DE10333144A1

DE10333144A1 - Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Citronensäure mit einer genetisch veränderten Hefe Yarrowia lipolytica

Info

Publication number: DE10333144A1
Application number: DE10333144A
Authority: DE
Inventors: Kordula Kruse; André Foerster; Thomas Dr. Juretzek; Stephan Dr. Mauersberger; Gerold Prof. Barth
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2002-07-16
Filing date: 2003-07-16
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2023-07-17
Also published as: RU2005102929A; DE10333144B4; WO2004009828A1; CN1723286A; AU2003258457A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Citronensäure mit einer genetisch veränderten Hefe Yarrowia lipolytica. DOLLAR A Dabei wird eine für die Isocitratlyase-Aktivität kodierende Gensequenz mehrfach in das Hefegenom stabil integriert. Vorteilhaft wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren das unerwünschte Nebenprodukt Isocitronensäure deutlich vermindert gebildet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Citronensäure (CS) mit einer genetisch veränderten Hefe Yarrowia lipolytica (Y. lipolytica)

Citronensäure wird gegenwärtig zu 99% auf biotechnologischen Weg unter Verwendung ausgewählter Stämme des Ascomyceten Aspergillus niger großtechnisch hergestellt. Als Kohlenstoff-Quelle (C-Quelle) werden insbesondere Melasse und andere zuckerhaltige landwirtschaftliche Abfallprodukte verwendet. Bei diesem Verfahren kommt es jedoch auch zur Bildung von signifikanten Mengen an flüssigen und festen Abfallprodukten. Die in kristalliner Form vertriebene Citronensäure wird in großem Umfang in verschiedenen Industriezweigen, vorwiegend jedoch in der Lebensmittelindustrie und der pharmazeutischen Industrie als Geschmacksträger, Konservierungsmittel, Säuerungsmittel und Antioxidationsmittel eingesetzt (Roehr et al. 1996, Citric acid, Biotechnology Vol 6, Rehm and Reed, eds).

Interessant ist ein alternatives Produktionsverfahren für Citronensäure mit der Hefe Y. lipolytica, mit dem aufgrund der Eigenschaften dieser Hefe eine Reihe hydrophober Substrate, wie pflanzliche und tierische Öle und Fette oder n-Alkane, als C-Quelle verwertet werden können. Bereits seit Mitte der 60er Jahre ist bekannt, dass Y. lipolytica unter spezifischen Bedingungen in der Lage ist, Citronensäure (CS) und Isocitronensäure (ICS), sowie andere Metabolite des Intermediärstoffwechsels wie Pyruvat und a-Ketoglutarat, zu sekretieren. Die entsprechenden Kultivierungsbedingungen wurden seitdem umfassend untersucht. Wichtigste Voraussetzung für eine Überproduktion und Ausscheidung dieser Metabolite ist eine Wachstumslimitation der Produktionskultur bei gleichzeitigem Überschuss an verwertbarer C-Quelle (Stottmeister et al. 1982, Z Allg Mikrobiol 22: 399–424). Die Wachstumslimitation der Kultur wird dabei durch Begrenzung notwendiger Nährmediumsbestandteile wie z. B. Mineralstoffe, Vitamine und Aminosäuren erzielt. Die Art der gebildeten Metabolite richtet sich nach der limitierenden Nährstoffkomponente und weiteren Kultivierungsbedingungen, wie der eingesetzten C-Quelle oder dem pH-Wert des Produktionsmediums.

Die Überproduktion von Citronen- und Isocitronensäure kann durch Stickstoff-, Phosphor-, Schwefel- oder Magnesiummangel hervorgerufen werden (Stottmeister et al. 1982, Z Allg Mikrobiol 22: 399–424). Bei auxotrophen Stämmen ist die CS/ICS-Bildung zudem durch Aminosäuremangel induzierbar (Barth und Krebs 1984, DD 227 448 A1). Eine Wachstumslimitation durch Mangel an Thiamin, welches von Y. lipolytica nicht selbst gebildet wird, initiiert hingegen die Bildung von 2-Ketoglutarsäure und Pyruvat (Weissbrodt et al. 1988, DD 267999A1, Chernyavskaya et al. 2000, Appl Microbiol Biotechnol 53: 152–158).

Bei einem industriellen Prozess der Citronensäureproduktion ist die gleichzeitige Bildung von mehr als 10% Isocitronensäure bezogen auf den Gesamtsäuregehalt (CS+ICS) unerwünscht, da dies die Produktaufarbeitung, insbesondere die Kristallisation der CS, erschwert.

Das Produktverhältnis CS/ICS und die Produktausbeute sind bei Wildtypstämmen von Y. lipolytica abhängig von den eingesetzten C-Quellen. Auf Glucose und Glycerol bildet Y. lipolytica etwa 90% CS und 10% ICS (Treton et al. 1978, Appl Microbiol Biotechnol 6: 67–77). Bei Verwendung von Ethanol als C-Quelle wurden ähnliche Produktverhältnisse gefunden (Arzumanov et al. 2000, Appl Microbiol Biotechnol 53: 525–529). Auf den für eine industrielle Anwendung interessanten hydrophoben Substraten wie pflanzlichen Ölen oder n-Alkanen verschiebt sich das Produktverhältnis auf einen ICS-Anteil von 40 bis 50% (Übersichten bei Stottmeister et al. 1982, Z Allg Mikrobiol 22: 399–424, und Finogenova 1991, In: Alkane metabolism and oversynthesis of metabolites by microorganisms, Finogenova TV and Sharyshev AA, eds, Center for Biological Research, USSR Academy of Science, Pushchino, Russia, pp 96–114). Die Reduzierung dieses hohen ICS-Anteils ist ein maßgeblicher Kostenfaktor für eine industrielle Citronensäureproduktion mit Y. lipolytica.

Aus diesem Grund gab es zahlreiche Bemühungen, spontan auftretende oder durch chemische oder UV-Mutagenese erzeugte Mutanten von Y. lipolytica zu selektieren, die eine Verschiebung des Produktverhältnisses CS/ICS aufweisen. Bei der weiteren Untersuchung solcher Mutanten wurden verschiedene Veränderungen in der Expression und Regulation von Enzymen des Citronensäure- und Glyoxylatzyklus gefunden. Im wesentlichen konzentrierten sich diese Untersuchungen auf die Aconitase (ACO), die Isocitratlyase (ICL) und die Isocitratdehydrogenasen (NAD(P)-IDH).

Von Akiyama et al. (1972, Agric Biol Chem 36: 339–341) wurde gezeigt, dass durch chemische Mutagenese erzeugte Mutanten mit gegenüber Wildtypstämmen erhöhter ACO-Aktivität eine Verschiebung des Produktverhältnisses CS/ICS zugunsten der ICS aufweisen. In Arbeiten von Finogenova et al. (Finogenova 1991, In: Alkane metabolism and oversynthesis of metabolites by microorganisms, Finogenova TV and Sharyshev AA, eds, Center for Biological Research, USSR Academy of Science, Pushchino, Russia, pp 96–114) wurde dargestellt, dass Mutanten mit gegenüber dem Wildtyp erhöhter und reduzierter ICS-Akkumulation eine Reihe von Veränderungen in den spezifischen Aktivitäten von Enzymen des Citronensäure- und Glyoxylatzyklus zeigten. Weitere Erkenntnisse stammen aus der gezielten Veränderung spezifischer Enzymaktivitäten durch definierte Kultivierungsbedingungen. So wiesen Hattori et al. (1974, Hakko Kogatku Zasshi 52: 542–550) nach, dass infolge Absenkung der spezifischen Aktivität der Aconitase und der NADP-abhängigen Isocitratdehydrogenase durch pH-Regulation mittels Ammoniak bei Kultivierung auf Paraffin eine Verschiebung des Produktverhältnisses zugunsten der CS auftrat.

Obwohl zahlreiche Anhaltspunkte für die Beeinflussung des Produktspektrums durch die Enzyme des Citronensäure- und Glyoxylatzyklus vorliegen, sind die biochemischen und molekularbiologischen Zusammenhänge bis heute nicht vollständig geklärt. Mit den bisher bekannten Methoden ist eine gezielte Herstellung leistungsfähiger Produktionsstämme für die CS-Produktion mit geringer ICS-Akkumulation nicht möglich.

Aufgrund intensiver molekularbiologischer Forschung an der Hefe Y. lipolytica in den letzten zwei Jahrzehnten stehen heute alle notwendigen Methoden für eine genotypische Stammoptimierung zur Verfügung (Barth und Gaillardin 1997, FEMS Microbiol Rev 19: 219–237). Zahlreiche Gene, die an der Verwertung hydrophober Substrate beteiligt sind, wurden bereits charakterisiert und kloniert. Von den oben genannten Enzymen des Glyoxylatzyklus wurde bisher eine Sequenz des Strukturgens der Isocitratlyase (ICL1) beschrieben und kloniert (Barth und Scheuber 1993, Mol Gen Genet 241: 422–430). Der starke und gut regulierbare Promotor dieses Gens wurde bereits mehrfach zur heterologen Expression von Proteinen in Y. lipolytica genutzt (Juretzek et al. 1995, DE19525282, Juretzek et al. 1998, DE 19932811 , WO0003008).

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure mit der Hefe Y. lipolytica zu entwickeln, bei dem deutlich weniger Isocitronensäure anfällt und mit dem eine wirtschaftlich effiziente Citronensäureproduktion mit der Hefe Y. lipolytica ermöglicht wird.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Citronensäure in Hefezellen von Yarrowia lipolytica umfassend die Schritte:

a) Transformation von Hefezellen, welche einen Defekt in einem für ihr Wachstum wichtigen Gen tragen, mit einem für die mehrfache genomische Integration geeigneten Vektor, der einen als Selektionsmarker wirkendes Gen enthält, das oben genannten Defekt kompensieren kann,
b) Kultivierung der Hefe unter Mangelbedingungen und einer Kohlenstoffquelle,
c) Reinigung der Citronensäure, wobei der Vektor eine Expressionskassette mit einer für Isocitratlyaseaktivität codierenden Gensequenz enthält und Klone in einem geeigneten Nährmedium selektiert werden, die mehrere Kopien einer für die Isocitratlyaseaktivität codierenden Gensequenz und des Selektionsmarkers stabil in ihr Genom integriert haben.

Die mehrfache Integration eines für die Isocitratlyaseaktivität codierenden Gens in das Hefegenom wird durch die Transformation mit speziellen multicopy Plasmidvektoren und anschließendem Selektionsdruck erreicht. Dazu wird in einen Vektor, der einen multicopy Selektionsmarker enthält, ein für eine Isocitratlyaseaktivität (ICL-Aktivität) codierende Gensequenz einkloniert und der Vektor in einen zum Selektionsmarker passenden Y. lipolytica Stamm transformiert.

Vorzugsweise wird dazu eine Gensequenz in den Vektor einkloniert, die für ein Protein gemäß SEQ ID No. 1 codiert. Das erfindungsgemäße ICL-Protein gemäß SEQ ID No. 1 unterscheidet sich in seiner Sequenz signifikant zu der aus Barth und Scheuber 1993, Mol Gen Genet 241: 422–430 bekannten Sequenz.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Expressionskassette gemäß SEQ ID No. 2 in den Vektor einkloniert. Dabei enthält die Expressionskassette gemäß SEQ ID No. 2 eine Gensequenz, die für das erfindungsgemäße Protein gemäß SEQ ID No. 1 codiert.

Geeignete Vektoren und Y. lipolytica Stämme sind dem Fachmann bekannt und zugänglich. Diese Vektoren enthalten neben dem Selektionsmarker, wie beispielsweise allele Varianten des URA3-Gens, eine homologe Transformationsplattform, wie den Sequenzbereich der ribosomalen DNA (rDNA) oder die zeta genannte LTR-Sequenz (long terminal repeat) des Retrotransposons Ylt1 aus Y. lipolytica. Eine solche Transformationsplattform ermöglicht eine Integration durch homologe Rekombination mit häufig vorhandenen Sequenzen im Hefegenom (Juretzek et al. 2001, Yeast 18: 97–113).

Die integrative Transformation erfolgt mit den linearisierten Vektoren unter Verwendung der Lithium-Acetat-Methode (modifiziert nach Barth und Gaillardin 1996, Yarrowia lipolytica. In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp 313–388).

Transformiert wird in einen zum Markergen passenden Y. lipolytica Stamm. Im Falle eines URA3-Allels als Selektionsmarker, ist dies beispielsweise ein Y. lipolytica Stamm, in dem das URA3-Gen defekt ist. Y. lipolytica Stämme mit defektem URA3-Gen und Methoden zu Ihrer Herstellung sind in der Literatur beschrieben (Barth und Gaillardin 1996, Yarrowia lipolytica. In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp 313–388).

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht vor allem darin, dass leistungsfähige Y. lipolytica Stämme für die Citronensäureproduktion mit verringerter Isocitronensäurebildung einfach und gezielt hergestellt werden können.

Vorzugsweise enthält der verwendete Vektor eine Expressionskassette gemäss SEQ ID No. 2.

In Ausführungsbeispiel 1 wird dazu beispielhaft die Transformation der Vektoren p64ICL1 und p67ICL1 in den Y. lipolytica Stamm H222-S4 (ura3-302) mit einem Defekt im URA3-Gen beschrieben. Die Plasmide p64ICL1 und p67ICL1 enthalten ein im Promoterbereich verkürztes Allel des URA3-Gens, ura3d4, als Selektionsmarker. Durch die Verkürzung des Promoterbereichs im ura3d4-Allel wird eine mehrfache Integration von ura3d4 in das, Hefegenom notwendig, um den Defekt im URA3-Gen zu kompensieren. Plasmide mit anderen multicopy Selektionsmarkern, wie z. B. von entsprechenden allelen Varianten des LEU2-Gens und entsprechende Y. lipolytica Stämme können auch verwendet werden.

Die Expression des Genproduktes Isocitratlyase wird in Y. lipolytica Stämmen, die das ICL1-Gen mehrfach in ihr Genom integriert haben, deutlich erhöht. Gleichzeitig wird eine stabile Zunahme der spezifischen Isocitratlyaseaktivität erzielt. Überraschenderweise wird weder die erhöhte ICL1-Expression, noch die Isocitratlyaseaktivität durch transkriptionelle, posttranslationale und metabolische Gegenregulationsmechanismen aufgehoben (s. Ausführungsbeispiel 2).

Zur Herstellung von Citronensäure werden die erfindungsgemäßen Y. lipolytica Stämme, die das ICL1-Gen mehrfach in ihr Genom integriert haben, unter Mangelbedingungen, die zu einer Überproduktion von CS und ICS führen, kultiviert, wie beispielsweise unter Stickstoff-, Phosphor-, Schwefel-, Magnesium- oder bei Verwendung auxotropher Stämme durch Aminosäuremangel.

Vorteilhaft muss durch die stabile Integration des ICL1-Gens in das Hefegenom der erfindungsgemäßen Stämme bei der Citronensäureproduktion kein weiterer Selektionsdruck mit kostenintensiven Chemikalien ausgeübt werden. Die erfindungsgemäß hergestellten Stämme können zur Citronensäureproduktion daher problemlos in großvolumigen Bioreaktoren (Fermentern) verwendet werden.

Ein wichtiger wirtschaftlicher Vorteil des erfindungsgemäßen, Verfahrens besteht darin, dass die verwendeten Y. lipolytica Stämme für die Citronensäureproduktion eine Vielzahl verschiedener C-Quellen wie z.B. Glucose, Glycerol, Ethanol, n-Alkane, pflanzliche oder tierische Öle bzw. Fette nutzen können. Mit allen genannten Substraten resultiert das erfindungsgemäße Verfahren in einer deutlich verringerten Akkumulation der nicht gewünschten Isocitronensäure im Vergleich zu Wildtypstämmen. Überraschend ergibt sich somit bei der Herstellung von Citronensäure mit Y. lipolytica Stämmen, die das ICL1-Gen mehrfach in ihr Genom integriert haben, eine deutliche Verschiebung des Produktverhältnisses CS/ICS zugunsten der Citronensäure (s. Ausführungsbeispiel 3).

Durch den erheblich verminderten Anteil an Isocitronensäure wird die anschließende Reinigung der Citronensäure stark vereinfacht. Letztere geschieht nach bekannten Methoden, wie beispielsweise durch Ausfällen oder chromatographische Verfahren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die in dem Ausführungsbeispiel 1 verwendete Expressionskassette gemäss SEQ ID No. 2.

Gegenstand der Erfindung sind auch Vektoren, welche die Expressionskassette gemäss SEQ ID No. 2 enthalten, bevorzugt die Vektoren p64ICL1 oder p67ICL1 deren Sequenzen der SEQ ID No. 3 bzw. SEQ ID No. 4 entsprechen. Des weiteren ist Gegenstand der Erfindung ein Stamm von Y. lipolytica, der mehrere Kopien einer für eine Isocitratlyaseaktivität codierenden Gensequenz stabil in sein Genom integriert hat, bevorzugt die Sequenz gemäss SEQ ID No.2.

Bevorzugt sind auch die Stämme von Y. lipolytica, die mit einem der Vektoren p64ICL1 oder p67ICL1 transformiert sind. Des weiteren bevorzugt ist der Stamm von Y. lipolytica H222-S4(p64ICL1) T1 mit der Hinterlegungsnummer DSM 15105 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig gemäss dem Budapester Vertrag hinterlegt.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Stammes von Y. lipolytica zur Herstellung von Citronensäure.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
In diesen Beispielen werden folgende Hefestämme und Vektoren verwendet: Wildtyp- und Laborstämme für die Transformation von Yarrowia lipolytica

– H222 (MATA): Wildtypstamm (Mauersberger et al. 2001, J Bacteriol 183: 5102–5109).
– H222-S4 (MATA ura3-302): Herstellung durch Genzerstörung des URA3-Gens in H222 infolge Insertion des SUC2-Gens aus Saccharomyces cerevisiae durch integrative Transformation mit einem 4,3 kb Sall aus dem Plasmid pINA302 (Mauersberger et al. 2001, J Bacteriol 183: 5102–5109). Dieser Stamm enthält, wie H222, keine freien zeta Elemente bzw. kein intaktes YIt1 (Juretzek et al. 2001, Yeast 18: 97–113).
– E129L1 (MATA lys11-23 ura3-302 xpr2-322): Herstellung durch Komplementation der Leucin-Auxotrophie aus dem Laborstamm E129 (MATA lys 11-23 leu2-270 ura3-302 xpr2-322) mit dem Plasmid pINA62 (Barth und Gaillardin 1996, Yarrowia lipolytica. In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp 313–388).

Die in den Ausführungsbeispielen verwendeten Stämme entstammen der Stammsammlung des Institutes für Mikrobiologie an der TU Dresden.
Ausführungsbeispiel 1
Multiple Integration des ICL1-Gens in Yarrowia lipolytica
Integrative Vektoren für die multicopy Transformation von Yarrowia lipolytica
Für die multiple Integration des ICL1-Genes in das Hefegenom wurden die multicopy Vektoren p64ICL1 und p67ICL1 (1, SEQ ID No. 3 und 4) auf der Grundlage der Plasmide p64IP und p67IP für die heterologe Expression von Proteinen unter Kontrolle des ICL1-Promotors in Y. lipolytica (Juretzek et al. 2001, Yeast 18: 97–113) konstruiert. Die verwendeten Ausgangsvektoren p64IP und p67IP enthalten ein ICL1-Promotorfragment aus Y. lipolytica. Als multicopy Selektionsmarker wurde das ura3d4-Allel des URA3-Gens von Y. lipolytica eingesetzt. Diese Markensequenz ermöglicht die multicopy Transformation von Y. lipolytica Stämmen mit einem Defekt im URA3-Gen (Ura). Als homologe Transformationsplattform tragen die Vektoren die rDNA Sequenz (p64IP) bzw. die als zeta bezeichnete long terminal repeat (LTR) Sequenz des Retrotransposons YIt1 aus Y. lipolytica (p67IP). Im Gegensatz zur rDNA tritt zeta nicht in allen Y. lipolytica Stämmen auf, so dass die Vektoren p67IP bzw. p67ICL1 für die Transformation zeta freier Stämme mit deutlich geringerer Transformationseffizienz einsetzbar sind.
In die Vektoren p64IP bzw. p67IP wurde das 2,3 kb BamHI Fragment des ICL1-Strukturgens eingesetzt. Die so erhaltenen Vektoren p64ICL1 und p67ICL1 (1) enthalten damit als Expressionskassette das vollständige ICL1-Gen (gemäß Seq ID No. 2).
Multiple Integration des ICL1-Gens in Yarrowia lipolytica Für die Amplifikation der Integrationsvektoren wurde der E. coli Stamm DH5ac verwendet. Die E. coli Zellen wurden dazu in LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C kultiviert. Die Isolierung der Vektor-DNA erfolgte mittels Plasmidpräparation nach Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
Die Vektoren (1) wurden nach Linearisierung mit SacII (p64ICL1) bzw. NotI (p67ICL1) unter Verwendung der modifizierten Lithium-Acetat-Methode nach Barth und Gaillardin (Barth und Gaillardin 1996, Yarrowia lipolytica. In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp 313–388) integrativ in die Rezipientenstämme H222-S4 und E129L1 transformiert. Für die Transformation wurden jeweils 2–5 μg Plasmid-DNA eingesetzt. Die Transformanden mit einer Kompensation des Uracil-Defektes infolge der multicopy Integration des Vektors wurden auf Agarplatten mit Minimalmedium M (nach Reader, modifiziert: Mauersberger et al. 1996, Candida maltosa. In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp 411–580) mit Glucose als C-Quelle durch Kultivierung bei 28°C über 3 bis 10 Tage selektiert.
Transformanden (TF) mit dem rDNA Vektor p64ICL1 wurden mit den beiden Ausgangsstämmen N222-S4 und E129L1 mit einer Frequenz von 30 bis 70 TF/μg DNA erhalten. Mit dem zeta Vektor p67ICL1 konnte der zeta freie Stamm H222-S4 jedoch nur mit der deutlich geringeren Effizienz von etwa 0,5–1 TF/μg DNA transformiert werden. Der viele zeta Kopien tragende Stamm E129L1 war dagegen mit dem Vektor p67ICL1 mit einer Effizienz von 30 TF/μg DNA transformierbar. Im Vergleich dazu war die integrative Transformation dieser Stämme mit den single copy Plasmiden p65ICL1 und p66ICL1 (enthalten das ura3d1-Allel als Selektionsmarker anstelle ura3d4, bei sonst gleichem Aufbau wie die Plasmide des Typs p64 bzw. p67, vgl. Juretzek et al. 2001, Yeast 18: 97–113) mit einer deutlich höheren Effizienz von 1600 bis 2400 TF/μg DNA möglich. Jedoch fällt auch in diesem Fall die Transformationseffizienz des Stammes H222-S4 mit dem zeta Plasmid p67ICL1 auf 30 TF/μg DNA deutlich ab.
Die Gewinnung der schwerer zu isolierenden p67ICL1 Transformanden von N222-S4 war von Interesse, da frühere Befunde zeigten, dass Transformanden mit Plasmiden des p67-Typs durch Tandem- und/oder Mehrfachintegration an verschiedenen Orten des Genoms offensichtlich eine größere Stabilität besitzen als die Transformanden des p64-Typs, da letztere durch Integration in die sich durch größere Flexibilität auszeichnenden ribosomalen DNA (rDNA) Regionen entstehen (Juretzek et al. 2001, Yeast 18: 97–113). Die multicopy Transformanden von N222-S4 mit p67ICL1 wurden deshalb mit den Transformanden des Typs N222-S4(p64ICL1) verglichen.
Ausführungsbeispiel 2
Charakterisierung von ICL1-multicopy Transformanden
Southern-Blot
Der Nachweis der Mehrfachintegration des ICL1-Genes in ausgewählten Transformanden erfolgte mittels Southern-Hybridisierung. Dazu wurde die genomische DNA der eingesetzten Rezipientenstämme und ausgewählter Transformanden unter Verwendung der Methode von Hoffmann und Winston (1987, Gene 57: 267–272) nach mechanischem Zellaufschluss präpariert. Die Sondenpräparation und -detektion erfolgte mittels des "Gene Images random prime labelling and detection system" der Firma Amersham Life Sciences.
Zur Bestimmung der Kopiezahl des ICL1-Genes (2) wurde die genomische DNA vollständig mit dem Restriktionsenzym Ncol gespalten. Nach Auftrennung der Präparate in der Gelelektrophorese und anschließendem Membranblotting wurde das 2,3 kb BamHI Fragment des ICL1-Strukturgens als Detektionssonde für die Hybridisierung verwendet. Bei beiden analysierten Ausgangsstämmen wurden 3 spezifische Banden (Banden a, d, e in 2) der genomischen Kopie des ICL1-Gens bei ca. 4.500, ca. 1.300 und 1.233 by detektiert. Die untersuchte Transformande T1 des Typs N222-S4(p64ICL1) wies zusätzliche Banden bei 2,9 kb und 1,9 kb (Banden b und c in 2) auf, welche aus dem mehrfach integrierten Vektor resultierten. Zusätzlich wurde die genomische Bande bei 1.233 by (Bande e in 2, Ncol Fragment des ICL1) durch das äquivalente Fragment aus dem integrierten Vektor verstärkt. Zur Abschätzung der Kopiezahl wurde der durch Southern-Hybridisierung erhaltene Röntgenfilm eingescannt und mit der Software ImageQuant für den Phosphoimager STORM (Amersham Pharmacia Biotech) bearbeitet. Das Programm vergleicht dabei die unterschiedliche Intensität der auf dem Film vorliegenden Banden und setzt diese miteinander ins Verhältnis. Aus einer vergleichenden Bewertung der Bandenintensitäten von Ausgangsstamm H222-S4 und Transformande konnte für H222-S4(p64ICL1) T1 eine Kopiezahl von 15 bis 25 zusätzlichen ICL1-Kopien abgeschätzt werden.
In einer weiteren Analyse (3) wurde die Kopiezahl der integrierten Vektoren auch durch den Nachweis des in den Transformationsvektoren als Markergen eingesetzten ura3d4-Allels bestimmt. Dazu wurde nach vollständiger Restriktion der genomischen DNA mit Sall ein 1,7 kb Fragment aus dem URA-Gen von Y. lipolytica als Detektionssonde für den Southern-Blot verwendet. Der Ausgangsstamm H222-S4 wies unter diesen Bedingungen eine spezifische Bande bei 4,3 kb (Bande a in 3) auf, welche aus dem verbliebenen genomischen Fragment des weitgehend deletierten URA3-Gens (Genzerstörung des URA3-Gens in H222 infolge Deletion des URA3-ORF und Insertion des SUC2-Genes aus Saccharomyces cerevisiae durch integrative Transformation mit einem 4,3 kb Sall Fragment aus dem Plasmid pINA302) resultiert. Bei den untersuchten N222-S4(p64ICL1) Transformanden T1, T9 und T11 trat zusätzlich eine kräftige spezifische Bande bei 2,8 kb (Bande b in 3) auf, welche aus dem ura3d4 Allel des mehrfach integrierten Vektors stammt. Die Erhöhung der Kopiezahl wird durch die hohe Intensität dieser spezifischen ura3d4 Bande b (3) bei den Transformanden H222-S4(p64ICL1) gegenüber der Bande des ura3-302-Allels (Bande a) im Ausgangsstamm (eine Kopie) verdeutlicht. Eine Abschätzung der Kopiezahlen der integrativen Plasmide im Hefegenom aus dem Vergleich der Bandenintensitäten (Bande a mit b in 3) ergab etwa 10–24 Kopien für die untersuchten Transformanden mit p64ICL1, was gut mit den dargestellten Befunden zur ICL1-Kopienzahl übereinstimmt.
Vergleich der Isocitratlyaseaktivitäten von Ausgangsstamm und Transformanden
Die spezifische Aktivität der Isocitratlyase des Ausgangsstammes H222-S4 und ausgewählter ICL1-multicopy Transformanden wurde bei Kultivierung auf unterschiedlichen C-Quellen bestimmt.
Dazu wurden die Stämme zunächst über Nacht in 100 ml Schüttelkolben mit 25 ml Hefe-Minimalmedium M mit 2% Glucose als C-Quelle sowie notwendigen Supplementen (0,3 μg/ml Thiaminhydrochlorid für alle Kulturen, 40 mg/l Uracil für H222-S4) bei 28°C auf einem Horizontalschüttler bei 230 rpm (Umdrehungen pro Minute) kultiviert (1. Vorkultur). Nach pH-Abgleich mittels 2,5 mol/l NaOH auf pH 5,5 bis 6,0 wurden jeweils 20 ml der 1. Vorkultur in 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml des gleichen Nährmediums übertragen (2. Vorkultur). Die 2. Vorkultur wurde unter den oben genannten Bedingungen über 15 bis 24 h inkubiert und nach pH-Abgleich für die Beimpfung der Hauptkulturen in 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml Hefe-Minimalmedium M und notwendigen Supplementen (Thiamin, Uracil) sowie verschiedenen C-Quellen (2% Glucose, 1% Ethanol, 5% Sonnenblumenöl oder 5% Hexadecan) eingesetzt. Die Inokulierung erfolgte mit einer Animpfkonzentration von 2 bis 3 10⁷ Zellen/ml. Die Kultivierung wurde wie für die Vorkulturen beschrieben durchgeführt.
Nach ausgewählten Inkubationszeiten wurden 5 bis 10 ml der Hefesuspension geerntet und 5 min bei 3000 rpm und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 2 ml eiskaltem Aufschlusspuffer (100 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, pH 7,0) gewaschen und anschließend in 1 ml dieses Puffers resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden anschließend durch kräftiges Vortexen (3 mal 1 min, dazwischen jeweils mindestens 2 min Inkubation auf Eis) in einem Reagenzglas mit Glasperlen (0,45–0,5 mm) aufgeschlossen. Der zellfreie Extrakt wurde nach 5 min Zentrifugation bei 3000 rpm und 4°C gewonnen und für die Bestimmung der Isocitratlyaseaktivität sowie der Proteinkonzentration verwendet. Die Messung der Isocitratlyaseaktivität erfolgte photometrisch nach Dixon und Kornberg (1959, Biochem J 72: 3) auf Grundlage der Bildung von Phenylhydrazon aus Phenylhydrazin und Glyoxylat über einen Zeitraum von 3 bis 5 min bei 324 nm und 30°C. Zur Ermittlung der spezifischen Isocitratlyaseaktivitäten wurde die Proteinkonzentrationen der zellfreien Extrakte nach Lowry et al. (1951, J Biol Chem 193: 265–275) bestimmt.
Bei Kultivierung von H222-S4 und der Transformande H222-S4(p64ICL1) T1 unter Einsatz von Glucose und Ethanol als C-Quelle (4) wurde auf beiden Substraten nach einer Inkubationszeit von 9 h eine 15- bis 16-fach höhere spezifische Isocitratlyaseaktivität des transformierten Stammes gegenüber dem Ausgangsstamm gefunden. Unter den gewählten Versuchsbedingungen tritt nach ca. 9 h bei allen untersuchten Stämmen ein Maximum der spezifischen Isocitratlyaseaktivität auf. Auch Messungen vor und nach diesem Aktivitätsmaximum belegten die hohe relative Zunahme der spezifischen ICL-Aktivität der Transformande im Vergleich zum Ausgangsstamm. Die Untersuchung von zwei weiteren multicopy Transformanden des Typs N222-S4(p64ICL1) auf Ethanol als C-Quelle bestätigte den oben genannten Befund. Nach 12 h Kultivierung wurde für den Ausgangsstamm H222-S4 eine spezifische ICL-Aktivität von 221 mU/mg Protein ermittelt. Die Transformanden H222-S4(p64ICL1) T9 und T18 wiesen hingegen eine etwa 20-fach höhere spezifische ICL-Aktivität von 4264 bzw. 4790 mU/mg Protein auf.
Die erhöhte Isocitratlyaseaktivität der Transformande N222-S4(p64ICL1) T1 im Vergleich zum Ausgangsstamm wurde auch bei Einsatz der hydrophoben Substrate Sonnenblumenöl und Hexadecan für die Citronensäureproduktion bestätigt (5). Dazu wurde Hefe-Minimalmedium M mit einem reduzierten Ammoniumstickstoffgehalt von 1 g/l (NH₄)₂SO₄ eingesetzt, wodurch nach ca. 3 Tagen Kultivierung eine durch Stickstoffmangel bedingte Wachstumslimitation der Kulturen eintrat und die Produktion von Citronen- und Isocitronensäure induziert wurde. Messungen der spezifischen Isocitratlyaseaktivität in der Wachstums- und Produktionsphase zeigten, dass über die gesamte Kultivierungsdauer eine etwa 20-fache Erhöhung der spezifischen ICL-Aktivität in der Transformande N222-S4(p64ICL1) T1 gegenüber dem Ausgangsstamm gefunden wurde.
Die durch die Bestimmung der spezifischen enzymatischen Aktivitäten nachgewiesene Überexpression der Isocitratlyase infolge der Mehrfachintegration des ICL1-Gens in das Hefegenom wurde auch in der Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli (1970, Nature 227: 680–685) von zellfreien Extrakten der auf Ethanol kultivierten Zellen des Ausgangssstammes N222-S4 und der Transformande H222-S4(p64ICL1) T1 besonders deutlich (6). Im Bereich von ca. 60 kDa (Molekulargewicht der ICL) wurde in der Transformande gegenüber dem Ausgangsstamm schon in der Coomassie-Färbung eine deutliche Zunahme einer Proteinbande in der SDS-PAGE beobachtet.
Ausführungsbeispiel 3
Citronensäureproduktion mit den Ausgangsstämmen H222, H222-S4 und ausgewählten ICL1-multicopy Transformanden
Vorkulturen für die Kultivierung zur Citronensäureproduktion
Die Kulturen wurden in 500 ml Schüttelkolben in 100 ml YPD über 24 h auf einem Horizontalschüttler bei 28°C und 230 rpm inkubiert, anschließend unter sterilen Bedingungen bei 5000 rpm 5 min zentrifugiert und das Pellet in Hefe-Minimalmedium M ohne Stickstoffzusatz zweimal gewaschen. Das Zellpellet wurde anschließend in 5 ml Minimalmedium M ohne Stickstoffzusatz aufgenommen und für die Beimpfung der Hauptkulturen verwendet.
Hauptkulturen für die Citronensäureproduktion
Die Kultivierung zur Citronensäureproduktion erfolgte in 500 ml Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 ml Hefe-Minimalmedium M mit einem reduziertem Ammoniumsulfatgehalt von 1 g/l. Als C-Quelle wurden je nach Versuchsziel 3 bis 10% Glucose, Sonnenblumenöl, Altfett (pflanzliches Fettgemisch) oder Hexadecan zugegeben. Sonnenblumenöl wurde ohne vorherige Substrataufbereitung, Altfett hingegen als wäßrige Emulsion (Emulgierung von 20% Altfett mit 1% Tween 80 in Wasser mittels Ultraschall) eingesetzt. Weiterhin wurden allen Kulturen 0,3 μg/ml Thiaminhydrochlorid und bei N222-S4 zusätzlich 40 mg/l Uracil zugegeben. Die Kultivierung erfolgte nach Beimpfung der Kulturen (Animpftiter 0,5 bis 2 OD – Optische Dichte bei 600 nm) auf einem Horizontalschüttler bei 230 rpm und 28°C unter regelmäßigem pN-Abgleich auf pH 6,0 mittels 2,5 mol/l, 5 mol/l oder 10 mol/l NaOH über einen Zeitraum von 5 bis 12 Tagen.
Die Analyse des Ammoniumstickstoffgehaltes im Kulturmedium erfolgte mit einem enzymatischen Testkit der Fa. Dr. Lange GmbH & Co KG (Düsseldorf). Die Analyse der Citronensäure- und Isocitronensäurekonzentration erfolgte unter Verwendung von enzymatischen Testkits (Kit-Nr. 0139076 bzw. 0414433) der Firma R-Biopharm GmbH (Darmstadt), bzw. mittels eines Ionenchromatographie-Systems DX-320 der Firma Dionex (Sunnyvale, USA – Trennsäule IonPac AS 15, 2 mm Durchmesser, Leitfähigkeitsdetektor CD 25a, Autosampler AS 40).
Bildung von Citronen- und Isocitronensäure
Unter den gewählten Kultivierungsbedingungen wurde nach 3 bis 4 Tagen eine deutliche Limitierung des Wachstums der Hefekulturen infolge Stickstoffmangels bei gleichzeitigem C-Quellenüberschuss erreicht. Dadurch wurde die Produktion von Citronensäure und Isocitronensäure induziert. Diese für alle Untersuchungen zur Citronensäure-/Isocitronensäureproduktion eingesetzte Kulturführung zur Erzeugung der Stickstofflimitation in Schüttelkolben ist in 7 beispielhaft am Wildtypstamm H222 bei Einsatz von Sonnenblumenöl als C-Quelle dargestellt. Die unter den gewählten Bedingungen der Schüttelkulturen mit H222 auf Sonnenblumenöl erzielten Produktbildungsraten lagen zwischen 190 bis 250 mg/l*h für Citronensäure (Gesamtsäure CS+ICS 340 bis 390 mg/l*h) bei einer Biomassekonzentration (Hefetrockenmasse) von 13 bis 14 g/l. Die in 7 gezeigte Produktbildung an CS/ICS konnte durch längere Kulturführung (bis zu 20 Tage) und Substratkonzentrationen von 8–10% Sonnenblumenöl auf 100 bis 150 g/l (Gesamtsäuregehalt) gesteigert werden.
Unter Verwendung dieser Kultivierungsbedingungen wurde das Produktverhältnis Citronensäure/Isocitronensäure (CS/ICS) der Ausgangsstämme H222 und H222-S4 sowie ausgewählter ICL1-multicopy Transformanden des Typs N222-S4(p64ICL1) und N222-S4(p67ICL1) auf verschiedenen C-Quellen untersucht (8, Tab. 1). Auf Sonnenblumenöl wurde für N222-S4 nach bis zu 15- bis 18-tägiger Kultivierung mit 8-10% Sonnenblumenöl als C-Quelle eine CS/ICS-Verhältnis von durchschnittlich 60:40 bei einem Gesamtsäuregehalt (CS+ICS) von ca. 80–85 g/l gefunden. Die unter gleichen Bedingungen untersuchten Transformanden N222-S4(p64ICL1) T8, T9, T11, T12, T16, T17 und T18 wiesen ein deutlich günstigeres CS/ICS-Produktspektrum von 94:6 bis 96:4 bei einem Gesamtsäuregehalt von 80 bis 100 g/l auf (8). Vergleichbare Ergebnisse wurden mit ausgewählten Transformanden des Typs H222-S4(p67ICL1) erzielt. Diese deutliche Verschiebung des Produktverhältnisses zugunsten der Citronensäure bei den ICL1-multicopy Transformanden wurde bei Kultivierung auf Glucose, Altfett (Gemisch pflanzlicher Fette) und Hexadecan bestätigt (Tab. 1).
Tab. 1 Verhältnis der CS/ICS-Produktion mit Y. lipolytica H222, H222-S4 (ura3-302) sowie den ICL1-multicopy Transformanden N222-S4(p64ICL1) und N222-S4(p67ICL1) auf verschiedenen C-Quellen.
Die Hefezellen wurden in 500 ml Schüttelkolben mit 100 oder 200 ml Minimalmedium M mit 1 g/l (NH₄)₂SO₄) und 5–6% C-Quelle über 5 bis 12 Tage, bzw. bis zu 18 Tagen für die Versuche mit Sonnenblumenöl kultiviert. Bei längerer Kultivierung erfolgte eine Nachdosierung der C-Quelle bei Auszehrung des Substrates (insgesamt 8–10% Substrat). Die mit ¹⁾ gekennzeichneten Daten wurden nach kürzerer Kulturzeit von 5–7 Tagen erhalten.
Anhand der folgenden Abbildungen (Figuren) werden die Ausführungsbeispiele weiter erläutert:
1
Aufbau der multicopy Transformationsvektoren p64ICL1 und p67ICL1
Dargestellt sind die für die Erhöhung der Kopiezahl des ICL1-Genes durch integrative Transformation eingesetzten multicopy Vektoren mit rDNA Sequenz (p64ICL1) bzw. der zeta Sequenz (p67ICL1) als homologe Transformationssequenzen. Die Vektoren enthalten als funktionsfähige Expressionskassette das ICL1-Gen aus Y. lipolytica mit Promotor (pICL1), Intron (ICLi), offener Leserahmen des ICL1 (ICL1 ORF) und Terminator (ICLt), sowie das ura3d4 Allel des URAS-Gens von Y. lipolytica als multicopy Selektionsmarker. Die Vektoren werden nach Linearisierung mit SacII (p64ICL1) bzw. NotI (p67ICL1) integrativ in das Genom von Y. lipolytica transformiert.
2
Nachweis der erhöhten Kopiezahl des ICL1-Gens.
Dargestellt ist ein Southern-Blot nach vollständigem Verdau der genomischen DNA durch das Restriktionsenzym NcoI und Detektion spezifischer Banden mittels des 2,3 kb BamHI Fragmentes des ICL1-Gens aus Y. lipolytica.
Auftragung:
1: Ausgangsstamm H222-S4; 2: Ausgangsstamm E129L1; 3: Multicopy Transformande H222-S4(p64ICL1) T1; MW: Molekulargewichtsstandard.
Detektierte Banden:
a, d: Genomische ICL1-Fragmente bei ca. 4500 und 1300 bp;
e: ICL1-Fragment aus Genom bzw. dem Vektor bei 1233 bp;
b, c: ICL1-haltige Fragmente aus dem Vektor p64ICL1 bei 1,9 kb und 2,9 kb.
3
Nachweis der erhöhten Kopiezahl des ura3d4 Allels.
Dargestellt ist ein Southern-Blot nach vollständigem Verdau der genomischen DNA durch das Restriktionsenzym SalI und Detektion spezifischer Banden mittels eines 1,7 kb SalI Fragmentes des ura3d4-Allels aus Y. lipolytica.
Auftragung:
1: Ausgangsstamm H222-S4; 2–4: Multicopy Transformanden H222-S4(p64ICL1) T1, T9 und T11; MW: Molekulargewichtsstandard.
Detektierte Banden:
a: Genomisches Fragment mit dem ura3-302 Allel bei 4,3 kb;
b: Das ura3d4-haltige Fragment aus dem Vektor p64ICL1 bei 2,8 kb.
4
Nachweis der Erhöhung der spezifischen Isocitratlyaseaktivität infolge multicopy Integration des ICL1-Gens bei Kultivierung auf den C-Quellen Glucose und Ethanol.
Die Abbildung zeigt den Verlauf der spezifischen Isocitratlyaseaktivität bei Kultivierung des Ausgangsstamms N222-S4 und der multicopy Transformande H222-S4(p64ICL1) T1 auf Glucose bzw. Ethanol als C-Quelle über eine Kultivierungszeit von 27 h. Aufgrund der ICL-Repression durch Glucose werden auf diesem Substrat deutlich niedrigere ICL-Aktivitäten gefunden als bei Ethanol. Unabhängig von dieser Transkriptionsregulation und weiteren metabolischen Regulationsmechanismen ist ab 6 h Kultivierung bei vergleichbaren Bedingungen stets eine mindestens 10- bis 20-fach höhere spezifische ICL-Aktivität der Transformande H222-S4(p64ICL1) T1 im Vergleich zum Ausgangsstamm nachweisbar.
5
Nachweis der Erhöhung der spezifischen Isocitratlyaseaktivität infolge multicopy Integration des ICL1-Genes bei Kultivierung auf den C-Quellen Sonnenblumenöl und Hexadecan.
Die Abbildung zeigt die spezifischen Isocitratlyaseaktivitäten des Ausgangsstammes H222-S4 und der multicopy Transformande H222-S4(p64ICL1) T1 nach 16-, 40- und 162-stündiger Kultivierung auf Sonnenblumenöl (Öl) bzw. Hexadecan. Unter den gewählten Kultivierungsbedingungen wurde nach ca. 40 h bis 50 h die Produktion von Citronen- und Isocitronensäure induziert (Produktionsphase). Über die gesamte Kulturzeit (Wachstums- und Produktionsphase) wurde eine 20-fach höhere ICL-Aktivität der Transformande N222-S4(p64ICL1) T1 gegenüber dem Ausgangsstamm nachgewiesen.
6
Bestätigung der Überexpression der Isocitratlyase in ICL1-multicopy Transformanden mittels SDS-PAGE.
Dargestellt ist die elektrophoretische Auftrennung zellfreier Proteinextrakte in der SDS-PAGE nach 3, 6, 9 und 12-stündiger Kultivierung auf Ethanol als C-Quelle (vgl. 4). Die Auftrennung der Proteine (Auftragung von 20 μg Protein je Probe) erfolgte in 8%igem Polyacrylamidgel bei 20 bis 50 mA. Im Vergleich zum Ausgangsstamm H222-S4 wurden für die untersuchte ICL1-multicopy Transformande H222-S4(p64ICL1) T1 über die gesamte Kultivierungszeit deutlich stärkere Proteinbanden bei ca. 60 kDa (Molekulargewicht der Isocitratlyase) nachgewiesen.
7
Kulturverlauf zur Citronensäureproduktion mit Y. lipolytica unter den Bedingungen der Stickstofflimitation am Beispiel von H222 auf Sonnenblumenöl.
Die Abbildung zeigt den Verlauf der Kultivierung von Y. lipolytica H222 zur Citronensäureproduktion im modifizierten Hefe-Minimalmedium M mit reduziertem Gehalt an Ammoniumsulfat von 1 g/l (Produktionsmedium) und 5% Sonnenblumenöl als C-Quelle im Schüttelkolbenversuch. Die Produktion von Citronen- und Isocitronensäure setzt nach ca. 60 h bis 70 h Kultivierung nach Auszehrung der Stickstoffquelle und Beginn einer Wachstumslimitation der Kultur ein. Die unter diesen Bedingungen mit H222 auf Sonnenblumenöl erzielten Produktbildungsraten lagen zwischen 190 bis 250 mg/l*h für Citronensäure (Gesamtsäure CS und ICS:. 340 bis 390 mg/l*h) bei einer Biomassekonzentration (Hefetrockenmasse) von 13 bis 14 g/l.
8
Nachweis der Verschiebung des Produktverhältnisses CS/ICS infolge multicopy Integration des ICL1-Genes bei Kultivierung auf Sonnenblumenöl.
Die Abbildung zeigt das Produktverhältnis Citronensäure/Isocitronensäure (CS/ICS) des Ausgangsstammes H222-S4 und der Transformanden H222-S4(p64ICL1) T8, T9, T11, T12, T16, T17 und T18 nach 18-tägiger Kultivierung mit 8% bis 10% Sonnenblumenöl als C-Quelle. Der Ausgangsstamm wies ein CS/ICS-Verhältnis von etwa 60:40 (57:43 bis 65:35) bei einem Gesamtsäuregehalt (CS und ICS) von 80 g/l bis 85 g/l auf. Die unter gleichen Bedingungen untersuchten Transformanden wiesen ein deutlich günstigeres Produktspektrum von 94:6 bis 96:4 bei einem Gesamtsäuregehalt von 80 bis 100 g/l auf.
Im Beschreibungstext und in den Figuren werden folgende Abkürzungen verwendet:

bp Basenpaare
C-Quelle Kohlenstoff-Quelle
CS Citronensäure
DNA Desoxyribonukleinsäure
DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
E. coli Eschericha coli
ICL Isocitratlyase
ICS Isocitronensäure
kb Kilo-Basenpaare
KDa Kilodalton
MW Molekulargewichtstandard
OD Optische Dichte
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
LTR long terminal repeat
rDNA ribosomale DNA
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
SDS Sodiumdodecylsulfat
TF Transformande(n)
URA-3 Den 3. Schritt der Uracil-Biosynthese katalysierende Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase
Y. lipolytica Yarrowia lipolytica
Zeta LTR des Retrotransposons YIt1 aus Y. lipolytica

Claims

Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Citronensäure in Hefezellen von Yarrowia lipolytica mit den Schritten: a) Transformation von Hefezellen mit einem für die mehrfache genomische Integration geeigneten Vektor, der ein als Selektionsmarker wirkendes Gen enthält, b) Kultivierung der Hefe unter Mangelbedingungen mit einer Kohlenstoffquelle, c) Reinigung der Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor eine Expressionskassette mit einer für Isocitratlyaseaktivität codierenden Gensequenz enthält und Klone in einem geeigneten Nährmedium selektiert werden, die mehrere Kopien einer für die Isocitratlyaseaktivität codierenden Gensequenz und des Selektionsmarkers stabil in ihr Genom integriert haben.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor eine Expressionskassette enthält, welche eine Gensequenz enthält, die für ein Protein mit einer Isocitratlyaseaktivität gemäss SEQ ID No. 1 codiert.
Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor eine Expressionskassette gemäss SEQ ID No. 2 enthält.
Vektor zur genomischen Integration einer Gensequenz codierend für eine Isocitratlyaseaktivität, der mindestens eine Gensequenz enthält, die für ein Protein mit einer Isocitratlyaseaktivität gemäss SEQ ID No. 1 codiert.
Vektor nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass er eine Gensequenz gemäss SEQ ID No. 2 enthält.
Vektor nach Anspruch 5 mit einem Strang gemäß gemäss SEQ ID No. 3.
Vektor nach Anspruch 5 mit einem Strang gemäß gemäss SEQ ID No. 4.
Genveränderter Stamm von Yarrowia lipolytica, der mehrere Kopien einer für die Isocitratlyaseaktivität codierenden Gensequenz stabil in sein Genom integriert hat.
Genveränderter Stamm von Yarrowia lipolytica nach Anspruch 8, der mehrere Kopien einer für das Protein gemäß SEQ ID No. 1 codierenden Gensequenz stabil in sein Genom integriert hat.
Genveränderter Stamm von Yarrowia lipolytica nach Anspruch 9, der mehrere Kopien der SEQ ID No. 2 stabil in sein Genom integriert hat.
Genveränderter Stamm von Yarrowia lipolytica, transformiert mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 4 bis 7.
Genveränderter Stamm von Yarrowia lipolytica nach Anspruch 11, Yarrowia lipolytica N222-S4(p64ICL1) T1, wie bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig, Deutschland, mit Hinterlegungsnummer DSM 15105 hinterlegt.
Expressionskassette mit einer für eine Isocitratlyaseaktivität codierenden Gensequenz, wie im Stamm nach Anspruch 12 in mehreren Kopien enthalten.
Expressionskassette mit einer für ein Protein mit einer Isocitratlyaseaktivität codierenden Gensequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie für eine Protein gemäß SEQ ID No. 1 codiert.
Expressionskassette nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Gensequenz gemäß SEQ ID No. 2 enthält.
Protein mit einer Isocitratlyaseaktivität gemäß SEQ ID No. 1.
Verwendung eines Stammes nach einem der Ansprüche 8 bis 12 zur biotechnologischen Herstellung von Citronensäure.