DE954002C

DE954002C - Biological production of chlortetracycline and cobalamines

Info

Publication number: DE954002C
Application number: DEA17756A
Authority: DE
Inventors: Milton Andrew Petty Jun
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1952-04-04
Filing date: 1953-04-03
Publication date: 1956-12-13

Description

Erzeugung von Chlortetracyclin und Cobalaminen auf biologischem Wege Die Erfindung betrifft die Herstellung sowohl von Chlortetracyclin als auch von Cobalaminen durch Fermentation von Nährböden mit Streptomyces aureofaciens.Biological production of chlortetracycline and cobalamines The invention relates to the production of both chlortetracycline and Cobalamines by fermentation of culture media with Streptomyces aureofaciens.

Künstliche und natürliche Mutanten von S. aureofaciens ergeben Veränderungen in der Ausbeute sowohl von Chlortetracyclin als auch den Cobalarninen. Durch Auswahl von mutierenden Stämmen, welche hohe Ausbeuten ergeben, ist es möglich, die Erzeugung von Chlortetracyclin und Cobalaminen zu erhöhen. Es wurde jedoch unerwarteterweise gefunden, daB bekannte übliche Medien, welche Kohlehydrate, organische Stickstoffquellen und andere Bestandteile umfassen,, keine wesentlich hohen Ausbeuten mit diesen Stämmen erzeugen. Es scheint, daß das Medium selbst die Erzeugung von Chlortetracyclin und Cobalaminen beschränkte, ohne Rücksicht darauf, welcher Stamm von S. aureofaciens verwendet wurde.Artificial and natural mutants of S. aureofaciens produce changes in the yield of both the chlorotetracycline and the cobalarnines. By choice of mutating strains which give high yields, it is possible to generate increase of chlortetracycline and cobalamines. However, it was unexpected found that known common media, which are carbohydrates, organic nitrogen sources and other ingredients do not include significantly high yields with these strains produce. It appears that the medium itself is capable of generating chlortetracycline and Cobalaminen restricted regardless of which strain of S. aureofaciens was used.

Gegenstand der Erfindung ist die Schaffung eines neuen und verbesserten Mediums, wodurch das Erzeugungspotential von Stämmen, welche durch Mutation und andere Auswahlprozesse aus dem Mutterorganismus erhalten werden, veiwertet wird. Diese ergeben eine höhere Ausbeute, und demgemäß werden die Erzeugungskosten dieser außerordentlich wichtigen Arzneimittel merklich vermindert.The object of the invention is to provide a new and improved one Medium, reducing the generation potential of strains caused by mutation and other selection processes from the Mother organism are preserved, is valued. These give a higher yield and accordingly the production cost of these extremely important drugs is markedly reduced.

Alle Stämme, welche durch Mutation und andere natürliche und künstliche Auswahlprozesse von dem Stammorganismus S. aureofaciens erhalten werden, werden in Übereinstimmung mit den Grundsätzen des internationalen botanischen Kongresses als S. aureofaciens klassifiziert. Bestimmte dieser Stämme erzeugen viel höhere Ausbeuten an Chlortetracyclin als der Mutterstamm. Weiterhin wurde gefunden, daß die Stämme von S. aureofaciens, weiche die größeren Chlortetracyclinmengen zu ergeben vermögen, auf Variationen in dem Medium ansprechen, gegen welche die Mutterstämme nicht empfindlich sind. Manche Stämme sprechen günstiger auf ein solches Medium an als. andere.All strains caused by mutation and other natural and artificial Selection processes obtained from the parent organism S. aureofaciens in accordance with the principles of the International Botanical Congress classified as S. aureofaciens. Certain of these strains produce much higher ones Yields of chlorotetracycline than the parent strain. It was also found that the strains of S. aureofaciens, which yield the larger amounts of chlortetracycline able to respond to variations in the medium against which the parent strains are not sensitive. Some tribes speak more favorably on such a medium on as. other.

Erfindungsgemäß werden für die Erzeugung von Chlortetracyclin und Cobalaminen zur Züchtung von S. aureofaciens Nährböden verwendet, die neben den üblichen Bestandteilen Zusätze von Verbindungen aufweisen, die Chloridionen in Mengen von o,15 bis 2,5 Gewichtsteilen und Kobaltionen in Mengen von Spuren bis 0,o1 Gewichtsteilen liefern.According to the invention for the production of chlortetracycline and Cobalaminen used for the cultivation of S. aureofaciens culture media, which in addition to the usual constituents have additions of compounds that contain chloride ions in quantities from 0.15 to 2.5 parts by weight and cobalt ions in amounts of traces to 0.1 parts by weight deliver.

Der Zusatz von Spurenelementen, auch von Kobalt, ist für biologische Zwecke an sich bekannt. Die Bestandteile eines im Rahmen der vorliegenden Erfindung typischen Nährmediums sind die folgenden: Teile Wasser . .. . . .. .. .. .. .. .. .. . 500,0 bis 1500,o organische Stickstoffquelle .... 20,o - 40,0 Calciumcarbonat, fein gemahlen 4,5 - 15,0 Kohlehydrat ................. 20,o - 40,0 Ammoniumionen ............. 0,5 - 2,5 Chloridionen .. .. .. .. ......... 0,15 - 2,5 Magnesium .................. o,1 - 0,5 Eisen ........................ Spur bis 0103 Mangan .. .. .. ............... - - 0,04 Zink ......................... - - 0,04 Kobalt ...................... - - 0,o1 Da die Mengen an metallischen Spurenelementen Magnesium, Eisen, Mangan, Zink und Kobalt, welche in dem erfindungsgemäßen Nährmedium erforderlich sind, sehr gering sind und eine Variation in der Konzentration nicht besonders kritisch ist, so ist es vorzuziehen, besser diese Elemente in der erforderlichen Menge zuzugeben als zu analysieren und sich teilweise auf die in den anderen Bestandteilen als Verunreinigungen vorhandenen Mengen zu verlassen.The addition of trace elements, including cobalt, is known per se for biological purposes. The components of a nutrient medium typical in the context of the present invention are the following: Parts Water . ... . .. .. .. .. .. .. ... 500.0 to 1500, o organic nitrogen source .... 20.00 - 40.0 Calcium carbonate, finely ground 4.5 - 15.0 Carbohydrate ................. 20.00 - 40.0 Ammonium ions ............. 0.5 - 2.5 Chloride ions .. .. .. .. ......... 0.15 - 2.5 Magnesium .................. o, 1 - 0.5 Iron ........................ track up to 0103 Manganese .. .. .. ............... - - 0.04 Zinc ......................... - - 0.04 Cobalt ...................... - - 0, o1 Since the amounts of metallic trace elements magnesium, iron, manganese, zinc and cobalt, which are required in the nutrient medium according to the invention, are very small and a variation in the concentration is not particularly critical, it is preferable to use these elements in the required amount admit rather than analyze and rely in part on the amounts present in the other ingredients as impurities.

Da die Ionen aus den löblichen Salzen in dem Medium in dissoziiertem Zustand vorhanden sind, so können ihre Elemente oder Radikale in verschiedenen Salzkombinationen zugesetzt werden, um dasselbe Medium zu ergeben. Demgemäß ist die Konzentration als Gehalt an metallischen Bestandteilen definiert. Die Metallionen können als Salze, Säuren oder Basen zugesetzt werden. Beispielsweise können die metallischen. Spurenelemente als Sulfate oder Chloride oder andere lösliche Salze zugesetzt werden. In ähnlicher Weise kann eine bestimmte Menge des erforderlichen Chloridions t.ls Ammoniumchlorid oder Calciumchlorid usw. zugesetzt werden. Es ist zweckmäßig, einen Teil der Kationen als Sulfatsalze vorliegen zu haben, da das Sulfation bei der Regelung des pH-Wertes nützlich ist und für die Salze ein unschädliches Anion liefert. Die gewünschten Kationen können auch als Carbonate, Salze mit organischen Säuren,, z. B. Zitronensäure oder Milchsäure, zugefügt werden.Since the ions from the laudable salts are dissociated in the medium State exist so their elements or radicals can be in various salt combinations can be added to give the same medium. The concentration is accordingly defined as the content of metallic components. The metal ions can be used as salts, Acids or bases can be added. For example, the metallic. Trace elements added as sulfates or chlorides or other soluble salts. In a similar way Way can a certain amount of the required chloride ion t.ls ammonium chloride or calcium chloride, etc. may be added. It is useful to have some of the cations in the form of sulfate salts, since the sulfate ion helps regulate the pH value is useful and provides a harmless anion for the salts. The desired Cations can also be used as carbonates, salts with organic acids ,, z. B. Citric Acid or lactic acid.

Unter »Spur« ist die kleinste natürlich auftretende Menge gemeint, welche normalerweise als Verunreinigung in anderen Bestandteilen eingeführt wird. Es ist weder erwünscht noch wirtschaftlich möglich, eine vollständige Abwesenheit derartiger Bestandteile zu sichern."Trace" means the smallest naturally occurring amount which is normally introduced as an impurity in other components. It is neither desirable nor economically possible to have a complete absence to secure such components.

Die Spurenelemente, wie Eisen, Mangan, Kobalt und Zink, sind für maximales Wachstum erforderlich, jedoch sind die Mengen so gering, daß Nährstoffe, wie Maisquellwasser, hinreichend davon für ein wirksames Wachstum enthalten, obwohl festgestellt wurde, daß Zusätze, wie oben angegeben, die Angemessenheit sichern und eine konsequentere Erzeugung an hohe Ausbeuten liefernden Fermentationen gestatten.The trace elements, such as iron, manganese, cobalt and zinc, are for maximum Growth required, but the amounts are so small that nutrients such as corn steep liquor, contain sufficient of it for effective growth, although it has been found that additions, as stated above, ensure appropriateness and a more consistent one Allow production of high yield fermentations.

Zur Erzielung bester Ergebnisse sollte ein solches Medium mit 0,33 bis 1 Volumen Luft pro Volumen Lösung je Minute gelüftet und mit einer Eingangsleistung des Schaufelrades des Rührwerks von etwa 0,3 bis 2 PS je 454,61 gerührt werden. Die Belüftung und das Rühren sind gegenseitig abgestimmt, so daß eine höhere Rührgeschwindigkeit miteiner niedrigeren Belüftungsgeschwindigkeit benutzt werden kann, und umgekehrt. Bei den. größeren Tanks ergibt eine Zufuhr von weniger PS je 45461 Fassungsvermögen normalerweise denselben Grad des Rührens.To achieve the best results, such a medium should be aerated with 0.33 to 1 volume of air per volume of solution per minute and stirred with an input power of the paddle wheel of the agitator of about 0.3 to 2 HP per 454.61. The aeration and agitation are coordinated so that a higher agitation speed can be used with a lower aeration speed, and vice versa. Both. larger tanks a feed of fewer horsepower per 45461 capacity will typically give the same degree of agitation.

Ein steriles Specköl mit oder ohne Octadekanol oder ein Silikonölan@ti:schaumöl oder andere Schauminhibitoren können zur* Regelung des Schäumens des Mediums in dem Fermentationstank verwendet werden.A sterile bacon oil with or without octadecanol or a silicone oil an @ ti: foam oil or other foam inhibitors can be used to regulate the foaming of the medium in the fermentation tank.

Der pH-Wert soll während der Fermentation zwischen etwa 5 und 8 bleiben. Es wurde gefunden, daß die besten Ergebnisse in dem Bereich von etwa 6,2 bis 6,6 gemessen nach der Sterilisation des Mediums und knapp vor dessen Beimpfung, erhalten -,verden. Gewöhnlich hat das Medium, wie es hergestellt wird, einen derartigen pH-Wert, so daß eine Einstellung nicht notwendig ist.The pH should stay between about 5 and 8 during the fermentation. It has been found that the best results are in the range of about 6.2 to 6.6 measured after sterilization of the medium and just before inoculation -, verden. Usually the medium as it is made has a pH such that so that adjustment is not necessary.

S. aureofaciens wächst auf dem Medium in den Temperaturgrenzen von etwa 2o bis 35°. Bessere Ergebnisse werden in einem Bereich von etwa 25 bis 30° erhalten. Der Mittelpunkt dieses. Bereichs, nämlich 27 bis 28°, ist der bevorzugte Temperaturbereich, der normalerweise bei der Produktion verwendet wird.S. aureofaciens grows on the medium within the temperature limits of about 2o to 35 °. Better results will be in a range of about 25 to 30 degrees obtain. The focus of this. Range, namely 27 to 28 °, is the preferred one Temperature range normally used in production.

Etwas Ausbeute kann erhalten werden, wenn man. eine so geringe Zeit, wie 24 Stunden, fermentiert, besonders, wenn viel Impfstoff verwendet wird. Das maximale Wachstum tritt gewöhnlich zwischen etwa 6o und 72 Stunden auf, und dieser Bereich wird für die wirtschaftlichste Erzeugung bevorzugt. Ein Tank kann jedoch auch eine so lange Zeit, wie i4o Stunden, fermentiert werden, ohne dal3 ein unangemessenes Absinken in der Wirksamkeit auftritt. Zur Erzielung der Höchstproduktion würde eine so lange Zeit unangemessene Kosten hinreichend großer Tanks zum Arbeiten erfordern. Es kann jedoch aus verschiedenen Gründen beim Arbeiten im Betrieb zweckmäßig werden, einen Tank während dieser oder einer noch längeren Zeit arbeiten zu lassen, bevor die Gewinnung von Chlortetracyclin und Cobalaminen vörgenommen wird.Some yield can be obtained if one. such a short time like 24 hours, fermented, especially if a lot of vaccine is used. That maximum growth usually occurs between about 60 and 72 hours, and this one Area is used for the most economical generation preferred. A However, the tank can be fermented for as long as 14 hours without that there is an unreasonable decrease in effectiveness. To achieve the Maximum production would be sufficiently large at such a long time unreasonable cost Require tanks to work. However, it can work for various reasons In operation it will be useful to have a tank during this or an even longer one Time to get to work before the extraction of chlortetracycline and cobalamines is carried out.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit sind die Konzentrationen, in Gramm je Liter ausgedrückt, als das exakte verwendete Gewicht anzugeben; das letztere kann für irgendeine Größe eines Fermentationstanks von den hier angegebenen bevorzugten Konzentrationswerten berechnet werden.The following example is intended to explain the invention in more detail without it to restrict. For convenience, the concentrations are in grams expressed per liter as the exact weight used; the latter may be preferred for any size of fermentation tank from those given here Concentration values are calculated.

Beispiel Für die Verwendung in einem go goo 1 fassenden Gärkessel wurde eine ursprüngliche Beschickung hergestellt, welche gogo 1 Wasser enthielt, zu dem eine hinreichende Menge der Bestandteile zugefügt wurde, so daß nach der Verdünnupg auf 9o goo 1 die folgenden Konzentrationen vorhanden waren: Maisquellwasser, wie es für die Penicillinherstellung verwendet wird, 5o%. Feststoffe ......... ...... 30,0 g/1 Calciumcarbonat, USP XIII, hell 9,o - Saccharose ... .. ................. 30,0 - Ammoniumsulfat ................ 3,3 - Ammoniumchlorid .............. i,0 - Mg cl2'6 H2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 - Fe SO, -:2 H20 .. .. .. .. .. .. .. .. . o,o4i - M"SOa - 4H20 .. .. .. .. .. .. . . .. . 0,05 - ZnS04 - 7 H20 .. .. .. .. .. .. .. .. . o,io - C0 C12 - 6H2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,005- Die Stoffe wurden in der angegebenen Reihenfolge unter Rühren zugefügt. Das Konzentrat wurde durch 40 Minuten langes Erhitzen auf 12o° sterilisiert und aseptisch in den Gärkessel übergeführt, welcher vorher mit strömendem Dampf sterilisiert worden war. Das Konzentrat wurde in dem Gärkessel belüftet, gerührt und gekühlt und dann aus dem städtischen Leitungsnetz so viel sterilisiertes Wasser zugefügt, so daß auf die oben angegebenen Konzentrationen verdünnt und der Gärkessel auf go goo 1 aufgefüllt wurde. Die Temperatur des verdünnten Mediums wurde auf 27° eingestellt. Ein Antischaummittel, das aus i 0/e Octadekanol .enthaltendem Specköl bestand, wurde zu einem Speisungstank zugefügt, so daß es, falls notwendig, steril zugegeben werden konnte. Ursprünglich wurde i g/1 zugesetzt, und weiteres Antischaummittel wurde zugefügt, wenn es notwendig war, das Schäumen im Verlaufe der Fermentation zu steuern. Insgesamt wurden 3 g/1 im Verlauf der Fermentation verwendet. Das Medium in dem Fermentationsta_nk wurde mit 4 Volumprozent aus einem Impftank geimpft, der einen 25stündigen, eine hohe Ausbeute liefernden Stamm S. aureofaciens enthielt. Der beimpfte Tank wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,4 Volumen Luft je Volumen Maische je Minute belüftet, wobei die Luft nahe dem Boden des Fermentationstanks durch eine Reihe von Belüftungsdüsen eingeleitet wurde, so daß sich eine geringe Bläschengröße ergab. Der Inhalt des Ferrpentationstanks wurde durch ein Schaufelrad gerührt, das mit einem go-PS-Motor angetrieben wurde, der bei seiner Nennleistung arbeitete. Die Belüftung und das Rühren wurden 62 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung wurde die Maische geerntet, und man stellte fest, daß sie 25oo Mikrogramm je ccm Chlortetracyclin und 742 Mikrogramm je Liter Vitamin B" enthielt.Example For use in a fermentation kettle with a capacity of 1 gooo, an original charge was prepared which contained goo 1 water, to which a sufficient amount of the ingredients had been added so that the following concentrations were present after dilution to 90 goo 1: corn steep liquor, how it is used for penicillin production, 5o%. Solids ......... ...... 30.0 g / 1 Calcium carbonate, USP XIII, light 9, o - Sucrose ... .. ................. 30.0 - Ammonium sulfate ................ 3.3 - Ammonium chloride .............. i, 0 - Mg cl2'6 H2 O. . . . . . . . . . . . . . . . . 2.0 - Fe SO, -: 2 H20 .. .. .. .. .. .. .. ... o, o4i - M "SOa - 4H20 .. .. .. .. .. .... ... 0.05 - ZnS04 - 7 H20 .. .. .. .. .. .. .. ... o, io - C0 C12-6H2 O. . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.005- The substances were added in the order given while stirring. The concentrate was sterilized by heating at 120 ° for 40 minutes and aseptically transferred into the fermentation kettle, which had previously been sterilized with flowing steam. The concentrate was aerated, stirred and cooled in the fermentation kettle and then as much sterilized water was added from the municipal mains network that it was diluted to the concentrations given above and the fermentation kettle was filled to go goo 1. The temperature of the diluted medium was adjusted to 27 °. An antifoam agent consisting of lard oil containing 10 / e octadecanol was added to a feed tank so that it could be added sterile, if necessary. Initially ig / 1 was added and additional antifoam was added when it was necessary to control foaming during fermentation. A total of 3 g / l was used in the course of the fermentation. The medium in the fermentation tank was inoculated at 4 percent by volume from an inoculation tank containing a 25-hour, high-yielding strain of S. aureofaciens. The inoculated tank was vented at a rate of 0.4 volume of air per volume of mash per minute, the air being introduced near the bottom of the fermentation tank through a series of aeration nozzles to give a small bubble size. The contents of the ferritation tank were agitated by a paddle wheel powered by a go hp motor operating at its rated output. Aeration and stirring were carried out for 62 hours. When finished, the mash was harvested and found to contain 25oo micrograms per cc of chlorotetracycline and 742 micrograms per liter of vitamin B ".

Claims

PATENT CLAIM: The use of chloride ions in amounts of 0.15 to 2.5 parts by weight and cobalt ions in amounts of traces up to 0.0 parts by weight as an additive to the usual nutrient media for the cultivation of Streptomyces aureofaciens for the production of chlortetracycline and cobalamines. References considered: Arch. Biochemistry 28, 195o, pp. Iii to 116; Ind. Engng. Chem. 41, February 1949, pp. 432 to 435 Arch. Hyg. Baktariol. 133, 1950, pp. 308 to 313; U.S. Patent No. 2,586,766.