kalziumchlorid χ 2 H₂O 20

Eisen(ll)sulfatx7H₂O 5

Zinksulfat χ 7 H₂O 0,44

Mangansulfat χ 4 H₂O 0,82

Kupfersulfat x 5 H₂O 0,78

Natriummolybdatx2H₂O 0,25

Nach Erreichen eines C-Iimitierten, stationären kontinuierlichen Prozeßzustandes wird in das Fermentationsmedium Glucose gegeben und über einen Zeitraum von 5 Stunden die Glucosekonzentration in einem Bereich zwischen 5 und 30g/l konstant gehalten.

Nach 5 Stunden Glucoseschock wurde die Biomasse geerntet, und analog Beispiel 1 für die mikrobielle Gluconsäureproduktion verwendet. Dabei werden nach 40 Stunden Gluconsäurekonzentrationen von 265g/l erreicht.

Mit ungeschockter Biomasse wurden im Vergleich dazu nur 200g/l Gluconsäure erhalten.

Beispiel 7:

Analog Beispiel 6 wurde die Kultur Acinetobacter calcoaceticus ZIMET 11089 kohlenstofflimitiert auf Acetat erzeugt und anschließend mit Gluconat geschockt.

Mit dieser Biomasse wurde nach 40 Stunden Gluconsäurekonzentrationen von 237g/l erhalten.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Gluconsäure mittels Bakterien unter Verwendung von Stämmen der Gattungen Acetobacter, Gluconobacter oder Acinetobacter, gekennzeichnet dadurch, daß die Oxydationsleistung der Bakterienkulturen durch phänotypische Maßnahmen während oder bei Beendigung der Wachstumsphase erhöht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Oxydationsleistung durch einen 1-bis 15stündigen Substratschock bei Beendigung des kohlenstoffsubstratlimitierten Wachstums zur Erzeugung des Produzenten erhöht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß zum Schocken Methanol in einer Konzentration von 1 bis 10g/l bzw. Glucose in einer Konzentration bis 80g/l zugegeben werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß, sofern der Produzent nicht auf Glucose erzeugt wird, dem Kultivierungsmedium (z. B. Methanol oder Acetat) Gluconsäure, Gluconat bzw. Glucose in einer Konzentration zwischen 0,01 bis 0,5g/l, bevorzugt 0,1 g/l zugesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß in der Produktionsphase der pH-Wert durch Titration bei Verwendung von Acetobacter methanolicus zwischen 2,5 und 3,3 und von Acinetobacter calcoaceticus zwischen 5 und 6,5 konstant gehalten wird.

6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß der Produzent geschockt wird und/oder unter Zusatz von Gluconsäure, Gluconat oder Glucose erzeugt wird und der pH-Wert während der Produktbildung bei Verwendung von Acetobacter methanolicus 2,5 nicht unterschreitet und zwischen 2,5 und 3,3 konstant gehalten wird.