DD259969A3 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF GLUCONIC ACID BY BACTERIA - Google Patents

PROCESS FOR THE PREPARATION OF GLUCONIC ACID BY BACTERIA Download PDF

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DD259969A3
DD259969A3 DD29215986A DD29215986A DD259969A3 DD 259969 A3 DD259969 A3 DD 259969A3 DD 29215986 A DD29215986 A DD 29215986A DD 29215986 A DD29215986 A DD 29215986A DD 259969 A3 DD259969 A3 DD 259969A3
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glucose
gluconic acid
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methanol
bacteria
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DD29215986A
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Rolf Dueresch
Joerg Schmidt
Hans-Peter Richter
Wolfgang Babel
Uwe Iske
Mirko Jechorek
Dietmar Miethe
Werner Kochmann
Original Assignee
Adw Ddr
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Abstract

Durch die Erfindung wird die Oxidationsleistung der als Katalysator fuer die mikrobielle Glucoseoxidation verwendeten Bakterienbiomasse erhoeht. Dies wird durch phaenotypische Massnahmen bewirkt, die waehrend oder bei Beendigung der Wachstumsphase der Bakterien vorgenommen werden. Zu diesem Zweck werden die Bakterien mit Methanol oder Glucose geschockt oder dem Kultivierungsmedium, sofern es nicht Glucose, sondern z. B. Methanol oder Acetat ist, Gluconsaeure, Glucanat oder auch Glucose zugesetzt und/oder der p H-Wert in der Produktionsphase durch Titration konstant gehalten. Durch diese Massnahmen werden sowohl wesentlich hoehere Produktivitaeten und hoehere Saeure- bzw. Gluconatendkonzentrationen erreicht. Diese signifikante Steigerung der Prozesseffektivitaet wird darueberhinaus bei Verwendung geringer Zellkonzentrationen erreicht.The invention increases the oxidation performance of the bacterial biomass used as a catalyst for microbial glucose oxidation. This is done by phenotypic measures taken during or at the end of the growth phase of the bacteria. For this purpose, the bacteria are shocked with methanol or glucose or the culture medium, if it is not glucose, but z. As methanol or acetate, gluconic acid, glucanate or glucose is added and / or held constant the pH value in the production phase by titration. Through these measures, both significantly higher productivity and higher acid or Gluconatendkonzentrationen be achieved. This significant increase in process efficiency is also achieved using low cell concentrations.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Gluconsäure- bzw. Gluconatlösung durch Oxydation von Glucose mit Hilfe von Bakterien.The invention relates to a biotechnological process for the preparation of an aqueous gluconic acid or gluconate solution by oxidation of glucose by means of bacteria.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Die technische Herstellung von Gluconsäure bzw. Gluconaten, die gegenwärtig in großen Mengen in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie angewendet werden und in der Waschmittelherstellung oder als Industriereiniger auf Grund ihrer komplexbildenden Eigenschaften zum Einsatz kommen, erfolgt fast ausschließlich auf mikrobiellem Wege, wobei meist Stämme vonAspergillus niger, verwendet werden (J. H. Rehm: Industrielle Mikrobiologie, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1980).The industrial production of gluconates or gluconates, which are currently used in large quantities in the food and pharmaceutical industry and used in detergent production or as industrial cleaners due to their complex-forming properties, takes place almost exclusively by microbial route, mostly strains of Aspergillus niger (JH Rehm: Industrial Microbiology, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1980).

Obwohl bekannt ist, daß verschiedene Acetobacter-, Gluconobacter- und Pseudomonasspezies in der Lage sind, Glucose zu Gluconsäure zu oxidieren (P. E. Milsom, J. L. Meers: Gluconic and Itaconic Acids. In Comprehensitive Biotechnology [Ed. M. Moo-Young], Vol.3 [ed. by C. L. Cooney, A. E. Humphrey], Pergamon Press, Oxford 1985, pp. 681-700), werden in technisch realisierten Verfahren lediglich Spezies der Gattung Gluconobacter benutzt.Although it is known that various Acetobacter, Gluconobacter, and Pseudomonas species are capable of oxidizing glucose to gluconic acid (PE Milsom, JL Meers: Gluconic and Itaconic Acids., In Comprehensive Biotechnology [Ed M. Moo-Young], Vol. 3 [ed. By CL Cooney, AE Humphrey], Pergamon Press, Oxford 1985, pp. 681-700), only species of the genus Gluconobacter are used in technically implemented methods.

Die technischen Prozesse werden diskontinuierlich, zweistufig durchgeführt. Alle haben den Nachteil, daß die Produzenten nur unter sterilen Bedingungen gewonnen werden können, auch während der Produktbildungsphase der Sterilität weitestgehend aufrechterhalten und als Substrat für die Erzeugung des Produzenten Glucose benutzt werden muß. Letzteres ist erforderlich, um die Produktbildungsleistung auf ein hohes Niveau zu heben.The technical processes are carried out discontinuously, in two stages. All have the disadvantage that the producers can be obtained only under sterile conditions, even during the product formation phase of the sterility must be largely maintained and used as a substrate for the production of the producer glucose. The latter is required to raise product production performance to a high level.

Mit dem DD-WP 238067 ist ein kontinuierliches Verfahren unter Verwendung von Bacterien von Acinetobacter calcoaceticus bekannt, bei dem dies durch Verwendung eines Substratgemisches umgangen wird. Die ständig anwesende Glucose hält das Oxydationspotential des Produzenten hoch, ohne daß Glucose assimiliert wird. Sie kann maximaj zu Gluconsäure umgesetzt werden. Ein Nachteil dieses wie aller Verfahren, die mit neutrophilen Bakterien arbeiten, ist, daß der pH-Wert durch Titration mit Alkali- oder Erdalkalihydroxid zwischen 5 und 7, bevorzugt 7, gehalten werden muß, und — bei zweistufigem Betrieb — nur gegen Ende der Produktbildungsphase auf niedrigere Werte absinken darf, wie in der DE-AS 1817907 beschrieben. Das Verfahren gemäß DD-WP 236754 besitzt zwar diese Nächteile nicht, allerdings überschreitet die mögliche Produktivität des Gesamtprozesses (bei einer erreichbaren Gluconsäurekonzentration von 310g/l) einen Wert von 7g Säure/l · h nicht. Die in diesem Patent beschriebene Produktivität von 15g/l · h in einem Konzentrationsbereich bis 160g/l ist nur erreichbar, wenn eine Biomassekonzentration von 50g/l eingesetzt wird. Mit derartig hohen Biomassekonzentrationen sind allerdings mehrere Nachteile verbunden. So sinkt z. B. die auf Glucose bezogene Ausbeute bei hohen Zellkonzentrationen durch Veratmung/ Endoxydation der Glucose unter 90%. Es entsteht zusätzlicher Aufwand für die Erzeugung der Biomasse als Produzent und für die Abtrennung der Biomasse aus der gluconsäurehaitigen Fermentationslösung. Die damit verbundenen Kosten belasten den Prozeß signifikant.DD-WP 238067 discloses a continuous process using bacteria from Acinetobacter calcoaceticus, which avoids this by using a substrate mixture. The constantly present glucose keeps the oxidizing potential of the producer high, without glucose being assimilated. It can maximaj be converted to gluconic acid. A disadvantage of this, as well as all neutrophil bacterial processes, is that the pH must be maintained between 5 and 7, preferably 7, by titration with alkali or alkaline earth hydroxide, and only at the end of the product formation phase in two-stage operation may decrease to lower values, as described in DE-AS 1817907. Although the method according to DD-WP 236754 does not have these disadvantages, the possible productivity of the overall process (with an achievable gluconic acid concentration of 310 g / l) does not exceed a value of 7 g acid / lh. The productivity of 15 g / lh in a concentration range up to 160 g / l described in this patent can only be achieved if a biomass concentration of 50 g / l is used. With such high biomass concentrations, however, several disadvantages are associated. So z. As the glucose-related yield at high cell concentrations by inhalation / endoxidation of glucose below 90%. There is additional effort for the production of biomass as a producer and for the separation of the biomass from the gluconic acid fermentation solution. The associated costs significantly burden the process.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Oxydationsleistung von Gluconsäureproduzenten zu steigern und damit die Produktivität von Verfahren zur mikrowellen Gluconsäureproduktion zu verbessern.The object of the invention is to increase the oxidation performance of gluconic acid producers and thus to improve the productivity of processes for microwave gluconic acid production.

Wesen der ErfindungEssence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Kapazität von Bakterien zur Oxydation von Glucose zu Gluconsäure zu erhöhen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß die Oxydationsleistung der verwendeten Bakterienkulturen durch phänotypische Maßnahmen bei Beendigung oder während der Wachstumsphase erhöht wird.The invention has for its object to increase the capacity of bacteria for the oxidation of glucose to gluconic acid. According to the invention, the object is achieved in that the oxidation performance of the bacterial cultures used is increased by phenotypic measures at the end or during the growth phase.

Dabei wird vorteilhafterweise so verfahren,-daß zur Gluconsäureproduktion befähigte Bakterien der Gattungen Aceto- bzw. Gluconobacter sowie Acinetobacter während oder bei Beendigung der kohlenstofflimitierten Kultivierung zur Erzeugung des Produzenten über einen Zeitraum von 1 bis 15 Stunden mit Methanol in Konzentrationen von 1 bis 10 g/l oder mit Glucose bis zu 80 g/l geschockt werden, oder daß diesen Stämmen, sofern sie nicht auf Glucose kultiviert werden bzw. werden können, beim Wachstum auf anderen Kohlenstoffquellen, (wie z.B. Methanol oder Acetat), Gluconsäure, Glucanat bzw. auch Glucose in einer Konzentration zwischen 0,01 bis 0,5% zugesetzt wird. -In this case, it is advantageously carried out in such a way that the bacteria capable of producing gluconic acid of the genera Aceto- or Gluconobacter and Acinetobacter are exposed to methanol in concentrations of 1 to 10 g during or at the end of the carbon-limited cultivation for producing the producer over a period of 1 to 15 hours. l or are shocked with glucose up to 80 g / l, or that these strains, if they can not be cultured on glucose or, when growing on other carbon sources, (such as methanol or acetate), gluconic acid, glucanate or Glucose is added in a concentration between 0.01 to 0.5%. -

Diese Verfahrensweise zeichnet sich gegenüber dem durch das DD-WP 236754 repräsentierten Stand der Technik durch eine erhöhte spezifische Produktbildungskapazität aus. Im Falle von Acetobacter methanolicus können Produktivitäten von 26g/l · h im Bereich der Produktbildungsphase bis 100g Säure/l bzw. 17g/l · h im Bereich bis 200g Säure/l erreicht werden. Hervorzuheben ist dabei, daß diese hohen Produktivitäten bereits mit Biomassekonzentrationen im Bereich zwischen 0,5 bis 8g/l möglich sind und daß biszu 400g Gluconsäure pro Liter erreicht werden können bei einer „Überalles" Produktivitätvon 10g/l h, wodurch die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens erheblich verbessert wird.This procedure is distinguished from the prior art represented by DD-WP 236754 by an increased specific product-forming capacity. In the case of Acetobacter methanolicus, productivities of 26 g / lh in the region of the product formation phase up to 100 g acid / l or 17 g / l · h in the range up to 200 g acid / l can be achieved. It should be emphasized that these high productivities are already possible with biomass concentrations in the range between 0.5 to 8 g / l and that up to 400 g gluconic acid per liter can be achieved with a "everywhere" productivity of 10 g / lh, which significantly improves the economics of the process becomes.

Die auf diese Weise (d. h. durch Schocken oder Zugabe von Gluconsäure bzw. Glucose in das Wachstumsmedium) gesteigerte Produktivität kann weiter erhöht werden, indem der pH-Wert während der Produktbildungsphase konstant gehalten wird. Unter Nutzung der bei der Verwendung acidophiler Bakterien gegebenen Vorteile der unsterilen Prozeßführung sowohl in der Stufe der Biomasseerzeugung als auch der eigentlichen Produktion wird die Gluconsäureproduktion bevorzugt mit Acetobacter methanolicus durchgeführt und der pH-Wert zwischen 2,5 und 3,3 konstant gehalten, so daß Produktivitäten bis 400g Säure/l von 7 g/l · h erreicht werden. Bei Anwendung von nichtacidophilen Bakterien sollte ein pH-Wert von 4,5 nicht unterschritten werden. Durch Kombination von Schocken oder Glucose bzw. Gluconsäurezusatz am Ende der Wachstumsphase und Titration ist eine weitere Steigerung der Prozeßproduktivität möglich, die sich im Bereich bis 200g Säure/l auf 20g/l .· h und im Bereich bis 400g Säure/l auf 10g/l h beläuft.The increased productivity in this way (i.e., by shock or addition of gluconic acid or glucose into the growth medium) can be further increased by keeping the pH constant during the product formation phase. Taking advantage of the advantages of non-sterile process control in the use of acidophilic bacteria both in the stage of biomass production and the actual production, the production of gluconic acid is preferably carried out with Acetobacter methanolicus and the pH is kept constant between 2.5 and 3.3, so that Productivities up to 400g acid / l of 7 g / l · h can be achieved. When using nonacidophilic bacteria, the pH should not fall below 4.5. By combination of shock or glucose or gluconic acid addition at the end of the growth phase and titration, a further increase in process productivity is possible, ranging from 200 g acid / l to 20 g / l · h and up to 400 g acid / l to 10 g / lh amounts.

Säureendkonzentrationen von 500 g/l können auf diese Weise erzeugt werden. Durch nachfolgende Beispiele soll die Erfindung näher erläutert werden.Acid end concentrations of 500 g / l can be produced in this way. By following examples, the invention will be explained in more detail.

Ausführungsbeispieleembodiments Beispiel 1:Example 1:

Acetobacter methanolicus wird in einem 101 Laborfermenter unter folgenden Bedingungen kultiviert:Acetobacter methanolicus is cultured in a 101 laboratory fermenter under the following conditions:

Reaktorinhalt 4kgReactor content 4kg

Verweilzeit: 7hResidence time: 7h

pH-Wert: 4,0pH value: 4.0

gel. O2-Konz.: §5% des Sättigungswertesgel. O 2 concentration: §5% of the saturation value

Substrat: Methanol, C-IimitiertSubstrate: methanol, C -impeded

Temperatur: 32°CTemperature: 32 ° C

Rührerdrehzahl: 1 500 U/minStirrer speed: 1,500 rpm

Nährlösungszusammensetzung: (bilanziert für 20g BTS/I)Nutrient solution composition: (weighted for 20g BTS / I)

NH4CI 8g/I, K2HPO42,4g/l, MgSO4 · 7H2O 1,6g/l, CuSO4 5H2O 9,6mg/l, CoSO4 · 5H2O 2,4mg/l, MnSO4 4H2O 18,8mg/l, H3BO3 28mg/l, FeCI2 · 7H2O 16,8mg/l, CaCI2 · 6H2O 28,8mg/l, Na2MoO4 · 2H2O 31,2mg/l, ZnCI2 · 7H2O 24mg/lNH 4 CI 8g / l, K 2 HPO 4 2.4 g / l, MgSO 4 .7H 2 O 1.6 g / l, CuSO 4 5H 2 O 9,6mg / l, CoSO 4 · 5H 2 O 2.4 mg / 1, MnSO 4 4H 2 O 18.8 mg / l, H 3 BO 3 28 mg / l, FeCl 2 · 7H 2 O 16.8 mg / l, CaCl 2 · 6H 2 O 28.8 mg / l, Na 2 MoO 4 · 2H 2 O 31.2 mg / l, ZnCl 2 · 7H 2 O 24 mg / l

Nach Erreichen eines stationären kontinuierlichen Prozeßzustandes bei einer Biomassekonzentration von 19,5g/l und kohlenstofflimitierten Prozeßführung wird der Methanolgehalt im Fermentationsmedium auf 4,5g/l gestellt und über einen Zeitraum von 5 Stunden konstant gehalten. ·After reaching a stationary continuous process state at a biomass concentration of 19.5 g / l and carbon-limited process control, the methanol content in the fermentation medium is set to 4.5 g / l and kept constant over a period of 5 hours. ·

Nach 5 Stunden Methanolschock wird die Biomasse geerntet, zentrifugiert und als Impfmaterial für die mikrobieile Gluconsäureproduktion verwendet.After 5 hours of methanol shock, the biomass is harvested, centrifuged and used as a seed for microbial gluconic acid production.

Zu diesem Zweck werden in einen 121 Rührkesselreaktor 41 einer 15%igen Glucoselösung gegeben und mit Acetobacter methanolicus (Methanol geschockt) angeimpft, so daß sich eine Zelldichte von 6,5g/l ergibt. Die Produktsynthese wird bei folgenden Prozeßparametern durchgeführt:For this purpose, 41% of a 15% strength glucose solution are added to a 121 stirred tank reactor and inoculated with Acetobacter methanolicus (methanol shocked) to give a cell density of 6.5 g / l. The product synthesis is carried out at the following process parameters:

Rührerdrehzahl: 800U/minStirrer speed: 800 rpm

Temperatur: 32°CTemperature: 32 ° C

Belüftungsrate: 50 l/kg · hVentilation rate: 50 l / kg · h

Eine Regelung des pH-Wertes während des Prozesses erfolgt nicht.A regulation of the pH value during the process does not take place.

Die Zuführung von Glucose erfolgt so, daß ein aktueller Konzentrationsbereich von S10 S 30g/l eingehalten wird.. Folgende Ergebnisse werden im Vergleich zu ungeschockter Biomasse erhalten:The addition of glucose is such that a current concentration range of S10 S 30g / l is maintained. The following results are obtained in comparison to unstocked biomass:

Reaktionsreaction Säurekonzen-Säurekonzen- 85*85 * Produktivitätproductivity 17*17 * spezifischespecific 2,6*2.6 * zeitTime tration  tration 130*130 * 10,8*10.8 * 1,7*1.7 * 300*300 * 7,5*7.5 * Produktbildungsproduct education 1,2*1.2 * IhIIHI /g/l// G / l / /g/l-h// G / l-h / raterate 55 115115 2323 /g/g-h// G / g-h / 1212 200200 16,616.6 3,53.5 4040 390390 9,89.8 2,62.6 * Einsatz ungeschockter Biomasse* Use of unshocked biomass 1,51.5

Die Zugabe der Glucose wird in den letzten 10 Stunden des Prozesses so geregelt, daß am Ende der Reaktion die Glucosekonzentration im Medium <0,1 % beträgt.The addition of glucose is controlled in the last 10 hours of the process so that at the end of the reaction the glucose concentration in the medium is <0.1%.

Beispiel 2:Example 2:

Analog Beispiel 1 wird in einem 121 Rührkesselreaktor der Stamm Acetobactermethanolicus MB 58 kontinuierlich kultiviert. Anstelle von reinem Methanol als Substrat wird ein Mischsubstrat bestehend aus Methanol und Gluconat im Verhältnis 5:1 eingesetzt. Die so produzierte Biomasse wird wie in Beispiel 1 beschrieben zur mikrobiellen Glucoseoxidation in einem Laborfermenter eingesetzt. Die Zellkonzentration betrug 7,9g Γ1. Folgende Werte wurden ermittelt:Analogously to Example 1, the strain Acetobactermethanolicus MB 58 is cultivated continuously in a 121 stirred tank reactor. Instead of pure methanol as a substrate, a mixed substrate consisting of methanol and gluconate in a ratio of 5: 1 is used. The biomass thus produced is used as described in Example 1 for microbial glucose oxidation in a laboratory fermenter. The cell concentration was 7.9 g Γ 1 . The following values were determined:

Reaktionsreaction Säurekonzenacid Concentration Produktivitätproductivity spezifischespecific zeitTime trationtration /g/l-h// G / l-h / ProduktbildungsrateProduct formation rate IhIIHI /g/l// G / l / 20,620.6 /g/g-h// G / g-h / 55 103103 15,515.5 2,62.6 1010 155155 13,013.0 1,91.9 2020 260260 9,59.5 1,61.6 4040 380380 1,21.2

Die auf Glucose bezogene Ausbeute betrug 93,2%, die Restglucosekonzentration im Medium <0,1 %.The glucose-related yield was 93.2%, the residual glucose concentration in the medium <0.1%.

Beispiel 3:Example 3:

Analog Beispiel 1 wird in einem 121 Laborrührkesselreaktor der Stamm Acetobactermethanolicus MB 58 kontinuierlich auf dem Substrat Glucose kultiviert. Aus dem Ferrnentationsmedium wird in einer Laborzentrifuge Biomasse abgetrennt und wie in Beispiel 1 beschrieben 4I einer 15%igen Glucoselösung in einem 121 Laborfermenter angeimpft, die Konzentration im Medium beträgt 0,9g/l.Analogously to Example 1, the strain Acetobactermethanolicus MB 58 is continuously cultured on the substrate glucose in a 121 laboratory stirred tank reactor. Biomass is separated from the fermentation medium in a laboratory centrifuge and, as described in Example 1, 4I of a 15% glucose solution in a 121 laboratory fermenter are inoculated, the concentration in the medium is 0.9 g / l.

Folgende Werte wurden in der Phase der Produktbildung erreicht:The following values were reached in the product formation phase:

Reaktions- Säurekon- spezifischeReaction acid specific

zeit zentration Produktivität Produktbildungsratetime concentration productivity Product formation rate

/h/ ' /g/l/ /g/I - h/ /g/g-h// h / '/ g / l / / g / l - h / / g / g-h /

1212 190190 2626 260260 3636 310310

15,815.8

10,010.0

8,68.6

17,617.6

11,111.1

9,69.6

Die auf Glucose bezogene Ausbeute betrug 94,3%", die Restglucosekonzentration im Medium < 0,2%.The glucose-related yield was 94.3% ", the residual glucose concentration in the medium <0.2%.

Beispiel 4:Example 4:

Analog Beispiel 1 wird die Kultur Acetobacter methanolicus kontinuierlich kohlenstofflimitiert auf Methanol erzeugt, geerntet und nach Zentrifugation als Produzent für die Gluconsäuresynthese eingesetzt.Analogously to Example 1, the culture Acetobacter methanolicus continuously produced carbon-limited to methanol, harvested and used after centrifugation as a producer for Gluconsäuresynthese.

In Abweichung von Beispiel 1 wird während des Prozesses der Produktbildung (eingesetzte Biomassekonzentration 6,5 g/l) der pH-Wert des Fermentationsmediums bei 3,0 durch Titration mit 50% Natronlauge konstant gehalten.In deviation from Example 1, the pH of the fermentation medium is kept constant at 3.0 by titration with 50% sodium hydroxide solution during the process of product formation (used biomass concentration 6.5 g / l).

Folgende Ergebnisse werden erhalten:The following results are obtained:

Reaktions- Säurekon- spezifischeReaction acid specific

zeit zentration* Produktivität Produktbildungsratetime concentration * Productivity Productification Rate

lh/ /g/l/ g/l-h/ /g/g-h/ lh / / g / l / g / lh / / g / gh /

55 112112 1212 180180 4040 350350 5050 385385 6060 420420 8080 440440

22,4 15,0 8,8 7,7-7,0 5,522.4 15.0 8.8 7.7-7.0 5.5

3,4 2,3 1,3 1,2 1,1 0,83.4 2.3 1.3 1.2 1.1 0.8

* berechnet auf freie Säure* calculated on free acid

Die auf Glucose bezogene Ausbeute beträgt 94,1 %.The glucose-related yield is 94.1%.

Beispiel 5:Example 5:

Analog Beispiel 1 wird Biomasse der Kultur Acetobacter methanolicus erzeugt und mit Methanol geschockt. Anschließend wird die so behandelte Biomasse analog Beispiel 4, d. h. unter Titration bei einem pH-Wert von 3,0, zur Produktbildung eingesetzt. Unter diesen Bedingungen werden folgende Ergebnisse erhalten:Biomass of the culture Acetobacter methanolicus is produced analogously to Example 1 and shocked with methanol. Subsequently, the thus treated biomass is analogous to Example 4, d. H. under titration at a pH of 3.0, used for product formation. Under these conditions, the following results are obtained:

Reaktionsreaction SäurekonSäurekon Produktivitätproductivity spezifischespecific zeitTime zentration*concentration * /g/l · h// g / l · h / ProduktbildungsrateProduct formation rate IhIIHI /g/l// G / l / 25,025.0 Vg/g-h/Vg / g-h / CJlCJL 125125 20,020.0 3,83.8 1010 200200 17,317.3 3,13.1 2020 345345 10,410.4 2,72.7 4040 415415 8,18.1 1,61.6 6060 485485 1,21.2

* berechnet auf freie Säure* calculated on free acid

Die auf Glucose bezogene Ausbeute beträgt 93,8%.The glucose-related yield is 93.8%.

Beispiele:Examples:

Acinetobacter calcoaceticus ZIMET 11089 wird in einem Laborfermentor bei 30cC gezüchtet, der pH-Wert von 6,8 wird durch Zugabe von NaOH bzw. HCI konstant gehalten. Die Gelöstsauerstoffkonzentration wurde größer 20% Sättigung eingestellt. Die kontinuierliche Kultivierung erfolgte auf Na-Acetat als Kohlenstoffquelle und einem Mineralsalzmedium folgender Zusammensetzung (in mg/l):Acinetobacter calcoaceticus ZIMET 11089 is cultivated in a laboratory fermentor at 30 c C, the pH value of 6.8 is kept constant by addition of NaOH or HCl. The dissolved oxygen concentration was set to greater than 20% saturation. The continuous cultivation was carried out on Na acetate as carbon source and a mineral salt medium of the following composition (in mg / l):

Ammoniumchlorid 3400Ammonium Chloride 3400

Kaliumhydrogenphosphat 310Potassium hydrogen phosphate 310

Magnesiumsulfat χ 7H2O 15Magnesium sulfate χ 7H 2 O 15

Kalziumchlorid χ 2 H2O 20Calcium chloride χ 2 H 2 O 20

Eisen(ll)sulfatx7H2O 5Iron (II) sulphate x7H 2 O 5

Zinksulfat χ 7 H2O 0,44Zinc sulfate χ 7 H 2 O 0.44

Mangansulfat χ 4 H2O 0,82Manganese sulphate χ 4 H 2 O 0.82

Kupfersulfat x 5 H2O 0,78Copper sulfate x 5 H 2 O 0.78

Natriummolybdatx2H2O 0,25Sodium molybdatex2H 2 O 0.25

Nach Erreichen eines C-Iimitierten, stationären kontinuierlichen Prozeßzustandes wird in das Fermentationsmedium Glucose gegeben und über einen Zeitraum von 5 Stunden die Glucosekonzentration in einem Bereich zwischen 5 und 30g/l konstant gehalten.After reaching a steady state continuous process state, glucose is added to the fermentation medium and the glucose concentration is kept constant in a range between 5 and 30 g / l over a period of 5 hours.

Nach 5 Stunden Glucoseschock wurde die Biomasse geerntet, und analog Beispiel 1 für die mikrobielle Gluconsäureproduktion verwendet. Dabei werden nach 40 Stunden Gluconsäurekonzentrationen von 265g/l erreicht.After 5 hours of glucose shock, the biomass was harvested and used as in Example 1 for microbial gluconic acid production. Gluconic acid concentrations of 265g / l are reached after 40 hours.

Mit ungeschockter Biomasse wurden im Vergleich dazu nur 200g/l Gluconsäure erhalten.With unshocked biomass, only 200 g / l gluconic acid was obtained in comparison.

Beispiel 7:Example 7:

Analog Beispiel 6 wurde die Kultur Acinetobacter calcoaceticus ZIMET 11089 kohlenstofflimitiert auf Acetat erzeugt und anschließend mit Gluconat geschockt.Analogously to Example 6, the culture Acinetobacter calcoaceticus ZIMET 11089 was carbon-limited to acetate and then shocked with gluconate.

Mit dieser Biomasse wurde nach 40 Stunden Gluconsäurekonzentrationen von 237g/l erhalten.Gluconic acid concentrations of 237 g / l were obtained with this biomass after 40 hours.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von Gluconsäure mittels Bakterien unter Verwendung von Stämmen der Gattungen Acetobacter, Gluconobacter oder Acinetobacter, gekennzeichnet dadurch, daß die Oxydationsleistung der Bakterienkulturen durch phänotypische Maßnahmen während oder bei Beendigung der Wachstumsphase erhöht wird.1. A process for the production of gluconic acid by means of bacteria using strains of the genera Acetobacter, Gluconobacter or Acinetobacter, characterized in that the oxidation performance of the bacterial cultures is increased by phenotypic measures during or at the end of the growth phase. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Oxydationsleistung durch einen 1-bis 15stündigen Substratschock bei Beendigung des kohlenstoffsubstratlimitierten Wachstums zur Erzeugung des Produzenten erhöht wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the oxidation performance is increased by a 1 to 15-hour substrate shock at the end of the carbon substrate-limited growth to produce the producer. 3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß zum Schocken Methanol in einer Konzentration von 1 bis 10g/l bzw. Glucose in einer Konzentration bis 80g/l zugegeben werden.3. The method according to claim 2, characterized in that methanol are added to the shock in a concentration of 1 to 10g / l or glucose in a concentration to 80g / l. 4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß, sofern der Produzent nicht auf Glucose erzeugt wird, dem Kultivierungsmedium (z. B. Methanol oder Acetat) Gluconsäure, Gluconat bzw. Glucose in einer Konzentration zwischen 0,01 bis 0,5g/l, bevorzugt 0,1 g/l zugesetzt werden.4. The method according to claim 1, characterized in that, if the producer is not produced on glucose, the culture medium (eg methanol or acetate) gluconic acid, gluconate or glucose in a concentration between 0.01 to 0.5g / l, preferably 0.1 g / l are added. 5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß in der Produktionsphase der pH-Wert durch Titration bei Verwendung von Acetobacter methanolicus zwischen 2,5 und 3,3 und von Acinetobacter calcoaceticus zwischen 5 und 6,5 konstant gehalten wird.5. The method according to claim 1, characterized in that in the production phase, the pH is kept constant by titration using Acetobacter methanolicus between 2.5 and 3.3 and of Acinetobacter calcoaceticus between 5 and 6.5. 6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß der Produzent geschockt wird und/oder unter Zusatz von Gluconsäure, Gluconat oder Glucose erzeugt wird und der pH-Wert während der Produktbildung bei Verwendung von Acetobacter methanolicus 2,5 nicht unterschreitet und zwischen 2,5 und 3,3 konstant gehalten wird.6. Process according to Claims 1 to 3, characterized in that the producer is shocked and / or produced with the addition of gluconic acid, gluconate or glucose and the pH during product formation when using Acetobacter methanolicus 2.5 does not fall below and between 2.5 and 3.3 is kept constant.
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