DE102011056290A1

DE102011056290A1 - Pilzstämme mit genetischer modifikation betreffend einen carbonsäure-transporter

Info

Publication number: DE102011056290A1
Application number: DE102011056290A
Authority: DE
Inventors: Andreas Aurich; Martina Holz; Anne Kretzschmar; Christina Otto; Gerold Barth; Isabel Waengler; Roland Arno Müller
Original assignee: ThyssenKrupp Uhde GmbH
Current assignee: ThyssenKrupp Industrial Solutions AG
Priority date: 2011-12-12
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2013-06-13
Also published as: US20150010973A1; WO2013087714A1; BR112014014082A2; EP2791332A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Pilzstämme aufweisend mindestens eine genetische Modifikation die zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt, sowie Verfahren zu deren Herstellung bzw. deren Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Pilzstämme mit genetischer Modifikation betreffend einen Carbonsäure-Transporter, sowie Verfahren zur Herstellung bzw. Verwendung solcher Pilze.
GEBIET DER ERFINDUNG
Das Interesse an biotechnologisch hergestellten Carbonsäuren etwa des Citratzyklus als ein potentielles intermediäres Ausgangsmaterial und als Alternative zu petrochemischen Produktionsprozessen in der Industrie steigt stetig. Viele dieser Carbonsäuren haben das Potenzial, als sogenannte Building-Block-Chemikalie zu fungieren. Wichtige Vorstufen für die chemische Synthese, Polyesterproduktion und andere Prozesse können aus besagten Carbonsäuren gebildet werden. So wird beispielswiese das für industrielle Zwecke wichtige Succinat derzeit noch hauptsächlich petrochemisch aus Maleinsäureanhydrid ausgehend von Butan gewonnen. Die petrochemische Herstellung von Succinat unter Verwendung von Schwermetallkatalysatoren, organischen Lösungsmitteln, hohen Temperaturen und Drücken ist kostenintensiv.
Daher war der Markt für Succinat bisher relativ klein. Aufgrund steigender Ölpreise, aber auch wegen das anhaltenden Bedarfs an Syntheseprodukten rückt die biotechnologische Produktion von Carbonsäuren, insbesondere von Succinat, und die Entwicklung entsprechender Prozesse immer stärker in den Fokus der produzierenden Industrie.
Carbonsäuren wie Succinat werden natürlicherweise durch viele Mikroorganismen, Pflanzen und Tiere als Intermediat im zentralen Stoffwechsel oder als Stoffwechselendprodukt gebildet. Die Mehrheit der natürlichen und optimierten Produzenten stellen Bakterienstämme dar, die beispielsweise Succinat vor allem unter anaeroben Bedingungen akkumulieren. Aufgrund der Nachteile der bakteriellen Produktionsverfahren, wie z. B. der Notwendigkeit von komplexen Kultivierungsmedien, der potenziellen Pathogenität und besonders der geringen Säuretoleranz, rücken jedoch mikrobielle Pilze immer stärker in den Fokus der Untersuchungen zur Entwicklung von Verfahren zur Produktion organischer Säuren wie Succinat.
Verschiedene genetische Modifikationen werden diskutiert, um in Pilzen insbesondere die Succinatbildung zu beeinflussen. So wurden mehrere Gene des Citratcyclus disruptiert, wobei gezeigt wurde, dass die Deletion von SDH1, das für eine Untereinheit der SDH (Succinatdehydrogenase) kodiert, zu einer 1,6fachen Steigerung der Succinatproduktion, in Kombination mit einer FUM1-Deletion (Gen, das für Fumarase kodiert) sogar zu einer 2,6fachen Steigerung der Succinatproduktion führte (Arikawa et al. 1999b).
Die Disruption der Gene der SDH, die in S. cerevisiae aus mindestens vier Untereinheiten besteht (Ghezzi et al. 2009) in Sake-Stämmen der Gattung Saccharomyces resultierte in einer Reduktion der SDH-Aktivität und einer Erhöhung der Succinatbildung, wobei maximal 0,3 g L^–1 Succinat gebildet wurden (Kubo et al. 2000).
Mit Hilfe dieser Erkenntnisse wurden später S. cerevisiae Stämme mit dem Ziel der Succinatproduktion für den industriellen Einsatz konstruiert (Raab und Lang 2011). Bei gleichzeitiger Deletion von SDH1, SDH2, IDH1 (dem Gen für die Isocitratdehydrogenase), und IDP1 (das für ein mitochondriales Isoenzym der IDH kodiert), wurden maximal 3,62 g L^–1 Succinat nach 168 h produziert. Allerdings wurden auch Ethanol, Glycerol, Acetat, α-Ketoglutarat (AKG) und Pyruvat als Nebenprodukte gebildet.
Weitere Veränderungen, wie die durch einen reprimierbaren Promotor kontrollierte Expression von IDH1 und SDH2 oder IDH1 und DIC1, das für einen Dicarboxylattransporter zum Transport von Succinat und Malat aus dem Cytosol in die Mitochondrien kodiert, wurden in der Literatur beschrieben (Raab und Lang 2011).
Im Zuge dessen wurde versucht, die Expression weiterer Gene (PYC1, ACS1, CIT1, ACO1, ICL1, MLS1, MDH2 und CIT2) durch Kontrolle durch einen konstitutiven Promotor (pADH1 – Promotor der Alkoholdehydrogenase) zu deregulieren oder durch Gene von Craptreenegativen Hefen zu ersetzen (Raab und Lang 2011).
Die US20110104771 offenbart, dass ein S. cerevisiae Stamm mit einem ICL Gen aus K. lactis, dem Malatsynthasegen aus S. cerevisiae, mit einem Gen für die PEPCK aus M. succiniciproducens, dem Gen MDH2 aus S. cerevisiae sowie mit Genen für Fumarase (aus Rhizopus oryzae) und Fumaratreduktase (aus Trypanosoma brucei) bis zu 6,3 g L^–1 Succinat nach 7 Tagen produzieren kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahren bzw. Organismen zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe die Produktion von organischen Säuren wirtschaftlich bewerkstelligt werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahren bzw. Organismen zur Produktion von organischen Säuren zur Verfügung zu stellen, die gegenüber den bakteriellen Verfahren Vorteile aufweisen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Aufgaben werden mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Die Unteransprüche geben bevorzugte Ausführungsformen an.
Demnach ist ein Pilzstamm vorgesehen, aufweisend eine genetische Modifikation, die zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt.
Bei besagtem Carbonsäure-Transporter handelt es sich um ein Membrantransport-Protein, das in der Lage ist, Carbonsäuren durch die Zellmembran und ggf. die Zellwand zu transportieren. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Transporter für Dicarbonsäuren, vorzugsweise um Transporter für Carbonsäuren des Citratcyclus bzw. benachbarter Stoffwechselwege. Dies können Symporter (Co-Transporter) sein, aber auch Uniporter oder Antiporter sein, ganz besonders bevorzugt Transporter für mindestens eine organische Säure ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Fumarat, Lactat, Pyruvat, Malat, Malonat und/oder Succinat.
Für Kluyveromyces lactis und Schizosaccharomyces pombe wurden bereits Dicarboxylatpermeasen beschrieben, die den Transport von Succinat/Malat/Fumarat (KlJen2p) bzw. Lactat/Pyruvat (KLJen1p) sowie den Transport von Succinat/Malat/Malonat (SpMae1p) vermitteln. Die beiden erstgenannten gehören zur Gruppe der JEN-Transporter, während letztgenannte der Gruppe der MAE-Transporter zugehören.
Der Begriff "pilzeigen", wie hier verwendet, soll klarstellen, dass der besagte Carbonsäure-Transporter im Genom des Pilzes kodiert ist. Alternativ kann auch der Begriff "homolog" verwendet werden. Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass besagter Pilz eine erhöhte extrazelluläre Carbonsäureproduktion aufweist.
Der Begriff "Carbonsäuren", wie hier verwendet, ist identisch mit dem Begriff "organische Säuren" und bezieht sich auf all jene Stoffwechselprodukte des besagten Pilzes, die als Carbonsäuren bezeichnet werden können. Bevorzugt bezeichnet der Begriff die Carbonsäuren des Citratcyklus und benachbarter Stoffwechselwege, insbesondere Pyruvat, α-Ketoglutarat, Malat, Oxalacetat, Citrat, Isocitrat, Fumarat, Malonat, Lactat und/oder Succinat. Bei den meisten dieser Säuren handelt es sich um Dicarbonsäuren.
Ebenso ist ein Verfahren zur genetischen Modifikation eines Pilzstamms zwecks Erhöhung der extrazellulären Carbonsäureproduktion vorgesehen, wobei besagtes Verfahren zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt.
Bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass die Verminderung der Aktivität des Carbonsäure-Transporters erreicht wird durch mindestens eine Eigenschaft bzw. einen Schritt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend:

a) Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens codierend für einen Carbonsäure-Transporter
b) Expression eines dysfunktionalen oder vermindert aktiven Carbonsäure-Transporters, und/oder
c) Inhibierung oder Verminderung der Aktivität des exprimierten Carbonsäure-Transporters

Die Inhibierung oder Verminderung der Expression kann beispielsweise durch Inhibierung oder Verminderung der Transkription des codierenden Gens oder der Translation der generierten mRNA erfolgen. Die Expression eines dysfunktionalen oder vermindert aktiven Carbonsäure-Transporters kann beispielsweise durch Deletion, Insertion, Substitution oder Punktmutation in dem codierenden Gen bewerkstelligt werden.
Hierzu kommen beispielsweise die folgenden Methoden in Frage: Beim Gen-Silencing erfolgt die Genregulation durch eine Hemmung der Übertragung (Transkription) einer genetischen Information von der DNA auf die mRNA (transkriptionelles Gen-Silencing) oder der nachfolgenden Übersetzung (Translation) der auf der mRNA gespeicherten Information in ein Protein (post-transkriptionelles Gen-Silencing). Transkriptionelles Gen-Silencing ist ein Resultat von epigenetischen Veränderungen der DNA, wie insbesondere DNA-Methylierung oder Histonmodifikationen. Durch diese Modifikationen der Histonenden wird eine Art heterochromatischer Zustand um das Gen geschaffen, welcher es der Transkriptionsmaschine (RNA-Polymerase, Transkriptionsfaktoren, etc.) verwehrt, zu binden. Das klassische Beispiel ist das als Positionseffekt-Variegation (PEV) bezeichnete Phänomen. Es verändert den Chromatinzustand und kontrolliert somit die Transkriptionsaktivität des betroffenen Gens oder der Genregion. Als posttranskriptionelles Gen-Silencing (PTGS) werden die Prozesse der Genstilllegung bezeichnet, die erst nach der Transkription der genetischen Information von der DNA auf die übertragende mRNA stattfinden. Zu den Formen des posttranskriptionellen Gen-Silencings zählen insbesondere der Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) und die RNA-Interferenz (RNAi). Während der Nonsense-mediated mRNA decay vorrangig der Vermeidung von Nonsense-Punktmutationen dient, ist die RNA-Interferenz ein überwiegend regulatorischer Prozess unter Beteiligung spezifischer RNA-Moleküle, wie miRNA und siRNA. Das posttranskriptionelle Gen-Silencing kann zu einem intensivierten Abbau der mRNA eines bestimmten Gens führen. Durch den Abbau der mRNA wird die Translation und somit die Bildung des spezifischen Genproduktes (meist ein Protein) verhindert. Darüber hinaus ist eine genspezifische direkte Hemmung der Translation als Folge des posttranskriptionellen Gen-Silencings möglich. Unter Gen-Knockout wird das vollständige Abschalten eines Gens im Genom eines Organismus verstanden. Das Abschalten des Gens wird durch Gene-Targeting erreicht. Eine Deletion, auch Gendeletion, ist in der Genetik eine Variante der Genmutation bzw. bei der eine Nukleotidsequenz bzw. ein Teil bis hin zum gesamten Chromosom fehlt. Eine Deletion ist daher immer ein Verlust von genetischem Material. Jegliche Anzahl von Nukleinbasen können deletiert sein, von einer einzelnen Base (Punktmutation) bis hin zum Chromosom. Es wird zwischen der interstitiellen und der terminalen Deletion unterschieden. Die erstere beschreibt einen Verlust innerhalb des Chromosoms, die letztere ein Verlorengehen eines Endabschnittes, also eines Teils des Telomerbereiches.
Als Folge der Deletion, kann nach der Translation aus der aus der DNA entstandenen mRNA ein fehlerhaftes Protein entstehen. Denn durch die Deletion von Basenpaaren kann eine Leserasterverschiebung-Mutation hervorgerufen werden, wenn eine Anzahl von Basenpaaren entfernt wurde, die nicht durch drei teilbar ist. Bei der ortsspezifischen oder gezielten Mutagenese wird mit Hilfe einer rekombinanten DNA eine gezielte Veränderung der DNA ermöglicht. Es können damit gezielt einzelne Nukleinbasen eines Gens ausgetauscht oder auch ganze Gene entfernt werden. Alternativ kann mittels einer Deletionskassette, die in einen Vektor integriert wurde, eine Deletion in dem zu mutierenden Gen erzeugt werden.
Alternativ kann die Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens durch Einklonierung eines heterologen Promotors erfolgen, der durch einen exogenen Faktor hemmbar ist, beispielsweise einen Tetracyclin-regulierten tetO-Promotor. Ebenso kann die Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens durch Einklonierung eines heterologen Promotors erfolgen, der schwächer ist als der betreffende homologe Promotor, beispielsweise pPOT1.
Die Inhibierung oder Verminderung der Aktivität des exprimierten Carbonsäure-Transporters kann beispielsweise durch Gabe von Inhibitoren oder synchrone Expression von geeigneten, heterologen Inhibitoren erfolgen.
Bei besagtem Pilzstamm handelt es sich bevorzugt um einen Stamm mikrobieller Pilze.
Der Begriff "mikrobieller Pilz", wie hier verwendet, soll insbesondere solche Pilze umfassen, die mit biotechnologischen Methoden kultiviert werden können und sich insbesondere für fermentative Produktionsverfahren eignen, beispielsweise in Suspensionskulturen.
Bevorzugt ist vorgesehen, dass es sich bei dem Pilz um ein Mitglied der Gruppe der Schlauchpilze (Ascomycota) handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um ein Mitglied der Gruppe der Hemiascomycetes oder der Euascomycetes.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei besagtem Pilzstamm um eine Hefe oder einen Schimmelpilz. Besagter Pilz gehört besonders bevorzugt einer Gattung an, die ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Saccharomyces; Schizosaccharomyces; Wickerhamia; Debayomyces; Hansenula; Hanseniospora; Pichia; Kloeckera; Candida; Zygosaccharomyces; Ogataea; Kuraishia; Komagataella (= Pichia); Yarrowia; Metschnikowia; Williopsis; Nakazawaea; Kluyveromyces; Cryptococcus; Torulaspora; Torulopsis; Bullera; Rhodotorula; Sporobolomyces; Pseudozyma; Saccharomycopsis; Saccharomycodes; Aspergillus; Penicillium; Rhizopus; Trichosporon und/oder Trichoderma.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der mindestens eine Carbonsäure-Transporter aus der Gruppe der JEN-Transporter und/oder der MAE-Transporter entstammt.
Für Kluyveromyces lactis und Schizosaccharomyces pombe wurden bereits Dicarboxylatpermeasen beschrieben, die den Transport von Succinat/Malat/Fumarat (KlJen2p) bzw. Lactat/Pyruvat (KLJen1p) sowie den Transport von Succinat/Malat/Malonat (SpMae1p) vermitteln. Die beiden erstgenannten gehören zur Gruppe der JEN-Transporter, während letztgenannte der Gruppe der MAE-Transporter zugehören.

Bislang wurden 35 Proteine, die durch putative Orthologe der K. lactis Gene KlJEN1 und KlJEN2 kodiert wurden, in 17 verschiedenen Pilzarten (13 Hemiascomyceten, 7 Euascomyceten) gefunden. Dabei variiert die Anzahl an JEN-Orthologen von einem (z. B. S. cerevisiae) bis zu 6 orthologen Genen in Y. lipolytica. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die Gruppe der JEN-Transporter, sowie, in den letzten Zeilen, über die bekannten MAE-Transporter:

Typ	Art	Arbeitsname	EMBL	Swiss-Prot	Länge (aa)	Anzahl der Transmembran domänen
JEN	K. lactis	KLLA-E-KLJEN1	AJ585426	Q70DJ7	600	12
		KLLA-F-KLJEN2	AJ627630	Q701Q9	528	11
	Sac. cerevisiae	SACE-K-JEN1	U24155	P36035	616	12
	Sac. paradoxus	SAPA-X1-J101			616	12
	Sac. mikatae	SAMI-X1-J101			616	12
	Sac. kudriavzevii	SAKU-X1-J101			614	10
	Sac. bayanus	SABA-X1-J101			615	12
	K. thermotolerans	KLTH-G-J201			542	11
	K. waltii	KLWA-X1-J201			534	11
	Sac. kluyveri	SAKL-X1-J101			598	10
		SAKL-X2-J201			523	11
		SAKL-X3-J001			531	11
	A. gossypii	ASGO-A-J001	AAS50559	Q75E88	500	10
		ASGO-B-J201	AAS50561	Q75E76	478	9
		ASGO-F-J101	AAS53704	Q753H9	500	9
	D. hansenii	DEHA-D-J202	CAG87482	Q6BR62	511	10
		DEHA-F-J101	CAG89500	Q6BL03	513	12
		DEHA-F-J201	CAG89946	Q6BJV3	506	12
	C. albicans	CAAL-D-J001	EAK98054	Q5A5U2	513	10
		CAAL-C-J101	EAK97104	Q5A2W4	541	10
	Y. lipolytica	YALI-B-J101	CAG83351	Q6CE14	529	10
		YALI-C-J102	CAG82184	Q6CBU1	499	10
		YALI-C-J201	CAG82410	Q6CB72	523	10
		YALI-D-J204	CAG81250	Q6C8F4	502	10
		YALI-D-J202	CAG81440	Q6C7X3	503	10
		YALI-E-J203	CAG80310	Q6C3Q6	524	10
	N. crassa	NECR-X1-J201	EAA33605	Q7SB47	557	11
		NECR-X2-J202	EAA32361	Q9P732	518	9
	A. fumigatus	ASFU-G-J202	EAL86916	Q4WGM5	501	11
		ASFU-H-J001	EAL85090	Q4WB22	520	10
		ASFU-B-J201	EAL93241	Q4X1M4	511	9
	A. nidulans	ASNI-A-J201			495	10
		ASNI-A-J202			514	11
	A. oryzae	ASOR-A-J201			508	11
		ASOR-G-J202			512	10
MAE	S. pombe	n/a	n/a	P50537	438	10
MAE	Y. lipolytica	n/a	n/a	n/a

Bekannte Carbonsäure-Transporter aus der Gruppe der JEN- bzw. MAE-Transporter in mikrobiellen Pilzstämmen. A = Aspergillus; Sac = Saccharomyces; N = Neurospora; Y = Yarrowia; C = Candida; D = Debaromyces und K = Kluyveromyces

Bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass der mindestens eine Carbonsäure-Transporter aus der in der folgenden Tabelle aufgeführten Gruppe der JEN-Transporter und/oder der MAE-Transporter entstammt.

Organismus	Zugehörig zur Dicarboxylat permeasen-Gruppe:	Arbeitsname	Aliasname	Deletionskassette SEQ ID No	Vektor SEQ ID No
Y. lipolytica	KlJEN1	YALI-B-J101	JEN2	1	2
	KlJEN1	YALI-C-J102	JEN1	3	4
	KlJEN2	YALI-C-J201	JEN6	5	6
	KlJEN2	YALI-D-J204	JEN4	7	8
	KlJEN2	YALI-D-J202	JEN3	9	10
	KlJEN2	YALI-E-J203	JEN5	11	12
Schizosacchar omyces pombe	SpMae1		SPMAE1	13	14
Y. lipolytica	SpMae1		MAE1	13	14

Experimentell wurde das betreffende Gen mittels einer in einem Vektor integrierten Deletionskassette deletiert (SEQ ID Nos 1, 3, 5, 7, 9 und 11). Bei dem verwendeten Vektor handelt es sich jeweils um pUCBM21, der ursprünglich von Boehringer entwickelt wurde (SEQ ID Nos 2, 4, 6, 8, 10, 12). Es sind jedoch auch alle anderen geeigneten aus dem Stand der Technik bekannten Vektoren verwendbar.
Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass der mindestens eine Carbonsäure-Transporter durch das Gen YALI-D-J204 (EMBL-ID: CAG81250; Swiss-Prot ID: Q6C8F4) kodiert ist. Besagtes Gen wird im Rahmen dieser Anmeldung stets auch als „JEN4“ bezeichnet. Ebenso ist besonders bevorzugt vorgesehen, dass besagter Pilz der Gattung Yarrowia, besonders bevorzugt der Art Yarrowia lipolytica zugehört.
Wie oben gezeigt, weist die Y. lipolytica insgesamt 6 JEN-Orthologen auf. Diese hohe Anzahl an Genen für putative Carboxylattransporter spiegelt das große Potenzial der Hefe Y. lipolytica für die Produktion von organischen Säuren, wie z. B. Succinat, Malat oder Fumarat, wider. Außerdem ist Y. lipolytica umfangreich genetisch und physiologisch charakterisiert, kann ein breites Spektrum an Substraten verwerten und ist tolerant gegenüber niedrigen pH-Werten.
Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass besagter Pilz mindestens eine weitere genetische Modifikation ausgewählt aus der Gruppe enthaltend:

• Reduktion der Aktivität bzw. Expression der Succinatdehydrogenase (SDH), beispielsweise durch Austausch des nativen Promotors von SDH2 gegen einen schwachen Promotor, (bei Glucose und Glycerol als Substrat eignet sich beispielsweise pPOT1), oder durch Verwendung einer geeigneten Deletionskassette,
• Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Pyruvatcarboxylase (PYC), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens PYC1, und/oder
• Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Isocitratlyase (ICL), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens ICL1

All diese genetischen Modifikationen stehen im Zusammenhang mit der Bildung von Carbonsäuren im Rahmen des Citratzyklus. Die genannten Modifikationen sind im Methodenteil ausführlich beschrieben.
Weitere in Frage kommende genetische Modifikation, die in Kombination mit den genannten Modifikationen verwendet werden können, betreffen eine Reduktion der Aktivität bzw. Expression der Gene SDH1, SDH3 und/oder SDH4, das Einbringen eines heterologen Gens ausgewählt aus der Gruppe codierend für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PCK1), Fumarat Reduktase und/oder Fumarase (FUM1), und/oder die Reduktion der Aktivität bzw. Expression des Gens codierend für Isocitrat-Dehydrogenase (IDH1) sowie mindestens eines der Gene codierend für den mitochondrialen Dicarboxylat-Carrier (DIC1) und/oder SDH2, und optional mindestens eines der Gene FUM1, osmotic growth Protein (OSM1), Malat Dehydrogenase (MDH3) und/oder Citrat Synthase (CIT2). Die Reduktion der Expression kann beispielsweise durch einen heterologen Promotor erfolgen, der durch einen exogenen Faktor hemmbar ist, bevorzugt einen Tetracyclin-regulierten tetO-Promotor. Alternative Methoden (Gene Silencing, Gene Knock out, Deletion) sind weiter oben dargestellt

Die genannten Gene sind in der folgenden Tabelle identifiziert, dabei wurden als Beispiel die UniProt-Einträge für Saccharomyces cerevisiae gewählt. Es versteht sich, dass der Fachmann anhand dieser Angaben die korrespondierenden Gene in anderen Pilzstämmen, insbesondere in Yarrowia, ohne weiteres finden kann.

Name	Abkürzung	UniProt
Succinat Dehydrogenase Komplex, subunit	SDH2 bzw. SDHB	P21801
Succinat Dehydrogenase Komplex, subunit	SDH1 bzw SDHA	Q00711
Succinat Dehydrogenase Komplex, subunit b	SDH3 bzw CYB3	P33421
Succinat Dehydrogenase Komplex, small subunit b	SDH4 bzw ACN18	P37298
Pyruvatcarboxylase	PYC1	P11154
Isocitratlyase	ICL1	P28240
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase	PCK1	P10963
Fumarat Reduktase, subunit A
Fumarat Reduktase, subunit C
Fumarat Reduktase, subunit D
Fumarase	FUM1	P08417
Isocitrat-Dehydrogenase	IDH1	P28834
Mitochondrialer Dicarboxylat-Carrier	DIC1	Q06143
Osmotic growth Protein	OSM1	P21375
Malat Dehydrogenase	MDH3	P32419
Citrat Synthase	CIT2	P08679

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren vorgesehen, wobei in dem Verfahren ein Pilzstamm gemäß einem der vorherigen Ansprüche verwendet wird.
Besonders bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass als Kohlenstoffquelle Hexosen, wie z.B. Glucose oder Saccharose, oder Alkohole, wie z.B. Glycerol, verwendet wird. Glucose und Saccharose sind besonders geeignet, weil sie kostengünstige Substrate darstellen.
Glycerol fällt in großen Mengen als Abfallprodukt beispielsweise in der Produktion von Biodiesel an und ist daher ebenfalls ein kostengünstiges Substrat. Für Glycerol spricht überdies, dass seine Aufnahme durch die Pilze durch eine Beeinträchtigung eines Carbonsäure-Transporters nicht berührt wird.
Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass die Pilzstämme in einem Medium kultiviert werden, und wobei ferner die Sauerstoffaufnahmerate (OUR) auf einen Bereich zwischen ≥ 5 und ≤ 50 mmol O₂/l·h eingeregelt wird.
In diesem Bereich, so haben Untersuchungen der Anmelderin ergeben, werden die höchsten Produktionsraten erzielt. Bevorzugt wird die Sauerstoffaufnahmerate auf einen Bereich zwischen ≥ 10 und ≤ 40 mmol O₂/l·h eingeregelt. Besonders bevorzugt wird die Sauerstoffaufnahmerate auf einen Bereich zwischen ≥ 20 und ≤ 30 mmol O₂/l·h eingeregelt. Äußerst bevorzugt wird die Sauerstoffaufnahmerate auf einen Bereich zwischen 25 ± 3 mmol O₂/l·h eingeregelt.
Technisch kann in einem Fermenter der Sauerstoffeintrag OTR durch die Luftbegasungsrate (l min^–1), die Rührerdrehzahl (U min^–1), die Druckbeaufschlagung des Fermenters und die Gaszusammensetzung (Anteil O₂ im Gasgemisch) beeinflusst werden. Die Sauerstoffaufnahmerate OUR kann anhand der bekannten eingetragenen Gaszusammensetzung sowie der Gasmenge und der Messung der Sauerstoffkonzentration im Abgas mit Hilfe allgemein bekannter Gleichungen bestimmt werden.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Es zeigen:
1 Schematische Darstellung der Expressionskassette zum Austausch des SDH2-Promotors gegen den Promotor der Gene ICL1, GPR1 oder POT1. Alle Expressionskassetten enthielten URA3 als Selektionsmarker, flankiert durch die lox-sites und homologe Bereiche des SDH2-Promotors und SDH2-ORF. Der SDH2-ORF wurde direkt mit dem jeweiligen Promotor fusioniert. Die pICL1 enthaltende Expressionskassette hatte eine Größe von 4,9 kb, die pPOT1-Kassette 3,8 kb und die GPR1B-Kassette war 4,2 kb groß.
2 Plasmide pSpIvS-Ura, pSpPS-Ura und pSpGS-Ura mit den Expressionskassetten zum Austausch des SDH2-Promotors gegen pICL1, pPOT1 bzw. GPR1B. Als Selektionsmarker ist das mit den lox-Sites flankierte Markergen URA3 enthalten.
3 Vektorkonstruktion des Plasmids p64PIC ausgehend von p64PYC1 und p64ICL1. Neben den gewünschten Genen mit eigenem Promotor- und Terminatorbereich enthielt p64PIC das URA3-Allel ura3d4 als multicopy Markergen und rDNA als Integrationssequenz.
4 PYC- und ICL-Aktivitäten des Wildtypstamms Y. lipolytica H222 und der Transformanden H222-AZ8 T3, T4, T5 und H222-AZ9 T2 und T3 in MG-Medium. Die Stämme wurden in je 100 ml MG-Medium (Wachstumsmedium) in 500-ml Erlenmeyerkolben bei 28°C und 220 rpm kultiviert. Die Probenahme für die Aktivitätsmessung erfolgte nach 4 h.
5 Schematische Darstellung zur Deletion von JEN4 durch homologe Rekombination in Promotor- und Terminatorregion mit der URA3 enthaltenen Deletionskassette.
6 Wachstum (a) und Succinatproduktion (b) des Wildtypstamms Y. lipolytica H222 und der Transformanden H222-AZ7 T11 und T23 in YNB-Medium. Die Stämme wurden in je 150 ml Kultur-Medium in 500-ml Erlenmeyerkolben bei 28°C und 220 rpm mit 5 % Glycerol kultiviert. Die Succinatgehalte im Kulturüberstand wurden ionenchromatografisch bestimmt.
7 Strategie zur Konstruktion des Stamms H222-AZ10.
8 PYC-Aktivitäten des Wildtypstamms Y. lipolytica H222 und der Transformanden H222-AZ10 T1, T5 und T9 in MG-Medium. Die Stämme wurden in je 100 ml MG-Medium (Wachstumsmedium) in 500-ml Erlenmeyerkolben bei 28°C und 220 rpm kultiviert. Die Probenahme für die Aktivitätsmessung erfolgte nach 4 h.
9 Wachstum (a) und Succinatproduktion (b) des Wildtypstamms Y. lipolytica H222 und der Transformanden H222-AZ7 T11, H222-AZ8 T3 sowie H222-AZ10 T1, T5 und T9 in YNB-Medium. Die Stämme wurden in je 150 ml Kultur-Medium in 500-ml Erlenmeyerkolben bei 28°C und 220 rpm mit 5 % Glycerol kultiviert. Die Succinatgehalte im Kulturüberstand wurden ionenchromatografisch bestimmt.
10 Maximal gebildete Produktmengen der organischen Säuren Succinat, Malat, α-Ketoglutarat (AKG) und Fumarat bei Kultivierung der Stämme Y. lipolytica H222, H222-AZ8 T3, H222-AZ7 T11 und H222-AZ10 T1, T5 und T9 in YNB-Medium. Kultivierung in YNB-Medium mit 5 % Glycerol als C-Quelle.
11 Prozentualer Anteil der organischen Säuren Succinat (SA), Malat (MA), α-Ketoglutarat (AKG) und Fumarat (FA) am Gesamtsäureprodukt bei Kultivierung der Stämme Y. lipolytica H222, H222-AZ8 T3, H222-AZ7 T11 und H222-AZ10 T1, T5 und T9 in YNB-Medium. Kultivierung in YNB-Medium mit 5 % Glycerol als C-Quelle.
12 Maximale Säureproduktion der MAE1 deletierten Transformanden. Gezeigt wurde die gemittelte, maximale Säuremenge der H222-SW2ΔMAE1-Transformanden TF3, TF7 und TF8, sowie des Referenzstammes H222 aus 3-facher Kultivierung in Produktionsmedium nach Tabuchi et al. (1981). AKG = α-Ketoglutarat, FU = Fumarat, MA = Malat, SUC = Succinat
13: Vektorkonstruktion des Plasmids p64PYC1 ausgehend von p64T.
14: Southern Blot Analyse zur Bestätigung der multiplen Integration von p64PYC1 in Y. lipolytica H222-S4. Die genomische DNA wurde mit der Restriktase EcoRV vollständig verdaut. Für die Detektion von PYC1 wurde eine spezifische Sonde für den PYC1-ORF (2,1 kb) verwendet, die mittels PCR und den Primern PYC_ORF_for und PYC_ORF_rev gewonnen wurde. Der schwarze Pfeil kennzeichnet das 8,9 kb große genomische (g) PYC1-Fragment und der rote Pfeil zeigt das 6,2 kb vektorielle (v) PYC1-Fragment. λ-Molekulargewichtsstandard; 1-Rezipientenstamm H222-S4; 2-Transformande H222-AK1-1; 3-Transformande H222-AK1-2; 4-Transformande H222-AK1-3; 5-Transformande H222-AK1-4; 6-Transformande H222-AK1-5; 7-Transformande H222-AK1-6; 8-Transformande H222-AK1-7.
15 Kinetik der spezifischen Pyruvatcarboxylase-Aktivität der Transformanden mit einer Mehrfachintegration der PYC1-Expressionskassette im Vergleich zu dem Wildtyp H222. Die spezifischen Aktivitäten wurden während der Kultivierung in 100 ml Minimalmedium mit 1 % Glucose bestimmt. Der charakteristische Verlauf der spezifischen Aktivitäten ergab sich aus den Enzymaktivitätsbestimmungen von drei unabhängigen Kultivierungen.

16: Wachstum (a) und Succinatproduktion (b) der Stämme Y. lipolytica H222 (Wildtyp) und H222-AM3 in Tabuchi-Medium. Zur Beurteilung des Wachstums wurde die optische Dichte der Kultur bei 600 nm zu bestimmten Zeitpunkten bestimmt. Die Stämme wurden in je 100 ml Produktionsmedium nach Tabuchi et al. (1981) in 500-ml Erlenmeyerkolben bei 28°C und 220 rpm mit 10 % Glycerol kultiviert. Die Bestimmung der Succinatgehalte erfolgte ionenchromatografisch. Dargestellt sind Verlauf der optischen Dichten (OD₆₀₀) sowie der Succinatproduktion jeweils eines der Versuche aus mehreren Wiederholungen. Zusammensetzung des Kulturmediums 1. YNB-Medium

NH4Cl	10,0 g L^–1
KH₂PO₄	1,0 g L^–1
MgSO₄ × 7H₂0	1,0 g L^–1
Na₂HPO₄ × 2H₂O	1,3 g L^–1
CaCl₂ × 6H₂O	0,2 g L^–1
NaCl	0,1 g L^–1
Pharmaglycerol (99%)	50 g L^–1
Thiamin	1,0 mg L^–1
FeSO₄ × 7H₂O	35 mg L^–1
Spurenelemente	1,0 ml L^–1
Aqua dest. (steril)

Tabelle 1a: Zusammensetzung des YNB-Kulturmediums 2. Spurenelemente YNB

H₃BO₃	0,5 g L^–1
CuSO₄ × 5H₂O	0,63 g L^–1
KI	0,1 g L^–1
MnSO₄ × H₂O	0,45 g L^–1
Na₂MoO₄ × 2H₂O	0,24 g L^–1
ZnSO₄ × 7H₂O	0,71 g L^–1

3. Tabuchi-Medium

NH₄Cl	3,0 g L^–1
KH₂PO₄	0,1 g L^–1
MgSO₄ × 7H₂O	0,5 g L^–1
FeSO4 × 7H₂O	0,035 g L^–1
Hefeextrakt	2,5 g L^–1

Tabelle 1b: Zusammensetzung des Mediums modifiziert nach Tabuchi et al. (1981):

Zu Beginn der Arbeiten wurde der Y. lipolytica Wildtypstamm H222 für die Untersuchung der Succinatproduktion ausgewählt. H222 hatte sich bereits hinsichtlich der Citrat- bzw. AKG-Produktion als sehr guter Säureproduzent gegenüber anderen Y. lipolytica Stämmen bewährt. H222 wurde in einem Kultivierungsmedium, das für die Itaconsäureproduktion durch Candida-Stämme optimiert wurde, kultiviert.
Als C-Quellen wurden Glucose (10 %), Glycerol (10 %) und Sonnenblumenöl (5 %) ausgewählt. Die Kultivierung erfolgte in 500-ml-Erlmeyerkolben ohne Schikanen in 100 ml Kultivierungsmedium bei 28 °C und 220 rpm. Bei Verwendung von Sonnenblumenöl als C-Quelle wurden die Flüssigkulturen in 500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen geschüttelt. Die Vorkultur erfolgte in 50 ml des gleichen Mediums und wurde 2–3 Tage bei 28°C und 220 rpm inkubiert. Die Vorkultur wurde durch Zentrifugation (3.500 rpm, 5 min, RT) geerntet und in Produktionsmedium ohne C-Quelle, Hefeextrakt und Eisensulfat aufgenommen. Nach Bestimmung der optischen Dichten wurden die Hauptkulturen mit je 100 ml des Produktionsmediums mit einer optischen Dichte von 2 OD ml^–1 beimpft. Anschließend erfolgte eine Kultivierung bei 28°C und 220 rpm bis zu 500 h. Die Analyse der Konzentrationen der während der Kultivierung von Y. lipolytica sekretierten organischen Säuren erfolgte mittels Ionenchromatografie unter Verwendung des Ionenchromatographie-Systems ICS-2100 der Firma Dionex (Sunnydale, USA).

Die Ionenchromatographie-Systeme enthielten folgende Komponenten: Isokratische Pumpe und Leitfähigkeitsdetektor IC20, Eluentengenerator EG40, Autosampler AS40/Autosampler AS50, Selbstregenerierender Suppressor ASRS, Trennsäule IonPac AS19 (2 × 250 mm) mit Vorsäule IonPac AS19 (2 × 50 mm), Analytiksoftware Chromeleon Version 6.8. Die Trennparameter der Trennmethode sind in Tabelle 2 aufgelistet. Vorbereitung der Proben für die Ionenchromatografie: Zu bestimmten Zeiten der Kultivierung wurden je 1 ml der Kultur entnommen und je nach enthaltener C-Quelle aufbereitet. Abgesehen von den Kulturen, in denen Sonnenblumenöl als C-Quelle verwendet wurde, wurden die Proben bei maximaler Geschwindigkeit (5 min, 4°C) zentrifugiert und der Überstand mit entsprechender Verdünnung in bidestilliertem Wasser für die Ionenchromatografie eingesetzt. Wurde Sonnenblumenöl als C-Quelle verwendet, so musste dieses vor der Analyse entfernt werden. Dazu wurde die Probe mit 0,5 ml n-Hexan versetzt, 5 min stark geschüttelt und anschließend 5 min bei maximaler Geschwindigkeit und 4°C zentrifugiert. Die dabei entstehende wässrige untere Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und erneut mit 0,3 ml n-Hexan versetzt, geschüttelt und nochmals zentrifugiert. Wieder wurde die wässrige Phase abgenommen und mit entsprechender Verdünnung für die ionenchromatografische Analyse eingesetzt. Da das hier verwendete Kultur-Medium bisher nicht für die Succinatproduktion optimiert wurde und die Kultivierungsbedingungen, wie z. B. pH und pO₂, i m Schüttelkolbenmaßstab nicht dauerhaft stabil gehalten werden können, wurde in diesem und in allen folgenden Kultivierungsexperimenten auf die Berechnung maximaler Produktivitäten bzw. maximaler spezifischer Produktbildungsraten verzichtet.

Säule	IonPac AS19
Flussrate	0,3 ml min–1
Injektionsvolumen	10 µl
Laufmittel	ddH₂O
Eluent	KOH 0–3 min: isokratisch, 5 mM 3–25 min: linear auf 38 mM 25–36 min: isokratisch 38 mM 36–38 min: linear auf 5 mM 38–40 min: isokratisch, 5 mM
Retentionszeiten (min)	Pyruvat Malat Succinat α-Ketoglutarat Fumarat	7,5 min 19,6 min 20,3 min 23,4 min 27,4 min

Tabelle 2: Trennparameter der Ionenchromatografie sowie Retensionszeiten für die organischen Säuren.

1. Ausgangsorganismen
Für eine weitere molekularbiologische Bearbeitung dieses Stamms war eine Einführung von Auxotrophien/Selektionsmarkern notwendig. Der uracilauxotrophe Stamm H222-S4 war zu Beginn der Arbeiten bereits vorhanden (Mauersberger et al. 2001). Weitere auxotrophe Stämme wurden konstruiert. Innerhalb dieses Projekts wurde nur ein weiterer uracilauxotropher Stamm (H222-SW2) eingesetzt. H222-SW2 wurde durch Deletion des Ku70 Gens, dessen Genprodukt eine Rolle bei der DNA-Rekombination spielt, in H222-S4 erzeugt.
Es wurden Expressionskassetten konstruiert, die neben dem Selektionsmarker URA3 den entsprechenden Promotor (pICL1, GPR1B oder pPOT1) fusioniert mit dem Beginn des SDH2-ORFs sowie einen homologen Bereich von pSDH2 enthielten (1). Der Selektionsmarker URA3 wurde durch die sogenannten lox-sites flankiert, wodurch eine eventuelle spätere Entfernung dieses Markers mittels Crelox-System ermöglicht wurde. Die homologen Bereiche aus pSDH2 und SDH2-ORF sollten zur homologen Integration dieser Expressionskassette dienen.
Als Ausgangsplasmid diente pUCBM21 (2). In diesen wurde zuerst das mit den Primern pSDH2-fw und pSDH2-rv amplifizierte SDH2-Promotorfragment pSDH2 (569 bp) in die NcoI-Schnittstelle integriert. Mittels PCR wurden ein 1242 bp großes Fragment des SDH2 ORFs (Primer: SDH2-fw und SDH2-rv) und ein 776 bp großes pICL1-Fragment (Primer: pICL1-fw und pICL1-rv) amplifiziert und diese mittels Overlap-PCR fusioniert (Primer: overlap-fw und overlap-rv). Nach Verdau mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI wurde dieses pICL1-SDH2’-Fragment in den pSDH2 enthaltenen Vektor, ebenfalls BamHI und EcoRI verdaut, integriert. In dieses Konstrukt wurde das 2,16 kb große pICL1-Fragment, das mittels KpnI und BamHI Verdau aus dem Plasmid p64PT (Gerber (1999) gewonnen wurde, zwischen die KpnI- und BamHI-Schnittstellen kloniert. Zum Schluss erfolgte die Integration der loxR-URA3-loxP-Kassette in dieses Plasmid mit der ´pSDH2-pICL1-SDH2’-Kassette, das mit XbaI und KpnI verdaut wurde.
Die 1,4 kb große Expressionskassette wurde aus dem Plasmid JMP113 (Fickers et al. 2003) mittels XbaI/KpnI-Verdaus isoliert. Schließlich wurde das 8196 bp große Plasmid pSpIvS-Ura (2) erhalten, welches die Expressionskassette ´pSDH2-loxR-URA3-loxP-pICL1-SDH2’ zum Austausch des nativen SDH2-Promotors gegen den ICL1-Promotor enthielt. Diese wurde durch KspAI/MluI-Verdau aus dem Plasmid isoliert und für die Transformation mittels LiAc-Methode in den uracilauxotrophen Rezipientenstamm H222-SW2 (MATA ura3-302 ku70Δ-1572) (Werner 2008) verwendet.
Das ´pSDH2-loxR-URA3-loxP-pPOT1-SDH2’ enthaltene Plasmid pSpPS-Ura (2) wurde ausgehend von pSpIvS-Ura konstruiert. Dafür wurde pSpIvS-Ura mit den Restriktionsenzymen KpnI und MluI verdaut und das 4773 bp große Fragment (mit ´pSDH2 und URA3) isoliert. Dann wurden das mittels PCR gewonnene SDH2’- (838 bp, Primer: SDH2-pPOT1-fw, SDH2-MluI-rv) und das pPOT1-Fragment (1538 bp, Primer: KpnI-pPOT1-fw und pPOT1-SDH2-rv) in einer Overlap-PCR mit den Primern KpnI-pPOT1-fw und SDH2-MluI-rv zu einem 2336 bp großen Konstrukt fusioniert. Dieses Konstrukt wurde mit KpnI und MluI verdaut und mit dem 4773 bp Fragment von pSpIvS-Ura ligiert. Schließlich wurde ein pSpPS-Ura Plasmid mit einer Größe von 7,1 kb isoliert, das die Expressionskassette ´pSDH2-loxR-URA3-loxP-pPOT1-SDH2’ zum Austausch des nativen SDH2-Promotors gegen den POT1-Promotor enthielt. Auch diese Expressionskassette konnte mittels KspAI/MluI-Verdau aus dem Plasmid isoliert und für die Transformation in den uracilauxotrophen Rezipientenstamm H222-SW2 (MATA ura3-302 ku70Δ-1572) (Werner 2008) verwendet werden.
Analog zu pSpPS-Ura wurde das ´pSDH2-loxR-URA3-loxP-GPR1B-SDH2’ enthaltene Plasmid pSpGS-Ura (2) konstruiert. GPR1B wurde mittels PCR (Primer: KpnI-pGPR1-fw und pGPR1-SDH2-rv, Fragmentgröße: 1971 bp) aus dem Plasmid pTBS1 isoliert. Das mittels PCR gewonnene SDH2’-(838 bp, Primer: SDH2-pGPR1-fw, SDH2-MluI-rv) wurde in einer Overlap-PCR mit den Primern KpnI-pGPR1-fw und SDH2-MluI-rv zu einem 2769 bp großen Konstrukt fusioniert. Dieses Konstrukt wurde mit KpnI und MluI verdaut und mit dem 4773 bp Fragment von pSpIvS-Ura ligiert. Schließlich wurde ein pSpGS-Ura Plasmid mit einer Größe von 7,5 kb isoliert, das die Expressionskassette ´pSDH2-loxR-URA3-loxP-GPR1B-SDH2’ zum Austausch des nativen SDH2-Promotors gegen den GPR1B-Promotor enthielt. Zur Überprüfung der Sequenz wurden die Expressionskassetten sequenziert.
Diese Expressionskassetten wurden in den uracilauxotrophen Rezipientenstamm H222-SW2 (MATA ura3-302 ku70Δ-1572) (Werner 2008) transformiert. Schließlich wurden die uracilprototrophen Transformanden H222-AZ1 (pICL1-SDH2), und H222-AZ2 (pPOT1-SDH2) und H222-AZ3 (pGPR1-SDH2) erhalten. Die Integration der entsprechenden Expressionskassetten wurde mittels PCR oder Southern Hybridisierung nachgewiesen.
2. Kombination von Überexpression von PYC1 und SDH2-Promotoraustausch bzw. PYC1 + ICL1 und SDH2-Promotoraustausch
Ausgangsstamm war H222-AZ2. Weiterhin wurden ausgehend von H222-AZ2 Stämme konstruiert, in denen sowohl PYC1 als auch das Isocitratlyase kodierende Gen ICL1 simultan überexprimiert vorliegen.
Für die Konstruktion eines Stamms (H222-AZ8), in dem sowohl der SDH2-Promotor gegen den POT1-Promotor ausgetauscht als auch das Pyruvatcarboxylase kodierende Gen PYC1 überexprimiert vorliegen, wurde H222-AZ2 als Ausgangsstamm verwendet. Um diesen für weitere Manipulationen einsetzen zu können, musste in H222-AZ2 eine Uracilauxotrophie erzeugt werden. Die Expressionskassette zum Austausch des SDH2-Promotors wurde so konstruiert, dass das Markergen URA3, das essenziell für die zelleigene Uracilsynthese ist, von den sogenannten lox-sites flankiert wurde. Um dieses Markergen wieder zu entfernen und dadurch den Verlust der Uracilprototrophie zu erreichen, wurde das sogenannte Crelox-System angewendet. Dazu wurde H222-AZ2 mit dem Plasmid pUB4-Cre transformiert, das sowohl ein Gen für die Cre-Rekombinase als auch ein HygromycinB-Resistenz-vermittelndes Gen enthielt. Die Zellen wurden anschließend auf HygromycinB-haltigem Vollmedium und dann auf Minimalmedium mit bzw. ohne Uracil selektiert. Transformanden, in denen es mit Hilfe der Cre-Rekombinase zu einer Rekombination der lox-Sites kam, konnten aufgrund des dadurch verursachten Verlusts von URA3 kein Uracil mehr produzieren und somit nicht mehr auf uracilfreien Medium wachsen.
Aus diesen uracilauxotrophen Transformanden wurde eine Transformande ausgewählt und als H222-AZ2U für die weiteren Arbeiten verwendet. Im Anschluss wurde das integrative multicopy Plasmid p64PYC1, welches das in Y. lipolytica für die Pyruvatcarboxylase kodierende Gen PYC1 mit eigenem Promotor- und Terminatorbereichen sowie das URA3-Allel ura3d4 als multicopy Markergen und rDNA als Integrationssequenz enthielt, mittels Lithiumacetat-Methode (Barth und Gaillardin 1996) in den uracilauxotrophen Stamm H222-AZ2U transformiert. Es erfolgte eine Selektion der uracilprototrophen Transformanden auf uracilfreiem Minimalmedium mit Glucose als C-Quelle. Aus den erhaltenen Transformanden wurden drei ausgewählt und hinsichtlich der multiplen Integration von p64PYC1 mittels PCR und Southern Blot überprüft.
Zum Nachweis der PYC-Aktivität wurden alle drei Transformanden sowie der Wildtyp H222 in Minimalmedium mit Glucose kultiviert. Nach 4 Stunden wurden Zellen geerntet und mechanisch aufgeschlossen. Die Bestimmung der PYC-Aktivität im zellfreien Extrakt erfolgte nach van Urk et al. (1989). Die Kultivierung erfolgte analog zu beschriebenen Kultivierung der Stämme H222-AZ1 bis H222-AZ3.
Für die Konstruktion eines Stamms (H222-AZ9), in dem sowohl der SDH2-Promotor gegen den POT1-Promotor ausgetauscht als auch PYC1 und ICL1 überexprimiert vorliegen, wurde analog zur Konstruktion von H222-AZ8 verfahren und ein uracilauxotropher Abkömmling von H222-AZ2 als Ausgangsstamm verwendet. Das zu transformierende Plasmid p64PIC wurde durch Restriktion und Ligation aus den Plasmiden p64PYC1 und p64ICL1 (Kruse et al. 2004) konstruiert. Dazu wurde das ca. 4,6 kb große SphI-FspAI-Fragment aus p64ICL1 isoliert und in den SphI-FspAI geschnitten Vektor p64PYC1 integriert (3). Das entstandene Plasmid p64PIC hatte eine Größe von 15,4 kb und wurde für die Transformation in der SacII-Schnittstelle linearisiert. Die Integration wurde mittels PCR bzw. Southern Blot verifiziert. Zwei ausgewählte Transformanden wurden hinsichtlich der PYC- und ICL-Aktivität (Tabelle 3) nach Dixon und Kornberg, (1959) überprüft und schließlich in YNB-Medium kultiviert.

Stammlösung Endkonzentration

Tris-HCl, pH 7,0 100 mM 53,3 mM

Cystein-HCl 20 mM 2 mM

MgCl₂ 50 mM 5 mM

D,L-Na-Isocitrat 16,7 mM 1,67 mM

Phenylhydrazin- HCl 33 mM 3,3 mM

Tabelle 3: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes zur Bestimmung der ICL-Aktivität. Das Prinzip des Assays basiert auf der Messung des Anstiegs der Extinktion bei 324 nm resultierend aus der Bildung von Glyoxylat-Phenylhydrazon (ε = 17 L mmol^–1 cm^–1) aus Glyoxylat und Phenylhydrazine.
Zur Charakterisierung wurden drei Transformanden von H222-AZ8 (T3 – T5) sowie zwei Transformanden von H222-AZ9 (T2 + T3) ausgewählt. In allen Transformanden wurde die PYC-Aktivität und in den H222-AZ9 Transformanden wurde zusätzlich die Aktivität der ICL untersucht. In 4 sind die Ergebnisse dieser Aktivitätsmessungen dargestellt. Sowohl alle Transformanden von H222-AZ8 als auch H222-AZ9 zeigten eine gesteigerte PYC-Aktivität (2,6–3,7fach) im Vergleich zum Wildtyp H222. Die Transformanden H222-AZ9 T2 und T3 zeigten darüber hinaus eine 24–25fach Steigerung der ICL-Aktivität verglichen mit H222.
3. Deletion von JEN4
Die Erfinder haben Untersuchungen zur Charakterisierung der durch JEN-Orthologe kodierten Proteine in Y. lipolytica durchgeführt. Diese Untersuchungen lieferten Hinweise auf die Funktionsweise dieser JEN-Genprodukte als Dicarboxylat-Importer mit mehreren spezifischen Substraten. Dabei wurden Stämme konstruiert, in denen einzelne JEN-Gene deletiert wurden. Bei Kultivierung dieser Stämme wurden teilweise, besonders bei der Deletion von JEN4, größere Mengen an extrazellulärem Succinat detektiert.
Dabei wurde in den uracilauxotrophen Yarrowia lipolytica-Stamm H222-AZ2U eine JEN4-Deletionskassette (ca. 4,5 kb) transformiert. Die JEN4-Deletionskassette (5) enthielt die Promotor- und Terminatorregionen von JEN4, dazwischen das von TcR-Sequenzen flankierte URA3 (Hübner 2010). Die Deletionskassette wurde mittels Lithium-Acetat-Methode transformiert. Durch homologe Rekombination in Promotor- und Terminatorregion sollte es zu einer Deletion von JEN4 kommen (5). Zwei uracilprototrophe Transformanden, in denen die Deletion von JEN4 mittels PCR und Southern Blot nachgewiesen wurde, wurden isoliert. Beide Transformanden wurden in YNB kultiviert.

Die beiden untersuchten Transformanden H222-AZ7 T11 und T23 verhielten sich hinsichtlich des Wachstums ähnlich zu H222-AZ2 (3). Beide Transformanden produzierten außerdem mehr Succinat als die Ausgangsstämme H222 und H222-AZ2 (6, Tab. 2).

Stämme	Maximaler Succinatgehalt [g L^–1]	Q [mg L^–1 h^–1]	q [µg OD^–1 h^–1]
H222	3,6 ± 0,4	9,8 ± 0,6	0,60 ± 0,01
AZ2	15,0 ± 4,0	31,8 ± 7,9	2,50 ± 0,68
AZ7 T11	21,1 ± 0,4	50,7 ± 2,2	3,00 ± 0,09
AZ7 T23	20,8 ± 1,1	54,7 ± 13,3	3,06 ± 0,07

Tabelle 4: Maximale Succinatgehalte, volumenspezifische und biomassespezifische Produktbildungsrate der Stämme H222, H222-AZ7 T11 und T23 in YNB-Medium. Kultivierung in YNB-Medium mit 5 % Glycerol als C-Quelle.

4. Überexpression von PYC1
Für die Überexpression der Pyruvatcarboxylase (PYC) in Y. lipolytica wurde das integrative multicopy Plasmid p64PYC durch Integration des PCR-amplifizierten ORFs des entsprechenden Gens zusammen mit den eigenen Promotor- und Terminatorregionen von ca. 1 kb in den Empfängervektor p64T konstruiert.
Die Pyruvatcarboxylase wird in Y. lipolytica durch ein Gen (PYC1) kodiert (Flores und Gancedo 2005). Da der Bereich, des ORFs von PYC1 (3844 bp) gemeinsam mit den zugehörigen jeweils 1 kb großen Promotor- und 0,3 kb großen Terminatorbereich eine Größe von 5149 bp umfasste, wurde diese Expressionskassette in zwei Schritten amplifiziert, um das Einbringen von eventuellen Sequenzfehlern durch die Polymerase zu verringern. Die Oligonukleotide PYCa_for und PYCa_rev amplifizierten den 2442 bp großen Bereich, welcher den 1 kb großen Promotorbereich und einen Teil des ORFs von PYC1 beinhaltete. Der 2822 bp große Bereich, des restlichen ORFs von PYC1 gemeinsam mit dem 300 bp großen Terminatorbereich, wurde durch die Oligonukleotide PYCb_for und PYCb_rev amplifiziert. Für die vereinfachte Integration in den Expressionsvektor p64T wurden durch die Oligonukleotide PYCa_for eine PaeI und durch PYCb_rev eine BglII-Schnittstelle angefügt, außerdem wurde die in dem ORF enthaltene BglII Schnittstelle für die Vektorintegration und die Fusion der zwei Fragmente genutzt. Das 2442 bp große PYCa-Fragment (Promotorbereich mit einem Teil des PYC-ORFs) wurde mit PaeI und BglII verdaut und in den ebenfalls mit PaeI und BglII verdauten p64T Vektor kloniert. Der entstandene p64PYC1a Vektor wurde sequenziert. Die Sequenzierung des Plasmides des Klons T22 ergab einen fehlerfreien PYC1-ORF und für das Plasmid des Klons T97 wurde ein fehlerfreier Promotorbereich nachgewiesen. Ein fehlerfreier p64PYC1a Vektor wurde durch die Integration des fehlerfreien PaeI-BamHI-Promotorbereiches aus p64PYC1a von dem Klon T97 in den mit PaeI und BamHI verdauten p64PYC1a Vektor von dem Klon T22 erzielt. In den resultierenden p64PYC1a Vektor wurde das BglII-PYCb-Fragment (Teil des PYC1-ORFs und der Terminatorbereich) kloniert und anschließend sequenziert. Es wurde der Vektor p64PYC1 erhalten, der eine fehlerfreie Expressionskassette (pPYC1-PYC1-PYC1t) für die Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens enthielt. Für die Transformation in die Y. lipolytica Stämme H222-S4 und H222-AK7 (Δscs2) wurde dieser Vektor mit SacII linearisiert.
Die Integration der Expressionskassette in den erhaltenen Transformanden H222-AK1 wurde mittels Southern Hybridisierung überprüft ( ). Für den Elternstamm H222-S4 wurde eine dem genomischen PYC1-ORF entsprechende Bande bei 8,9 kb nachgewiesen. Die zusätzlich detektierte Bande bei 6,2 kb in den Transformanden diente als Nachweis für die Integration des multicopy Vektors p64PYC1. Diese Banden wiesen gegenüber der genomischen Bande des Vergleichsstammes H222-S4 eine verstärkte Intensität auf, wodurch eine mehrfache Integration der entsprechenden Expressionskassette bestätigt wurde. Die Transformanden H222-AK1-2, H222-AK1-5 und H222-AK1-7 wurden aufgrund ihrer hohen Vektorbandenintensitäten für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Der Gen-Dosis-Effekt auf die Pyruvatcarboxylase Aktivität wurde in den Stämmen H222-AK1-2, H222-AK1-5 und H222-AK1-7 untersucht.

Für die Bestimmung der PYC-Aktivität wurden alle ausgewählten Transformanden in 100 ml Minimalmedium mit 1 % Glucose kultiviert. Nach Ernte einer Probe der Kultur wurden die Hefezellen mittels Glasperlen aufgeschlossen. Die Bestimmung der PYC-Aktivität erfolgte im zellfreien Extrakt nach der Methode von van Urk et al. (1989). Die Zusammensetzung des Reaktionansatzes ist in folgender Tabelle aufgelistet. Die photometrische Messung erfolgte bei 340 nm.

	Stammlösung	Endkonzentration
Tris-HCl, pH 7,8	1 M	100 mM
MgSO₄	100 mM	6,7 mM
KHCO₃	400 mM	40 mM
Pyrazol	15 mM	1,5 mM
NADH	1,5 mM	0,15 mM
Acetyl-CoA	10 mM	90 µM
Pyruvat	100 mM	10 mM
Malat-DH	6 U µl^–1	6 U
ATP	33 mM	3,3 mM

Die erhöhte Gen-Dosis des PYC kodierenden Gens zeigte einen positiven Effekt auf die spezifischen PYC-Aktivitäten der untersuchten Stämme. Die spezifischen Aktivitäten für die Transformanden H222-AK1-2 und H222-AK1-7 erreichten ein Maximum nach 6 h. Im Gegensatz dazu wurde für die Transformande H222-AK1-5 sowie für den Wildtyp H222 kein erkennbares Maximum der spezifischen Enzymaktivität nachgewiesen. Die Transformanden H222-AK1-2 und H222-AK1-7 zeigten mit 0,48 ± 0,04 U/mg und mit 0,51 ± 0,02 U/mg die höchste spezifische PYC Aktivitäten im Vergleich zu den weiteren untersuchten Stämmen, deren Enzymaktivitäten bei 0,42 ± 0,1 U/mg (H222-AK1-5) und bei 0,16 ± 0,06 U/mg (H222) bestimmt wurden. Der Stamm H222-AK1-7 zeigte neben der höchsten spezifischen Aktivität ein mit dem Wildtyp vergleichbares Wachstum und wurde somit für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Diese Transformande H222-AK1-7 wird im Folgenden als Transformande H222-AK1 (= H222-AM3) bezeichnet.
Im Vergleich zum Wildtypstamm H222 zeigte der Stamm mit erhöhter PYC-Aktivität moderate Unterschiede hinsichtlich Wachstums- und Produktionsverhalten. Der Wildtyp H222 produzierte maximal 3,3 ± 0,02 g L^–1 Succinat mit einer durchschnittlichen Produktivität von 5,4 ± 0,6 mg L^–1 h^–1. Für H222-AM3 konnten leicht erhöhte Succinatmengen von 4,1 ± 0,1 g L^–1 detektiert werden.
5. Kombination von JEN4-Deletion mit Überexpression von PYC1
Da sowohl Überexpression von PYC1 als auch die Deletion von JEN4 ausgehend von H222-AZ2 (mit SDH2-Promotoraustausch) zu einer gesteigerten Succinatproduktion führten, wurden Stämme für die Succinatproduktion konstruiert, in denen diese drei Modifikationen kombiniert enthalten sind.
Die Konstruktion dieses neuen Stamms (H222-AZ10) erfolgte ausgehend von H222-AZ7 (ΔJEN4). Dazu wurde in H222-AZ7 mittels FOA-Seletion eine Uracilauxotrophie eingeführt. Die Strategie ist in 7 dargestellt. FOA (5’-Fluororotsäure) wird durch die Oritidin-5’-Phosphat-Decarboxylase, die durch URA3 kodiert wird, zu 5-Fluoruracil umgesetzt. 5-Fluoruracil ist toxisch für die Zelle. Daher können in Anwesenheit von FOA nur Zellen wachsen, in denen kein URA3 vorhanden ist bzw. in denen URA3 durch Rekombination der flankierenden TcR-Sequenzen entfernt wurde. Dazu wurden 10³ Zellen von H222-AZ7 auf FOA- und uracilhaltigem Minimalmedium mit Glucose ausgestrichen und die erhaltenen Kolonien mittels Stempeltest auf Uracilauxotrophie überprüft. Der Verlust des URA3 wurde außerdem mittels PCR nachgewiesen. Aus den getesteten Kolonien wurde eine uracilauxotrophe ausgewählt (H222-AZ7U) und mit dem integrativen PYC1 multicopy Vektor p64PYC1 transformiert. Nach ein bis zwei Wochen wurden Transformanden isoliert, die mittels PCR auf die Integration des Vektors überprüft wurden. Alle getesteten Transformanden waren positiv. Aus diesen positiven Transformanden wurden 3 ausgewählt und hinsichtlich der PYC-Aktivität getestet. Dazu wurden diese 3 Transformanden sowie der Wildtyp in Minimalmedium mit Glucose kultiviert. Nach 4 Stunden wurde eine Probe für die Bestimmung der PYC-Aktivität genommen und die Aktivität der Pyruvatcarboxylase bestimmt. Drei ausgewählte Transformanden wurden hinsichtlich der PYC-Aktivität und Succinatproduktion untersucht. Die Ergebnisse der Aktivitätsmessungen sind in 8 dargestellt. Alle Transformanden zeigen eine im Vergleich zum Wildtyp zwei- bis dreifach gesteigerte PYC-Aktivität.
Die drei getesteten Transformanden wurden in YNB-Medium kultiviert, um die Auswirkungen auf die Succinatproduktion zu untersuchen.

In 9 sind Wachstumsverhalten und Succinatproduktion von H222 (Wildtyp) und den neuen Transformanden H222-AZ10 T1, T5 und T9 dargestellt. Als Vergleich wurden außerdem die Stämme H222-AZ7 T11 und H222-AZ 8 T3 mitgeführt. Die Durchschnittswerte aus allen durchgeführten Versuchen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.

Stämme	Succinat [g L^–1]	Q [mg L^–1 h^–1]
H222	3,0 ± 0,0	6,0 ± 0,1
AZ10 T1	16,8 ± 1,0	34,8 ± 3,1
AZ10 T5	17,7 ± 1,3	36,1 ± 3,4
AZ10 T9	18,3 ± 1,3	36,8 ± 4,4
AZ8 T3	19,3 ± 0,9	45,5 ± 2,7
AZ7 T11	13,2 ± 2,4	36,6 ± 10,5

Tabelle 5: Durchschnittliche maximale Succinatgehalte, volumenspezifische Produktivitäten und biomassespezifische Produktbildungsraten der Stämme H222 (Wildtyp), H222-AZ10 T1, T5, T9, H222-AZ8 T3 und H222-AZ7 T11. Kultivierung in Schüttelkolben bei 28°C, 220 rpm in 150 ml YNB-Medium mit 5% Glycerol als C-Quelle (+3% nach 168h) in zwei Versuchsdurchläufen.

Zusätzlich zur Succinatproduktion wurde auch das Nebenproduktspektrum aus den organischen Säuren Malat, AKG und Fumarat betrachtet. Alle veränderten Stämme zeigten allerdings im Vergleich zum Wildtyp deutlich reduzierte Gehalte an Malat, AKG und Fumarat (Tab. 6).

	MA_max [g L^–1]	AKG_max [g L^–1]	FA_max [g L^–1]
H222	7,5 ± 2,1	2,0 ± 0,7	2,8 ± 0,2
AZ10 T1	3,2 ± 0,1	1,7 ± 0,1	1,7 ± 0,1
AZ10 T5	1,3 ± 0,0	1,3 ± 0,2	1,3 ± 0,1
AZ10 T9	1,5 ± 0,0	1,2 ± 0,0	1,3 ± 0,1

Tabelle 6: Maximal gebildete Produktmengen der organischen Säuren Malat (MA), α-Ketoglutarat (AKG) und Fumarat (FA) bei Kultivierung der Stämme Y. lipolytica H222, H222-AZ10 T1, T5 und T9 in YNB-Medium. Kultivierung in YNB-Medium mit 5 % Glycerol als C-Quelle.

6. Deletion von MAE1
In ähnlicher Weise wie oben beschrieben wurde in Yarrowia lipolytica das Gen des Carboxylat-Transporter Mae1 deletiert. Die verwendeten Deletionskassetten und Plasmide finden sich in der eingangs gezeigten Tabelle. Im Deletionsstamm H222-SW2ΔMAE1 erfolgte die Deletion des SpMAE1-homologen Gens MAE1, codierend für einen putativen Dicarboxylat-Transporter. Bei den Kultivierungen der H222-SW2ΔMAE1-Transformanden 3, 7 und 8 wurden die akkumulierten organischen Säuren α-Ketoglutarat, Fumarat, Malat, Pyruvat und Succinat im Vergleich zum Ausgangsstamm H222 untersucht. Ergänzend erfolgte weiterhin während der Kultivierung die Bestimmung gebildeter Biotrockemassen.
Die gebildete Biotrockenmasse der ΔMAE1-Transformanden bei Kultivierung in 10 % Glycerol war im Vergleich zum Referenzstamm H222 um 40 % geringer, zeigte aber im Vergleich der Transformanden untereinander kaum Unterschiede. Dieser deutliche Unterschied im Wachstum kann aus einer reduzierten Aufnahme der Tricarbonsäurezyklus-Intermediate α-Ketoglutarat, Fumarat, Malat und Succinat resultieren, welche Edukte vieler Biosynthesen, wie etwa für Amino- oder Fettsäuren darstellen. Bei Betrachtung der Säureproduktion wiesen alle Transformanten eine Erhöhung der Produktion der untersuchten organischen Säuren α-Ketoglutarat, Fumarat, Malat und Succinat auf. Durchschnittlich wurden dabei maximal 30 % mehr AKG, Fumarat und Succinat, sowie 40 % mehr Malat (TF7 nur 10 %) gebildet. Die Resultate finden sich in Tabelle 7. Dargestellt sind die Mittelwerte der maximale Mengen an Malat-, Succinat-, α-Ketoglutarat und Fumarat der Transformanden 3, 7, 8 von H222-SW2ΔMAE1 verglichen mit Referenzstamm H222 bei Kultivierung in Produktionsmedium nach Tabuchi et al. (1981). SA ΔMAE1 = Standardabweichung der Maximalwerte der 3 Transformanden:

Organische Säuren in g L^–1

Stamm α-Ketoglutarat Fumarat Malat Succinat

H222 8,7 3,6 4,8 2,9

ΔMAE1 12,2 4,7 6,4 4,0

SA ΔMAE1 0,31 0,05 0,70 0,17
LITERATUR

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Zitierte Patentliteratur

US 20110104771 [0010]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Urk et al. (1989) [0077]
Urk et al. (1989) [0087]
Tabuchi et al. (1981) [0096]

Claims

Pilzstamm, aufweisend mindestens eine genetische Modifikation die zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt.
Pilzstamm gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Pilz eine erhöhte extrazelluläre Carbonsäureproduktion aufweist.
Verfahren zur genetischen Modifikation eines Pilzstamms zwecks Erhöhung der extrazellulären Carbonsäureproduktion, wobei besagtes Verfahren zu einer Verminderung der Aktivität mindestens eines pilzeigenen Carbonsäure-Transporters führt.
Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Verminderung der Aktivität des Carbonsäure-Transporters erreicht wird durch mindestens eine Eigenschaft bzw. einen Schritt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: a) Inhibierung oder Verminderung der Expression eines Gens codierend für einen Carbonsäure-Transporter b) Expression eines dysfunktionalen oder vermindert aktiven Carbonsäure-Transporters c) Inhibierung oder Verminderung der Aktivität des exprimierten Carbonsäure-Transporters bewerkstelligt ist bzw. wird.
Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem Pilzstamm um ein Mitglied der Gruppe der Schlauchpilze (Ascomycota) handelt.
Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei besagter Pilzstamm einer Gattung zugehört, die ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Saccharomyces; Schizosaccharomyces; Wickerhamia; Debayomyces; Hansenula; Hanseniospora; Pichia; Kloeckera; Candida; Zygosaccharomyces; Ogataea; Kuraishia; Komagataella; Yarrowia; Metschnikowia; Williopsis; Nakazawaea; Kluyveromyces; Cryptococcus; Torulaspora; Torulopsis; Bullera; Rhodotorula; Sporobolomyces; Pseudozyma; Saccharomycopsis; Saccharomycodes; Aspergillus; Penicillium; Rhizopus; Trichosporon und/oder Trichoderma.
Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei der mindestens eine Carbonsäure-Transporter aus der Gruppe der Jen-Transporter und/oder der Mae-Transporter entstammt.
Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei besagter Pilzstamm mindestens eine weitere genetische Modifikation ausgewählt aus der Gruppe enthaltend – Reduktion der Aktivität bzw. Expression der Succinatdehydrogenase (SDH), beispielsweise durch Austausch des nativen Promotors von SDH2 gegen einen induzierbaren Promotor, beispielsweise pPOT1 oder durch Verwendung einer geeigneten Deletionskassette, – Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Pyruvatcarboxylase (PYC), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens PYC1, und/oder – Steigerung der Aktivität bzw. Expression der Isocitratlyase (ICL), beispielsweise durch Überexpression des korrespondierenden Gens ICL1 aufweist.
Pilzstamm bzw. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei besagter Pilzstammstamm der Art Yarrowia lipolytica zugehört.
Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren, wobei in dem Verfahren ein Pilzstamm gemäß einem der vorherigen Ansprüche verwendet wird.