-
Gewinnung von Cholesterinoxydase Ausscheidung aus Patent . ... ...
(Patentanmeldung P 22 24 133.4) Zusatz zu Patent . ... , (Patent-3.-,meldurlg P
22 24 133*4) Die Erfindung betrifft die Gewinnung von Cholesterinoxydase durch Verwendung
bestimmter Mikroorganismen.
-
Es ist bekannt, daß Mikroorganismen Steroide umsetzen und Steroide
als alleinige Kohlenstoffquelle verwerten können. Es ist auch bekannt, daß zahlreiche
Mikroorganismen Cholesterin in Cholestenon überführen können (J.Bakteriol. 47, 487
bis 493 (1944)). Es wurde angenommen, daß der Abbau des Cholesterins durch koordinierte
Einwirkung einer Vielzahl von Organismen erfolgt. Bekannt ist auch, daß auf Glycerin
als Sohlenstoffquelle gewachsenes Mycobacterium cholesterolicum Cholesterin in Cholestenon
überführt. Wurde dieser Mikroorganismus auf Cholesterin wachsen gelassen, so wurde
anstelle von Cholestenon überwiegend Oholestendion gebildet (J.Biol.Chem. 206, 511
bis 523 (1954)). Eine Aufklärung des Reaktionsmechanismus scheiterte daran, daß
kein lösliches Enzymsystem aufgefunden werden konnte, welches den Cholesterinabbau
durchzuführen vermochte.
-
Aufgabe der Erfindung ist die Auffindung von Mikroorganismen, aus
welchen ein lösliches Cholesterin abbauendes Enzym gewonnen werden kann.
-
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungegemäß durch die Verwendung von
Proactinomycetes erythropolis NCIB 9158 (NBC 9158) zur Gewinnung von Cholesterinoxydase,
welche die Oxydation von Cholesterin gemäß der Reaktionsgleichung Cholesterin +
02 --, Cholestenon + H202 katalysiert.
-
Aus der DT-OS 2 021 465 ist bereite ein Verfahren zur Gewinnung von
Sterindehydrase aus Mikroorganismen vom Genus Brevibacterium bekannt. Dieses Enzym
ist keine Oxydase, die mit Sauerstoff als Akzeptor unter Bildung von H202 reagiert.
Außerdem dehydriert es nicht nur die OH-Gruppe in 3ß-Stellung des Cholesterins,
sondern auch die 3ß-Hydroxy- und 17ß-Hydroxygruppen anderer Sterine, so daß es schon
aus diesem Grunde nicht zur spezifischen Bestimmung des Cholesterins geeignet wäre.
-
Die erfindungsgemäß gewonnene Cholesterinoxydase dagegen ist spezifisch
für Cholesterin und reagiert nicht mit 17ß>Hydroxygruppen.
-
Cholesterinoxydase ist ein neues Enzym, welches in löslicher Form
aus den genannten Mikroorganismen isoliert werden kann.
-
Es handelt sich um eine Oxidoreduktase mit °2 als Akzeptor.
-
Die Umsetzung verläuft unter Bildung von H202 stöchiometrisch.
-
Die Aktivität des Enzyms läßt sich leicht bestimmen in Ausnützung
der obigen Reaktion, beispielsweise indem das unter festgelegten Bedingungen gebildete
H202 bestimmt wird. Das Enzym ist spezifisch und kann andere Steroide nicht oxydieren.
-
Aufgrund dieser Eigenschaften eignet sich das Enzym für eine spezifische
Bestimmungsmethode für Cholesterin. Eine derartige Bestimmungsmethode fehlte bisher.
-
Bei der Züchtung der erwähnter Mikroorganismen auf Cholesterin ale
einziger Kohlenstoffquelle besteht das Problem, daß Cholesterin nur sehr wenig wasserlöslich
ist und sich infolge dessen an den Permenterwänden absetzt. Hierdurch wird bewirkt,
daß die sich vermehrenden Mikroorganismen adsorbiert und eingeschlossen werden und
so aus der Kulturlösung austreten. Ein Zusatz von Lösungsvermittlern wie Alkoholen
oder Ketonen hat den Nachteil, daß diese Substanzen vom Mikroorganismus als Kohlenstoffquelle
bevorzugt werden und damit der Gehalt an Oholesterinoxydase stark verringert wird.
Ein Zusatz von Emulgatoren führte zu einer Wachstumshemmung.
-
Diese Schwierigkeit wurde erfindungsgemäß überwunden, indem die Mikroorganismen
auf einem peptonhaltigen Mineralsalzmedium wachsen gelassen wurden und, sobald die
logarithmische Wachstumsphase erreicht war, eine wässrige Emulsion zugesetzt wurde,
die durch Naßvermahlung einer wässrigen (?holesterinsuspension und anschließende
Hitzesterilisation hergestellt worden war. Es gelang so, eine hundertprozentige
Ausnutzung des Cholesterins innerhalb einer eintägigen Kulturdauer bei einer Ausbeute
von 1 bis 2 g reiner Zelltrockensubstanz zu erzielen. Die Emulsion wurde dabei der
Kulturbrühe in solcher Menge zugesetzt, daß insgesamt 1 bis 20 g Cholesterin Je
1 im Verlauf des Wachstums zugegeben wurden. Die Zugabe erfolgt zweckmäßig portionsweise
im Maße des Mikroorganismenwachstiltiis. Eine kleine Menge Cholesterin wird der
Wachstumsbrühe vorzugsweise bereits bei Beginn des Wachstums, also vor Erreichung
der logarithmischen Wachstumsphase zugesetzt.
-
Als Nährboden hat sich eine wässrige Lösung mit einem Gehalt pon etwa
0,1 bis 2 Gew.-% Pepton, 0,01 bis 0,2 Ge,- .2EP04.
-
0,05 bis 1 Gew.-% NH4H2PO4, 0,05 bis 0,1 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat,
die Eisenchlorid und Calciumchlorid in Spuren enthielt und einen pH-Wert zwischen
6 und 9 aufwies, bewährt.
-
Die anfängliche Cholesterinzugabe liegt zweckmäßig zwischen 0,01 und
0,1 %.
-
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
-
Beispiel 1 2 1 eines Nährbodens, bestehend aus 0,5 Gew.-% Pepton aus
Kasein (tryptisch), 0,05 Gew.-% K2HPO4, 0,2 Gew.-% NH4H2PO4, 0,02 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat,
Eisenchlorid und Calciumchlorid in Spuren in Leitungswasser und durch KOH auf pH
7,5 eingestellt, werden in einem Schüttelkolben mit 200 ml einer gut bewachsenen
Vorkultur von Proactinomyces erythropolis NCIB 9158 (NBC 9158) beimpft und auf einem
Magnetrührer kräftig belüftet. Mit Beginn der logarithmischen Wachstumsphase, erkennbar
an der auftretenden Urübungszunahme, wird schubweise durch Naßvermahlung bereitete,
sterilisierte Cholesterinsuspeneion im Verlauf der weiteren Züchtung derart zugegeben,
daß innerhalb von 20 Stunden insgesamt eine Menge von 10 g Cholesterin in den Kolben
eingebracht wird. 5 Stunden nach der letzten Zugabe wird die Zellmasse durch Zentrifugation
abgeerntet. Man erhält 4 g Bakterientrockenmasse. Nach Aufschluß mit Ultraschall
ergeben sich 3 U/g Cholesterinoxydase. Dabei entspricht 1 U der Bildung von 1 pMol
H202/min - Oxydation von 1 SMol Cholesterin/min unter folgenden Testbedingungen:
2,31 ml P04-Puffer, 0,05 M, pH 7,0 (+ 2,2-Azlnbenzthiazolonsulfonsaures-Ammonium
2 ml, c = 50 mg/ml auf 100 ml Puffer) 0,05 ml Cholesterinlösung, c = 3,7 mg/ml,
in t-Butanol
0,6 ml t-Butanol, 0,02 ml POD, c = 1, 0,02 ml Bakterienextrakt.
-
Beispiel 2 In einem geeigneten Kulturgefäß werden 60 1 des in Beispiel
1 beschriebenen Mediums mit 0,5 1 gut bewachsener Vorkultur von P. erythropolis
NCIB 9158 (NBo 9158) bei kräftiger Burchl£-tung kultiviert. Hierbei werden gleich
von Beginn an 0,05 % Cholesterin zugesetzt. Man erhält dabei eine Bakterienmasse
von 40 g. Aus der Bakterienmasse werden durch Ultraschallaufschluß 7,1 U/g Cholesterinoxydase
erhalten.
-
Nach etwa 25 Stunden wird begonnen, frischen Nährboden dem gulturgefäß
zuzuführen und in gleichem Maße bewachsene Kulturlösung dem Kulturgefäß zu entnehmen.
Die Verdünnungsrate (Fließgeschwindigkeit pro Arbeitsvolumen) beträgt hierbei 0,04.
Gleichzeitig wird dem Fermenter Cholesterinsuspension derart zugeführt, daß pro
Stunde etwa 3 g Cholesterin zugegeben werden. Man erhält so in kontlnuierlicher
Züchtung eine Ausbeute von 1,2 bis 1,5 g/l Bakterientrockenmasse mit einer spezifischen
Aktivität von 7,1 U/g.
-
Das obige Beispiel zeigt, daß die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen
auch im kontinuierlichen Züchtungsverfahren für die Gewinnung von Cholesterinoxydase
geeignet sind.