CN1723286A - 用基因变异的酵母Yarrowia Lipolytica制造柠檬酸的生物技术方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用一基因变异的酵母YarrowiaLipolytica以生物技术制造柠檬酸的方法，此处将一个对异柠檬酸裂解酶活性编码的基因序列稳定地多重整合在酵母基因组中，本发明的优点在于使不希望生成的副产物异柠檬酸明显减少。

Description

用基因变异的酵母Yarrowia Lipolytica 制造柠檬酸的生物技术方法

本发明涉及用基因变异的酵母Yarrowia Lipolytica(欧蓍草脂解酶下称Y.Lipolytica)制造柠檬酸(CS)的生物技术方法。

目前，99％的柠檬酸是采用生物技术途径选择的子囊菌种墨曲霉进行大规模工业生产的，特别是以糖蜜和其它含糖的农业废料用作碳-源(c-源)，按这种方法也含生成大量液体和固体的副产物。以结晶形态销售的柠檬酸广泛地用于各工业部门，主要是在食品工业和医药工业中作为味觉载体、防腐剂、酸味剂和抗氧剂使用(Roehr et al.1996，citric acid，Biotechnology vol.6，Rehm and Reed，eds)。

有意义的是另一可选择的方法，它系用Y.Lipolytica酵母生产柠檬酸，该方法基于此酵母的性能，能利用一系列疏水性的作用物如植物性和动物性的油和油脂或正烷烃作为c-源。从60年代中期以来已知Y.Lipolytica在特定条件下具有分泌柠檬酸(cs)和异柠檬酸以及媒解代谢作用的其它代谢产物，如丙酮酸酯和α-酮戊二酸酯的能力。自那时起广泛地研究了相应的培养条件，对这类代谢物过量生产和析出最重要的先决条件是同时存在可利用c-源的生产培养物的生长限制(stottmeister et al.1982，Z Allg Mileroliol.22：399-424)。此处培养物生长限制是通过限定必要的营养培养基成分，例如矿物质、维生素和氨基酸来达到的。所生产代谢产物的种类取决于起限制作用的营养物组分和其它培养条件，如采用的c-源或生产培养基的pH-值。

氮-、磷-、硫-或镁-缺乏可导致柠檬酸和异柠檬酸的过量生产[stottmeister et al.1982，Z Allg.Mikrobiol 22：399-424]。因而对营养缺陷型菌种通过氨基酸缺乏能诱发cs/ics的生成(Barth imd Krebs 1984，DD 227 448 A1)；与此相反，通过硫胺素缺乏的生长限制引起生成α-酮戊二酸和丙酮酸酯，而硫胺素不只是由Y.Lipolytica本身生成的(Weissbrodt et al.1988，DD 267999 A1，Chernyavskaya et al.2000，ApplMicro-biol Biotechnol 53：152-158)。

在一柠檬酸生产的工业过程中，不希望同时产生10％以上的异柠檬酸(以cs+1cs)总酸含量计，因为这会增加产品加工，尤其是增加CS结晶的困难。

Cs/1cs产物的比例和产品收率对Y.Lipolytica的野生型菌种与所用的c-源有关，对葡萄糖和甘油而言，Y.Lipolytica生成约90％的CS和10％1CS(Treton et al.1978，Appl Microbiol Biotechnol 6：67-77)，在应用乙醇作为C-源时得到相似的产物比例(Arzumanvv et al.2000，ApplMicrobiol Biotechnol 53：525-529)。在用对工业应用有意义的疏水性作用物，如植物油或n-烷烃时，产物比例移向1CS一部分从40至50％。(概况一览参见Stotlmeister et al.1982，z Allg Mikrobiol 22：399-424，和Finogenova 1991，in：Alkane metabolism and oversynlhesis ofmetabolites by microorganismus，Finogenova TV and sharyshev AA，eds，Center for Biological Research，udssR Academy of Science，Pushchino，Russia，pp96-114)，降低这种高含量的1CS-组分对用Y.Lipolytica进行工业规模生产柠檬酸成为决定性的成本要素。

在此基础上对自发产生的或通达化学的或UV致突变制成的Y.Lipolytica突变体进行选择，使其改变CS/1CS产物比方面做了大量工作。在这类突变化的其它试验研究中发现柠檬酸一和乙醛酸-循环酶的表达和调节有不同的变异，研究主要集中在顺头酸酶(ACO)、异柠檬酸列介酶(1CL)和异柠檬酸脱氢酶(NAD(P)-1DH)上。

Akiyama等人(1972，Agric Biol chem 36：339-341)表明，通过化学致突变制得的突变体与较高ACO-活性的野生型菌种相比，能使CS/1CS产物比有利于向1CS方向移动，在Finogenova等人的工作中(Finogenva 1991.In：Alkane metalolism and oversynthesis of metaloliteby microorganismus，Finogenova TV and sharyshev AA，eds，center forBiological Research，uSSR Academy of science，pushchino，Russia，pp96-114)制成的突变体与提高和减少1CS聚积的野生型相比，在柠檬酸和乙醛酸循环酶的比活性方面显示有一系列的变异。另外获得的知识是源自于通过确定的培养条件有目的地改变比酶活性，这样Hattori等人(1974，Hakko kogatku zasshi 52：542-550)证明，通过用氨调节pH值对石蜡培养降低了顺序头酸酶和与NADP相关联的异柠檬酸脱氢酶的比活性，使产物比有利于向CS的方向移动。

尽管有许多论据认为柠檬酸和乙醛酸循环酶影响产物分布，但是生物化学和分子生物的关联迄今仍然不是很清楚。按目前已知的方法仍然不能有目的地制取对CS-生产形成较少1CS聚积的高效生产菌种。

近20年来基于在Y.Lipolytica酵母方面所进行的分子生物学深入研究，使得对基因型的菌种优化所有必要的方法都可利用(Barth andGaillardin 1997，FEMS Microliol BW 19：219-237)，大量能参予疏水的作用物利用的基因都已进行了表征和克隆。迄今由上述的乙醛酸循环酶描述和克隆了异柠檬酸裂介酶(ICL-1)结构基因的序列(Barth andscheuler 1993，Mol Gen Genet 241：422-430)。该基因的很强的和有良好调控性的启动子多次用于在Y.Lipolytica的蛋白质源性的表达(Juretzeket al.1995，DE 195 25 282，Juretzek et al.1998，DE 19932811，WO0003008)。

本发明的任务是开发一种用Y.Lipolytica酵母制取柠檬酸的方法，其中产生的异柠檬酸明显减少，而且可能成为有经济效益的柠檬酸生产方法。

按本发明该项任务通过一种Y.Lipolytica酵母细胞以生物技术制造柠檬酸的方法得以解决，包括的步骤为：

a)在一个对生长有重要作用的基因中存在缺陷的酵母细胞进行转化，它有一个对多次基因组整合适宜的载体，该载体含有作为选择标记物起作用的且能补偿上述缺陷的基因；

b)酵母是在一碳源和营养缺乏条件下培养的；

c)柠檬酸的净化，

此处，载体含有对异柠檬酸列介酶(1CL)活性编码基因序列的表达盒带和克隆是选择在一适宜的营养培养基中进行的，它稳定地在其基因组中整合了对1CL活性编码基因序列和选择标记物的多个拷贝。

1CL活性编码基因在酵母基因组中通过用特异多重拷贝的质粒载体的转化作用和选择印制达到多次整合，为此将一个对1CL活性编码的基因序列克隆在一个含有多重拷贝选择标记物的载体上，并且该载体转化到与选择标记的相匹配的Y.Lipolytica菌种中。

为此优选是将一个基因序列克隆在一载体上，该载体是按SEQID NO.1编码的蛋白质。按SEQ ID NO.1的本发明的1CL-蛋白质在它的序列中与由Barth和Schenben在1933，Mol Gen Genet 241：422-430中所述已知的序列有显著的区别。

在一优选的实施模式中，将一按SEQ ID NO.2的表达盒带克隆在载体中，此时按SEQ ID NO.2表达盒带含有一按SEQ ID NO.1编码的本发明蛋白质的基因序列。

适宜的载体和Y.Lipolytica菌种对专业人员是已知且可得到的，该载体除了选择标记物，例如URA3-基因的等位基因变异体之外，还含有一同源的转化平台，如核糖体DNA(rDNA)或称为zeta的由Y.Lipolytica构成的反转座子Ylti的LTR-序列(长末端重复)，这样一个转化平台有可能对在酵母基因组中经常存在的序列通过同源性再组合进行整合(Juretzek et al.2001，Yeast 18：97-113)。

集成转化是以线性化的载体应用醋酸锂方法实现的(改良的Barthand Gaillardin 1996，Yarrowia lipolytica.Ln：Nonconventional yeasts inBiotechnology，woll k，ed，Springer-verlag，Berlin Heicleelerg New York，p313-388)。

转化为与标记基因相匹配的Y.Lipolytica菌种，在URA3-等位基因作为选择标记物的情况下它例如是Y.Lipolytica是菌种，而在其中URA3-基因是有缺陷的。带有URA3-基因缺陷的Y.Lipolytica菌种和它的制造方法在文献中已有描述(Barth und Gaillardin 1996，Yarrowialipolytica.In：Noncon-ventional Yeasts in Biotechnology，woll k，ed，springer-Verlag，Berlin Heidellerg New York，pp313-388).

本发明方法的优点主要在于能够简单和有针对性地制备用于柠檬酸生产有效的Y.Lipolytica菌种，而其异柠檬酸的生成则减少。

优选采用的载体是含有按SEQ ID NO.2的表达盒带。

在实施实例1中描述了载体p641CL1和P671CL1转化为在URA3-基因中有缺陷的Y.Lipolytica菌种H222-S4(URA3-302)。质粒p641CL1和p671CL1含有一个在启动子区的URA3-基因缩短了的等位基因URA 3d4作为选择标记物。通过ura3d4-等位基因中启动子区的缩短，使ura3d4的多次整合进入酵母基因组中成为必要，以便补偿在uRA3-基因中的缺陷。带有其它多重拷贝选择标记物的质粒，例如LEU2-基因相应的等位基因变异体质粒和相应的Y.Lipolytica菌种也可以应用。

异柠檬酸裂介酶基因产物的表达度在Y.Lipolytica菌种中得到明显提高，该菌种将1CL-1-基因多次整合在其基因组中，同时比1CL尖性达到稳定的增加。令人惊异地发现，通过转录的、转译后的和代谢的反调节机制既不能相抵提高的1CL1-表达度，也不能抵消1CL活性(参见实施例2)。

为了制造柠檬酸，多次将1CL-1-基因整合于其基因组中的按本发明的Y.Lipolytica菌种在导致CS和1CS过量生产的营养缺乏条件下进行培养，例如在氮-、磷-、硫-、镁-缺失条件或应用缺乏氨基酸的营养缺陷型菌种。

优选通过1CL-1-基因稳定地整合在本发明的生产柠檬酸菌种的酵母基因组中，不再有用高成本化学品选择压力，因而本发明制备的生产柠檬酸的菌种在用于大容积的生物反应器(发酵罐)中不会有问题。

按本发明方法的一个重要经济的优势是用于生产柠檬酸的Y.Lipolytica菌种可以利用多种不同的C-1源，例如葡萄糖、甘油乙醇、正-烷烃、植物性或动物性油类或油脂。按本发明方法所用上述的作用物不希望得到的异柠檬酸的聚积与野生型菌种相比都明显减少。这样在用将1CL1-基因多次整合到其基因组中的Y.Lipolytica菌种制造柠檬酸时，令人惊异地出现CS/1CS产物比明显地移向柠檬酸的方向(见

实施例3)。

由于异柠檬酸成分大量减少，使随后的柠檬酸净化过程大为简化，可以用已知的方法例如通过沉淀或色谱方法实现。

本发明的另一对象是在实施例1中应用的按SEQ ID NO.2的表达盒带。

本发明的对象还有含有按SEQ ID NO.2的表达盒带的载体，优选是载体p641CL1ak p671CL1，它们的序列与SEQ ID NO.3或SEQID NO.4的序列相符。

本发明其它对象是Y.Lipolytica菌种，它将一个1CL活性编码的基因序列多个拷贝稳定地整合到它的基因组中，优选是按SEQ ID NO.2的序列。

优选还有是用p641CL1或p671CL1载体之一转化的Y.Lipolytica菌种。

另外优选是根据布达佩斯协定在Braunschweig市的德国微生物和细胞培养收藏公司(DSMZ)寄存的Y.Lipolytica Hzz-S4(p641CL1)T1菌种，寄存号为15105。

本发明的对象还有应用一种按本发明的Y.Lipolytica菌种生产柠檬酸。

通过下述实施例对本发明作进一步阐述。

在这些实例中应用了下面的酵母菌种和载体：

用于Y.Lipolytica转化的野生型一和实验室菌种

·H222(MATA)野生型菌种(Mcucerlerger et al.2001，J Bacteriol183：5102-5109)。

·H222-S4(MATA ura3-302)：由于酒酵母的SUC2-基因插入，通过来自质粒p1NA302的具有4.3kb Sa/1的集成转化破坏URA-3基因制成H222。(auerlerger et al.2001，J Bacteriol 183：5102-5109)。该菌种含有如同222，无自由的Zeta要素或无完整的Ylt 1(Juretzek et al.2001，Yeast 18：97-113)。

·E129L1(MATAlys 11-23ura 3-302xpr 2-322)：由实验室菌种E129(MATA 1ys 1r23 leu2-270ura3-302xpr 2-322)与质粒PINAbz的亮氨酸的营养缺陷型的互补作用制备的。(Barth and Gaillarohin 1996，Yarrowia lipolytica.1wi Nowconventional Yeasts in Biotech nology，wollk，ed，springer-verlag，Berlin Heidellerg New York，pp313-388).

在实施例中所用的菌种来自于Dresden技术大学的微生物系(研究所)的菌种收集室。

实施例1

1CL1-基因多重整合于Yarrowia lipolytica中

Y.Lipolytica多重拷贝转化的集成的载体

为了将1CL1-基因多重整合在酵母基因组中，设计了在质粒p641p和p671p的基础上的多重拷贝载体p641CL1和p671CL1(图1SEQID NO.3和4)在Y.Lipolytica中的1CL1-启动子的监控条件下蛋白质进行异源性表达(Juretzek et al.2001，Yeast 18：97-113)。所用的原料载体p641CL1和p671CL1包含来自Y.Lipolytica的1CL1-启动子片段，作为多重拷贝的选择标记物系用Y.Lipolytica的URA3-基因的ura 3d4-等位基因。该标记物序列使得在URA3-基因(ura)中带有缺陷的Y.Lipolytica菌种有机会多重拷贝转化，作为同源性转化平台载体拥有来自Y.Lipolytica(p671p)被称为zeta的反转座子Ylt1的长末端重复(LTR)序列或rDNA序列(p641p)与rDNA相反zeta不是在所有的Y.Lipolytica菌种中出现。这样，载体p671p或p671CL1对zeta自由菌种的转化，其转化效率要小得多。

往载体p641p或p671p中添加1CL1-结构基因的2，3Kb BamH1片段，这样获得的载体p641CL1和p671CL1(图1)含有完全的1CL1-基因作为表达盒带(按seq ID NO.2)。

1CL1-基因多重整合于Yarrowia lipolytica中

为了扩展整合载体，采用DH5αC的大肠杆菌菌种，为此将该大肠杆菌细胞在37℃时于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB-培养基中进行培养。载体DNA的分离是按Samlrook等人的质粒制备方法实现的(1989，Molecular cloning：A Laloratory Manual.Cold spring lfartorlaloratory Press，New York).

载体(图1)是应用按Barth和Gaillardin改进的醋酸锂方法(Barthand Gaillardin 1996，Yarrowia lipolytica in：Noncon-ventioral Yeasts inBiotechnology，wollk，ed，Spninger-verlag，Berlin Heidoellerg New York，pp313-388)用Sacll(p641CL1)或Notl(p671CL1)线型化后集成转化为受体菌种H222S4和E129L1，为转化须各加2-5μg质粒-DNA，由于载体的多重拷贝整合带有URACIL-缺陷裣的转化株是在葡萄糖作为C-源的最小培养基M的琼脂板上经过28℃3天至10天的培养选择的(按Reader改良的：Mauerslerger et al.1996，candida waltosa.In：nonconventional Yeasts in Biotechnology，woll k，ed，Springer-Verlag，Berlin Heidellerg New York，pp411-580)。

含有rDNA载体p641CL1的转化株(TF)是用两种原料菌种H222-S4和E129L1以30至70TF/μgDNA的频率获得的，zeta自由菌种H222-S4可以用zeta载体p671CL1只能以约0.5-1TF/μgDNA的较低效率转化，相反拥有许多zeta拷贝的菌种E129L1可用载体p671CL1以30TF/μgDNA的效率进行转化，与此相对照含有单一拷贝质粒p651CL1和p661CL1的集成转化(含有ura 3d1一等位基因代替ura 3d4作为选择标记物，而在其它构成方面如同p64或p67型的质粒；参见Juertzek et al.2001，Yeast 18：97-113)效率明显要高，可达到1600至2400TF/μgDNA，但即便在这种情况下含有zeta质粒p671CL1的H-222-S4菌种的转化效率仍明显降到30TF/μgDNA。

H222-S4难分离p671CL1转化株的制取是有意义的，因为以往的结果表明，含有p67型质粒的转化株通过在不同位置的连续整合和/或多重整合比p64型质粒的转化株往往具有较大的稳定性，因为后者是通过整合到具有较大柔性为特征的核糖体DNA(rDNA)区而形成的(Juretzek et al.2001，Yeast 18：97-113)，因此含有p671CL1的H222-S4的多重拷贝转化株与H222-S4(p641CL1)型的转化株是可以比拟的。

实施例2

1CL1-多重拷贝转化株的表征

Southern-印迹法

1CL1-基因多重整合在挑选的转化株中的验证可借助Southern-杂交法完成，为此采用的受体菌种和挑选出的转化株的基因组的DNA是应用Hoffmann和winston方法(1987，Gene 57：267-272)经机械细胞粉碎之后制备的。这种特殊的制备和检测是借助美国生命科学公司的“Gene lmages random prime lalelling and detectlin system”完成的。

为确定1CL1-基因的拷贝数(图2)将基因组的DNA全部用限制酶NC01裂解，制备物经二以胶电泳拆分和继而经膜印迹之后，应用1CL1-结构基因的2.3kb Bam H1片段作为杂交检测探头，在两个分析的原料菌种中检出1CL1-基因的基因组拷贝的3个特殊带(在图2的a、d、e带)即约在4.500、约1.300和1.233bp。在试验的H222-S5(p641CL1)型的转化株T1还出现了2.9kb和1.9kb的带(在图2的b和c带)，它们是由多重整合的载体产生的，在1.233bp处的带(图2中e带，1CL1的NC01片段)通过经整合载体的等效片段进一步加强。经Southern-杂交化得到的X-光片，扫描出拷贝数的估值，并且用Phosphoimager STORM的图像量子软件(Amersham PharmaciaBiotech)进行加工，该程序与图片中不同强度的带对比和将它们换算成比例关系，从原料菌种H222-S4和转化株的带强度的对比数值可以作出附加于1CL1拷贝的H2220-S4(p641CL1)T1拷贝数估计为15至25。

在另一分析(图3)中整合载体的拷贝数也可通过查证在转化载体中作为标记物采用的ura3d4-等位基因确定，将带有Sa/1基因组的DNA完全限制后由Y.Lipolytica URA-基因的1.7kb片段作为用于southern印迹的检测探头，原料菌种H-222S4在该条件下显示出4.3kb的特殊带(在图3的a带)，该带是由URA3-基因大为缺失的保留基因组片段产生的(在H-222的URA3-基因的基因破坏是由于通过由Pina302质粒中的-4.3kg sa/l片段的集成转化作用，而使URA3-ORF缺失和插入酒酵母的Suc2-基因引起的)。试验的H-222-S4(p641CL1)转化株T1，T9和T11还在2.8kb处出现了一很强的特异带(图3中的b带)，它是由多重整合载体的URA3d4-等位基因产生的，通过转化株H-222-S4(p641CL1)中特异的URA3d4b带(图3)与原料菌种(1个拷贝)的URA3-302的等位基因(a带)带相比，其强度增强；这说明了拷贝数的增多。从带的强度比较(图3的a带与b带)可估计试验的p641CL1的转化株在酵母基因组中集成质粒的拷贝数约为10至24，这与对1CL1-拷贝描述的结果相当符合。

原料菌种和转化株的异柠檬酸裂解酶活性的比较

原料菌种H-222-S4和挑选的1CL1-多重拷贝转化株的异柠檬酸裂解酶的比活性是通过不同碳源的培养确定的。

为此先将菌种在-100ml的振荡并中，加入25ml含有2％葡萄糖作为C-源的酵母一最小培养基M以及必需的添加物(0.3μg/ml硫胺素盐酸盐对所有的培养物，40mg/l尿嘧啶对H222-S4)在水平振荡器上于28℃以230rpm(转/分)的速度培养(第1步预培养)，用2.5mol/lNaOH调节pH值到5.5至6之后，将20ml的第1步预培养物转加到含有100ml同样营养培养基的500ml的锥形烧瓶中(第2步预培养)。第2步预培养在上述的条件下经15至24小时培育和为使之培养物接种在调节pH后，加到含有100ml酵母最小培养基M和必需的添加物(硫胺素、尿嘧啶)以及不同C-源(2％葡萄糖，1％乙醇，5％向日葵籽油或5％十六碳烷烃)500ml的锥形瓶中，接种是以达到2至3*10⁷细胞/ml的接种浓度结束，培养过程如同预培养所述进行。

在经过所选定的培育时间之后获得了5至10ml酵母悬浮液和在4℃以3000rpm速度离心分离5分钟粒状物用冰冷却的溶解缓冲剂(100mM Tris-Hle，5mM Mgcl₂ pH7.0)洗涤，尔后，在1ml的该缓冲剂中再成为悬浮液，经悬浮的细胞随后通过在有玻璃珠(0.45-0.5mm)的试管中强有力地涡旋(1分钟3次，其间至少在冰中培养2分钟)，使其分解，在4℃至3000rpm的离心分离，5分钟后得到不含细胞的萃取液，用于测定异柠檬酸裂解酶活性及蛋白质浓度。异柠檬酸裂解酶活性的测定是按Dixon和Kornlerg(1959，Biochem.J 72：3)用光度分析法实施的，其原理是在30℃时经3-5分钟的时间在324nm处由苯肼和乙醛酸生成苯腙，为计算出比异柠檬酸裂解酶活性可根据Lowry等人(1951.J Biol.Chem.193：265-275)的方法测定该无细胞萃取液的蛋白质浓度。

在采用葡萄糖和乙醇作为C-源(图4)培养H222-S4和转化株H222-S4(p641CL1)T1时，经过9小时对两作用物进行培育，转化菌种的比1CL活性与原料菌种相比提高了15至14倍。在优选的试验条件下经过约9小时后，所有经试验的菌种都出现最大的比1CL活性，在此，最大活性之前和之后测定证明转化株与原料菌种相比，其比1CL活性相对增大很多，对两个以乙醇为C1源的其它多重拷贝H222-S4(p641CL1)型转化株的试验证明上述的发现，经12小时培养得出原料菌种H222-S4的比1CL活性为221m¹¹/mg蛋白质；反之，转化株H222-S4(p641CL1)T9和T18则具有约20倍的较高比1CL活性，达到4264或4790m¹¹/mg蛋白质。

转化株H222-S4(p641CL1)T1与原料菌种相比，其1CL活性的提高也在生产柠檬酸时添加疏水作用物葵花籽油和十六碳烷烃情况下得到证实(图5)，为此，加入酵母最小培养基M采用降低铵氮含量1g/l(NH₄)₂SO₄，这样经过约3天的培养，由于在缺失氮的条件下，实现了培育物的生长限制和旅发柠檬酸和异柠檬酸的生产。在生长和生产周期中，由比1CL活性的测定表明，发现在整个培养过程中转化株H222-S4(p641CL1)T1的比1CL-1活性与原料菌种相比较增大了约20倍。

通过测定比发酵活性验证的1CL过表达度，这是由于1CL-基因多次整合在酵母基因组中所致，在无细胞萃取液按Laemmil(1970Neture 227：680-685)的方法的聚丙烯酰胺二以胶电泳(SDS-PAGE)中显得更为清楚(图6)，该萃取液来自原料菌种H222-S4和转化株H222-S4(p641CL1)T1由乙醇培养的细胞。在约60kDa区域(1CL分子量)转化株与原料菌种比较，用Coomassie-染色法可观察到在SDS-PAGE中的蛋白质带有明显增大。

实施例3

用原料菌种H222，H222-S4和挑选的1CL1-多重拷贝转化株的林檬酸生产。

培养用于柠檬酸生产的预培养物

培养物在一有100ml YPD的500ml振荡瓶中经24h在28℃用230rpm的水平振荡器进行培育，尔后，在消毒条件下以500rpm的速度离心分离5分钟，而粒状物在无氮添加的酵母最小培养基M中2次洗涤，细胞粒随后加到5ml无氮添加的最小培养基M中，用于主体培养物的接种。

生产柠檬酸的主体培养物

用于柠檬酸生产的培养是在含有各100ml酵母-最小培养基M的-500ml的锥形瓶中实施的，M的硫酸铵含量降低到1g.l，根据试验的目的各加入3～10％的葡萄糖、葵花籽油、陈化脂肪(植物性脂肪混合物)或十六碳烷烃，葵花籽油无需先前的作用物准备阶段，相反，陈化脂肪是以水乳液(20％陈化脂肪用1％的非离子活性剂Tween 80在水中借助超声波乳化)形式加入，此外，所有培养物都加0.3μg/ml的硫胺素盐酸盐和在H222-S4时再加40mg/l的尿嘧啶，培养经接种后(接种子滴定率0.5至20D-光密度为60mm)是在一水平振荡器上于28℃以230rpm经5至12天的时间，在这过程中借助2.5mol/l，5mol/l或10mol/l的NaOH将pH均衡地调到6.0。

在培养基中铵氮含量的分析是用Dr.Lange GmbH公司(“Dusseldorf”)生产的酶试仪Teskit实施的。柠檬酸和异柠檬酸浓度分析是利用R-Biopharm公司(Darmstaolt)的酶试仪(kitNr.0139076或04144331或借助Dionex公司(美国的Sunnyvale)离子色谱系统DX-320进行的(分离柱lon pac As 15，2mm直径，导电探测器CD25a自动采样AS40)。

柠檬酸和异柠檬酸的生成

在选择的培养条件下经过3-4天时间后，由于在C-源过量的同时氮的缺乏，使酵母培养物生长达到极限，从而诱发生产柠檬酸和异柠檬酸，在图7中以野生型H222在加入葵花籽油作为C-源的情况下，用图形描述了在振荡瓶中产生氮限制的所有生产CS/1CS试验所用的培养周期。在葵花籽油H222的振荡培养物的选择条件下得到的产物生成率在生物质量浓度(酵母干物料)为13至14g/l时，柠檬酸在190至250mg/l*h之间(全酸CS+1CS为340-390mg/l*h)。从图7中可看出，通过长培养周期(直至20天)和作用物为8～10％葵花籽油时，CS/1CS产物生成可提高到100-150g/l(总酸含量)。

应用这些培养条件试验了在不同C-源中原料菌种H222和H222-S4以及挑选的1CL1-多重拷贝的H222-S4(p641CL1)和H222-S4(p671CL1)型的转化株的CS/1CS产物比(图8表1)。用葵花籽油的H222-S4经15至18天的培养用8-10％的葵花籽油作C-源获得的总酸含量CS+1CS约为80-85g/l；CS/1CS比平均为60∶40，在相同条件下试验转化株H222-S4(p641CL1)T8，T9，T11，T12，T16，T17和T18，其总酸量为80至100g/l时具有明显有利的产品分布(图8)CS/1CS为94∶6至96∶4。用挑选的H222-S4(p671CL1)型的转化株达的相类似的结果。1CL1-多重拷贝转化株对产物比明显移向有利于柠檬酸的结论，在用葡萄糖、陈化脂肪(植物性脂肪混合物)和十六碳烷烃培养时得到了证实(表1)。

表1Y.Lipolytica H222，H222-S4(ura3-302)以及1CL1-多重拷贝的转化株H222-S4(p641CL1)和H222-S4(p671CL1)在不同的C-源中生产CS/1CS的产物比

C-源	菌种	5-18天后的酸浓度(g/l)			CS∶ICS
						CS	ICS	CS+ICS
		葡萄糖	H222H222-S4H222-S4(p641CL1)T11)H222-S4(p671CL1)T5	51.239.628.548.8					6.93.81.11.8	58.143.429.650.6	88∶1291∶996∶496∶4
甘油	H222				61.8	7.1	68.9	90∶10
		陈化脂肪	H222-S41)H222-S4(P641CL1)T11)	9.512.3					5.90.6	15.412.9	62∶3895∶5
葵花籽油	H222H222-S41)H222-S4H222-S4(p641CL1)T11)H222-S4(p641CL1)T9-T18H222-S4(p671CL1)T5				43.013.148-5139.580-9542.7	23.59.630-342.83-53.7	66.523.280-8542.385-10046.4	65∶3557∶4360∶4094∶695∶592∶8
		十六碳烷烃	H222-S4H222-S4(p641CL1)T1	28.442.7					17.31.6	45.644.3	62∶3896∶4

在用葵花籽油试验时将酵母细胞加到含有100或200ml的有1g/l(NH₄)₂SO₄和5-6％C-源的最小培养基M的500ml振荡并中经5至12天或直至18天培养，在较长时间培养过程中当作用物虚弱时要计量补加C-源(总共8-10％作用物)，经5-7天短时间的培养期后即获得的用¹⁾标记的数据

借助下述的图示对实施例作进一步阐述：

图1多重拷贝转化作用载体p641CL1和p671CL1的构成。

描绘了所加入的多重拷贝带有rDNA序列(p641CL1)的载体，它通过集成转化的1CL1-基因提高了拷贝数，还描绘了作为同源性转化作用序列的zeta序列(p671CL1)，这些载体包含来自带启动子(p1CL1)，内含子(1CL1)、1CL1(1CL1DRF)空匠读码和终端子(1CLT)的Y.Lipolytica的1CL1-基因作为功能性的表达盒带，以及包含Y.Lipolytica URA3-基因的ura3d4等位基因作为多重拷贝选择标记物，载体在用Sac11(P641CL1)或Not(p671CL1)线型化之后集成转化到Y.Lipolytica的基因组中。

图2 1CL1-基因拷贝数增大的证明

借助来自Y.Lipolytica 1CL1-基因的2.3kb BamH1片段，通过限制酶Ncol和特异带的检测，描绘了基因组的DNA在完全消化后的Southern-印迹。

绘制：

1：原料菌种H222-S4；2：原料菌种E129L1；

3：多重拷贝转化株H2222-S4(p641CL1)T1；MW：分子量标准，检测带

a，d：在约4500和1300bp处的基因组1CL1-片段；

e：来自在1233bp的载体或基因组的1CL1-片段；

b，c：来自在1.9kb和2.9kb处的载体p641CL1的含1CL1的片段。

图3ura 3d4等位基因的拷贝数增大的证明

借助来自Y.Lipolytica ura 3d4-等位基因的1.7kb sal1片段，通过限制酶Sal1和特异带的检测描绘了基因组DNA完全消化后的Southern-印迹。

绘制：

1.原料菌种H222-S4；2-4；多重拷贝转化株H222-S4(p641CL1)T1，T9和T11；MW：分子量标准。

检测带

a：具有在4.3kb的ura3-302的基因组片段

b：来自在2.8kb的载体p641CL1的含ura3d4的片段

图4以葡萄糖和乙醇为C-源时，由于培养的1CL-基因的多重拷贝整合，增大比1CL-活性的证明

绘图表示了原料H222-S4和多重拷贝转化株H222-S4(p641CL1)T1的培养，以葡萄糖或乙醇为C-源时，经过27小时的培养时间比1CL活性的变化，基于通过葡萄糖对1CL的阻遇可见到在该作用物上1CL-活性显著低于乙醇时的活性，它与该转录调节作用和其它代谢调节机制无关，始终可以验证在相似的培养条件下，从6小时起转化株H222-S4(p641CL1)T1的比1CL-活性比原料菌种至少高出10至20倍。

图5以葵花籽油和十六碳烷烃为C-源时，由于培养的1CL1-基因的多重拷贝增大比1CL-活性的证明

绘图表明了原料菌种H222-S4和多重拷贝转化株H222-S4(p641CL1)T，在葵花籽油或十六碳烷烃中经16-、40-和162小时的培养后的比1CL-活性，在选择的培养条件下经过40至50小时后诱发了柠檬酸和异柠檬酸的生产(生产阶段)，验证了在整个培养基(生长和生产阶段)转化株H222-S4(p641CL1)T1的1CL-活性比原料菌种高20倍。

图6：借助SDS-PAGE证明在1CL1-多重拷贝转化株中的异柠檬酸裂解酶的过表达度

描绘了在以乙醇为C-源时经过3、6、9和12小时培养在SDS-PAGE中的无细胞蛋白质萃取液的电泳拆分(比较图4)，蛋白质的拆分(每个样品为20μg蛋白质的图示)是在8％的聚丙烯酰胺二以胶中在20至50mA时实施的。与原料菌种H222-S4比较，证明试验的1CL1-多拷贝转化株H222-S4(p641CL1)T1经过整个培养期在约60kDa(1CL的分子量)有明显的强蛋白质带。

图7：以H222在葵花籽油中为实例，在氮限制条件下用Y.Lipolytica生产柠檬酸的培养变化过程

绘图表明在振荡瓶试验中，在含有减少硫酸铵含量到1g/l(生产培养基)和5％葵花籽油作为C-源的改性酵母-最少培养基M中生产柠檬酸时Y.Lipolytica培养的变化过程，在氮源虚弱和培养物生长限制开始后经约60至70小时培养，开始生产柠檬酸和异柠檬酸，在该条件下用葵花籽油的H222达到产物生成速率在生物质量浓度(酵母干物料)为13至14g/时柠檬酸为190至250mg/l*h(CS和1CS总酸为340至390mg/l*h)。

图8：由于用葵花籽油培养时1CL1-基因多重拷贝整合移动CS/1CS产物比的证明

绘图表明用8至10％的葵花籽油为C-源，经18天培养，原料菌种H222-S4和转化株H222-S4(p641CL1)T8、T9、T11、T12、T16、T17和T18的CS/1CS产物比，原料菌种在全部酸含量(CS和1CS)为80g/l至85g/l小时的CS/1CS之比为60∶40(57∶43至65∶35)。在同样条件下试验的转化株在总酸含量为80至100g/l时，显示出非常有利的产物分布为94∶6至96∶4。

在说明书和图中应用了下述的缩写：

bp            碱基对

C-Quelle      碳源

CS            柠檬酸

DNA           脱氧核糖核酸

DSMZ          德国微生物和细胞培养物收藏公司

E.coli        大肠杆菌

ICL           异柠檬酸裂解酶

ICS           异柠檬酸

kb            千克-碱基对

KDa           千克-道尔顿(质量单位)

MW            分子量标准

OD            光密度

PAGE          聚丙烯酰胺二以胶电泳

LTR           长末端重复

rDNA          核糖体DNA

rpm           每分钟转数

SDS           十二烷基硫酸钠

TF            转化株

URA-3         对尿嘧啶-生物合成有催化作用的乳清酸核苷-5’-磷酸盐-脱羧酸酶的第3步

Y.lipolytica  欧蓍草脂解酶

Zeta          来自Y.Lipolytica的反转座子的LTR

酵母菌种Y.Lipolytica H222-S4(p641CL1)T1已于2002.7.16依照布达佩斯协定寄存在DSMZ，德国微生物和细胞培养物收藏公司

Mascheroder Weg 1b

D-38124 Brauschweig

其寄存号为DSM15105

经律师担保，与申请附在一起的软盘中的4顺序(序列)与申请的顺序相一致。

Dresden，den 2003.7.16

H.Uhlemann

专利律师

                          序列表

序列记录

序列记录1-顺序排列表1-SEQ ID No 1

<110>Dresden技术大学

<120>用一种基因变异的酵母Yarrowia lipolytica制造柠檬酸的生物技术方法

<130>017P22PCT

<150>DE 102 33 600.8

<151>2002-07-16

<160>4

<170>专利在3.1分类

<210>1

<211>540

<212>PRT

<213>欧蓍苯脂解酶

<220>

<221>蛋白质

<222>(1)..(540)

<223>

<400>1

Met Ser Glu Gln Gln Arg Phe Asn Asn Glu Val Glu Glu Ile Lys Lys

1               5                   10                  15

Trp Trp Ser Ser Pro Arg Trp Lys His Thr Lys Arg Val Tyr Ser Pro

            20                  25                  30

Glu Asp Ile Ala Ser Arg Arg Gly Thr Ile Lys Val Pro Gln Ala Ser

        35                  40                  45

Ser Gln Gln Ala Asp Lys Leu Phe Lys Leu Leu Gln Glu His Glu Lys

    50                  55                  60

Asn His Thr Ala Ser Phe Thr Tyr Gly Ala Leu Asp Pro Val Gln Val

65                  70                  75                  80

Thr Gln Met Ala Lys Tyr Leu Asp Ser Ile Tyr Val Ser Gly Trp Gln

                85                  90                  95

Ser Ser Ser Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro Ser Pro Asp Leu Ala

            100                 105                 110

Asp Tyr Pro Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val Glu His Leu Trp Phe

        115                 120                 125

Ala Gln Leu Phe His Asp Arg Lys Gln Asn Glu Glu Arg Leu Ser Leu

    130                 135                 140

Pro Glu Ser Glu Arg Ser Lys Leu Pro Ala Pro Val Asp Tyr Leu Arg

145                 150                 155                 160

Pro Ile Ile Ala Asp Ala Asp Thr Gly His Gly Gly Leu Thr Ala Val

                165                 170                 175

Val Lys Leu Thr Lys Met Phe Ile Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile His

            180                 185                 190

Ile Glu Asp Gln Ala Pro Gly Thr Lys Lys Cys Gly His Met Ala Gly

        195                 200                 205

Lys Val Leu Val Pro Ile Gln Glu His Ile Asn Arg Leu Ile Ala Ile

    210                 215                 220

Arg Ala Ser Ala Asp Ile Phe Gly Ser Asp Leu Leu Ala Ile Ala Arg

225                 230                 235                 240

Thr Asp Ser Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr Ser Ser Ile Asp Tyr Arg

                245                 250                 255

Asp His Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Thr Asn Lys Asp Ala Gly His Leu

            260                 265                 270

Val Asp Val Met Val Ala Ala Glu Leu Glu Gly Lys Gln Gly Ala Ala

        275                 280                 285

Leu Gln Ala Val Glu Asp Glu Trp Asn Arg Lys Ala Gly Val Lys Leu

    290                 295                 300

Phe His Glu Ala Phe Ala Asp Glu Val Asn Ala Gly Ser Tyr Ser Asn

305                 310                 315                 320

Lys Ala Glu Leu Ile Ala Glu Phe Asn Lys Lys Val Thr Pro Leu Ser

                325                 330                 335

Asn Thr Pro Ala Leu Glu Ala Arg Ala Leu Ala Ala Arg Leu Leu Gly

            340                 345                  350

Lys Asp Ile Tyr Phe Asn Trp Glu Ala Ala Arg Val Arg Glu Gly Tyr

        355                 360                 365

Tyr Arg Tyr Gln Gly Gly Thr Gln Cys Ala Val Asn Arg Gly Ile Ala

    370                 375                 380

Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Ile Trp Met Glu Ser Lys Leu Pro Asp

385                 390                 395                 400

Tyr Ala Gln Ala Lys Glu Phe Ala Glu Gly Val Lys Asn Ala Val Pro

                405                 410                 415

His Gln Trp Leu Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Phe Asn Trp Thr Thr

            420                 425                  430

Ala Met Ser Pro Glu Asp Gln Glu Thr Tyr Ile Ser Arg Leu Ala Lys

        435                 440                 445

Leu Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Leu His Thr Asn

    450                 455                 460

Ala Leu Ile Ser Asp Lys Phe Ala Lys Ala Tyr Ser Glu Arg Gly Met

465                 470                 475                 480

Lys Ala Tyr Gly Gly Glu Ile Gln Gln Pro Glu Ile Asp Gln Gly Cys

                485                     490             495

Glu Val Val Lys His Gln Lys Trp Ser Gly Ala Glu Tyr Ile Asp Gly

            500                     505             510

Ile Leu Arg Met Val Thr Gly Gly Ile Thr Ser Thr Ala Ala Met Gly

        515                 520                 525

Ala Gly Val Thr Glu Asp Gln Phe Lys Ser Lys Leu

   530                  535                 540

序列记录2-顺序排列表2-SEQ ID No2

<110>Dresden技术大学

<120>用一种基因变异的酵母Yarrowia lipolytica制造柠檬酸的生物技术方法

<130>017P22PCT

<150>DE 102 33 600.8

<151>2002-07-16

<160>4

<170>专利在3.1分类

<210>2

<211>4447

<212>DNA

<213>Yarrowia lipolytica

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(2178)

<223>pICL1D-ICL1的启动子

<220>

<221>exon

<222>(2179)..(2179)

<223>ICL1 exon 1-仅有1核苷酸A

<220>

<221>intron

<222>(2180)..(2537)

<223>ICL1i-在启动ATG中ICLi-的内含子-在恰当剪接之后AUG形成

after

     correct splicing

<220>

<221>外显子

<222>(2538)..(4159)

<223>ICL1外显子2-除在剪接之后形成启动AUG外包括全部ORF

<220>

<221>终端子

<222>(4160)..(4447)

<223>ICL1t-ICL1终端子在4425位对BamHI定点起动用

4425

<400>2

ctcgagatgg acatacttgt atcgtcgccc tatgtactcg taatgcaagg gattccacca

60

gacattcctg ccacaatggc agggtccgtg aaaacgccga ccactgacaa gatgccttgt

120

tcgtcttgac cacggactaa ctggcacaag cgagattaac gtcgtcggag actattcggc

180

acacaaggcc agactgtgtg gcacttctca tctctcgtac cgacctctgt caacagtcta

240

accgattttt aatgctcgat attaccaatg tttctttgtg tcttttaacc agaacaaccg

300

agcagacccg aacaggtgcc gaacatgtga atagcagtgc tggagctcca tcagtaagca

360

taataacaca gctgcccagc gacctccgcc cagcgacctc tacccagcga cctcgggcac

420

gtgactatct gctccgttcc tcgcggtcgc tggcacgctg gcaaatctgg ggtctccaca

480

ttttcccccg gatgtcttgt tccgtagcgt gactcatgcg gaatgacgtg aatgtaggag

540

gggctgagaa tggggtccgc agttgataac cggggattat tggccggcgg cattgtcaac

600

caggtgtttt cactggcgtt cctagaataa aaagaaatag gcgaccccct tgagcgagtt

660

cagcggcggc aaaatgcctg ttgaaacacc tactttgttc ccagcacccc catcggataa

720

atggagacgc atacatcggc tatgtttgga tacgatcttg ggccggtgtg cgtggtgtgc

780

gcggtcattt tgttctcctt ttggacccac gcaaggttca accgaacccc ggattcgact

840

gtgaaaacga acaacggttt agtgcggttt aaaaagtatc aagttcaggg agggaagcga

900

tccaggccaa cagctatgac caagaaacca agcgaccaag acatctgaag accaacaaaa

960

ccaataatcg ctcaccagat gctccccaaa cactaacggc agactctact ccagatttgc

1020

acttgtagga ccccgatatc gggttgcaga tcatggtgtc ataatctctg aacgtgaagg

1080

ttaggtggag gggatgtttt ggccagaaat gagcggtttt gtgagcttgg agacggtaaa

1140

tcggatacgc ccagcgtgag gattccatag accccctcct tttgccagta tatccaccgc

1200

aacacccacc atgagcgaca tctgataccg tgccgcgacc actaccccaa ataagctcca

1260

actaatatgc cgaggcaggt gggaaactat gcactccagt cgacgctgta gaagcacatg

1320

gaaggtgcgg aggcggtggc aacgaggggc atgagccatc aacgagtaac cacagacaag

1380

gcaagggggg aaacgcgacc ggaatctctc gcggtcacgt gacccgcccg ggttccactc

1440

gtccatgttg tgtctctggt gtcttcggcc gactcgcatt ggttaaactt ccaccaccgc

1500

aatcacgtcc cactggccaa actttttctg ctttctctga ctttttctgg ccaaaaggca

1560

acgtcggaaa gggtcgggag gattcggaac cgacgaaaat cggccggctc cagcgggggt

1620

agttcggcag tcctggtggg agctctaggg gagctgtggt ctgtgtaggg cgcgggtccg

1680

ggtttgttgg gtgtcaaatc acgtgttttt gcccccccgc tgagccggac tccgacaacc

1740

gtgtctccaa cggcctgact aagctgctcc cagcactctg ccgtagcgtt ggtctgtcct

1800

gtcgcactct gttcaaagac agaagaaaga aaaagctaac ctccacgtca gagacaatgg

1860

tagaaggctt gttccttgca accgaggaga gtgagtgttc tcggcacgag catcatgggc

1920

gatctggagg gtatttttga ggggaaaaaa cgggatcagg acaaacagag gccacagacc

1980

gggaatctgg gccccaaaac ggccttttcc cgtcgcaaaa ccggtctaca tacacccctt

2040

cggcccgcca caggccggtg tgaaaaaccc taaagcttgc ttcaaaccag acggacgcac

2100

agcaagacac atcatgaaga gtcacctgca gtatatatag atctggggat ccccagtaga

2160

ctgaccaagc atacaaaa a gtgagtatcc aacagcgaca cgtgagatgg cagagacaca

2219

gagacgtgtc tacatggttg gacaagtctc cacattcgcc agagacgtat ccacatacaa

2279

acacaatctc acagctgatc tgctcctgtg acagcacagt acatgttagt ggatgaggtg

2339

ttgtgtagtg ggttaaatgg gtggactgat tcagtggcat cggtggcgac accctctact

2399

cttcatgtcg tcacctaccg ttcggaatcc caattatctg atgaactaaa cgatttctgg

2459

ccaaaacaca attttgccaa agaagtcggt ctcaccaatg caagtgtcac atcaaacatc

2519

tgtcccgtac taacccag tg  tcc gaa cag cag cga ttc aac aac gaa gtc

2569

                    Met Ser Glu Gln Gln Arg Phe Asn Asn Glu Val

                                    5                   10

gag gag atc aag aag tgg tgg tct tcc ccc cga tgg aag cac acc aag

2617

Glu Glu Ile Lys Lys Trp Trp Ser Ser Pro Arg Trp Lys His Thr Lys

            15                  20                  25

cgt gtc tac tct ccc gag gac att gcc tcc cga cga gga acc atc aag

2665

Arg Val Tyr Ser Pro Glu Asp Ile Ala Ser Arg Arg Gly Thr Ile Lys

        30                  35                  40

gtc ccc cag gcc tct tct cag cag gct gac aag ctc ttc aag ctg ctc

2713

Val Pro Gln Ala Ser Ser Gln Gln Ala Asp Lys Leu Phe Lys Leu Leu

    45                  50                  55

cag gag cac gag aag aac cac acc gcc tcc ttc acc tac ggt gcc ctc

2761

Gln Glu His Glu Lys Asn His Thr Ala Ser Phe Thr Tyr Gly Ala Leu

60                  65                  70                  75

gac ccc gtc cag gtg acc cag atg gcc aag tac ctc gac tcc atc tac

2809

Asp Pro Val Gln Val Thr Gln Met Ala Lys Tyr Leu Asp Ser Ile Tyr

                80                  85                  90

gtt tcc gga tgg cag tct tct tct acc gcc tcc acc tcc aac gag ccc

2857

Val Ser Gly Trp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro

            95                  100                 105

tct ccc gat ctg gct gac tac ccc atg gac acc gtc ccc aac aag gtc

2905

Ser Pro Asp Leu Ala Asp Tyr Pro Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val

        110                 115                 120

gag cac ctg tgg ttt gcc cag ctc ttc cac gac cga aag cag aac gag

2953

Glu His Leu Trp Phe Ala Gln Leu Phe His Asp Arg Lys Gln Asn Glu

    125                 130                 135

gag cga ctg tct ctg ccc gag tcc gag cga tcc aag ctc ccc gcc ccc

3001

Glu Arg Leu Ser Leu Pro Glu Ser Glu Arg Ser Lys Leu Pro Ala Pro

140                 145                 150                 155

gtc gac tac ctg cga ccc atc att gcc gat gcc gac acc ggt cac gga

3049

Val Asp Tyr Leu Arg Pro Ile Ile Ala Asp Ala Asp Thr Gly His Gly

                160                 165                 170

ggt ctc act gcc gtc gtc aag ctc acc aag atg ttc atc gag cga ggt

3097

Gly Leu Thr Ala Val Val Lys Leu Thr Lys Met Phe Ile Glu Arg Gly

            175                     180             185

gcc gcc ggt atc cac att gag gac cag gct ccc ggt acc aag aag tgc

3145

Ala Ala Gly Ile His Ile Glu Asp Gln Ala Pro Gly Thr Lys Lys Cys

        190                 195                 200

ggt cac atg gcc ggt aag gtt ctt gtc cct atc cag gag cac atc aac

3193

Gly His Met Ala Gly Lys Val Leu Val Pro Ile Gln Glu His Ile Asn

    205                 210                 215

cga ctg att gcc atc cga gct tct gcc gat atc ttc ggc tct gac ctc

3241

Arg Leu Ile Ala Ile Arg Ala Ser Ala Asp Ile Phe Gly Ser Asp Leu

220                 225                 230                 235

ctg gcc att gcc cga acc gat tcc gag gct gct act ctt atc acc tct

3289

Leu Ala Ile Ala Arg Thr Asp Ser Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr Ser

                240                 245                 250

tcc atc gac tac cga gac cat tac ttc att gct ggt gcc acc aac aag

3337

Ser Ile Asp Tyr Arg Asp His Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Thr Asn Lys

            255                 260                 265

gat gct ggc cac ctc gtc gac gtc atg gtc gcc gcc gag ctc gag ggc

3385

Asp Ala Gly His Leu Val Asp Val Met Val Ala Ala Glu Leu Glu Gly

        270                 275                 280

aag cag ggc gcc gcc ctc cag gcc gtt gag gac gag tgg aac cga aag

3433

Lys Gln Gly Ala Ala Leu Gln Ala Val Glu Asp Glu Trp Asn Arg Lys

    285                 290                 295

gcc ggt gtc aag ctc ttc cac gag gct ttc gcc gat gag gtc aac gcc

3481

Ala Gly Val Lys Leu Phe His Glu Ala Phe Ala Asp Glu Val Asn Ala

300                 305                 310                 315

ggc tct tac tcc aac aag gct gag ctc atc gcc gag ttc aac aag aag

3529

Gly Ser Tyr Ser Asn Lys Ala Glu Leu Ile Ala Glu Phe Asn Lys Lys

                320                 325                 330

gtc acc cct ctg tct aac acc ccc gct ctt gag gcc cga gct ctg gct

3577

Val Thr Pro Leu Ser Asn Thr Pro Ala Leu Glu Ala Arg Ala Leu Ala

            335                 340                 345

gct cga ctc ctc ggc aag gac atc tac ttc aac tgg gag gct gcc cga

3625

Ala Arg Leu Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Phe Asn Trp Glu Ala Ala Arg

        350                 355                 360

gtc cga gag ggc tac tac cga tac cag gga gga acc cag tgt gcc gtc

3673

Val Arg Glu Gly Tyr Tyr Arg Tyr Gln Gly Gly Thr Gln Cys Ala Val

    365                 370                 375

aac cga ggt att gct tac gct ccc tac gct gac ctc atc tgg atg gag

3721

Asn Arg Gly Ile Ala Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Ile Trp Met Glu

380                 385                 390                 395

tcc aag ctg ccc gac tac gct cag gcc aag gag ttc gcc gag ggt gtc

3769

Ser Lys Leu Pro Asp Tyr Ala Gln Ala Lys Glu Phe Ala Glu Gly Val

                400                 405                 410

aag aac gcc gtc ccc cac cag tgg ctg gct tac aac ctg tct ccc tct

3817

Lys Asn Ala Val Pro His Gln Trp Leu Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser

            415                 420                 425

ttc aac tgg acc acc gcc atg tcg ccc gag gac cag gag acc tac atc

3865

Phe Asn Trp Thr Thr Ala Met Ser Pro Glu Asp Gln Glu Thr Tyr Ile

        430                 435                 440

agc cga ctg gcc aag ctc ggc tac gtg tgg cag ttc atc act ctg gcc

3913

Ser Arg Leu Ala Lys Leu Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala

   445                 450                 455

ggt ctg cac acc aac gct ctc atc tcc gac aag ttc gcc aag gct tac

3961

Gly Leu His Thr Asn Ala Leu Ile Ser Asp Lys Phe Ala Lys Ala Tyr

460                 465                 470                 475

tct gag cga ggc atg aag gct tac ggt ggt gag atc cag cag ccc gag

4009

Ser Glu Arg Gly Met Lys Ala Tyr Gly Gly Glu Ile Gln Gln Pro Glu

                480                 485                 490

att gac cag ggt tgt gag gtt gtc aag cac cag aag tgg tcc ggt gct

4057

Ile Asp Gln Gly Cys Glu Val Val Lys His Gln Lys Trp Ser Gly Ala

            495                 500                 505

gag tac att gac ggt atc ctg cga atg gtt acc gga ggt atc acc tct

4105

Glu Tyr Ile Asp Gly Ile Leu Arg Met Val Thr Gly Gly Ile Thr Ser

        510                 515                 520

acc gcc gcc atg ggt gcc ggt gtc act gag gac cag ttc aag tcc aag

4153

Thr Ala Ala Met Gly Ala Gly Val Thr Glu Asp Gln Phe Lys Ser Lys

    525                 530                 535

ctt taa gcagtttgtt tagcaaaata tatttaacga gtttgataga ggcgctggac

4209

Leu

540

tacatcatta ctgaatcacg cgtacatgtc tcagctcaaa ttgtatcacg gtttctttgt

4269

agcaatggag ggggagagtt gacaaggcat tagagaagag agcgagagga gaagacaagt

4329

ggatagacga ctgcaatcat atgatctgca caaactgcga tgttttcctg tcagatcatg

4389

ttcttttgct catagttaag ctatcgtgac tttacggatc cgccgagact cttagtag

4447

序列记录3-顺序排列表3-SEQ ID No3

<110>Dresden技术大学

<120>用一种基因变异的酵母Yarrowia lipolytica制造柠檬酸的生物技术方法

<130>017P22PCT

<150>DE 102 33 600.8

<151>2002-07-16

<160>4

<170>专利在3.1分类

<210>3

<211>10056

<212>DNA

<213>Yarrowia lipolytica

<220>

<221>p64ICL1

<222>(1)..(10056)

<223>质粒p64ICL1

<220>

<221>ura3d4

<222>(10)..(1331)

<223>ura3d4多重拷贝选择标靶物，启动子直到6bp缺失

URA3 fragment up to SalI site at 1331 bp

<220>

<221>URA3-ORF

<222>(16)..(870)

<223>完整的 URA3 ORF

<220>

<221>rDNA

<222>(1332)..(2790)

<223>rDNA，整合于Y.lipolytica基因组中的目标定点

<220>

<221>ampR

<222>(3190)..(4050)

<223>大肠杆菌中的Amp抵抗基因

<220>

<221>ICL1-gene

<222>(5288)..(9716)

<223>完整的 IcL1 gene

<220>

<221>pICL1D

<222>(5288)..(7464)

<223>ICL1启动子D

<220>

<221>ICL1-外显子

<222>(7465)..(7465)

<223>ICL1外显子1，仅有1核苷酸(A)

<220>

<221>ICL1i

<222>(7466)..(7823)

<223>在启动ATG中ICL1的内含子-在剪切之后形成AUG

<220>

<221>ICL1-外显子2

<222>(7824)..(9445)

<223>ICL1外显子2

<220>

<221>ICL1t

<222>(9446)..(9716)

<223>在BamHI定点的ICL1终端子

<400>3

aagcttgata ccaaaatgcc ctcctacgaa gctcgagcta acgtccacaa gtccgcctct

60

gccgctcgag tgctcaagct cgtggcagcc aagaaaacca acctgtgtgc ttctctggat

120

gttaccacca ccaaggagct cattgagctt gccgataagg tcggacctta tgtgtgcatg

180

atcaagaccc atatcgacat cattgacgac ttcacctacg ccggcactgt gctccccctc

240

aaggaacttg ctcttaagca cggtttcttc ctgttcgagg acagaaagtt cgcagatatt

300

ggcaacactg tcaagcacca gtaccggtgt caccgaatcg ccgagtggtc cgatatcacc

360

aacgcccacg gtgtacccgg aaccggaatc attgctggcc tgcgagctgg tgccgaggaa

420

actgtctctg aacagaagaa ggaggacgtc tctgactacg agaactccca gtacaaggag

480

ttcctagtcc cctctcccaa cgagaagctg gccagaggtc tgctcatgct ggccgagctg

540

tcttgcaagg gctctctggc cactggcgag tactccaagc agaccattga gcttgcccga

600

tccgaccccg agtttgtggt tggcttcatt gcccagaacc gacctaaggg cgactctgag

660

gactggctta ttctgacccc cggggtgggt cttgacgaca agggagacgc tctcggacag

720

cagtaccgaa ctgttgagga tgtcatgtct accggaacgg atatcataat tgtcggccga

780

ggtctgtacg gccagaaccg agatcctact gaggaggcca agcgatacca gaaggctggc

840

tgggaggctt accagaagat taactgttag aggttagact atggatatgt aatttaactg

900

tgtatataga gagcgtgcaa gtatggagcg ctgttcagct tgtatgatgg tcagacgacc

960

tgtctgatcg agtatgtatg gtactgcaca acctgtgtat ccgcatggtc tgtccaatgg

1020

ggcatgttgt tgtgtttctc gatacggaga tgctgggtac agtgctaata cgttgaacta

1080

cttatactta tatgaggctc gaagaaagct gacttgtgta tgacttattc tcaactacat

1140

ccccagtcac aataccacca ctgcactacc actacaccaa aaccatgatc aaaccaccca

1200

tggacttcct ggaggcagaa gaacttgtta tggaaaagct caagagagag aagccaagat

1260

actatcaaga catgtgtcgc aacttcaagg aggaccaagc tctgtacacc gagaaacagg

1320

cctttgtcga ctctatctag caaagtgctt tgtgcgtacc agggataggg taggtagtga

1380

aatctgagtt agtacatcaa ctctaggatc ttggtggtag tagcaaatat tcaaatgaga

1440

actttgaaga ctgaagtggg gaaaggttcc gtgtgaacag cagttggaca cgggtaagtc

1500

gatcctaagg ggtggcataa ctgtcgcgta cggcccgata agggcttctc caaaagggaa

1560

gccggttgaa attccggcac ttggatgtgg attctccacg gcaacgtaac tgaatgtggg

1620

gacggtggca caagtcttgg aaggagttat cttttctttt taacggagtc aacaccctgg

1680

aattagtttg tctagagata gggtatcgtt ccggaagagg ggggcagctt tgtcccctcc

1740

gatgcacttg tgacgcccct tgaaaacccg caggaaggaa tagttttcac gccaagtcgt

1800

actgataacc gcagcaggtc tccaaggtga acagcctcta gttgatagaa taatgtagat

1860

aagggaagtc ggcaaaatag atccgtaact tcgggataag gattggctct gggggttggt

1920

gga tggaagc gtgggagacc ccaagggact ggcggctggg caactggcag ccggacccgc

1980

ggcagacact gcgtcgctcc gtccacatca tcaaccgccc cagaactggt acggacaagg

2040

ggaatctgac tgtctaatta aaacatagct ttgcgatggt tgtaaaacaa tgttgacgca

2100

aagtgatttc tgcccagtgc tctgaatgtc aaagtgaaga aattcaacca agcgcgggta

2160

aacggcggga gtaactatga ctctcttaag gtagccaaat gcctcgtcat ctaattagtg

2220

acgcgcatga atggattaac gagattccca ctgtccctat ctactatcta gcgaaaccac

2280

agccaaggga acgggcttgg cagaatcagc ggggaaagaa gaccctgttg agcttgactc

2340

tagtttgaca ttgtgaagag acataggggg tgtagaataa gtgggagctt cggcgccggt

2400

gaaataccac tacccttatc gtttctttac ttatttagta agtggaagtg gtttaacaac

2460

cattttctag cattcctttc caggctgaag acattgtcag gtggggagtt tggctggggc

2520

ggcacatctg ttaaaagata acgcagatgt cctaaggggg actcaatgag aacagaaatc

2580

tcatgtagaa caaaagggta aaagtcccct tgattttgat tttcagtgtg aatacaaacc

2640

atgaaagtgt ggcctatcga tcctttagtt gttcggagtt tgaacctaga ggtgccagaa

2700

aagttaccac agggataact ggcttgtggc agtcaagcgt tcatagcgac attgcttttt

2760

gatccttcga tgtcggctct tcctatcata ccgaagcaga atttatggtg cactctcagt

2820

acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac

2880

gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc

2940

gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc

3000

ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca

3060

ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat

3120

tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa

3180

aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt

3240

tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag

3300

ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt

3360

tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg

3420

gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag

3480

aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta

3540

agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg

3600

acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta

3660

actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac

3720

accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt

3780

actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca

3840

cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agcccgtgag

3900

cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta

3960

gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag

4020

ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt

4080

tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat

4140

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta

4200

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttccgc gcgtaatctg ctgcttgcaa

4260

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt

4320

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag

4380

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta

4440

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca

4500

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag

4560

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa

4620

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga

4680

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc

4740

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc

4800

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttctg ctggcctttt

4860

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt

4920

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag

4980

gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa

5040

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat

5100

gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg

5160

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac

5220

gccaagcttc catgggatat cgcatgcctg cagagctcta gagtcgacgg gcccggtacc

5280

gggcccgtcg agatggacat acttgtatcg tcgccctatg tactcgtaat gcaagggatt

5340

ccaccagaca ttcctgccac aatggcaggg tccgtgaaaa cgccgaccac tgacaagatg

5400

ccttgttcgt cttgaccacg gactaactgg cacaagcgag attaacgtcg tcggagacta

5460

ttcggcacac aaggccagac tgtgtggcac ttctcatctc tcgtaccgac ctctgtcaac

5520

agtctaaccg atttttaatg ctcgatatta ccaatgtttc tttgtgtctt ttaaccagaa

5580

caaccgagca gacccgaaca ggtgccgaac atgtgaatag cagtgctgga gctccatcag

5640

taagcataat aacacagctg cccagcgacc tccgcccagc gacctctacc cagcgacctc

5700

gggcacgtga ctatctgctc cgttcctcgc ggtcgctggc acgctggcaa atctggggtc

5760

tccacatttt cccccggatg tcttgttccg tagcgtgact catgcggaat gacgtgaatg

5820

taggaggggc tgagaatggg gtccgcagtt gataaccggg gattattggc cggcggcatt

5880

gtcaaccagg tgttttcact ggcgttccta gaataaaaag aaataggcga cccccttgag

5940

cgagttcagc ggcggcaaaa tgcctgttga aacacctact ttgttcccag cacccccatc

6000

ggataaatgg agacgcatac atcggctatg tttggatacg atcttgggcc ggtgtgcgtg

6060

gtgtgcgcgg tcattttgtt ctccttttgg acccacgcaa ggttcaaccg aaccccggat

6120

tcgactgtga aaacgaacaa cggtttagtg cggtttaaaa agtatcaagt tcagggaggg

6180

aagcgatcca ggccaacagc tatgaccaag aaaccaagcg accaagacat ctgaagacca

6240

acaaaaccaa taatcgctca ccagatgctc cccaaacact aacggcagac tctactccag

6300

atttgcactt gtaggacccc gatatcgggt tgcagatcat ggtgtcataa tctctgaacg

6360

tgaaggttag gtggagggga tgttttggcc agaaatgagc ggttttgtga gcttggagac

6420

ggtaaatcgg atacgcccag cgtgaggatt ccatagaccc cctccttttg ccagtatatc

6480

caccgcaaca cccaccatga gcgacatctg ataccgtgcc gcgaccacta ccccaaataa

6540

gctccaacta atatgccgag gcaggtggga aactatgcac tccagtcgac gctgtagaag

6600

cacatggaag gtgcggaggc ggtggcaacg aggggcatga gccatcaacg agtaaccaca

6660

gacaaggcaa ggggggaaac gcgaccggaa tctctcgcgg tcacgtgacc cgcccgggtt

6720

ccactcgtcc atgttgtgtc tctggtgtct tcggccgact cgcattggtt aaacttccac

6780

caccgcaatc acgtcccact ggccaaactt tttctgcttt ctctgacttt ttctggccaa

6840

aaggcaacgt cggaaagggt cgggaggatt cggaaccgac gaaaatcggc cggctccagc

6900

gggggtagtt cggcagtcct ggtgggagct ctaggggagc tgtggtctgt gtagggcgcg

6960

ggtccgggtt tgttgggtgt caaatcacgt gtttttgccc ccccgctgag ccggactccg

7020

acaaccgtgt ctccaacggc ctgactaagc tgctcccagc actctgccgt agcgttggtc

7080

tgtcctgtcg cactctgttc aaagacagaa gaaagaaaaa gctaacctcc acgtcagaga

7140

caatggtaga aggcttgttc cttgcaaccg aggagagtga gtgttctcgg cacgagcatc

7200

atgggcgatc tggagggtat ttttgagggg aaaaaacggg atcaggacaa acagaggcca

7260

cagaccggga atctgggccc caaaacggcc ttttcccgtc gcaaaaccgg tctacataca

7320

ccccttcggc ccgccacagg ccggtgtgaa aaaccctaaa gcttgcttca aaccagacgg

7380

acgcacagca agacacatca tgaagagtca cctgcagtat atatagatct ggggatcccc

7440

agtagactga ccaagcatac aaaaagtgag tatccaacag cgacacgtga gatggcagag

7500

acacagagac gtgtctacat ggttggacaa gtctccacat tcgccagaga cgtatccaca

7560

tacaaacaca atctcacagc tgatctgctc ctgtgacagc acagtacatg ttagtggatg

7620

aggtgttgtg tagtgggtta aatgggtgga ctgattcagt ggcatcggtg gcgacaccct

7680

ctactcttca tgtcgtcacc taccgttcgg aatcccaatt atctgatgaa ctaaacgatt

7740

tctggccaaa acacaatttt gccaaagaag tcggtctcac caatgcaagt gtcacatcaa

7800

acatctgtcc cgtactaacc cagtgtccga acagcagcga ttcaacaacg aagtcgagga

7860

gatcaagaag tggtggtctt ccccccgatg gaagcacacc aagcgtgtct actctcccga

7920

ggacattgcc tcccgacgag gaaccatcaa ggtcccccag gcctcttctc agcaggctga

7980

caagctcttc aagctgctcc aggagcacga gaagaaccac accgcctcct tcacctacgg

8040

tgccctcgac cccgtccagg tgacccagat ggccaagtac ctcgactcca tctacgtttc

8100

cggatggcag tcttcttcta ccgcctccac ctccaacgag ccctctcccg atctggctga

8160

ctaccccatg gacaccgtcc ccaacaaggt cgagcacctg tggtttgccc agctcttcca

8220

cgaccgaaag cagaacgagg agcgactgtc tctgcccgag tccgagcgat ccaagctccc

8280

cgcccccgtc gactacctgc gacccatcat tgccgatgcc gacaccggtc acggaggtct

8340

cactgccgtc gtcaagctca ccaagatgtt catcgagcga ggtgccgccg gtatccacat

8400

tgaggaccag gctcccggta ccaagaagtg cggtcacatg gccggtaagg ttcttgtccc

8460

tatccaggag cacatcaacc gactgattgc catccgagct tctgccgata tcttcggctc

8520

tgacctcctg gccattgccc gaaccgattc cgaggctgct actcttatca cctcttccat

8580

cgactaccga gaccattact tcattgctgg tgccaccaac aaggatgctg gccacctcgt

8640

cgacgtcatg gtcgccgccg agctcgaggg caagcagggc gccgccctcc aggccgttga

8700

ggacgagtgg aaccgaaagg ccggtgtcaa gctcttccac gaggctttcg ccgatgaggt

8760

caacgccggc tcttactcca acaaggctga gctcatcgcc gagttcaaca agaaggtcac

8820

ccctctgtct aacacccccg ctcttgaggc ccgagctctg gctgctcgac tcctcggcaa

8880

ggacatctac ttcaactggg aggctgcccg agtccgagag ggctactacc gataccaggg

8940

aggaacccag tgtgccgtca accgaggtat tgcttacgct ccctacgctg acctcatctg

9000

gatggagtcc aagctgcccg actacgctca ggccaaggag ttcgccgagg gtgtcaagaa

9060

cgccgtcccc caccagtggc tggcttacaa cctgtctccc tctttcaact ggaccaccgc

9120

catgtcgccc gaggaccagg agacctacat cagccgactg gccaagctcg gctacgtgtg

9180

gcagttcatc actctggccg gtctgcacac caacgctctc atctccgaca agttcgccaa

9240

ggcttactct gagcgaggca tgaaggctta cggtggtgag atccagcagc ccgagattga

9300

ccagggttgt gaggttgtca agcaccagaa gtggtccggt gctgagtaca ttgacggtat

9360

cctgcgaatg gttaccggag gtatcacctc taccgccgcc atgggtgccg gtgtcactga

9420

ggaccagttc aagtccaagc tttaagcagt ttgtttagca aaatatattt aacgagtttg

9480

atagaggcgc tggactacat cattactgaa tcacgcgtac atgtctcagc tcaaattgta

9540

tcacggtttc tttgtagcaa tggaggggga gagttgacaa ggcattagag aagagagcga

9600

gaggagaaga caagtggata gacgactgca atcatatgat ctgcacaaac tgcgatgttt

9660

tcctgtcaga tcatgttctt ttgctcatag ttaagctatc gtgactttac ggatccacag

9720

gacgggtgtg gtcgccatga tcgcgtagtc gatagtggct ccaagtagcg aagcgagcag

9780

gactgggcgg cggccaaagc ggtcggacag tgctccgaga acgggtgcgc atagaaattg

9840

catcaacgca tatagcgcta gcagcacgcc atagtgactg gcgatgctgt cggaatggac

9900

gatatcccgc aagaggcccg gcagtaccgg cataaccaag cctatgccta cagcatccag

9960

ggtgacggtg ccgaggatga cgatgagcgc attgttagat ttcatacacg gtgcctgact

10020

gcgttagcaa tttaactgtg ataaactacc gcatta

10056

序列记录4-顺序排列表4-SEQ ID No4

<110>Dresden技术大学

<120>用一种基因变异的酵母Yarrowia lipolytica制造柠檬酸的生物技术方法

<130>017P22PCT

<150>DE 102 33 600.8

<151>2002-07-16

<160>4

<170>专利在3.1分类

<210>4

<211>9300

<212>DNA

<213>Yarrowia lipolytica

<220>

<221>p67ICL1

<222>(1)..(9300)

<223>质粒p67ICL1

<220>

<221>ura3d4

<222>(10)..(1331)<223>多重拷贝选择标记物，启动子

<223>ura3d4多重拷贝选择标记物，启动子缺失直到6bp；

在1331bp达到Sa1I定点的URA3片段

<220>

<221>URA3-ORF

<222>(16)..(870)

<223>complete URA3 ORF

<220>

<221>zeta

<222>(1342)..(2038)

<223>用HotI定点修改的Ylt1的LTR zeta

整合于Y.lipolytica基因组中的目标定点

<220>

<221>ampR

<222>(2434)..(3294)

<223>在大肠杆菌中的Amp抵抗基因

<220>

<221>ICL1-gene

<222>(4532)..(8955)

<223>完整的ICL1 gene

<220>

<221>pICL1D

<222>(4532)..(6708)

<223>ICL1启动子D

<220>

<221>ICL1-外显子

<222>(6709)..(6709)

<223>ICL1外显子，仅有1核苷酸(A)

<220>

<221>ICL1i

<222>(6710)..(7067)

<223>在启动ATG中的ICL1的内含子-在恰当剪接后形成AUG

<220>

<221>ICL1-外显子2

<222>(7068)..(8689)

<223>ICL1外显子2

<220>

<221>ICL1t

<222>(8690)..(8960)

<223>在8960bp达到BamHI定点的ICL1终端子

<400>4

aagcttgata ccaaaatgcc ctcctacgaa gctcgagcta acgtccacaa gtccgcctct

60

gccgctcgag tgctcaagct cgtggcagcc aagaaaacca acctgtgtgc ttctctggat

120

gttaccacca ccaaggagct cattgagctt gccgataagg tcggacctta tgtgtgcatg

180

atcaagaccc atatcgacat cattgacgac ttcacctacg ccggcactgt gctccccctc

240

aaggaacttg ctcttaagca cggtttcttc ctgttcgagg acagaaagtt cgcagatatt

300

ggcaacactg tcaagcacca gtaccggtgt caccgaatcg ccgagtggtc cgatatcacc

360

aacgcccacg gtgtacccgg aaccggaatc attgctggcc tgcgagctgg tgccgaggaa

420

actgtctctg aacagaagaa ggaggacgtc tctgactacg agaactccca gtacaaggag

480

ttcctagtcc cctctcccaa cgagaagctg gccagaggtc tgctcatgct ggccgagctg

540

tcttgcaagg gctctctggc cactggcgag tactccaagc agaccattga gcttgcccga

600

tccgaccccg agtttgtggt tggcttcatt gcccagaacc gacctaaggg cgactctgag

660

gactggctta ttctgacccc cggggtgggt cttgacgaca agggagacgc tctcggacag

720

cagtaccgaa ctgttgagga tgtcatgtct accggaacgg atatcataat tgtcggccga

780

ggtctgtacg gccagaaccg agatcctatt gaggaggcca agcgatacca gaaggctggc

840

tgggaggctt accagaagat taactgttag aggttagact atggatatgt aatttaactg

900

tgtatataga gagcgtgcaa gtatggagcg ctgttcagct tgtatgatgg tcagacgacc

960

tgtctgatcg agtatgtatg gtactgcaca acctgtgtat ccgcatggtc tgtccaatgg

1020

ggcatgttgt tgtgtttctc gatacggaga tgctgggtac agtgctaata cgttgaacta

1080

cttatactta tatgaggctc gaagaaagct gacttgtgta tgacttattc tcaactacat

1140

ccccagtcac aataccacca ctgcactacc actacaccaa aaccatgatc aaaccaccca

1200

tggacttcct ggaggcagaa gaacttgtta tggaaaagct caagagagag aagccaagat

1260

actatcaaga catgtgtcgc aacttcaagg aggaccaagc tctgtacacc gagaaacagg

1320

cctttgtcga ctctatctag caaagtgctt tgtgcgtacc agggataggg taggtagtga

1380

aatctgagtt agtacatcaa ctctagacga tgggcgtcgc ctgtgtagaa gaacaataac

1440

tcacccggta actaacacta tttctcggtg gtcaatgcgt cagaagatat caagacggtc

1500

cgttttgcgt ttaagccgag tgaatgttgc ctgccgttag taaatttatt atgaaaaacc

1560

ccactatgaa tacatcagcc tatactgata taccaagaag tgcaagggag gtgtcctgtt

1620

ccacctgaac gcggttcccg acagcggccg cactgagggc tttgtgagga ggtaacgccg

1680

attctctctg cagtcgtaag accaggtggt gtgtccgagg cagtatcgct ttcccaactc

1740

tagtaacctc ggtagtgtga gacacactac cctaacggta ggacagccgg acgacgatgg

1800

cgcagcaatt ggcgaacgct gttataaaac aattcactta cgtgcaatga aagttgtttg

1860

ggcaataaac aataaatgta ttagagccag acgatagaca acaatccagc agatgatgag

1920

caggaaaatt gagtaagatc gacgtggcaa gaagagttac agttacgcag agttaataag

1980

gtgttgggag attagagtta ccctgtcgga tgactaactc tccagagcga gtgttacaca

2040

tggaatttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc

2100

cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct

2160

tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca

2220

ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg

2280

ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct

2340

atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga

2400

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc

2460

cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg

2520

aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc

2580

aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact

2640

tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc

2700

ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag

2760

catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat

2820

aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt

2880

ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa

2940

gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc

3000

aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg

3060

gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt

3120

gctgataaat ctggagcccg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca

3180

gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat

3240

gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca

3300

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg

3360

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg

3420

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt

3480

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg

3540

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata

3600

ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca

3660

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag

3720

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc

3780

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga

3840

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg

3900

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac

3960

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg

4020

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg

4080

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct

4140

gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc

4200

gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc

4260

cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg

4320

ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta

4380

cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca

4440

ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cttccatggg atatcgcatg cctgcagagc

4500

tctagagtcg acgggcccgg taccgggccc gtcgagatgg acatacttgt atcgtcgccc

4560

tatgtactcg taatgcaagg gattccacca gacattcctg ccacaatggc agggtccgtg

4620

aaaacgccga ccactgacaa gatgccttgt tcgtcttgac cacggactaa ctggcacaag

4680

cgagattaac gtcgtcggag actattcggc acacaaggcc agactgtgtg gcacttctca

4740

tctctcgtac cgacctctgt caacagtcta accgattttt aatgctcgat attaccaatg

4800

tttctttgtg tcttttaacc agaacaaccg agcagacccg aacaggtgcc gaacatgtga

4860

atagcagtgc tggagctcca tcagtaagca taataacaca gctgcccagc gacctccgcc

4920

cagcgacctc tacccagcga cctcgggcac gtgactatct gctccgttcc tcgcggtcgc

4980

tggcacgctg gcaaatctgg ggtctccaca ttttcccccg gatgtcttgt tccgtagcgt

5040

gactcatgcg gaatgacgtg aatgtaggag gggctgagaa tggggtccgc agttgataac

5100

cggggattat tggccggcgg cattgtcaac caggtgtttt cactggcgtt cctagaataa

5160

aaagaaatag gcgaccccct tgagcgagtt cagcggcggc aaaatgcctg ttgaaacacc

5220

tactttgttc ccagcacccc catcggataa atggagacgc atacatcggc tatgtttgga

5280

tacgatcttg ggccggtgtg cgtggtgtgc gcggtcattt tgttctcctt ttggacccac

5340

gcaaggttca accgaacccc ggattcgact gtgaaaacga acaacggttt agtgcggttt

5400

aaaaagtatc aagttcaggg agggaagcga tccaggccaa cagctatgac caagaaacca

5460

agcgaccaag acatctgaag accaacaaaa ccaataatcg ctcaccagat gctccccaaa

5520

cactaacggc agactctact ccagatttgc acttgtagga ccccgatatc gggttgcaga

5580

tcatggtgtc ataatctctg aacgtgaagg ttaggtggag gggatgtttt ggccagaaat

5640

gagcggtttt gtgagcttgg agacggtaaa tcggatacgc ccagcgtgag gattccatag

5700

accccctcct tttgccagta tatccaccgc aacacccacc atgagcgaca tctgataccg

5760

tgccgcgacc actaccccaa ataagctcca actaatatgc cgaggcaggt gggaaactat

5820

gcactccagt cgacgctgta gaagcacatg gaaggtgcgg aggcggtggc aacgaggggc

5880

atgagccatc aacgagtaac cacagacaag gcaagggggg aaacgcgacc ggaatctctc

5940

gcggtcacgt gacccgcccg ggttccactc gtccatgttg tgtctctggt gtcttcggcc

6000

gactcgcatt ggttaaactt ccaccaccgc aatcacgtcc cactggccaa actttttctg

6060

ctttctctga ctttttctgg ccaaaaggca acgtcggaaa gggtcgggag gattcggaac

6120

cgacgaaaat cggccggctc cagcgggggt agttcggcag tcctggtggg agctctaggg

6180

gagctgtggt ctgtgtaggg cgcgggtccg ggtttgttgg gtgtcaaatc acgtgttttt

6240

gcccccccgc tgagccggac tccgacaacc gtgtctccaa cggcctgact aagctgctcc

6300

cagcactctg ccgtagcgtt ggtctgtcct gtcgcactct gttcaaagac agaagaaaga

6360

aaaagctaac ctccacgtca gagacaatgg tagaaggctt gttccttgca accgaggaga

6420

gtgagtgttc tcggcacgag catcatgggc gatctggagg gtatttttga ggggaaaaaa

6480

cgggatcagg acaaacagag gccacagacc gggaatctgg gccccaaaac ggccttttcc

6540

cgtcgcaaaa ccggtctaca tacacccctt cggcccgcca caggccggtg tgaaaaaccc

6600

taaagcttgc ttcaaaccag acggacgcac agcaagacac atcatgaaga gtcacctgca

6660

gtatatatag atctggggat ccccagtaga ctgaccaagc atacaaaaag tgagtatcca

6720

acagcgacac gtgagatggc agagacacag agacgtgtct acatggttgg acaagtctcc

6780

acattcgcca gagacgtatc cacatacaaa cacaatctca cagctgatct gctcctgtga

6840

cagcacagta catgttagtg gatgaggtgt tgtgtagtgg gttaaatggg tggactgatt

6900

cagtggcatc ggtggcgaca ccctctactc ttcatgtcgt cacctaccgt tcggaatccc

6960

aattatctga tgaactaaac gatttctggc caaaacacaa ttttgccaaa gaagtcggtc

7020

tcaccaatgc aagtgtcaca tcaaacatct gtcccgtact aacccagtgt ccgaacagca

7080

gcgattcaac aacgaagtcg aggagatcaa gaagtggtgg tcttcccccc gatggaagca

7140

caccaagcgt gtctactctc ccgaggacat tgcctcccga cgaggaacca tcaaggtccc

7200

ccaggcctct tctcagcagg ctgacaagct cttcaagctg ctccaggagc acgagaagaa

7260

ccacaccgcc tccttcacct acggtgccct cgaccccgtc caggtgaccc agatggccaa

7320

gtacctcgac tccatctacg tttccggatg gcagtcttct tctaccgcct ccacctccaa

7380

cgagccctct cccgatctgg ctgactaccc catggacacc gtccccaaca aggtcgagca

7440

cctgtggttt gcccagctct tccacgaccg aaagcagaac gaggagcgac tgtctctgcc

7500

cgagtccgag cgatccaagc tccccgcccc cgtcgactac ctgcgaccca tcattgccga

7560

tgccgacacc ggtcacggag gtctcactgc cgtcgtcaag ctcaccaaga tgttcatcga

7620

gcgaggtgcc gccggtatcc acattgagga ccaggctccc ggtaccaaga agtgcggtca

7680

catggccggt aaggttcttg tccctatcca ggagcacatc aaccgactga ttgccatccg

7740

agcttctgcc gatatcttcg gctctgacct cctggccatt gcccgaaccg attccgaggc

7800

tgctactctt atcacctctt ccatcgacta ccgagaccat tacttcattg ctggtgccac

7860

caacaaggat gctggccacc tcgtcgacgt catggtcgcc gccgagctcg agggcaagca

7920

gggcgccgcc ctccaggccg ttgaggacga gtggaaccga aaggccggtg tcaagctctt

7980

ccacgaggct ttcgccgatg aggtcaacgc cggctcttac tccaacaagg ctgagctcat

8040

cgccgagttc aacaagaagg tcacccctct gtctaacacc cccgctcttg aggcccgagc

8100

tctggctgct cgactcctcg gcaaggacat ctacttcaac tgggaggctg cccgagtccg

8160

agagggctac taccgatacc agggaggaac ccagtgtgcc gtcaaccgag gtattgctta

8220

cgctccctac gctgacctca tctggatgga gtccaagctg cccgactacg ctcaggccaa

8280

ggagttcgcc gagggtgtca agaacgccgt cccccaccag tggctggctt acaacctgtc

8340

tccctctttc aactggacca ccgccatgtc gcccgaggac caggagacct acatcagccg

8400

actggccaag ctcggctacg tgtggcagtt catcactctg gccggtctgc acaccaacgc

8460

tctcatctcc gacaagttcg ccaaggctta ctctgagcga ggcatgaagg cttacggtgg

8520

tgagatccag cagcccgaga ttgaccaggg ttgtgaggtt gtcaagcacc agaagtggtc

8580

cggtgctgag tacattgacg gtatcctgcg aatggttacc ggaggtatca cctctaccgc

8640

cgccatgggt gccggtgtca ctgaggacca gttcaagtcc aagctttaag cagtttgttt

8700

agcaaaatat atttaacgag tttgatagag gcgctggact acatcattac tgaatcacgc

8760

gtacatgtct cagctcaaat tgtatcacgg tttctttgta gcaatggagg gggagagttg

8820

acaaggcatt agagaagaga gcgagaggag aagacaagtg gatagacgac tgcaatcata

8880

tgatctgcac aaactgcgat gttttcctgt cagatcatgt tcttttgctc atagttaagc

8940

tatcgtgact ttacggatcc acaggacggg tgtggtcgcc atgatcgcgt agtcgatagt

9000

ggctccaagt agcgaagcga gcaggactgg gcggcggcca aagcggtcgg acagtgctcc

9060

gagaacgggt gcgcatagaa attgcatcaa cgcatatagc gctagcagca cgccatagtg

9120

actggcgatg ctgtcggaat ggacgatatc ccgcaagagg cccggcagta ccggcataac

9180

caagcctatg cctacagcat ccagggtgac ggtgccgagg atgacgatga gcgcattgtt

9240

agatttcata cacggtgcct gactgcgtta gcaatttaac tgtgataaac taccgcatta

9300

Claims (17)

1.在Y.Lipolytica的酵母细胞中制造柠檬酸的生物技术方法，其步骤为：

a)酵母细胞的转化，它有一个对多重基因整合的适宜载体，该载体包含一个作为选择标记物作用的基因；

b)酵母是在一个碳源和营养缺乏条件下培养的；

c)柠檬酸的净化，其特征在于，该载体含有对1CL活性编码基因序列的表达盒带，克隆是在一适当的营养培养基中选择的，它稳定地在其基因组中整合了对1CL活性编码基因顺序的和选择标记物的多个拷贝。

2.按权利要求1的方法，其特征在于，该载体包含有一基因序列的表达盒带，该序列对按SEQ ID NO.1带有1CL活性的蛋白质进行了编码。

3.按权利要求2的方法，其特征在于，该载体含有按SEQ ID NO.2的表达盒带。

4.对1CL活性编码的基因序列进行基因组整合的载体至少有一基因序列，该序列对按SEQ ID NO.1具有1CL活性的蛋白南进行了编码。

5.按权利要求4的载体，其特征在于，它含有一个按SEQ ID NO.2的基因序列。

6.按权利要求5的载体，其特征在于，它含有一个按SEQ ID NO.3的相适应的管段。

7.按权利要求5的载体，其特征在于，它含有一个按SEQ ID NO.4的相适应的管段。

8.Y.Lipolytica经基因变异的菌种将对1CL活性编码的基因序列稳定定地多重拷贝整合在其基因组中。

9.按权利要求8的Y.Lipolitica经基因变异的菌种，将对蛋白质按SEQ ID NO.1编码的基因序列稳定地多重拷贝整合在其基因组中。

10.按权利要求9的Y.Lipolytica经基因变异的菌种将SEQID NO.2的多重拷贝稳定地整合在其基因组中。

11.Y.Lipolytica经基因变异的菌种采用按权利要求4至7之一的载体进行转化。

12.按权利要求11的Y.Lipolitica经基因变异菌种Y.LipolyticaH222-s4(p641CL1)T1寄存在德国Braunschweig市的德国微生物和细胞培养物收藏公司(DSMZ)中，其寄存号为DSM15105。

13.带有一个对1CL活性编码的基因序列的表达盒带如同在权利要求12的菌种中有多重拷贝。

14.带有一个对具有1CL活性的蛋白质编码基因序列的表达盒带，其特征在于，它按SEQ ID NO.1对一蛋白质进行编码。

15.按权利要求14的表达盒带，其特征在于，它含有按SEQID NO.2的基因序列。

16.按SEQ ID NO.1的有1CL活性的蛋白质。

17.按权利要求8至12之一的菌种应用于生物技术柠檬酸生产中。

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