DE19932811A1 - Rekombinante haploide oder diploide Yarrowia lipolytica Zellen zur funktionellen heterologen Expression von Cytochrom P450 Systemen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft rekombinante haploide oder diploide Yarrowia (Y.)lipolytica Zellen zur funktionellen heterologen Expression von Cytochrom P450 (P450) Systemen, Plasmide zur Transformation der Zellen, ein Verfahren zur Herstellung der Zellen sowie die Verwendung dieser zur Stoffumwandlung. DOLLAR A Die Zellen beinhalten Plasmide mit Expressionskassetten, wobei die Expressionskassetten aus in Y.lipolytica funktionell aktiven Promotoren und Terminatoren und Genen oder cDNA zur Expression von Oligopeptiden oder Proteinen bestehen und damit Eigenschaften ausbilden, die zur Stoffumwandlung ausgenutzt werden.

Description

Die Erfindung betrifft rekombinante haploide oder diploide Yarrowia (Y.) lipolytica Zellen zur funktionellen heterologen Expression von Cytochrom P450 (P450) Systemen, Plasmide zur Transformation der Zellen, ein Verfahren zur Herstellung der Zellen sowie die Verwendung dieser zur Stoffumwandlung.

Monooxygenasen vom Cytochrom P450 Typ sind in Organismen der gesamten phylogenetischen Skala verbreitet. Sie katalysieren NAD(P)H- und O₂-abhängige Reaktionen in einer Vielzahl von anabolen und katabolen Stoffwechselwegen. Cytochrom P450 Enzyme katalysieren die Oxidation zahlreicher physiologischer Substrate wie Steroide, Fettsäuren, Eicosanoide u. a. Lipidmetabolite. Viele P450 Formen metabolisieren Xenobiotica wie Arzneimittel, Alkohol, Procarcinogene, Antioxidantien, organische Lösungsmittel und Anästhetika. Gegenwärtig sind die Primärsequenzen von mehr als 600 verschiedenen P450 Formen bekannt. Sie werden aufgrund charakteristischer Sequenzmerkmale zu einer Super-Genfamilie (CYP) zusammengefaßt (Übersichten bei Nelson et al. 1993 DNA Cell Biol 12: 1-38; Nelson et al. 1996 Pharmacogenetics 6: 1-42).

P450 Systeme zeichnen sich durch ihre hohe Regio- und Stereoselektivität und durch die Oxidation einer großen Vielfalt von meist hydrophoben Substraten aus. P450 katalysierte Biotransformationsreaktionen sind deshalb von besonderem Interesse für eine biotechnologische Anwendung.

Die heterologe Expression von Cytochrom P450 cDNA's oder Genen in einem geeigneten Wirt ist ein vielversprechender Weg zur Nutzung der Vielfalt der katalytischen Aktivität von P450 Enzymen in Biotransformationssystemen.

Die heterologe Expression ist oft auch der einzige gangbare Weg zur Charakterisierung individueller P450 Formen, bedingt durch die gleichzeitige Anwesenheit meist mehrerer P450 Isoenzyme mit unterschiedlichen Substratspezifitäten in tierischen und pflanzlichen Geweben und Mikroorganismen.

Die heterologe Expression von membrangebundenen P450 Formen ist heute sowohl in Bakterien (E. coli), in Hefen (meist Saccharomyces cerevisiae) als auch in Säugerzellkulturen bzw. Insektenzellkulturen möglich (Übersichten bei Yabusaki und Ohkawa 1991, In: Frontiers in Biotransformation, Ruckpaul K, Rein H, eds, Vol 4, pp 87-126, Akademie Verlag, Berlin; Guengerich et al. 1991 Methods Enzymol 206: 130 Gonzalez und Korzekwa 1995 Annu Rev Pharmacol Toxicol 1995; 35: 369-390).

Die Expression in Zellkulturen wird heute gut beherrscht, ist jedoch für eine biotechnologische Nutzung durch meist geringe Expressionsraten und hohen Aufwand für die Kulturführung weniger gut geeignet.

Im Gegensatz zu den sehr guten Ergebnissen mit löslichen bakteriellen P450 Formen (P450_CAM, P450_BM3) erfordert die Expression membranständiger P450 Enzyme in Bakterien (E. coli) einen hohen Aufwand relativ komplizierter gentechnischer Modifikationen am P450 Gen selbst (Barnes HJ, Arlotto MP, Waterman MR 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88: 5597-5601). Für die funktionelle Expression in E. coli ist außerdem die zusätzliche Bereitstellung von ebenfalls membranständigen Elektronentransferkomponenten erforderlich.

Dagegen sind Hefen aufgrund, ihrer eukaryotischen Zellstruktur gut geeignet, ER- gebundene P450 Formen funktionell aktiv zu exprimieren. Sie bieten darüber hinaus aufgrund ihrer relativ einfachen technologischen Handhabbarkeit sowie genetischen und gentechnischen Manipulierbarkeit günstige Voraussetzungen für die Schaffung von Biotransformationssystemen. Die Hefezellen können dazu als "rekombinante Zellfabriken" zu hohen Zellkonzentrationen (Hochzelldichtefermentation) heranwachsen und zur Biotransformation eingesetzt werden. Für die funktionelle heterologe Expression membrangebundener P450 Formen aus Säugern, Pflanzen und eukaryotischen Mikroorganismen wird bislang hauptsächlich die Hefe Saccharomyces cerevisiae genutzt. Nach ersten erfolgreichen Versuchen zur Expression einer cDNA von P450c der Rattenleber unter Kontrolle des ADH1- Promotors (Oeda et al.1985 DNA 4 : 203-210) wurden eine große Anzahl unterschiedlicher P450 Formen (ER-ständige sowie mitochondriale P450 Isoformen) in S. cerevisiae unter Kontrolle verschiedener starker Promotoren (ADH1, CUP1, PHO5, GAL7, GAL10; GAL-CYC, PGK u. a.) funktionell exprimiert (Übersichten dazu: Yabusaki und Ohkawa 1991 In: Frontiers in Biotransformation, Ruckpaul K, Rein H, eds, Vol 4, pp 87-126, Akademie Verlag, Berlin; Urban et al. 1990 Biochemie 72: 463- 472, Guengerich et al. 1991 Methods Enzymol 206: 130; Schunck et al. 1991 Eur J Cell Biol 55: 336-345; Renaud et al. 1993 Toxicology 22: 39-52; Gonzalez und Korzekwa 1995 Annu Rev Pharmacol Toxicol 1995; 35: 369-390; Dumas et al. 1996 Eur J Biochem 238: 495-504; Pompon et al. 1996 Methods Enzymol 272: 51-64; Pompon et al. 1997 J Hepatol 26S2: 81-85; Duport, et al. 1998 Nat Biotechnol 16: 186-189).

Die Hefe S. cerevisiae hat den Nachteil, daß die relativ geringen Konzentrationen und Aktivitäten der eigenen mikrosomalen Elektronentransportkomponenten (NADPH-P450 Reduktase, NADH-Cytochrome b₅ Reduktase, Cytochrome b₅) für die katalytische Aktivität hoher Konzentrationen eines heterologen P450 zum limitierenden Faktor werden können. Es wurde deshalb mit unterschiedlichen Strategien und Erfolg versucht, die Effektivität des mikrosomalen Elektronentransfers auf das P450 zu erhöhen - durch zusätzliche Expression der Gene von verschiedenen NADPH-P450 Reduktasen und in ausgewählten Fällen von Cytochrom b₅ bzw. durch Fusion der Reduktase- und P450 Strukturgene (Urban et al. 1990 Biochemie 72: 463-472, Sanglard et al. 1990 Biocatalysis 4: 19-28; Sakaki et al. 1990 DNA Cell Biol 9: 603- 614; Yabusaki und Ohkawa 1991 In: Frontiers in Biotransformation, Ruckpaul K, Rein H, eds, Vol 4, pp 87-126, Akademie Verlag, Berlin; Urban et al. 1993 Biochem Soc Trans 21: 1028; Pompon et al. Patent FR-PS-2679 249; Zimmer et al. 1995 DNA Cell Biol 14: 619-628; Zimmer et al. 1995 Patent DE 195 07 546).

Ein besonderer Nachteil von Saccharomyces Hefen ist die relativ geringe Aufnahmekapazität bzw. Aufnahmerate für lipophile Verbindungen wie Fettsäuren und Alkane (Kohlwein und Paltauf 1984 Biochim Biophys Acta 792: 310-317; Dell'Angelica et al. 1992 Comp Biochem Physiol 102B: 261-265; Dell'Angelica et al. 1996 Biochem Mol biol Int 39: 439-445). Die katalytischen Leistungen von heterolpgen P450 in S. cerevisiae sind demzufolge meist gering, was offensichtlich mit einem unzureichenden Substrat- und Elektronentransport in dieser Hefe in Zusammenhang steht.

Deshalb wurden in jüngster Zeit neben S. cerevisiae auch andere Hefen als Wirte für die heterologe Expression von P450 getestet. Für die Hefe Kluyveromyces lactis wurde über die funktionelle Expression, jedoch mit geringer Aktivität, von P450_scc und von Adrenodoxin unter Kontrolle des Lactasepromotors berichtet (Mencke et al. 1990 19 th FEBS-Meeting, Budapest August 1990, Abstracts).

In der methanolverwertenden Hefe Pichia pastoris gelang die funktionelle Expression des Cytochrom P450c17 (17α-hydroxylase/C17,20-lyase) aus einem Haifisch (Squalus acanthias) unter Kontrolle des AOX1-Promotors (Trant JM 1996 Arch Biochem Biophys 326: 8-14). Für die Expression wird eine Kultivierung dieser Hefe auf Methanol benötigt. Das heterologe P450 zeigt jedoch eine relativ geringe spezifische Aktivität.

Die alkanverwertenden Hefen, wie z. B. Candida maltosa, C. tropicalis oder Y. lipolytica, zeichnen sich durch eine hohe katalytische Aktivität ihrer eigenen P450 Systeme (in vivo Turnoverzahlen von 1-2 µmol/nmol P450 × min für die wirtseigenen alkaninduzierbaren P450) aus. Für die Hefen Y. lipolytica und C. maltosa sind gut entwickelte Wirts-Vektor-Systeme vorhanden (Übersichten in: Barth und Gaillardin 1996 Chapter 10 Yarrowia lipolytica In: Wolf K /Ed/ Non-conventional Yeasts in Biotechnology, Springer Verlag Berlin, pp 313-388; Barth und Gaillardin 1997 FEMS Microbiol Rev 19: 219-237; Mauersberger et al. 1996 Chapter 12. Candida maltosa. In: Non-conventional Yeasts in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer Verlag, Heidelberg, pp 411-580).

Die Candida Hefen sind jedoch insgesamt durch ihre vom universellen genetischen Code abweichende Translation des Codons CUG als Serin anstelle von Leucin insgesamt keine gut geeigneten Wirte für die funktionelle heterologe Expression (Zimmer und Schunck 1995 Yeast 11: 33-41; Sugiyame et al Yeast 11: 43-52; Übersicht in Mauersberger et al. 1996 Chapter 12. Candida maltosa. In: Non­ conventional Yeasts in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer Verlag, Heidelberg, pp 411-580). Das C. maltosa System ist deshalb nur für die Expression homologer P450 unter Kontrolle der homologen Promotoren GAL1-GAL10, PGK1 und ALK gut geeignet, nicht jedoch für die Expression heterologer Proteine (Ohkuma et al. 1995 Biochim Biophys Acta 1236: 163-169).

Die alkanverwertende Hefe Y. lipolytica wurde in den zurückliegenden Jahren biochemisch, genetisch und molekularbiologisch sehr intensiv untersucht (Übersichten in Weber und Barth 1988, CRC Crit Rev Biotechnol 7: 281-337; Gaillardin und Heslot 1988 J Basic Microbiol 28: 161-174; Barth und Gaillardin 1996 Chapter 10 Yarrowia lipolytica In: Wolf K /Ed/ Non-conventional Yeasts in Biotechnology, Springer Verlag Berlin, pp 313-388; Barth und Gaillardin 1997 FEMS Microbiol Rev 19: 219- 237).

Es sind Transformationssysteme mit integrativen (Davidow et al. 1985 Curr Genet 10: 39-48; Gaillardin et al. 1985 Curr Genet 10: 49-58) und autonom replizierenden (Fournier et al. 1991 Yeast 7: 25-36, Fournier et al. 1993) Plasmiden bekannt.

Für die Nutzung dieser Hefe zur heterologen Expression wurden neben dem gut untersuchten Expressionssystem mit dem XPR2-Promotor andere Vektoren mit regulierbaren starken Promotoren entwickelt, beispielsweise die Promotoren des Gens ICL1 der Isocitratlyase aus dem Glyoxylatzyklus (Barth und Scheuber 1993 Mol Gen Genet 241: 422-430; Juretzek et al. 1995, Patent DE 195 25 282.9) und des Gens POT1 der Thiolase der peroxisomalen β-Oxidation (Berninger et al. 1993 Eur J Biochem 216: 607-613). Bisher wurden eine Reihe von heterologen Proteinen in der Hefe Y. lipolytica exprimiert, wie z. B. der Blut-Gerinnungsfaktor XIIIa des Menschen (Tharaud et al. 1992 Gene 121: 111-119). Weitere Beispiele sind in Barth und Gaillardin 1996 (Chapter 10 Yarrowia lipolytica In: Wolf K /Ed/ Non-conventional Yeasts in Biotechnology, Springer Verlag Berlin, pp 313-388) sowie in Barth und Gaillardin 1997 (FEMS Microbiol Rev 19: 219-237) beschrieben.

Ein weiteres Problem stellt die Tatsache dar, daß natürliche high-copy Plasmide, wie sie in S. cerevisiae gefunden wurden, in Y. lipolytica nicht bekannt sind und nur artifizielle autonom replizierende low-copy Plasmide existieren. Die autonom replizierenden Plasmide vom Typ pINA237 (LEU2 CEN-ARS18) oder pINA443 (URA3 ARS68-CEN) tragen ARS/CEN-Sequenzen und kommen daher nur mit 1-2 Kopien pro Zelle vor. Plasmide, die nur die ARS-Sequenzen tragen, können mit mehreren Kopien pro Zelle vorkommen. Transformanden, die solche Plasmide tragen, sind aber relativ instabil und verlieren nach wenigen Generationswechseln diese Plasmide (Fournier et al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 4912-4916). Plasmide, die ins Genom integriert werden, zeichnen sich auch unter nichtselektiven Kultivierungsbedingungen durch eine hohe Stabilität aus. Die bekannten Plasmide dieser Art werden in der Regel in die mutierten Gene leu2, lys5, ura3 oder xpr2 [Locus: mutierte Gene LEU2, LYS5, URA3 oder XPR2] integriert und komplementieren die entsprechende Mutation. Diese Plasmide werden als eine Kopie ins Genom integriert.

Die als integrative multi-copy Plasmide geeigneten- Vektoren tragen dagegen das Selektionsmarkergen URA3, dessen Promotorfunktion durch Deletion (URA3d) eingeschränkt ist. Eine Komplementation der entsprechenden ura3 Mutation wird erst durch eine erhöhte Kopiezahl pro Zelle erreicht.

Die ersten für Y. lipolytica beschriebenen integrativen multi-copy Plasmide pINA764 bis pINA774 (Le Dall et al. 1994 Curr Genet 26: 38-44; Barth und Gaillardin 1996 Chapter 10 Yarrowia lipolytica In. . Wolf K /Ed/ Non-conventional Yeasts in Biotechnology, Springer Verlag Berlin, pp 313-388; Barth und Gaillardin 1997 FEMS Microbiol Rev 19: 219-237) werden in die chromosomalen repetitiven Sequenzen der ribosomalen DNA (rDNA G Einheit, Fournier et al. 1986 Gene 42: 273-282) integriert. Als Selektionsmarkergen dient das Gen URA3d, dessen deletierte Promotorbereiche nur 41 bis 6 Basepaare "upstream" vom Startcodon ATG lang sind. Die durchschnittliche stabile Kopiezahl liegt zwischen 5 (pINA767) und 13 (pINA772) Kopien pro Zelle. Mit dem Plasmid pINA773 konnten ursprünglich 20-60 Kopien pro Zelle integriert werden. Ein entscheidender Nachteil dieser Plasmide ist, daß unter induzierenden und nichtselektiven Expressionsbedingungen keine stabilen Kopiezahlen erhalten werden konnten bzw. die integrierten Plasmidkopien verloren gingen. Ein weiterer Nachteil dieser Plasmide ist, die Verwendung des Plasmides pBR322 als Basisvektor für die Amplifikation in E. coli, was eine geringe Plasmidkopiezahl bedingt, die nur durch Zusatz von Chloramphenicol erhöht werden kann. Dadurch wird die Gewinnung der Plasmide aufwendiger und langwieriger.

Eine andere Serie von integrativen Plasmiden (pINA970 - UHA3d, ZETA, XPR2_pro- XPR2_Ter, ermöglicht 5-15 Kopien pro Zelle; pINA1066 bzw. pINA1067 enthalten URA3d1 bzw. URA3d4, sowie ZETA, XPR2_pro-XPR2_Ter; (Le Dall et al. 1995 Abstract "First Yarrowia lipolytica International Meeting" Paris-Grignon; Barth und Gaillardin 1996 Chapter 10 Yarrowia lipolytica In: Wolf K /Ed/ Non-conventional Yeasts in Biotechnology, Springer Verlag Berlin, pp 313-388) enthält das LTR-Element ZETA (long terminal repeat) des Retrotransposons Ylt1 von Y. lipolytica (EMBL X74146 Schmid-Berger et al. 1994 J Bacteriol 176: 2477-2482) als Zielsequenz für die Integration ins Genom. Die Plasmide pINA1066 und pINA1o67 (rDNA-Varianten pINA1064 und pINA1065) sind zur Expression von homologen und heterologen Proteinen unter Kontrolle des XPR2-Promotors geeignet. Diese Plasmide besitzen aber ebenfalls die gleichen Nachteile wie die Vektoren pINA776 bis pINA773. Weiterhin besitzen sie keine "Multiple cloning site". Die Komplettierung der Expressionskassette ist unter Nutzung der Schnittstellen SrfI, ApaI und Bg/II möglich. Ein Austausch von Expressionskassetten zur Expression von Proteinen unter Kontrolle anderer Promotoren ist aber erst in mehreren Klonierungsschritten möglich. Daher ist es von großem Interesse, Plasmide zu entwickeln, die einen Austausch von DNA- Modulen (Expressionskassetten, Genbanken usw.) erlauben und zur multiplen Integration in das Genom geeignet sind.

Die Aufgabe besteht nun darin, ein neues, gut handhabbares System zur heterologen funktionellen Expression von Cytochrom P450 Genen in der Hefe Yarrowia lipolytica zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch rekombinante haploide oder diploide Y. lipolytica Zellen mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Ausstattungen der Zellen ergeben sich aus den abhängigen Unteransprüchen 2 bis 11.

Die Erfindung wird weiterhin durch Plasmide zur Erzeugung rekombinanter haploider oder diploider Y. lipolytica Zellen mit den im Anspruch 12 genannten Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Ausführungen der Plasmide ergeben sich aus den abhängigen Unteransprüchen 13 bis 19.

Die Erfindung wird außerdem durch ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter haploider oder diploider Y. lipolytica Zellen mit den im Anspruch 20 genannten Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Varianten des Verfahrens ergeben sich aus den abhängigen Unteransprüchen 21 bis 23.

Verwendungen der rekombinanten haploide oder diploide Y. lipolytica Zellen sind in den Ansprüchen 24 und 25 beschrieben.

Mit der Bereitstellung von neuen low-copy und high-copy Plasmiden, geeignet zur autonomen Replikation oder zur multiplen Integration von Expressionskassetten, die unter Kontrolle eines regulierbaren Promotors (beispielsweise des ICL1 Gens kodierend für die Isocitratlyase) der Hefe Y. lipolytica stehen, lassen sich rekombinante. haploide oder diploide Y. lipolytica Zellen erzeugen. Überraschend wurde dabei festgestellt, daß diese Plasmide mit hoher Kopiezahl ins Genom integrieren und unabhängig von den Integrationsorten und Kultivierungsbedingungen stabil in Yarrowia lipolytica-Transformanden erhalten werden können.

Die so gewonnenen Zellen sind geeignet zur mikrobiellen Oxidation von hydrophoben Verbindungen und führen in einfacher Kultivierung der rekombinanten Hefen zu guten Ausbeuten des Oxidationsproduktes, insbesondere von Steroiden und anderen hydrophoben Verbindungen.

Die Hefe Y. lipolytica wird durch Transformation mit neuen Expressionsvektoren (Expressionskassetten tragende Plasmide) in das Genom so verändert, daß Y. lipolytica Zellen in der Lage sind, durch einfache Kulturführung auf Medien mit geeigneter Kohlenstoffquelle zur funktionellen Expression von heterologen Proteinen, insbesondere Cytochrom P450 Enzymen, zu gelangen. Diese heterologen Cytochrom P450 Enzyme können in Y. lipolytica Zellen besser als in arideren bisher getesteten Hefen besonders effektiv zu mikrobiellen Stoffwandlungsprozessen eingesetzt werden.

Weiterhin werden durch die Plasmide gut handhabbare Vektoren zur Verfügung gestellt, die in hoher Kopiezahl stabil ins Genom der Hefe Y. lipolytica integriert werden können und dadurch die Erhöhung der Konzentration des heterolog zu exprimierenden Proteins erlauben. Ein besonderer Vorteil dieser Plasmide ist das Vorhandensein einer "Multiple cloning site", wodurch sich DNA-Module unterschiedlichster Art (Expressionskassetten) schnell und einfach in die Vektoren einsetzen lassen. Die Plasmide sind in die repetitiven Sequenzen von Y. lipolytica (LTR-Element ZETA, rDNA Cluster) integrierbar.

Durch die Konstruktion geeigneter Plasmide zur multiplen Integration ins Genom von Y. lipolytica und die dadurch ermöglichte Erhöhung der Kopiezahl von Expressionskassetten mit regulierbaren starken Promotoren (beispielsweise ICL1- Promotor) wird die Aufgabe in vorteilhafter Weise gelöst.

Verfahrensgemäß werden die Expressionskassetten zur heterologen Expression von Proteinen in Y. lipolytica, bestehend aus dem funktionell aktiven Promotor und Terminator (z. B. aus ICL1) und dem zu exprimierenden heterologen Genen, in autonom replizierende low-copy Plasmide oder integrative high-copy Plasmide überführt, in die Hefe transformiert und zur Expression gebracht.

Die Aufgabe wird vorteilhaft durch Monooxygenasesysteme gelöst, die aus Cytochrom P450 und entsprechender NADPH-Cytochrom P450 Reduktase bestehen, welche in Y. lipolytica gleichzeitig exprimiert werden. Dabei kann eine homologe oder heterologe NADPH-Cytochrom P450 Reduktase auch unter Kontrolle eines geeigneten Promotors mit dem P450 co-exprimiert werden.

Die hydrophoben Verbindungen (Steroide und Derivate) werden in die Kulturlösung von derart gentechnisch veränderten Y. lipolytica Zellen gebracht, wodurch die exprimierten Enzyme eine selektive Hydroxylierung bewirken. Nach der Umsetzung werden die Hydroxylierungsprodukte abgetrennt. Die für die Erfindung genutzten Transformanden der Hefe Y. lipolytica können auf lang- und mittelkettigen n-Alkanen oder Ethanol für die Induktion der Expression der heterologen Gene kultiviert werden. Bevorzugte Enzymsysteme sind steroidhydroxylierende Cytochrom P450 Formen, eine NADPH-Cytochrom P450 Reduktase aus Y. lipolytica oder anderen Ursprungs. Überraschenderweise zeigen besonders die auf n-Alkan (Hexadecan) kultivierten rekombinanten Hefezellen im Vergleich mit auf Ethanol kultivierten Zellen die höchsten spezifischen Umsatzraten (pro Zelle oder pro Molekül P450 Enzym) für das Substrat Progesteron in 17α Hydroxy-Progesteron.

Die hydrophoben Substrate, insbesondere Steroidverbindungen, werden erfindungsgemäß in Kulturen intakter Zellen (Zellsuspensionen) behandelt. Die zu hydroxylierenden Stoffe werden den Zellkulturen fein gemahlen oder in organischen Lösungsmitteln, z. B. Hexadecan oder Ethanol, gelöst zugesetzt.

Das Verfahren wird bei niedrigen Temperaturen zwischen 28-32°C durchgeführt.

Die Umsetzung von mindestens 0,22 g Substrat/L Zellkultur ist im Regelfall bereits nach 10 bis 30 Stunden Kulturführung weitgehend abgeschlossen. Der Abbruch der Reaktion erfolgt durch direkte Extraktion der Kulturflüssigkeit mit Isobutylmethylketon (MiBK) oder Dichlormethan (DCM) bzw. nach Ansäuerung mit verdünnter Schwefelsäure. Eine Kontrolle des Umsatzes kann mittels Chromatographie während der Kultivierungsdauer vorgenommen werden.

Inhalt der Erfindung sind rekombinante Yarrowia lipolytica Transformanden und die neuen Vektoren pBD64, p64zb, pBD67 und p67zb bzw. ihre Derivate mit einem Promotor p64ICLpro und p67ICLpro oder funktionsfähigen Expressionskassetten (beispielsweise p64IL43, p67IL43, p64IC17α oder p67IC17α), die zur multiplen Integration ins Genom von Y. lipolytica geeignet sind. Der Aufbau dieser Vektoren ist in Abb. 3-7 dargestellt.

Die Herstellung der rekombinanten Yarrowia lipolytica-Transformanden wird durch die Konstruktion einer Serie neuer Vektoren auf der Basis eines E. coli-Vektors mit Multipler cloning site vorteilhaft gelöst, die ein Markergen zur Selektion von multi-copy Transformanden und andere chromosomale DNA-Abschnitte von Y. lipolytica enthalten, welche zur multiplen Integration ins Genom der Hefe Y. lipolytica genutzt werden.

Diese Vektoren (Plasmidlinien) tragen als Selektionsmarker zur Amplifikation der Plasmid-DNA in E. coli das Ampicillin-Resistenzgen (amp^R) und lassen sich durch ihre hohe Kopiezahl in hohen Ausbeuten aus E. coli leicht präparieren. Die Sequenzen zur Integration ins Genom der Hefe Y. Jipolytica (rDNA, ZETA) und das Selektionsmarkergen URA3d4 werden durch Umklonierung aus den Plasmiden pINA1064 und pINA1067 (Abb. 2) gewonnen. DNA-Module, z. B. Expressionskassetten, lassen sich gut in die "Multiple cloning site" einklonieren. Die daraus resultierenden erfindungsgemäßen Basisplasmide pBD64 (rDNA) und pBD67 (LTR ZETA, Abb. 3 und 4) lassen sich in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung in wenigen Schritten leicht gewinnen.

In diese Basisplasmide lassen sich in die "Multiple cloning site" vorkonstruierte Expressionskassetten, bestehend aus einem starken und gut regulierbaren homologen Promotor (z. B. /CL1-Promotor), einem heterologen Gen (z. B. Iacz oder CYP17) und einem homologen Terminator (z. B. ICL1 Terminator), leicht einfügen. Die Expressionskassetten können außerdem nach Bedarf einfach gegen andere ausgetauscht werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden diese neuen Plasmide (Expressionsvektoren) dann zur multiplen Integration der Expressionskassetten ins Genom (chromosomale Sequenzen der rDNA oder LTR ZETA) von Y. lipolytica eingesetzt. Die damit erzeugten Transformanden weisen eine stabile Kopiezahl der Expressionskassetten (von etwa 10-14) auf. Sie zeigen überraschender Weise im Vergleich mit autonom replizierenden Plasmiden (Kopiezahl 1-2) eine deutlich höhere Expression heterologer Proteine, wie es am Beispiel des Reporterproteins β-Galactosidase (lacZ Gen aus E. coli, Abb. 11) und des Cytochrom P45017α (CYP17 Gen des Rindes, Abb. 13-14) gezeigt werden kann.

Eine für die Durchführung der Erfindung wichtige Besonderheit besteht darin, daß die erhaltenen Transformanden mit einer hohen Kopiezahl der Expressionskassetten mit anderen Y. lipolytica Stämmen gekreuzt werden können. Dadurch können vorteilhafte natürliche Merkmale eingekreuzt bzw. die Expressionskassetten von mindestens zwei heterologen Genen in einem Wirt co-exprimiert werden.

Die dadurch erhaltenen diploiden Stämme zeichnen sich ebenfalls durch Stabilität der Expressionskassetten aus und sind überraschenderweise besonders gut zur P450 katalysierten Biotransformation während des Wachstums auf n-Alkan und Ethanol geeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren mit rekombinanten Y. lipolytica Zellen zeichnet sich durch hohe Hydroxylierungsraten aus. So wird das Steroid Progesteron durch Y. lipolytica besser als mit bisher untersuchten rekombinanten Zellen von S. cerevisiae umgesetzt, die ebenfalls ein steroidhydroxylierendes P45017α exprimieren.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Ausführungsbeispielen noch näher erläutert.

Ausführungsbeispiel 1 1. Verwendete Hefestämme und Vektoren

Alle Stämme entstammen, wenn nicht anders angegeben, der Stammsammlung des Lehrstuhls für Allgemeine Mikrobiologie des Institutes für Mikrobiologie der Technischen Universität Dresden.

Yarrowia lipolytica Stämme

B204-12A-213 (MATB leu2 ura3 leaky)
PO1d (MATA leu2-270 ura3-302 xpr2-322 SUC2) (Nicaud et al. 1989 Curr Genet 16: 253-260)
T4 PO1d (p67lC17cxT4), kurz T4 genannt:
integrative Transformande T4 des Stammes PO1d mit dem im ZETA Element linearisierten Plasmid p67IC17α (URA3d4 ZETA), welche ca. 8-10 Kopien der Expressionskassette ICL1_pro

l CYP17/ICL1_Ter

zur heterologen Expression des Cytochrom P45017oc des Rindes unter Kontrolle des Promotors und Terminators des ICLI Gens von Y. lipolytica trägt.
A1-5 (MATB metAlk⁺) Naturisolat.
A15T4 (Alk⁺ prototroph) - diploider Stamm, entstanden durch Kreuzung der beiden Elternstämme A1-5 (MATB met⁻ Alk⁺) PO1d (p67IC17αT4).

Saccharomyces cerevisiae

GRF18 (MATa his3-11 his3-15 leu2-3 leu2-112 can^R)

E. coli/S. cerevisiae-Shuttle-Vektoren

YEp51 (Broach JR, Li Y-Y, Wu L-CC, Jayaram M, 1983, Vectors for high-level inducible expression of cloned genes in yeast. In: Experimental Manipulation of Gene Expression [Inoye M, ed], Academic Press, New York, 83-117) enthält das LEU2 Gen dieser Hefe als Selektionsmarker, den GAL1-GAL10-Promotor und Sequenzen aus dem 2p Plasmid von S. cerevisiae als Terminationsbereich und für die Gewährleistung hoher (50-100) Kopiezahlen dieser ARS-Plasmide.
YEp5117α (High-copy Plasmid, vgl. Abb. 9); CYP17 unter Kontrolle des sehr starken GAL10-Promotors, erhalten von Dr. W.-H. Schunck (MDC Berlin-Buch):
Literatur zum Wirts/Vektorsystem: Schunck W-H et al. 1991 Eur J Cell Biol 55: 336-345; Zimmer T et al. 1995 DNA Cell Biol 14: 619-628.

E. coli/Y. lipolytica-Shuttle-Vektoren

pINA237 - E. coli/Y. lipolytica-Shuttle-Vektor pINA237 trägt neben der CEN-ARS18 Sequenz zur autonomen Replikation in Y. lipolytica das homologe LEU2-Gen sowie einen Anteil von pBR322 zur Amplifikation in E. coli. Die Kopiezahl dieses Vektors in Y. lipolytica liegt bei 1-3 pro Zelle (Fournier et al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90: 4912-4916).

pYLI131D und pIL43 (Juretzek et al. 1995 Patent DE 195 25 282 A1.)

pINA1064 und pINA1067 (Abb. 2) basieren auf dem E. coli-Vektor pBR322 und tragen das multi-copy Selektionsmarkergen URA3d4. Der URA3-Promotor besteht aus 8 Basenpaaren. Das Plasmid pINA1064 trägt die rDNA-Sequenz für die integrative Transformation in die rDNA-Sequenz (G-Einheit) des Wirtes (Fournier et al. 1986 Gene 42: 273-282). Das Plasmid pINA1067 trägt die Sequenz des LTR ZETA (long terminal repeat) des Retrotransposon Ylt1 aus Y. lipolytica (Le Dall et al. 1995 Abstract "First Yarrowia lipolytica International Meeting" Paris-Grignon).

Andere Vektoren

puCBM21 Boehringer Mannheim.

Verwendete DNA-Sequenzen

Die cDNA für das CYP17 wurde aus dem Plasmid pCMV17α (J Biol Chem 266: 5898- 5904,1991) gewonnen und kodiert für das Cytochrom P45017α der Nebenniere des Rindes. Dieses Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. M. Waterman (Vanderbilt Universität Nashville) zur Verfügung gestellt.

Verwendete Medien

Minimalmedium (YNB): 0,67 oder 1,34% Yeast Nitrogen Base (Difco), 0,4% NH₄Cl, 0,3 mg/L FeCl₃
Minimalmedium (M) für die Kultivierung von Y. lipolytica im Fermenter (Scheller U et al. 1996 Methods Enzymol 272: 6,5-75).
Zusätze von Aminosäuren (Leucin, Methionin, 30-50 mg/L) bzw. Uracil (50 mg/L) zur Komplementation der entsprechenden Mutationen je nach Bedarf für den Stamm.
C-Quellen: 1% Glucose, 1% Ethanol, 1% Hexadecan.
Vollmedium: 1% Yeast Extract, 1% Bactopeptone, 2% Glucose.
Für Plattenkultur wurden die obengenannten Medien mit 2% Agar-Agar hergestellt.

Ausführungsbeispiel 2 2. Nachweis der repetitiven Sequenzen rDNA und ZETA in verschiedenen Yarrowia lipolytica-Stämmen (Abb. 1) und Transformationseffizienzen zur Integration ins Genom

Zur Darstellung der repetitiven Sequenzen rDNA und ZETA in verschiedenen Yarrowia lipolytica-Stämmen wurden die Stämme H222 (Wildtyp), B512-3, B204-12A-213, B204- 12C, PO1d, E150 und E129 mit dem Restriktionsenzym EcoRI hydrolysiert und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA wurde auf Nitrocellulose transferiert und mit folgenden Sonden beprobt: Nachweis ZETA-Sequenz mit ZETA-Fragment aus pBD67 (Abb. 3) und Nachweis rDNA mit rDNA-Fragment aus pBD64 (Abb. 3). Dabei zeigte sich überraschenderweise, daß in den Stämmen PO1d und H222 keine ZETA- Sequenzen nachgewiesen werden konnten (Abb. 1). Trotz der fehlenden ZETA- Sequenzen lassen sich die Plasmide mit der ZETA-Sequenz ins Genom vielfach integrieren (Abb. 8).

Ausführungsbeispiel 3 3. Konstruktion der Plasmide pBD64 und pBD67 (Abb. 3)

Der E. coli-Vektor pUCBM21 wurde mit der Restriktionsendonuklease Ndel vollständig verdaut. Die einzelsträngigen Enden der verdauten DNA wurden mit Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt. Die DNA wurde mit BamHI nachgespalten. Der so vorbereitete Vektor wurde jeweils mit den EcoRI/BamHI-Fragmenten aus den Vektoren pINA1064 (3178 bp) bzw. pINA1067 (2423 bp) ligiert. Dazu wurden die Vektoren pINA1064 und 1067 (Abb. 2) mit EcoRI verdaut und die einzelsträngigen Enden mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt. Anschließend wurde die DNA mit BamHI verdaut. Die resultierenden Vektoren sind die Plasmide pBD64 (mit rDNA als Target-Sequenz) und pBD67 (mit ZETA-Element als target-Sequenz) (Abb. 3). Diese Plasmide waren nun geeignet, DNA-Fragmente (z. B. Expressionskassetten) in die "Multiple cloning site" aufzunehmen.

Ausführungsbeispiel 4 4. Konstruktion der Vektoren p64ICLpro und p67ICLpro (Abb. 5)

Für die Konstruktion der Plasmide p64ICLpro und p67ICLpro (tragen ICL1-Promotor) wurden die Plasmide pBD64, pBD67 und pYLI131D (Juretzek et al. 1997 DE 195 25 282 A1) mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und kpnI verdaut. Das den ICL1- Promotor enthaltende 2162 bp große BamHI/KpnI-Fragment wurde mit den kpnl/BamHI geöffneten Plasmiden pBD64 und pBD67 ligiert. Die resultierenden Vektoren waren p64ICLpro und p67ICLpro. Diese Plasmide enthalten den ICL1- Promotor (Abb. 5).

Ausführungsbeispiel 5 5. Konstruktion der Vektoren p64IL43 und p67IL43 zur heterologen Expression von β-Galactosidase (IacZ-Gen) aus E. coli (Abb. 6)

Für die Konstruktion der Vektoren p64IL43 und p67IL43 wurden die Plasmide p64ICLpro und p67ICLpro mit BamHI verdaut und anschließend dephosphoryliert. Aus dem Plasmid pIL43 (Juretzek et al. 1995 DE 195 25 282 A1) wurde das 3833 bp große BarnHI-Fragment isoliert und mit den geöffneten Vektoren ligiert. Die resultierenden Plasmide waren p64IL43 und p67IL43 (Abb. 6) und enthalten die Expressionskassette ICL1-Promotor/IacZ-Gen/ICL1-Terminator.

Ausführungsbeispiel 6. Konstruktion der Vektoren p64IC17α und p67IC17α zur heterologen Expression von Cytochrom P45017α aus der Nebennierenrinde des Rindes

Die Klonierung der Expressionskassette für die heterologe Expression von CYP17 (Rind) unter Kontrolle des ICL1-Promotors wurde in mehreren Teilschritten, durch Umklonierung der CYP17-cDNA in den Vektor pYLI131D und durch Amplifizierung von DNA, die die korrekte Fusion des CYP17 ORF an den ICL1-Promotor ermöglicht, realisiert. Dazu wurde der für den C-Terminus kodierende Teil der CYP17 cDNA aus dem Vektor YEp5117α (Abb. 9) als HindIII/Bg/II-Fragment gemeinsam mit dem ICL1- Terminator-Fragment BamHI/HindIII in den BamHI/Bg/II geöffneten Vektor pYLI131D ligiert (Vorkonstrukt). Die Expressionskassette wurde komplettiert durch Einfügen des Bg/II-PCR-Fragmentes, welches mittels einer Zweischritt-rekombinanten PCR erzeugt wurde. Im ersten Schritt wurden separat das ICL1-Promotor/Intron- und das CYP17- Fragment von den Plasmiden pYLI131D bzw. YEp5117α mit folgenden Oligonukleotiden amplifiziert.
Amplifizierung ICL 1-Promotorl Intronfragment:
Primer 1, 5'-TAGATCTGGGGATCCCCAGTAGACTGACCAAGC-3';
Primer 2, 5'-CACTGGGTTAGTACGGG-3'.
Amplifizierung des CYP17-Fragmentes:
Primer 3, 5'-CCCGTACTAACCCAGTGTGGCTGCTCCTGGCTG-3';
Primer 4, 5'-TTATGTTGGTCACCGCC-3'.

Im zweiten Schritt wurden die Fragmente an sich überlappenden Sequenzen rekombiniert und mit Primer 1 und 4 amplifiziert. Das rekombinierte PCR-Produkt wurde als Bg/II-Fragment in das Vorkonstrukt eingesetzt und der autonom replizierende low-copy Vektor pIC17α (Abb. 9) erhalten. Durch Umklonierung als MluI/kpnI-Fragment in die Vektoren p64IL43 oder p67IL43 (Abb. 6) wurden die Vektoren p64ICl7α bzw. p67IC17α (Abb. 9) erhalten.

Ausführungsbeispiel 7 7. Konstruktion der Vektoren p64zb und p67zb

Die Vektoren pBD64 und pBD67 wurden mit der Restriktionsendonuklease HindIII partiell hydrolysiert, mit dem Enzym Klenow-Fragment die freien DNA-Enden aufgefüllt und religiert. Die Plasmide mit einem HindIII-Ort in der Multiple cloning site wurden isoliert und mit HindIII erneut hydrolysiert. Die linearisierten Fragmente wurden dephosphoryliert und mit nachfolgend beschriebenen HindIII-verdauten PCR- Fragmenten ligiert. Die korrektorientierten Vektoren p64zb und p67zb wurden isoliert.

Das PCR-Fragment zur Insertion in den Vektor pBD64 wurde von dem selbigen Plasmid mit den Oligonukleotiden 5'-attaagcttcggtatgataggaagag-3' und 5'-tggaagcttgggagaccccaagg-3' amplifiziert. Unter Nutzung der Oligonukleotide 5'-tgtaagcttcgtacgggagagttagtcatccgac-3' und 5'-aagaagcttaagggaggtgtcctgttccac-3' wurde vom Plasmid pBD67 das PCR-Fragment zur Insertion in den Vektor pBD67 synthetisiert.

Durch Insertion von Expressionskassetten in die Multiple cloning site muß der dritte Not1-Ort (Plasmid p67zb) bzw. SacII-Ort (Plasmid p64zb) eliminiert werden, da durch Hydrolyse mit den jeweiligen Enzymen die Abtrennung der E. coli-haltigen DNA erfolgt.

Ausführungsbeispiel 8 8. Integrative Transformation von Y. lipolytica PO1d und Bestimmung der integrierten Expressionskassetten

Zur integrativen Transformation in Y. lipolytica wurden kompetente Zellen erzeugt und mit linearisierter Plasmid-DNA (0,2-1 µg) und Carrier-DNA (2-5 µg) transformiert. Dazu wurde das Plasmid p64IL43 mit dem Restriktionsenzym SacII und das Plasmid p67IL43 mit NotI vollständig verdaut (siehe Abb. 6). Die Ura⁺Transformanden wurden nach 4 bis 14 Tagen auf Agar-Selektionsmedium erhalten. Die dabei erreichte Transformationseffizienz lag zwischen 3 und 50 Transformanden pro µg Plasmid-DNA (Methoden nach Barth und Gaillardin 1996 The dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. In Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer Verlag, Heidelberg, pp 313-388).

Zur Bestimmung der Kopiezahl der ins Genom integrierten Expressionskassetten wurde die Total-DNA der untersuchten Transformanden isoliert und vollständig mit BamHI verdaut. Die so gewonnene DNA wurde gelelektrophoretisch in 0,8% Agarose aufgetrennt und auf Nylonmembran geblottet. Zur Southern-Hybridisierung wurde als Sonde ³²P-radioaktivmarkierte DNA des bekannten ICL1-Introns aus Y. lipolytica eingesetzt. Die Verteilung der Radioaktivität und deren Intensität wurde mittels Phosphorimager "Storm" (MD) analysiert. Die Kopiezahl wurde aus dem Verhältnis der Intensität der 3833 bp Bande (integrierte lacZ-Expressionskassette) und der 2281 bp-Bande (chromosomales homologes ICL1-Gen) ermittelt. Die ermittelten Kopiezahlen lagen zwischen 4 und 38 Kopien pro Zelle (Abb. 10). Die durchschnittliche Kopiezahl liegt bei 10 bis 14 Kopien pro Zelle. Transformanden mit geringerer Kopiezahl wuchsen langsamer als der Wildtyp. Transformanden mit durchschnittlicher oder höherer Kopiezahl wuchsen vergleichbar schnell zum Wildtyp.

Ausführungsbeispiel 9 9. Expression der β-Galactosidase-Aktivität von multi-copy Transformanden

Zur Bestimmung der Expression der β-Galactosidase unter Kontrolle des induzierbaren ICL1-Promotors wurden die Transformanden auf Selektionsmedium mit Glucose für 28 h bei 28°C vorkultiviert und nach zweimaligem Waschen mit Medium ohne C-Quelle auf Selektionsmedium mit Ethanol zur Bildung der β-Galactosidase umgesetzt. Die optische Dichte (OD₆₀₀) zum Start der Induktion lag bei 0,7-1. Zur Bestimmung der spezifischen β-Galactosidase-Aktivität wurden alle 30 Minuten über 13 Stunden Proben entnommen (Reynolds und Lundblad 1994 In: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. /Eds/ J Wiley, New York, Vol 2, Unit 13.6.1). Als Vergleich wurde die Expression der β-Galactosidase mit dem low-copy Expressionssystem pIL43 (Juretzek et al. 1995 D195 25 282 A1) im Stamm PO1d bestimmt (Abb. 11).

Ausführungsbeispiel 10 10. Bestimmung der Stabilität von Transformanden

Zur Ermittlung der Stabilität wurden Transformanden in nichtselektivem Vollmedium (YPD), in Minimalmedium YNB mit Uracil und Glucose sowie in Minimalmedium mit Uracil und Ethanol über 20 Generationen kultiviert. Die Kopiezahlen wurden wie unter Punkt 5 bestimmt. Die getesteten Transformanden trugen nach 20 Generationen vergleichbar viele Kopien wie die Ausgangstransformanden. Transformanden mit 10 bis 14 Kopien pro Zelle wachsen normal und die Kopiezahlen sind in der Zellpopulation stabil.

Ausführungsbeispiel 11 11. Vergleich der Cytochrom P45017α Aktivität nach heterologer Expression in Y. lipolytica (Abb. 13 und Abb. 14)

Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität von heterolog exprimiertem Cytochrom P45017α in Y. lipolytica oder in S. cerevisiae wurden die Zellen im Schüttelkolben in Minimalmedium (M) mit induzierenden und nicht induzierenden C-Quellen kultiviert. Zum Zeitpunkt des Startes der Hauptkultur und alle 3 h über 25 h wurden Proben entnommen und die OD₆₀₀ durch Zugabe des entsprechenden Mediums auf eine OD₆₀₀ von 2 bis 4 eingestellt. Zu 1 ml dieser Verdünnung wurden 100 nmol ³H-Progesteron (gelöst in Ethanol) zugesetzt und die Kulturen für 30 min bzw. 60 min bei 28°C, 240 U/min im Schüttelinkubator kultiviert. Der Ansatz wurde mit 2 ml Dichlormethan extrahiert und die organische Phase gewonnen, eingedampft und in 100 µl Chloroform/­ Essigsäureethylester (3 : 1, Laufmittel) aufgenommen. Die Proben wurden dünnschichtchromatographisch auf Kieselgelplatten aufgetrennt und die Verteilung der Radioaktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb. 12 und Abb. 14 dargestellt.

Ausführungsbeispiel 12 12. Gewinnung des diploiden rekombinanten Stammes (A15T4), Fermentation von A15T4 auf Hexadecan, Biotransformation von Progesteron (Abb. 15)

Der diploide Stamm A15T4 wurde durch Kreuzung der Stämme A1-5 und T4 erzeugt (Diploidisierung nach Barth und Gaillardin 1996) The dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. In: Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Wolf K, ed, Springer Verlag, Heidelberg, pp 313-388).

Dieser Stamm wurde zur Umsetzung von Progesteron zu 17α-Hydroxprogesteron im 1-Liter-Bioreaktor eingesetzt (Abb. 15).

Medienzusammensetzung

Minimalmedium (M) für die Kultivierung von Y. lipolytica im Fermenter (Scheller U et al. Methods in Enzymology 272: 65-75 1996).

Fermentationsparameter

Volumen 1 LiterArbeitsvolumen
Temperatur: 28°C
Rührung: 750-1000 U/min
pH-Wert: 4,60, Regelung durch Zugabe von ca. 2M NaOH
Belüftung: 1-2 vvm zur Gewährleistung von 30-100% O₂

-Sättigung
Antischaum: Antifoam 289 (SIGMA A5551)

Kulturverlauf

1 Liter-Hauptkultur im Fermenter

• 1. Vorkultur - 10 ml M (1% Glucose)
• 2. Vorkultur - 100 ml M (1% Glucose)
  Start der Hauptkultur

Variante A

• 1) 900 ml M (0,2% Glucose) - Start mit 100 ml 2. Vorkultur Start-OD₆₀₀ ca. 1-1,5
• 2) Wachstum auf Glucose bis zum Glucoseverbrauch (nach ca. 6-8 h), bei OD₆₀₀ von ca. 5 angezeigt durch Stop der Säuerung bzw. leichten pH- Anstieg)
• 3) Zugabe von 1% Hexadecan (autoklaviert)
• 4) Beginn Verwertung von Hexadecan nach ca. 1-2 h Zugabe von 0,05% Progesteron mit 1% DMF (0,5g Progesteron in 10 ml DMF)
• 5) 2 ml Probennahme vor (Blindwert), sofort nach Progesterongabe und alle 2-3 h während der Kultivierung Extraktion mit 4 ml Dichlormethan (oder Isobutylmethylketon) und Analyse
• 6) Nach ca. 14 h Zugabe von weiteren 3% Hexadecan,

Variante B (Abb. 15)

• 1) 900 ml M (1% Hexadecan)-Start mit 100 ml 2. Vorkultur Start-OD₆₀₀ ca. 1-1,5
• 2) Nach 14h Zugabe von 0,05% Progesteron mit 1% Dichlormethan (0,5 g Progesteron in 10 ml Dichlormethan)
• 3) weiter wie Variante A Punkt 5

Analysen

Biomasse (OD₆₀₀

)
Progesteron-Umsetzung durch 2 ml Probennahme, sofortige Extraktion mit 4 ml Dichlormethan bzw. Isobutylmethylketon
Analyse durch TLC, GC oder HPLC.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von in den Abbildungen dargestellten Ausführungsbeispielen noch weiter erläutert.

Abb. 1: Nachweis der repetitiven Sequenzen rDNA und ZETA in verschiedenen Y. lipolytica-Stämmen durch Southern-Hybridisierung

0,5 µg chromosomale DNA wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Zur Detektion wurden die ZETA-Sequenz (A) aus dem Plasmid p67ICLpro bzw. rDNA (G-Unit)-Sequenz (B) aus dem Plasmid p64ICLpro als Fluorescein-markierte Sonden eingesetzt. Auftragung: 1 λ-DNA EcoRI/HindIII 2 H222, 3 B512-3, 4 B204-12A-213, 5 B204-12C, 6 PO1d, 7 E150, 8 E129

Abb. 2: Restriktionskarten der Ausgangsplasmide für die Konstruktion neuer Vektoren für die multi-copy Integration ins Genom von Y. lipolytica

Das Plasmid pINA1067 enthält das im Promotorbereich stark verkürzte URA3d4 Gen als Selektionsmarker für die multi-copy Integration, die Sequenz des ZETA-Elements des LTR (long terminal repeat) aus dem Retrotransposon Ylt1 von Y. lipolytica als Zielort für die Integration und den Promotor und Terminator des XPR2 Gens der alkalische Protease von Y. lipolytica. Das Plasmid pINA1064 enthält neben dem URA3d4 Gen und dem Promotor und Terminator des XPR2 Gens ein Fragment aus dem rDNA Gen (G-Einheit) von Y. lipolytica für die Integration ins Genom. Beide Plasmide wurden von Dr. J.-M. Nicaud (INRA-CNRS, Thiveral-Grignon, Frankreich) erhalten.

Abb. 3: Restriktionskarten der neu konstruierten Basisplasmide pBD67 und pBD64 zur multi-copy Integration in das Genom von Y. lipolytica

Die Plasmide basieren auf dem E. coli Vektor pUCBM21. Sie tragen das im Promotor defekte URA3d4 Gen als multi-copy Selektionsmarker. Das Plasmid pBD64 ist für die Integration in die rDNA (G-Unit) geeignet, das Plasmid pBD67 kann zur Integration in das LTR-Element ZETA (long terminal repeat) des Retrotransposons Ylt1 genutzt werden.
rDNA = rDNA-Fragment von Y. lipolytica G-Einheit, URA3d4 = defektives URA3 Gen von Y. lipolytica, amp^R = Ampicillin Resistenzgen, ZETA = LTR (long terminal repeat) des Retrotransposons Ylt1.

Abb. 4: Restriktionskarte der multi-copy "self cloning" Vektoren p64zbICLpr und p67zb zur Integration von E. coli-freier DNA ins Genom von Yarrowia lipolytica

Vektor basiert auf dem Plasmid pBD67 (Abb. 3) und trägt zusätzlich ein verkürztes ZETA-Element. Nach Verdau mit der Restriktionsendonuklease Not1 kann die DNA mit Ursprung aus dem Bakterium E. coli abgetrennt werden. URA3d4 = Selektionsmarker ZETA = LTR des Retrotransposon YIt1 aus Yarrowia lipolytica. ZETA' = Teil des LTR des Retrotransposons Ylt1 aus Yarrowia lipolytica. amp^R = Ampicillin-Resistenzgen.

Abb. 5: Restriktionskarten der multi-copy Vektoren p64ICLpro und p67ICLpro

Das Plasmid p64ICLpro enthält das rDNA-Fragment und das URA3d4 Gen aus pINA1064 und den ICL1-Promotor. Der SacII-Ort in der rDNA kann zur Linearisierung des Plasmides für eine integrative Transformation in das rDNA-Cluster (G-Einheit) genutzt werden. Das Plasmid p67ICLpro enthält das ZETA Element und das UHA3d4 Gen aus dem Plasmid pINA1067 und den ICL1-Promotor. Der Not/-Ort kann zum Öffnen des Plasmides für die anschließende Integration in die ZETA-Elemente des LTR (long terminal repeat des Retrotransposons Ylt1) des Wirtsgenoms genutzt werden. Heterologe Gene (lacZ oder CYP17) können nach Fusion mit dem ICL1- Terminator leicht in diese Plasmide eingefügt werden. Dadurch werden komplette Expressionskassetten in den abgeleiteten Plasmiden geschaffen (vgl. Abb. 5 und Abb. 6, Erläuterungen der Abkürzungen vgl. auch Abb. 3).

Abb. 6: Restriktionskarten der multi-copy Vektoren p64IL43 und p67IL43 zur heterologen Expression des lacZ Gens aus E. coli in der Hefe Y. lipolytica

Die Vektoren basieren auf den Plasmiden pBD64 und pBD67 (vgl. Abb. 3) und tragen die Expressionskassette für das lacZ Gen unter der Kontrolle des ICL1-Promotors und Terminators.
rDNA = rDNA-Fragment von Y. lipolytica G-Einheit, URA3d4 = defektives URA3 Gen, amp^R = Ampicillin Resistenzgen, ICLpro = 1CL1-Promotor, ICLI = ICL1-Intron, ICLt = ICL1-Terminator, ZETA = LTR ZETA (long terminal repeat) des Retrotransposons YIt1 von Y. lipolytica.

Abb. 7: Restriktionskarten der multi-copy Expressionsvektoren Plasmid p64IC17α und p67IC17α für die heterologe Expression des Cytochrom P45017α (CYP17) der Nebenniere des Rindes in Yarrowia lipolytica

Die Vektoren basieren auf den Plasmiden pBD64 und pBD67 (vgl. Abb. 3) und tragen die Expressionskassette für CYP17 P450 Gen unter der Kontrolle des ICL1-Promotors und Terminators. Erläuterungen der Abkürzungen vgl. Abb. 6.

Abb. 8: Transformationseffizienz von kompetenten Zeilen der Stämme PO1d und E129

Zellen wurden mit 200 mg linearisierter Plasmid-DNA und 5,0 µg Carrier-DNA transformiert. Die Transformanden wurden nach 3-14 Tagen beobachtet.

Abb. 9: Restriktionskarten der autonom replizierenden Plasmide YEp5117α und pIC17α zur heterologen Expression des Cytochrom P45017α der Nebenniere des Rindes in der Hefe Yarrowia lipolytica und in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Der Vektor YEp5117α wurde durch Dr. W.-H. Schunck (MDG Berlin-Buch) zur Verfügung gestellt. Für die Herstellung des Vektors YEp5117α wurde die cDNA für das CYP17 aus dem Plasmid pCMV17α in mehreren Schritten in den high-copy Hefe- Shuttle-Vektor YEp51 (LEU2, 2 µ ARS, Kopiezahlen von 50-100) kloniert. Der Vektor YEp5117α erlaubt die durch Galactose induzierbare Expression des P45017α in der Hefe S. cerevisiae unter Kontrolle des GAL10-Promotors. Die cDNA für das CYP17 wurde aus dem Plasmid pCMV17α (J Biol Chem 266: 5898-5904, 1991) gewonnen und kodiert für das Cytochrom P45017α der Nebenniere des Rindes. Dieses Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. M. Waterman (Vanderbilt Universität Nashville) zur Verfügung gestellt. Das Plasmid pIC17α basiert auf dem autonom replizierenden low­ copy Vektor pINA237 (ARS18/CEN, gewährleistet 1-3 Kopien pro Zelle) für Y. lipolytica und enthält eine Expressionskassette für das Cytochrom P45017α (CYP17) unter der Kontrolle des ICL1-Promotors (ICLp/ICLi/CYP17/ICLt). Die cDNA CYP17, codierend für das Cytochrom P45017α des Rindes, wurde in mehreren Schritten in den low-copy Vektor pYLI131D für Y. lipolytica anstelle des ICL1 Strukturgens eingesetzt. Dazu wurde die cDNA mit Hilfe der rekombinanten PCR direkt am T₃₆₀G₃₆₁ des 3'-Endes des Introns im ICL1-Promotor fusioniert. Das resultierende Plasmid pIC17α erlaubt die Expression des P45017α unter Kontrolle des regulierten /CL1-Promotors nach korrektem Spleißen des Introns und der Neuformierung des Translationsstarts A₁U₃₆₀G₃₆₁.

Abb. 10: Kopiezahlen der Expressionskassetten für das lacZ Gen unter Kontrolle des ICL1-Promotors in integrativen multi-copy Transformanden des Y. lipolytica Stammes PO1d mit dem Plasmid p64IL43

Ausgewählte Transformanden mit dem integrativen Plasmid p64IL43 (vgl. Abb. 6) wurden in YNB/Glucose Medium kultiviert. Die Kopiezahl wurde durch Southern Blot Hybridisierung mit dem ³²P-markierten ICL1-Intron als Sonde bestimmt. Die Kopiezahl wurde aus dem Verhältnis der Bandenintensität bei 3.8 kb (lacZ Kassette) und 2.2 kb (ICL1 als eine Kopie pro Genom) kalkuliert. Als Vergleich diente eine Transformande mit dem autonom replizierenden ARS/CEN Plasmid pIL43.

Abb. 11: Abhängigkeit der maximalen spezifischen β-Galactosidase-Aktivität von der Kopiezahl der Expressionskassetten in Transformanden von Yarrowia lipolytica PO1d, die durch das low-copy replikative Plasmid pIL43 oder durch das multi-copy integrative Plasmid p64IL43 transformiert wurden

Dargestellt ist ein Vergleich der maximalen spezifischen β-Galactosidase-Aktivitäten nach 10 bis 12 h Kultivierung im Minimalmedium mit 1% Ethanol als induzierender C- Quelle. Die β-Galactosidase-Aktivität wurde als Miller Units bestimmt. Die Kopiezahl der Expressionskassette wurde in jeder Transformande mit Zellen der Glucose- Vorkultur bestimmt (vgl. Abb. 10).

Abb. 12: Nachweis der funktionellen Expression von Cytochrom P45017α der Nebenniere des Rindes in einer Transformande der Hefe Yarrowia lipolytica mit dem low-copy ARS/CEN Plasmid pIC17α unter Kontrolle des ICL1-Promotors

• (A) Dünnschichtchromatographische Analyse der Umsetzung von ³H-markiertem Progesteron (P, 100 nmol in 1 ml Versuchsansatz) durch intakte Zellen (1 × 10⁸ Zellen/ml) bei der Inkubation von auf Hexadecan kultivierten Transformanden des Stammes Y. lipolytica B204-12A-213 mit dem Plasmid pIC17α und pINA237 (als Negativkontrolle). Der Reaktionsansatz wurde mit 2 ml Dichlormethan extrahiert, bis zur Trockne eingedampft, in jeweils 100 µ1 Laufmittel (Chloroform/­ Essigsäureethylester 3 : 1) gelöst und dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Die Verteilung der Radioaktivität wurde mit einem Bertholdt-Radioscanner bestimmt. Die Laufstrecke für das Hauptprodukt war identisch mit dem des 17α-Hydroxy- Progesterons (17ºHP).
• (B) Cytochrom P45017α katalysierte Umwandlung von Progesteron (P) in das Produkt 17α-Hydroxy-Progesteron (17αHP).

Abb. 13: Vergleich der Expressionssysteme für Cytochrom P45017α in den Hefen Yarrowia lipolytica (low-copy Plasmid pIC17α und Saccharomyces cerevisiae (multi-copy Plasmid YEp5117α) bei der Nutzung von autonom replizierenden Plasmiden Abb. 14: Vergleich des spezifischen Gehaltes von Cytochrom P45017α nach heterologer Expression in den Hefen Yarrowia lipolytica und Saccharomyces cerevisiae von Plasmiden mit hoher Kopiezahl

Maximalwerte des spektral mit Hilfe des CO-Differenzspektrums bestimmbaren P450 Gehaltes in der multi-copy Transformande T4 von Y. lipolytica PO1d (Integration von 8-10 Kopien der Expressionskassette mit Hilfe des Plasmides p67IC17α Expression unter Kontrolle des ICL1-Promotors) bei Kultivierung auf 1% Ethanol im Minimalmedium. Als Vergleich sind Werte aufgeführt, die mit dem autonom replizierenden high-copy Plasmid YEp5117α (ca. 50 Kopien pro Zelle) im Stamm S. cerevisiae GRF18 bei Kultivierung auf Galactose (Expression unter Kontrolle des GAL10-Promotors) erzielt wurden.

Abb. 15: Kultivierung des diploiden Yarrowia lipolytica Stammes A15T4 auf Hexadecan (C16) und Biotransformation von Progesteron in 17α-Hydroxy- Progesteron

Vorkultur auf 1% Glucose, Kultur in 1 L Bioreaktor auf 1% C16. Nach 14 h Kultivierung Zugabe von 0.5 g Progesteron in 10 ml Dimethylformamid (DMF) und Zugabe von 2% C16.

Claims (26)

1. Rekombinante haploide oder diploide Yarrowia (Y.) lipolytica Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Plasmide mit Expressionskassetten beinhalten, wobei die Expressionskassetten aus in Y. lipolytica funktionell aktiven Promotoren und Terminatoren und Genen oder cDNA zur Expression von Oligopeptiden oder Proteinen bestehen und damit Eigenschaften ausbilden, die zur Stoffumwandlung ausgenutzt werden.

2. Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Expressionskassetten zur Expression von Genen oder cDNA, codierend für Cytochrom P450 Enzyme, enthalten.

3. Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Expressionskassetten zur Expression von Genen oder cDNA, codierend für Elektronentransfersysteme zur Übertragung von Elektronen auf Cytochrom P450

Enzyme (z. B. NADPH-abhängige Cytochrom P450 Reduktase, Cytochrom B₅, Adrenodoxin und/oder Adrenodoxin-Reduktase), enthalten.

4. Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen verschiedene Expressionskassetten zur gleichzeitigen Expression (Koexpression) von Genen, codierend für Elektronentransfersysteme zur Übertragung von Elektronen auf Cytochrom P450 Enzyme und Cytochrom P450 Proteine, enthalten.

5. Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Expressionskassetten enthalten, bestehend aus dem Promotor und Terminator der homologen Isocitratlyase (ICL1 Gen) und Genen zur heterologen Expression.

6. Zellen nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Verbindungen, die native oder artifizielle Cytochrom P450 Enzymsubstrate sind, aufnehmen, enzymatisch umwandeln, in der Zelle akkumulieren oder an die Umgebung abgeben.

7. Zellen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Steroide oder Analoga aufnehmen, enzymatisch umwandeln und in der Zelle akkumulieren oder an die Umgebung abgeben.

8. Zellen nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen diese Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen z. B. bei der Verwertung von Glucose, Glycerol, Ethanol, Fettsäuren oder Alkanen ausbilden.

9. Zellen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen diese Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen besonders bei der Verwertung von mittel- und langkettigen n-Alkanen ausbilden.

10. Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen integrative multi-copy Plasmide, bestehend aus E. coli-freier DNA ("self cloning vectors"), einem Selektionsmarkergen zur Selektion von multi-copy Transformanden und aus anderen chromosomalen Y. lipolytica DNA-Fragmenten, die geeignet sind zur Integration ins Genom der Hefe Y. lipolytica, enthalten.

11. Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen integrative multi-copy Plasmide, bestehend aus Replikons bakteriellen Ursprungs, einem Selektionsmarkergen zur Selektion von multi-copy Transformanden und aus anderen chromosomalen Y. lipolytica DNA-Fragmenten, die geeignet sind zur Integration ins Genom der Hefe Y. lipolytica, enthalten.

12. Plasmide zur Erzeugung rekombinanter haploider oder diploider Yarrowia (Y.) lipolytica Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide Expressionskassetten, bestehend aus einem in Y. lipolytica funktionell aktiven Promotor und Terminator und einem Gen oder einer cDNA zur Expression von Oligopeptiden und Proteinen, in der Multiple cloning site enthalten.

13. Plasmide nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide Expressionskassetten, bestehend aus dem Y. lipolytica ICL1-Promotor und ICL1- Terminator und einem Gen zur Expression von Oligopeptiden und Proteinen, in die Multiple cloning site enthalten.

14. Plasmide nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide vielfach ins Genom der Hefe Y. lipolytica integriert sind.

15. Plasmide nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide in die Sequenzen des LTR-ZETA-Element ("Long Terminal Repeat" des Retrotransposons Ylt1) von Y. lipolytica integriert sind.

16. Plasmide nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide in die Sequenzen der rDNA integriert sind.

17. Plasmide nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide in die Sequenzen der G-Einheit der rDNA integriert sind.

18. Plasmide nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide illegitim ins Genom integriert sind.

19. Plasmide nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide zur Expression von heterologen Proteinen in transformierten Hefezellen geeignet sind.

20. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten haploiden oder diploiden Yarrowia (Y.) lipolytica Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassetten in die Multiple cloning site der Plasmide eingesetzt werden und die Y. lipolytica Zellen mit den die Expressionskassetten tragenden Plasmiden transformiert werden.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide auf Replikons bakteriellen Ursprungs aufgebaut werden.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide aus zwei ZETA-Elemente ("Long Terminal Repeats" LTR des Retrotransposons Ylt1) aus Y. lipolytica erzeugt werden, die den DNA-Anteil aus E. coli flankieren und vor der Transformation der Y. lipolytica Zellen der E. coli DNA-Anteil abgetrennt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide aus zwei rDNA-Elemente aus Y. lipolytica erzeugt werden, die den DNA-Anteil aus E. coli flankieren und vor der Transformation der Y. lipolytica Zellen der E. coli DNA-Anteil abgetrennt wird.

24. Verwendung von rekombinanter haploider oder diploiden Y. lipolytica Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die transformierten Zellen heterologe Proteine synthetisieren.

25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß nachdem von den transformierten Zellen heterologe Proteine synthetisieren worden sind, die transformierten Zellen zur gezielten Stoffumwandlung eingesetzt werden.