CN1670213A - Glyt1转基因小鼠 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于产生非人类转基因动物的遗传构建体和方法，所述非人类转基因动物的基因组中含有编码GLYT1的转基因DNA。这些转基因动物还能被用于产生能够生成更多活性GLYT1的转基因动物。此外，还提供所述产生更多GLYT1蛋白质的转基因动物，以及产生它们的方法。本发明也涉及这些动物作为模型在分析抑制突触NMDA受体功能的效果以及研究化合物减轻精神病行为症状的能力中的用途。
Description
背景技术
甘氨酸是脊髓和脑干主要的抑制性神经递质，也是NMDA受体的辅助兴奋剂。甘氨酸的细胞外浓度至少由两个Na+/Cl+-依赖的甘氨酸转运蛋白(GLYT1和GLYT2)调节，所述转运蛋白通过将甘氨酸重吸收进突触前神经末端及围绕的纤细的神经胶质突起中，在终止突触后甘氨酸能的作用以及保持甘氨酸的细胞外低浓度方面发挥着重要的作用。GLYT2在啮齿动物的脊髓、脑干和小脑高水平表达，在这些部位，其表达与马钱子碱敏感的甘氨酸受体的存在紧密相关(Zafra，F.，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt2)：p.3952-69；Luque，J.M.，N.Nelson和J.G.Richards，Neuroscience，1995.64(2)：p.525-35和Jursky，F.和N.Nelson，J Neurochem，1995.64(3)：p.1026-33)。免疫组织化学分析表明在推定的甘氨酸能突触中主要定位于突触前(Zafra，F.，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt 2)：p.3952-69；Spike，R.C.，等人，Neuroscience，1997.77(2)：p.543-51)，这强烈暗示了在甘氨酸能抑制性突触传递的终止中的作用。人的GLYT2已经被克隆，并且似乎表现出相似的表达模式(Morrow，J.A.，等人，FEBS Lett，1998.439(3)：p.334-40)。GLYT2具有一定程度的异质性。事实上已经在啮齿动物的脑中鉴定了两种GLYT2同种型(2a和2b)。
通过对于肌氨酸和甘氨酸的N-甲基化衍生物阻断的敏感性，可以从药理学上区分GLYT1和GLYT2(Liu，Q.R.，等人，J Biol Chem，1993.268(30)：p.22802-8，Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)：p.608-17)。已经克隆了人glyt1基因，该基因编码GLYT1a、1b、1c和1d 4个同种型(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)：p.608-17)，而已经鉴定的大鼠同种型只有GLYT1a和1b两种(Guastella，J.，等人，Proc Natl Acad SciUSA，1992.89(15)：p.7189-93；Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)：p.927-35；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)：p.851-63)。GLYT1似乎在大鼠CNS的神经胶质和神经元中都有表达(Zafra，F.，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt 2)：p.3952-69；Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)：p.927-35；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)：p.851-63；Zafra，F.，等人，Eur J Neurosci，1995.7(6)：p.1342-52)，GLYT1a在灰质和一些外周组织有明显表达，而GLYT1b只在CNS的白质有表达(Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)：p.851-63)。在人类中，针对所有GLYT1同种型的通用探针揭示出GLYT1在一些外周组织有表达，最显著的是肾，而GLYT1c似乎是大脑特异的(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)：p.608-17)。GLYT1的同种型只在它们的氨基端和5’非编码区存在差异(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)：p.608-17；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)：p.851-63)。GLYT1a和GLYT1b来源于从交替的启动子指导进行的转录，而人GLYT1c则是GLYT1b转录物的剪接变体(Kim，K.M.，等人，Mol Pharmacol，1994.45(4)：p.608-17；Adams，R.H.，等人，J Neurosci，1995.15(3 Pt 2)：p.2524-32；Borowsky，B.和B.J.Hoffman，J Biol Chem，1998.273(44)：p.29077-85)。由于在发表的研究之间明显存在主要分歧，GLYT1的外周表达和同种型不同的CNS表达模式具有一定的争议。GLYT1在脊髓、脑干和间脑中与GLYT2一同表达。有趣的是，GLYT1在没有发现功能抑制性甘氨酸能神经元的前脑区域(如脑皮层、海马、嗅球)也有表达(Zafra，F.，等人，J Neurosci，1995.15(5 Pt 2)：p.3952-69；Guastella，J.，等人，ProcNatl Acad Sci USA，1992.89(15)：p.7189-93；Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)：p.927-35；Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993 Eur J Neurosci，1995.7(6)：p.1342-52)，由此暗示GLYT1的其它作用，这些作用可能包括调节NMDA受体介导的神经传递(Smith，K.E.，等人，Neuron，1992.8(5)：p.927-35)。
NMDA受体的激活需要谷氨酸和甘氨酸的结合。尽管谷氨酸以活性依赖的方式从突触前末端释放，但甘氨酸明显以更稳定的水平存在，表明具有更多的调节功能。对细胞外和脑脊液中甘氨酸浓度的测量表明甘氨酸以较低的微摩尔水平存在(Westergren，I.等人，J Neurochem，1994.62(1)：p.159-65)。然而，甘氨酸转运蛋白可以在NMDA受体的局部微环境显著降低甘氨酸浓度。事实上，GLYT1b在非洲爪蟾(Xenopus)卵母细胞中的表达已经被证明可以在共表达的NMDA受体位置降低甘氨酸浓度(Supplisson，S.和C.Bergman，J Neurosci，1997.17(12)：p.4580-90)。此外，最进的研究表明甘氨酸摄取机制可以调节突触NMDA受体活性(Berger，A.J.，S.Dieudonne，和P.Ascher，J Neurophysiol，1998.80(6)：p.3336-40；Bergeron，R.，等人，Proc Natl Acad Sci USA，1998.95(26)：p.15730-4)。NMDA受体NR2亚基的性质影响受体对甘氨酸的亲和力，并且在重组系统中，含有NR2A的受体相对于含有NR2B、C或D的受体表现出明显降低的甘氨酸亲和力(Ikeda，K.，等人，FEBS Lett，1992.313(1)：p.34-8；Kutsuwada，T.，等人，Nature，1992.358(6381)：p.36-41；Priestley，T.，等人，Mol Pharmacol，1995.48(5)：p.841-8)。在成熟过程中产生一组具有明显较低甘氨酸亲和力的NMDA受体，表明在正常生理条件下存在一组不被甘氨酸所饱和的NMDA受体，此组受体的产生与发育中NR2A表达的增加相平行(Kew，J.N.，等人，J Neurosci，1998.18(6)：p.1935-43)。
谷氨酸神经传递(特别是NMDA受体活性)在突触可塑性、学习和记忆方面具有关键作用，如表现为门控突触可塑性和记忆形成阈值的分级开关(graded switch)的NMDA受体(Hebb，D.，The organization of behavior.1949，New York：Wiley；Bliss，T.V.和G.L.Collingridge，Nature，1993.361(6407)：p.31-9)。过表达NMDA NR2B亚基的转基因小鼠表现出增强的突触可塑性和优越的学习及记忆能力(Tang，Y.P.，等人，Nature，1999.401(6748)：p.63-9)。
NMDA受体的机能减退与精神分裂症的病理生理学有关(Olney，J.W.和N.B.Farber，Arch Gen Psychiatry，1995.52(12)：p.998-1007；Hirsch，S.R.，等人，Pharmacol Biochem Behav，1997.56(4)：p.797-802)。非竞争性NMDA受体拮抗剂(如PCP和氯胺酮(ketamine))能够诱导精神分裂症-样精神病(schizophrenia-like psychosis)(Allen，R.M.和S.J.Young，Am JPsychiatry，1978.135(9)：p.1081-4；Javitt，D.C.和S.R.Zukin，Am JPsychiatry，1991.148(10)：p.1301-8；Krystal，J.H.，等人，Arch GenPsychiatry，1994.51(3)：p.199-214)，所述精神病整合了阳性和阴性症状以及认知功能障碍，因此与患者的精神分裂症非常相似(Javitt，D.C.，等人，Biol Psychiatry，1999.45(6)：p.668-79)。NMDAR1亚基表达水平有所降低的转基因小鼠表现出相似于在药理学诱导的精神分裂症模型上观察到的行为异常，这支持了NMDA受体活性降低导致精神分裂症-样行为的模型(Mohn，A.R.，等人，Cell，1999.98(4)：p.427-36)。此外，缺乏NMDA受体2A亚基的小鼠在新环境中表现出自发运动性增强，并且除海马LTP和空间学习方面的缺陷外，在觅水任务(water-finding task)中还表现出潜在的学习受损(Miyamoto Y，Yamada K，Noda Y，Mori H，Mishina M和Nabeshima T，J Neurosci.2001 21(2)：750-757)。
过度产生GLYT1的小鼠为评估GLYT1的生理功能提供了一种有用的工具。这些小鼠应该在前脑表现出降低的甘氨酸水平，并且可以将它们用于研究NMDA受体甘氨酸位点占据的活性调节对于NMDA受体的生理功能是否重要这一问题。
发明概述
本发明提供用于产生非人类转基因动物的遗传构建体和方法，所述转基因动物的基因组中含有编码GLYT1的转基因DNA。还可以使用这些转基因动物来产生过表达活性GLYT1的转基因动物。此外，也提供所述过表达GLYT1蛋白质的转基因动物和产生它们的方法。本发明也涉及这些动物作为模型在分析抑制突触NMDA受体功能的效果和研究化合物减轻精神病行为症状的能力中的用途。
因此，本发明提供含有编码GLYT1的DNA序列的遗传构建体，所述DNA序列与启动子有效连接。glyt1基因的序列可能编码GLYT1的同种型。优选glyt1基因序列编码GLYT1b。
优选glyt1基因序列是cDNA序列。更优选此cDNA整合至少一个内含子序列。最优选的是，所述至少一个内含子序列含有聚腺苷酸化位点。
glyt1基因的序列可以来源于任何动物，优选glyt1序列来源于哺乳动物，更优选glyt1基因序列是人的序列。
启动子可以是神经元启动子。在一个实施方案中，启动子是组织特异的启动子。组织特异的启动子可以是任何以组织特异的方式(如在脑组织中、肌肉组织中、肝脏组织中、肾脏组织中等等)控制和指导基因表达的启动子。优选在前脑中提供特异表达的启动子。最优选的启动子是小鼠CamKαII启动子。
启动子也可以是可控制的启动子。可控制的启动子可以是任何以可调节和/或可诱导的方式(如通过添加特异的诱导物或阻遏物物质)来控制转基因表达的启动子。本领域已知若干可诱导的细菌启动子(Schultze N，Burki Y，Lang Y，Certa U，Bluethmann H；Nat Biotechnol 1996；14(4)：499-503；van der Neut R；Targeted gene disruption：applications inneurobiology；Neurosci Methods 1997；71(1)：19-27；Liu HS，Lee CH，LeeCF，Su IJ，Chang TY；Lac/Tet dual-inducible system functions inmammalian cell lines.Biotechniques.1998；24(4)：624-8，630-2)。
优选的遗传构建体是如图1所描述的遗传构建体。
这里使用的术语“转基因DNA”描述人工引入并整合进生物的DNA。
这里使用的术语“glyt1基因序列”描述编码GLYT1的DNA序列。
本发明还提供产生非人类转基因动物的方法，所述转基因动物基因组中含有编码GLYT1的转基因DNA，所述方法包括：
a)向非人类受精卵或非人类胚胎干细胞引入如上描述的遗传构建体，
b)从所述受精卵或胚胎干细胞制备非人类转基因动物，并由此，
c)产生基因组中含有编码GLYT1的转基因DNA的非人类转基因动物。
本发明的另一实施方案提供产生表达转基因GLYT1的非人类转基因动物的方法，包括：
a)向非人类动物来源的非人类受精卵或非人类胚胎干细胞引入如上描述的遗传构建体，
b)从所述受精卵或胚胎干细胞制备转基因动物，并由此，
c)产生表达转基因GLYT1的非人类转基因动物。
优选的用于如上描述的方法的受精卵是C57BL/6J受精卵。也可用于本发明方法中的本领域所使用的受精卵包括(但不限于)FVB/N受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵和DBA/2受精卵。
优选的用于如上描述的方法的胚胎干细胞是C57BL/6J胚胎干细胞。也可用于本发明方法中的本领域所使用的干细胞包括(但不限于)BALB/c胚胎干细胞、DBA/2J胚胎干细胞、CBA/J胚胎干细胞和129系小鼠的胚胎干细胞系。
受精卵或胚胎干细胞可以来源于任何非人类动物。优选受精卵或胚胎干细胞来源于啮齿类。更优选受精卵或胚胎干细胞来源于小鼠。
可以通过DNA的微注射来向受精卵引入遗传构建体。可以通过病毒感染来向胚胎干细胞引入遗传构建体。
例如，可以通过微注射后培养受精卵、将培养的受精卵转移到假孕的非人类动物中并生育非人类转基因动物来产生上文所述方法的非人类转基因动物。
这里使用的术语“转基因GLYT1”描述人工引入并整合进生物的DNA产生的GLYT1蛋白质。
这里使用的术语“转基因动物”描述基因组中含有转基因DNA的动物。此转基因DNA可能整合在基因组的某处。
本发明还提供由以上描述的任何方法所产生的非人类转基因动物。
在本发明的一个实施方案中，提供非人类转基因动物，所述转基因动物基因组中含有编码GLYT1的转基因DNA。在一个优选的实施方案中，非人类转基因动物含有如图1所描述的遗传构建体。
在另一实施方案中，提供表达转基因GLYT1的非人类转基因动物。在一个优选的实施方案中，组织特异性(即在大脑中)表达转基因GLYT1。在一个更优选的实施方案中，转基因GLYT1在非人类转基因动物的前脑特异表达。在另一实施方案中，转基因GLYT1的表达是可控的，如通过加入特异的诱导物或阻遏物物质。
在描述的过度产生GLYT1蛋白质的非人类转基因动物中，预期可以通过改变内源甘氨酸的水平体内调整NMDA受体活性。由于在海马和大脑皮层区缺乏GLYT2受体，这些区域的GLYT1过表达导致谷氨酸能突触中甘氨酸水平的下降，并因此抑制NMDA受体的功能。因此，预期过表达GLYT1的突变小鼠会发展出与精神分裂症或认知缺损有关的行为改变和异常。
非人类转基因动物可以是任何本领域已知的、可以用于本发明方法的非人类动物。优选的非人类转基因动物是哺乳动物，更优选的非人类转基因动物是啮齿动物。本发明最优选的转基因动物是小鼠。
可以对上文描述的非人类转基因动物进行遗传、分子和行为分析。
本发明也涉及本发明提供的非人类转基因动物与相同或其它基因型交配后产生的后代。
本发明还提供来源于本发明提供的非人类转基因动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织及器官型脑片培养物(organotypic brain sliceculture)。
可以通过两种方法制备基于细胞培养的模型。可以从非人类转基因动物中分离细胞培养物，或从使用同样的构建体、经标准的细胞转染技术建立的细胞培养物中制备细胞培养物。
可以通过多种方法检测含有转基因DNA(编码GLYT1)的遗传构建体的整合，包括使用从两到3周龄小鼠尾部活检组织中分离的DNA进行基因组Southern印迹和PCR分析。
对于本领域技术人员而言，显然存在许多可以用来检测转基因DNA表达的分析方法，包括在RNA水平的方法(包括通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或通过Northern印迹、原位杂交的mRNA定量)和在蛋白质水平的方法(包括组织化学、免疫印迹分析和体外结合研究)。此外，可以通过本领域技术人员众所周知的ELISA技术来定量目的基因的表达水平。
可以使用许多标准分析来完成定量测量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保护、Northern印迹分析、RNA斑点(RNA dot)分析在内的杂交方法测量转录水平。也可以使用免疫组织化学染色和Western印迹分析来评估是否存在转基因GLYT1蛋白质。
还可通过本领域已知的方法(包括免疫组织化学、电子显微镜、磁共振成像(MRI))和关于神经学及认知功能的行为研究来描述本发明转基因动物的特征。行为测试的例子有：自主行为(spontaneons behavior)测试、与认知功能有关的行为测试、药理学干扰的行为测试(pharmacologically-disrupted behavior)、握力测试、线操纵测试(wiremanoeuvre)、游泳测试、旋转杆测试(rotarod)、走动测试(locomotoractivity)、Morris水迷宫测试(Morris water maze)、Y-迷宫测试、明暗偏好测试(light-dark preference)、被动和主动回避测试(avoidance test)。
本发明另一目的是所述非人类转基因动物，或来自其的细胞系或组织或器官型脑片培养物，作为模型在研究化合物减轻精神病行为的能力中的用途。此外，这些转基因动物，或来自它们的细胞或组织或器官型脑片培养物可以作为模型用于研究抑制突触NMDA受体功能的效果。
在另一实施方案中，提供了用于评估GLYT1功能对NMDA受体活化的体内影响的方法，包括确定非人类转基因动物中NMDA受体活性、突触可塑性和行为(包括学习和记忆)，并将此NMDA受体活性、突触可塑性和行为与对照的相比较，其中所述非人类转基因动物的基因组中含有转基因glyt1基因序列，从而过表达活性GLYT1蛋白质的。
对照可以包括任何非人类动物，其中没有引入编码GLYT1的转基因DNA来过表达活性GLYT1蛋白质，或其中动物仅含有天然glyt7基因。评估的行为可以包括自主行为、与认知功能有关的行为(包括空间的短期和长期记忆、物体识别记忆、联想情绪记忆、条件性恐惧消退(conditionedfear extinction))和药理学干扰的行为(包括药物诱导的过多走动(hyperlocomotion)、药物诱导的社交退缩(Social withdrawal)、药物诱导的前脉冲抑制(prepulse inhibition)缺陷、和药物诱导的记忆丧失)。
在另一实施方案中，提供测试GLYT1抑制剂化合物增强NMDA受体功能的能力的方法，所述方法包括向基因组中含有转基因glyt1基因序列从而过表达活性GLYT1蛋白质的非人类转基因动物，或来自它们的细胞系或原代细胞培养物或器官型脑片培养物施予GLYT1抑制剂化合物，并确定化合物的效果(包括行为、电生理学和组织学的评估)，及与对照的行为、电生理学和组织学相比较。
可以被用于本发明方法的GLYT1抑制剂化合物有本领域已知的任何GLYT1抑制剂化合物，包括(但不限于)ALX-5407(NPS Pharmaceuticals)和ORG-24598(Organon)。
对照可以包括任何动物、细胞系或原代细胞培养物或器官型脑片培养物或组织，其中没有引入编码GLYT1的转基因DNA来过表达活性GLYT1蛋白质，或其中动物、细胞系或原代细胞培养物或器官型脑片培养物仅含有天然glyt1基因。评估的行为可以包括自主行为、与认知功能有关的行为(包括空间的短期和长期记忆、物体识别记忆、联想情绪记忆、条件性恐惧消退)和药理学干扰的行为(包括药物诱导的过多走动、药物诱导的社交退缩、药物诱导的前脉冲抑制缺陷、和药物诱导的记忆丧失)。
本发明还涉及测试化合物增强NMDA受体活性的能力的试剂盒，所述试剂盒包括基因组中含有转基因glyt1基因序列从而过表达活性GLYT1蛋白质的非人类转基因动物，或来自它们的细胞系或原代细胞培养物或组织或器官型脑片培养物或组织，以及确定化合物是否表现出增强NMDA受体活性的能力的手段。
此外，本发明提供基因组中含有转基因glyt1基因序列以致过表达活性GLYT1蛋白质的非人类转基因动物、或来自它们的细胞系或原代细胞培养物或组织或器官型脑片培养物或组织作为模型在研究化合物对精神病行为的作用和测试化合物的GLYT1特异性抑制效果中的用途。
本发明还提供基本如这里所描述的，在特别是在参考前述实施例之前所述的转基因动物、方法、组合物、试剂盒和用途。
对本发明进行一般性的描述之后，结合以下附图，参考具体的实施例，将会更好的理解本发明，这里包含实施例只是为了举例说明，而无限制的意图(除非另有说明)。
附图简述
图1显示遗传构建体的示意图，所述遗传构建体含有小鼠CamKαII启动子、整合内含子(I)的编码人GLYT1b(hGlyt1b)的cDNA，其中有一个内含子含有多聚腺苷酸化位点(pA)。图中给出了限制性位点。
图2：用于克隆glyt1b-cDNA的引物对(SEQ.ID NOs：3至8)和用于验证重组事件的引物对(SEQ.ID NOs：9和10)的示意图。
图3：转基因盒CamKaII启动子3’到glyt1b基因5’的PCR结果(SEQ.ID NOs：9和10)。来自遗传构建体的扩增子大小为1600bp。内源基因不产生扩增子。17-22：F1小鼠，M：标记。
实施例：
除非另有说明，实施例中涉及的商业获得的试剂按照制造商的说明书使用。
实施例1：小鼠的产生
A)人GLYT1b cDNA的克隆：
基于发表的人glyt1b-cDNA序列信息(注：GLYT1b序列作为1c序列被发表；SEQ.ID NOs：1)设计引物(SEQ.ID NOs：3至6)，通过嵌套PCR从全人脑的pACT2-cDNA文库(Clontech)中克隆glyt1b-cDNA。将扩增的cDNA亚克隆进克隆载体pCI的NheI和EcoRI限制性位点(Promega；SEQ.ID NOs：10)。
B)hGlyt1b转基因的克隆：
使用引物huGlyt1b-2147FLAG-PvuII-rev(SEQ.ID NOs：7)和huGlyt1b-234c(SEQ.ID NOs：8)，从上述载体中再扩增人glyt1b cDNA。用PvuII切割扩增子，纯化扩增子后将其克隆进pNN265载体(M.Mayford，E.Kandel，Columbia Universlty，New York，USA；Choi，T.，等人，Mol CellBiol，1991.11(6)：p.3070-4)的EcoRV位点，以便加入内含子和pdyA序列，产生pNN265-hGlyt1b-FLAG载体。对cDNA部分进行测序并与发表的序列相比较，以确证使用Pwo-聚合酶扩增的正确性。没有发现突变。
为了产生转基因的前脑特异性神经元表达模式，将hGlyt1b-cDNA随后克隆进含有小鼠CamKαII启动子的载体(Mayford，M.，等人，Science，1996.274(5293)：p.1678-83)。为此，用仅含有KpnI、HindIII和NotI限制性位点的最小克隆位点取代pBluescript II SK+质粒(Stratagene)的多克隆位点。此后，通过NotI和HindIII从pNN279载体(Mayford，M.，等人，Science，1996.274(5293)：p.1678-83)移出启动子-盒(SEQ ID NO：2)，并克隆进修饰的pBluescript II SK+载体。通过NotI消化，从pNN265-hGlyt1b-FLAG中将hGlyt1b-cDNA连同周围的内含子一同取走，并克隆进mCamKαII启动子后唯一的NotI位点(图1)。
C)转基因小鼠的产生
通过BssHII消化，从载体骨架上切下转基因盒，并纯化。以3ng/μl的浓度将DNA注入C57BL/6J受精卵(获得自Jackson实验室，600MainStreet，Bar Harbor，Maine 04609 USA)从而根据已确立的方法(Hogan，B.C.，F；Lacy，E，1986，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)获得转基因小鼠。通过使用引物对pNN279-7431c(SEQ.ID NOs：9)和huGlyt1b-786nc(SEQ.ID NOs：10)，以PCR筛选后代的基因组DNA，所述PCR会因为转基因的存在而扩增出1600bp的转基因盒片段(图2和图3)。将这一筛选鉴定的建立者(founders)与C57BL/6J小鼠交配，以建立品系。
实施例2：GLYT1b转基因小鼠的分子分析
A)GLYT1b突变小鼠的组织学分析
使用在兔和豚鼠体内激起的GLYT1特异的抗体，通过免疫组织化学和Western印迹分析确证GLYT1b在突变小鼠脑中的过表达。
B)GLYT1b突变小鼠的电生理分析
诱导一定形式的长时程增强(LTP)需要NMDA受体的激活(Bliss，T.V.和G.L.Collingridge，Nature，1993.361(6407)：p.31-9)。如先前所描述的(Kew，J.N.，等人，J Neurosci，2000.20(11)：p.4037-49)，在整个强直后时期，比较GLYT1b转基因小鼠与野生型对照的海马切片中θ强直刺激(Burst Stimulation)诱导的增强。确定是否GLYT1b转基因小鼠相比于野生型对照表现出不同水平的LTP增强。
C)前脑和脑干突触小体的制备
处死小鼠，并在冰上解剖脑组织，在4℃进行随后的操作。使用玻璃/特氟隆匀浆器(800rpm 10次)，在10vol(w/v)的10mM Tris-HCl(pH7.4，含有0.32M蔗糖)和1mM Pefabloc(蛋白酶抑制剂的混合物)(缓冲液A)中匀浆组织。将匀浆物在1300xg离心5分钟。小心的倾析出上清液，并置于冰上，然后用5vol(依据原始重量)的缓冲液A悬浮沉淀，如描述的进行匀浆和离心。将第二次的上清液加入第一次的上清液，并在17000xg离心20分钟。用5vol(依据原始重量)的Krebs-Ringer溶液(pH7.4，含有10mM葡萄糖)(KRB)悬浮产生的沉淀(突触小体粗组分)。
D)甘氨酸摄取
在96孔平板中进行分析。将小鼠前脑(0.1mg)和脑干(0.05mg)突触小体制备品的等分试样在含有120nM[3H]甘氨酸、总体积为250μl的KRB中于22℃孵育30分钟。通过迅速过滤到96孔Packard GF/B unifilter板上而终止孵育，随后用冰冷却的KRB洗涤3次。加入闪烁液后测量孔的放射性含量。
E)MK801的饱和结合
在96孔深平板(deep plates)中进行分析。将小鼠前脑和脑干突触前小体制备品的等分试样(0.07mg)在含有递增浓度(0.03nM-300nM)的[3HMK801、总体积为0.5ml的20mM Hepes-KOH(pH7.4，含有100μM谷氨酸和30μM甘氨酸)中于22℃孵育1小时。用10μM MK801确定非特异性结合。通过迅速过滤到96孔Packard GF/C unifilter平板上而终止孵育，随后用冰冷却的20mM Hepes-KOH(pH7.4)洗涤3次。加入闪烁液后测量孔的放射性含量。
F)体内的胞外甘氨酸水平
为了评估GLYT1b表达的增加对细胞外甘氨酸水平的影响，进行了微量透析研究。使用异氟烷(isoflurane)麻醉成年野生型和突变小鼠，并在它们的纹状体(Cpu，前囟点A：+0.9；L：-1.8；V：-4.6)插入微量透析垂直探针(CMA7 4/2，铜纺-膜定制)。在实验之前允许动物恢复3到4天。根据Smith和Sharp的方法(经较小的改动)定量透析液的甘氨酸水平。
实施例3：GLYT1突变小鼠的行为分析
A)神经学评估(neurological assessment)
神经学评估包括若干神经学测试，如屈反射、握力(g)和花在16和32rpm的旋转杆上的时间(sec)以及体重。
B)自主行为
观察GLYT1b转基因小鼠自然探究行为的迹象，包括身体姿势、步态、感觉反应(Irwin，S.，Psychopharmacologia，1968.13(3)：p.222-57)。此外，还分析了它们的自发走动活动(spontaneous locomotor activity)(活动箱activity box)。另外，通过将动物暴露于天然的厌恶刺激(高架十字迷宫测试和明/暗选择测试)，评估了它们的焦虑状态。
C)听觉惊跳和听觉惊跳反射的前脉冲抑制(prepulse inhibition)(精神分裂症相关行为)
在8个惊跳装置中进行测试，每个装置由装在有机玻璃平台上的有机玻璃圆柱组成(直径5cm)，所述有机玻璃平台被置于通风、弱音的小室中，以高频的扩音器产生所有听觉刺激。每个小室的背景噪音为68dB。检测圆柱内的运动，并通过附在树脂有机玻璃底部的压电式加速计转换，并使用计算机数字化和存储。在刺激开始时，记录65×1msec的读数，以获得动物的惊跳幅度。
每一部分起始于5分钟的适应期，之后是不包括在分析中的5个连续的110dB试验。然后进行10个不同类型的试验：单独的惊跳脉冲(ST110、110dB/40msec)；8个不同的前脉冲试验，其中20msec长的，72、78、84和90dB的刺激(P72、P78、P84、P90)或者是单独给予或在110dB脉冲之前100msec给予(PP72、PP78、PP84、PP90)；及最后一个只给予背景噪音的试验(NST)，以测量圆柱中的基线运动。所有的实验以伪随机的顺序给出，平均试验间隔期(ITI)为15msec。使用双因素ANOVA分析惊跳数据和前脉冲抑制(PPI)百分数。
D)筑巢
为了量化突变小鼠将绵纸撕碎来筑巢的能力，在每个笼中放入几张折叠的绵纸，24小时后对巢进行评定。
E)脑室内NMDA诱导的惊厥。
通过向有知觉小鼠的侧脑室注射NMDA(含5nM的1μl)来诱导抽搐。注射后立即将动物置于树脂玻璃盒内，并观察5分钟。记录每只小鼠表现出狂跑期和阵挛性惊厥的潜伏期(以秒计)，以便将突变小鼠和野生型小鼠进行比较。
F)认知功能相关的行为
短期和长期的空间记忆
如Durkin(Durkin，T.P.，等人，Behav Brain Res，2000.116(1)：p.39-53)的描述进行延迟匹配空间工作记忆任务(delayed matching spatial workingmemory task)。基于在5臂迷宫中获得的延迟匹配规则评估工作记忆。基本学习任务包括两个阶段。每个试验开始于呈现阶段(presentation phase)，在这一阶段，动物被强迫光顾准随机选择的一个臂，并得到奖励，其余4个臂被关闭。一旦被奖励后，将动物放置于等待的笼子中。经历持续时间不同的保留间隔期(对于工作记忆为延迟2-sec、20-sec和40-sec；对于短期和长期记忆为延迟5-min、1-hr、4-hr、24-hr)之后，进入寻回测试阶段(retrieval test phase)，在此阶段，将动物暴露于对5个开放的臂进行选择的位置。奖励正确的选择(选择之前光顾过的臂)。以保留间隔期的函数，通过在试验间隔固定为10秒的连续试验中正确命中选择的平均百分数来表示工作记忆保留能力。通过自动视频跟踪系统监控记忆任务。
可替代的是，在Morris描述的水迷宫范例(Morris，R.G.，等人，Nature，1982.297(5868)：p.681-3；Morris，R.G.，等人，Nature，1986.319(6056)：p.774-6)中评估空间学习和记忆。将小鼠置于圆形水池(直径120cm，高30cm)，在水池中它们通过寻找隐藏的平台而学习躲避乳白色的水(20cm深，20±1℃)。此目标平台(直径7cm，处于水面以下1cm)被置于水池特定四分之一区的中心，并沿水池安置了外部的视觉提示物，以便利于导航动物。在4天的测试期中，于随机选择的4个固定起始位点之一面向水池壁将小鼠置于水中(每天3个回合，每回合3次试验)。使用自动视频运动系统测量小鼠寻找目标所需的时间(逃跑潜伏期)以及游泳路径和速度。如果动物在60秒内未能找到目标，用手将其置于平台并允许其停留在那一个试验间隔期(10到20秒)。每一回合的间隔为1.5到两小时。在第4天的最终试验之后，将平台移走，并允许小鼠自由游泳60秒。记录小鼠在每一个四分之一区所花的时间以及它们的游泳路径。
联想情绪记忆
在两种行为任务(behavioral task)中评估依赖NMDA受体的联想情绪记忆：
i.恐惧加强的惊跳反射：使小鼠条件性对与足击(footshock)(aversive US)配对的光(CS)产生反应。在延迟24小时之后，通过在具有或不具有条件性光刺激情况下由不同听觉刺激(90-110dB)所引起的惊跳反射的幅度来评估情绪记忆。条件性光刺激的给予导致听觉惊跳反射增强(Davis，M.，Psychopharmacology(Berl)，1979.62(1)：p.1-7)。
ii.情景恐惧条件反射(contextual fear conditioning)：情景恐惧条件反射是一种暗示性厌恶相关的学习过程，通过这一过程，原本中性的情景在与非条件性厌恶刺激(US)反复联系后获得了引起厌恶的特性。将动物暴露于新的小室，几分钟后在此小室内用连续的足电击(US)处理小鼠，以引起非条件的恐惧反应(木僵行为)(Phillips，R.G.和J.E.LeDoux，BehavNeurosci，1992.106(2)：p.274-85)。通过对再次暴露于此情景而反应产生的木僵数量来衡量情景恐惧条件反射。在训练后的不同时期测试条件性木僵反应，以评估短期(1到3小时)和长期(1到10天)的情景记忆。
条件性恐惧消退
学会的恐惧反应的消失代表行为可塑性的一种形式，行为可塑性被认为依赖于新记忆形式的形成，而不是抹掉原来学会的联系(Falls，W.A.，M.J.Miserendino，和M.Davis，J Neurosci，1992.12(3)：p.854-63)。最近已证明条件性恐惧消退与NMDA受体依赖的过程有关(Tang，Y.P.，等人，Nature，1999.401(6748)：p.63-9)。训练后延迟24小时之后，可通过连续5天内重复暴露于情景出现的木僵反应数量随时间的减少来评估条件性木僵的消失。
G)药理学干扰的行为
可以通过施用脱水吗啡、D-苯异丙胺或非竞争性NMDA受体拮抗剂PCP来诱导一系列明显的精神分裂症-型症状，包括过多走动、前脉冲抑制(PPI)缺陷和记忆缺陷。使用了在野生型小鼠中干扰行为的最低有效剂量。然后测试了是否GLYT1b转基因小鼠表现出对于行为的药理学干扰具有不同的敏感性。
药物诱导的过多走动
通过记录水平走动、垂直活动、刻板动作(stereotypic movement)以及花在开放场所中心的时间，在开放场所(活动盒)中评估D-苯异丙胺对走动和刻板行为的影响。
药物诱导的社交退缩
为了评估GLYT1b过表达对D-苯异丙胺或PCP在社会行为方面造成的行为反应的影响，使用了社会探究测试(social exploration test)(Crestani，F.，F.Seguy，和R.Dantzer，Brain Res，1991.542(2)：p.330-5)。将单室饲养的雄性小鼠暴露于年青雌性小鼠5分钟。在施用药物前后经由视频跟踪系统记录社会性互动，包括肛殖和嗅闻颈、给对方梳毛(heterogrooming)和追赶。施用药物后，在不同的时间间隔(30分钟、两小时、4小时和24小时)检查药物诱导的社会探究衰退(social exploration deterioration)。
药物诱导的前脉冲抑制缺陷
脱水吗啡或PCP对前脉冲抑制(PPI)的干扰是常用的感觉运动门控缺陷(sensorimotor gating deficits)模型(Kretschmer，B.D.，等人，Eur JPharmacol，1997.331(2-3)：p.109-16；Bakshi，V.P.和M.A.Geyer，JNeurosci，1998.18(20)：p.8394-401；Bakshi，V.P.，等人，J Pharmacol ExpTher，1999.288(2)：p.643-52)，通过这种模型可以评估注意力和感觉运动门控。PPI是在呈递非诱导惊跳的前脉冲刺激后听觉或触觉惊跳反应的减弱。对听觉刺激之后动物的惊跳反应进行了评估。
药物诱导的记忆丧失
在上文描述的延迟匹配空间记忆任务中评估PCP或脱水吗啡诱导的记忆功能损伤。
H)GLYT1b突变小鼠中特异的GLYT1抑制剂逆转体外和体内缺陷/损伤。
研究人员测定了是否特异的GLYT1抑制剂能够逆转体外(见实施例2的B、D和E段落)和体内(见实施例2的F段落、实施例3的A到F段落)观察到的损伤/缺陷。
I)药理学攻击的GLYT1b突变小鼠中特异的GLYT1抑制剂逆转体外和体内缺陷/损伤。
研究人员测定了是否特异的GLYT1抑制剂能够在GLYT1b突变小鼠中逆转它们发生改变的对行为的药理学干扰的敏感性(见实施例3段落G)。
序列表
<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffman-La Roche)
<120>Glyt1转基因小鼠
<130>22511
<160>11
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2202
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>1c型甘氨酸转运蛋白(可变剪接)
<222>(1)..(2202)
<223>UniGene ID Hs.442590下的基因的代表性cDNA(s70612，自2004年2月18日起)，
<400>1
gcccacacac cccactccag ctccggagca cccgtgctgg gctgcatggg gactggccgg 60
aggggcaggg ccaggggagc gggtaggcag agcttcggga ggagatgagg tgaaagtaat 120
tgacgctgcc cagcccggca gtgggagagg caggggatgc gtcagtgtcg cgctggagct 180
ggcagaggtg atgagcggcg gagacacgcg gggctgcgat cgctcgcccc aggatggccg 240
cggctcatgg acctgtggcc ccctcttccc cagaacagaa tggtgctgtg cccagcgagg 300
ccaccaagag ggaccagaac ctcaaacggg gcaactgggg caaccagatc gagtttgtac 360
tgacgagcgt gggctatgcc gtgggcctgg gcaatgtctg gcgcttccca tacctctgct 420
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tccccctctt cttcatggag ctctccttcg gccagtttgc aagccagggg tgcctggggg 540
tctggaggat cagccccatg ttcaaaggag tgggctatgg tatgatggtg gtgtccacct 600
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tgacgcacgt gctgccctgg gcctactgca ataacccctg gaacacgcat gactgcgccg 720
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agtggatcct gcagaaaaag acctatgtga ccttgggcgt ggctgtggct ggcttcctgc 1560
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cggccagctt ctccttggtg gtcatctcct gcatcatgtg tgtggccatc atgtacatct 1680
acgggcaccg gaactacttc caggacatcc agatgatgct gggattccca ccacccctct 1740
tctttcagat ctgctggcgc ttcgtctctc ccgccatcat cttctttatt ctagttttca 1800
ctgtgatcca gtaccagccg atcacctaca accactacca gtacccaggc tgggccgtgg 1860
ccattggctt cctcatggct ctgtcctccg tcctctgcat ccccctctac gccatgttcc 1920
ggctctgccg cacagacggg gacaccctcc tccagcgttt gaaaaatgcc acaaagccaa 1980
gcagagactg gggccctgcc ctcctggagc accggacagg gcgctacgcc cccaccatag 2040
ccccctctcc tgaggacggc ttcgaggtcc agtcactgca cccggacaag gcgcagatcc 2100
ccattgtggg cagtaatggc tccagccgcc tccaggactc ccggatatag cacagctgcc 2160
aggggagtgc caccccaccc gtgctccacg agagactgtg ag 2202
<210>2
<211>7988
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>小鼠钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶IIα亚基基因5’侧翼序列
<222>(1)..(7988)
<223>代表性cDNA(AJ222796，自2004年2月18日起)
<400>2
cgatcttttt tccgtaaact caataccagg ctgatgtccc accggatctg atggcttagg 60
gtggcaggga atctcagttc ccctcagaca ctctcccttt gctggttctc agggaggagg 120
caaggtcaag tcttcatctg taggcacgtg gagggagggc acagaagccc tcagctgaat 180
agggtgggac ttggggaagg gcagcaacca ggctgggttg cctgggtcac aatcctgcct 240
ctttcctgat gagtttcctt tttgccctca ggttacctat agcagcattc tgcctcaatc 300
tcacccctaa gatgagctct ggtgacttta ggactccagt gtacacatgt gtctggggcc 360
atggcagggt ttcttgctga ccttgtcacc ttccagacaa cttgagtcca tgaccctctt 420
tccagctctc tgtggtgctc ttggatatca gctggagtat ggccagctgg ctgctgctct 480
gttgaacaac tcaatgagag aacggacagg gtaggctctg agaaatcttt acgttcctgg 540
agcctcatga cttgggagcc tagtggaatt cttctctttt ggtccccaac atctgggggg 600
agggggaact ggctgagcct gagccactgt atagtgaggg tgggggaaac agctgtgaaa 660
ggagcctttg atttggtctt gaacacagtt cttccccaca gggccttgat ttccctactt 720
gcaaaggagt agggaaatat gagccttggc tctgcctacc tcacgttgct ggtgctgtag 780
aaaactggcc aggctgatgg ttgtggagga gcctgtgaac ttgattaaag tgccattatc 840
cagaggcaag agatgctggt ctgtgtgtgt gtgagtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 900
gtgtgtgtgt cttggagacc tgtgtgagct cgatgctagc agaggggaca gaaggtaggt 960
gggaaggaat gaaggaatga aggaaggaaa gaaggaaggt tgaaaggaag aaaggaagga 1020
aggaaggaag gaaggaagga aggaaggaag gaaggaagga aggaaggaag gtcctgccac 1080
aggcttacca tgtagctgca ggcaaacccc tgaccctctc tgggcctaag tgtttctcta 1140
cacacaatgg atgattcaag agtccttact tttggtggtt acaggcaccc ctgtgcacat 1200
ttgcatctgg ggtggggggg acacaggctt ggtagtgttg aggagggggg tggttgtaga 1260
gcctgctagc tgcacactgc gttctgcata tctcccttca ggtcccagtc ggcgcagtgt 1320
gtgtaggcga aggccctgct gtgaattttg aaaatagtta tttttgtcac tggcaaagga 1380
ggccctgtta ggactcgtca gcttgtggat gagcgggatg ggtggagtgg ggtgggtgcg 1440
gtgccgccgt ggggggttac cgctgcttgc agggctgcat cgcccaggca gtgactgaat 1500
cctgcatgag ggcctggcct aggctgtggg gaggagatga ccactgcgtc ctagatcttt 1560
ccttagccct gtgcttcctt tcttcctttt ttccttaaga tttatttcta atgatgcgta 1620
ggttgtgtat ttgtgtgtgg gtatgtgcac ttgaataaag gacccacaga ggctatagac 1680
atcagatcct cctagagctg gggttacaga gggcgtgagt tgtccaacat gggcaccgga 1740
aaataaactt atgtgctcta cacgaccgag ctgtctctcc aacaccagcc ctcttctttt 1800
gacttttctc atctccctca cttgtatgtt ttcccttcct cgataatgct gatacccaga 1860
tggtaggcac ggcccaggat aggcaggggt ctctgcgctc cagtggctgt agtggttttc 1920
ctgcctgctc tgaagaagac actggctaag gtggtgtctt agcctactgt atcctagagg 1980
tgggttattc atagtctgcc cactgcccaa cacactctag gcctgctggg gcctattcta 2040
actctgcttg ctggcttgcc accctggcac acagtgtagg cttccctgta gagccaggct 2100
ttagagaact gtatgagtac ttctctgaga actgctggag gggccctgcc tgccaggact 2160
tttcaacttc cagccctgtc atctatatca cttctgagga ccccgtgtgg gggtcacgag 2220
aacaaaacca tatgtagtgc tttctgttct cccttgggtc ccaggctctg aatcaatctg 2280
gtcccaagat ataagggatg attggtgctg aggctggtgt ctgtttctga agttttgaag 2340
acaagggttg gctcaagcct ccctgtgttc agtcctccac tcaatgcaga actcagtgaa 2400
ctcagaattc tcagcccaga tgccagcata gcccagcata gcccagcata gcccaggagc 2460
tactggagca tcagtttgaa accaggtccg caggaactag tgggcaacag tgtgtgaggc 2520
cagtggtctt tggggtattg tattgaattg agaggtcctg cttagcagtc agcatgccca 2580
caacctgttc tctacggtgg tccggattcc cctcagcaag cacacctgaa tctttactac 2640
atcccagttc ctggttggct cctgacttcg ggttactatg gctgtgatga aacactacga 2700
ctaaaagcaa tgtggggaag aaagttaatt ttttcactcg accttccata gacagggttc 2760
atcactaaaa gcagagggca gaggaaaaga tagctcagcg gttaagagtg ctgtctactc 2820
aacaaagagg tcttgagttc aattcccagc aaccacatgg tggctcacaa ctgtctatcc 2880
tgggatctga tgcccttttc tggcatacag gtatacatac agatagagga ctcatataca 2940
taaaataaat aaataaatct ttaaaagcaa caagggcaga aattcaagca gggcagggac 3000
ccagaggcca aagctgacgc agaggccatg gaggggtgtt gcttactggc ttgctcctca 3060
tggcttgctc agcctgtttt cttatagaac ccacaaccac caggccagag atgggaccac 3120
ccacaaaggg cagagccttt ccctatcaat cactaatggg aaaacatcct gcagtcggat 3180
cttatgaaga cattttctca gctgagcttc cctcctatca gataactcta gcttgtgtca 3240
aggtgactta aaactagcca gcacagcacc ttatgctcac atcacctggg tccctttgga 3300
gaggacatag ttaaagggag cccagaggca gtccctaggc cacaggtctt cattgcccct 3360
ctctgggacg gattagacag gctgcagacc tgttagctgg aagagttaga ttcaggcaag 3420
agcttgaatc tttacctgat cctggctatg gagtcctggc ctctaatgat cagctcccta 3480
acaacccaat ggagccatat acctgcctgg gccacggctg tgtctcctct tctttcagac 3540
actcctggct tgcctaggac acaggctagc atcctgtcaa tgccaggaag gggcacagca 3600
gggaaagagc aatgctgttg gcctgactgc catcaactgg tgtacctgtt agagggcaac 3660
ctctattctc tgcaccttgg ttcctagctc taagggatat gtggccccta aaggtcttca 3720
tagcttgata tgggaggcag gggggctaag aacagcgcaa gagtggtgag cttgcacaga 3780
cccggatttg atctctgggt gagtgaggag gaaatgagat gggggtgggg gaagccctat 3840
ttctagctgt cttagcatag gaactgaacc tccttctgca gggcctgtgt cactgcccct 3900
ttcccccagg gagggcccct gcacggggca cctcagggca cagccctttt tccctccctc 3960
ctctcttaga cctggaatta ctcaacatcc tgccctgact cagttgctct cccctcagac 4020
cctcacagtc ttccttctct tctggcccac ttttggctga gcctgccccc aactttttct 4080
gcccttagtg ggacaggccc catggggacc attcagatgg cacttttttc cccccctggg 4140
gtggttttct gtggtggtgc cctattcagg caactgcaag accctgtggc atttagcata 4200
tgcatgagag cacatgaaga agctagctat ccctgtgtgc tgaggattgt aatcctctct 4260
catccttccc ttgtctcctg gaacccagtc cagcctcctg tccctcccgt tgacacgagc 4320
caatgctggc tcagcaaact ccagggctcc cacccctggc catcagccct tggcacacag 4380
gcttgtgctt gagtactgca cacgtgttgc agctggggta cacgtgctgg actgttatgc 4440
ctactgtggc cccgggggtg tgtgggaagt ctggcagaac caatccctcc atcccccgat 4500
gcaatcatca gcttattctc tcacggccac tcgggcatgc ttgactcctt gatgcccgcc 4560
gccactaggc acagctgcca gctttgtggg cacagaggat gtggcgaatt agtggtcatg 4620
cctcctcagt ggaatggcaa ttgcactcag catgcaggtg tctaccaaag gcagtcccta 4680
catccccgat gtactctcga gacccatcta aggactagat ctagtctcta gaaggtccca 4740
tgcagatgta agacagccct ccacagggag attcttccag ctagttctct attatcagat 4800
gggtctaaga tcctaggacc tgcctatccc ttagccctgc attcagcgag agaaggggta 4860
aagatgtgag gatgccaggg aggaaggaaa agggcacaag gaagaaagaa agggaaggaa 4920
gctggaagca tggaaggaca aagatggtga ccacagtaga attaggatcc catggttcct 4980
gtcagtggct tcctgtgcct tcctgtgcct ccctgagccc ctggggcatc ttctaaatgc 5040
tttgctggcc tctgagccaa gcactgcata ccatcccgtg gggagtgaca ggccagcact 5100
ggtcaacgag gatgatggct acttttgttc acagggtaac atctccatgg ttacagcctt 5160
tgcacattcc tcttagtact ttaccaatct caaagcagtt gccaagccct tgggccctaa 5220
taagtgaggg tcccagtgcc ctctttttta aattccttgc catttgtttt gcagaattta 5280
ctgcaaataa agccaacccc aggcaatgtc taaaccatga gttaaccccc cagcaaggtc 5340
tcagagaact gtgccccaga gagctgccaa ggttcaggga ggagtatgag gagacaggat 5400
ttctagttcc ttaataattc cttctgtctc agccactgtg ttcatcttgt ttcagccaca 5460
aaactacctt tattggtaag gaacattatt tacccagttt cacacttgaa gaggtccaga 5520
gacgttaaca catcgattca aaagcacagc ctgtaagtca catagccact gttagctgat 5580
cgacactatt tcccctgggc aatggctggg tgattccagg gatccccttg ggaacaggct 5640
agagcactgg ctctcaacct gtgcgggtcg tgacctcctt gaggggtagg ggtgagggca 5700
gtgtcaaaca acccttttac aggagtcgtt taagaccgtt gggaaaaaaa ccagatattt 5760
gcattatttt tcgtaacaga agcaagatta tagttatgga gtagtgacaa aaattatgtt 5820
acagttggag gtcagcacag catgaggaac tgtatttaag ggttgcggca ttaggaaggt 5880
tgagaatcac tggcctagcg gatctgaatc aggaacacgg acgtacagct ctgcgccact 5940
cctgccttcc tctggtgcct ctagccttgc ccatggtgtt ctgggcctgc ctgctaccca 6000
ccagctgtgc ggccctgtga gcacaggcct ttctgctccg ctctgaattg ccacgttggc 6060
ggcagaagcg ggaagcgtat tgtgcgcaga aacaaaacgg agtggttttt tttttccttt 6120
ttctgaaggt ggtaatggtg caattagtgg cgaagccatc accccctcct ccccggctcg 6180
cctccctcct tcctctccac ctcccttctc tttctttcct gagaaaaaaa gtggctgagt 6240
tgaaaagatc tcccgtcaat ctttctgtaa cggactcagg aagagggata gagggccccc 6300
taatgtttcc agggtcctcg agcctcagtt gggtcaggca cttgttggtg ctggagaata 6360
ttcaaaggta ccactatgtt ccccacaagg gagttgagca atggattctg aggagcaagt 6420
ttgaaacaga gaatttgcgt tcccaggtct tgtgatctgc cccttgttca ctgggggaca 6480
aatgctggca tgagaccctg agacctctgc tcagccacct ttctctctct ctctctcttt 6540
ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctgtcc ttaatggagg 6600
tgtgtgtgtg ttcaagacca agctgcagtg ttggagtgct tgtgggctca ttttaaaact 6660
tccatgtttt gccttctaga aactgaaaca taagaacccc attatggcct taggtcactt 6720
catctccatg gggttcttct tctgattttc tagaaaatga gatgggggtg cagagagctt 6780
cctcagtgac ctgcccaggg tcacatcaga aatgtcagag ctagaacttg aactcagatt 6840
actaatctta aattccatgc cttgggggca tgcaagtacg atatacagaa ggagtgaact 6900
cattagggca gatgaccaat gagtttagga aagaagagtc cagggcaggg tacatctaca 6960
ccacccgccc agccctgggt gagtccagcc acgttcacct cattatagtt gcctctctcc 7020
agtcctacct tgacgggaag cacaagcaga aactgggaca ggagccccag gagaccaaat 7080
cttcatggtc cctctgggag gatgggtggg gagagctgtg gcagaggcct caggaggggc 7140
cctgctgctc agtggtgaca gataggggtg agaaagcaga cagagtcatt ccgtcagcat 7200
tctgggtctg tttggtactt cttctcacgc taaggtggcg gtgtgatatg cacaatggct 7260
aaaaagcagg gagagctgga aagaaacaag gacagagaca gaggccaagt caaccagacc 7320
aattcccaga ggaagcaaag aaaccattac agagactaca agggggaagg gaaggagaga 7380
tgaattagct tcccctgtaa accttagaac ccagctgttg ccagggcaac ggggcaatac 7440
ctgtctcttc agaggagatg aagttgccag ggtaactaca tcctgtcttt ctcaaggacc 7500
atcccagaat gtggcaccca ctagccgtta ccatagcaac tgcctctttg ccccacttaa 7560
tcccatcccg tctgttaaaa gggccctata gttggaggtg ggggaggtag gaagagcgat 7620
gatcacttgt ggactaagtt tgttcgcatc cccttctcca accccctcag tacatcaccc 7680
tgggggaaca gggtccactt gctcctgggc ccacacagtc ctgcagtatt gtgtatataa 7740
ggccagggca aagaggagca ggttttaaag tgaaaggcag gcaggtgttg gggaggcagt 7800
taccggggca acgggaacag ggcgtttcgg aggtggttgc catggggacc tggatgctga 7860
cgaaggctcg cgaggctgtg agcagccaca gtgccctgct cagaagcccc aagctcgtca 7920
gtcaagccgg ttctccgttt gcactcagga gcacgggcag gcgagtggcc cctagttctg 7980
ggggcagc 7988
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>引物
<222>(1)..(21)
<400>3
agagcttcgg gaggagatga g 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>引物
<222>(1)..(21)
<400>4
agagcttcgg gaggagatga g 21
<210>5
<211>39
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>引物
<222>(1)..(39)
<400>5
gatctgctag ccaccatggc cgcggctcat ggacctgtg 39
<210>6
<211>32
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>引物
<222>(1)..(32)
<400>6
gatcggaatt cctatatccg ggagtcctgg ag 32
<210>7
<211>72
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>引物
<222>(1)..(72)
<400>7
gatccagctg gctagatatc ctacttgtca tcgtcgtcct tgtaatcgat atctatccgg 60
gagtcctgga gg 72
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>引物
<222>(1)..(38)
<400>8
gatccagctg caccatggcc gcggctcatg gacctgtc 38
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>引物
<222>(1)..(20)
<400>9
cagctgttgc cagggcaacg 20
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>引物
<222>(1)..(21)
<400>10
gaggctgtgg ttgagcaggt g 21
<210>11
<211>4006
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：哺乳动物表达载体
<220>
<221>克隆载体pCI
<222>(1)..(4006)
<223>DNA序列(U47119，自2004年2月18日起)
<400>11
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660
cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720
tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780
tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840
gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900
actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960
tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020
aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcctc gagaattcac gcgtggtacc 1080
tctagagtcg acccgggcgg ccgcttcgag cagacatgat aagatacatt gatgagtttg 1140
gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta 1200
ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc 1260
attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct 1320
acaaatgtgg taaaatcgat aaggatccgg gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 1380
atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gacgcgccct gtagcggcgc 1440
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 1500
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 1560
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 1620
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 1680
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 1740
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 1800
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 1860
attaacgctt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 1920
caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc 1980
cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct 2040
tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca 2100
ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg 2160
ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 2220
atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 2280
taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 2340
cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 2400
aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 2460
aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 2520
tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 2580
ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 2640
catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 2700
aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 2760
ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 2820
gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc 2880
aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 2940
gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 3000
gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 3060
gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 3120
gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 3180
gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 3240
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 3300
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 3360
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 3420
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 3480
ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 3540
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 3600
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 3660
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 3720
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 3780
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 3840
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 3900
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 3960
ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atggctcgac agatct 4006
Claims (24)
1.含有编码GLYT1的DNA序列的遗传构建体，所述DNA序列与启动子有效连接。
2.根据权利要求1的遗传构建体，其中DNA序列编码GLYT1的同种型。
3.根据权利要求1的遗传构建体，其中DNA序列编码GLYT1b。
4.根据权利要求1到3中任一项的遗传构建体，其中编码序列是人的序列。
5.根据权利要求1到4中任一项的遗传构建体，其中启动子是组织特异的启动子。
6.根据权利要求1到4中任一项的遗传构建体，其中启动子是前脑特异的启动子。
7.根据权利要求1到4中任一项的遗传构建体，其中启动子是可控制的启动子。
8.产生非人类转基因动物的方法，所述转基因动物的基因组含有编码GLYT1的转基因DNA，所述方法包括：
a)向非人类受精卵或非人类胚胎干细胞引入根据权利要求1到7中任一项的遗传构建体，
b)从所述受精卵或胚胎干细胞制备非人类转基因动物，并由此，
c)产生非人类转基因动物，所述转基因动物基因组中含有编码GLYT1的转基因DNA。
9.产生表达转基因GLYT1的非人类转基因动物的方法，包括：
a)向非人类受精卵或非人类胚胎干细胞引入根据权利要求1到7中任一项的遗传构建体，
b)从所述受精卵或胚胎干细胞制备非人类转基因动物，并由此，
c)产生表达转基因GLYT1的非人类转基因动物。
10.由权利要求8到9中任一项的方法产生的非人类转基因动物。
11.非人类转基因动物，其基因组中含有权利要求1到7中任一项的遗传构建体。
12.根据权利要求10或11的非人类转基因动物，其中转基因动物是啮齿动物。
13.根据权利要求10或11的非人类转基因动物，其中转基因动物是小鼠。
14.根据权利要求10到13中任一项的非人类转基因动物，所述转基因动物过表达GLYT1蛋白质。
15.根据权利要求10到13中任一项的非人类转基因动物，所述转基因动物组织特异性地过表达GLYT1蛋白质。
16.根据权利要求10到15中任一项的非人类转基因动物的后代。
17.来源于根据权利要求10到16中任一项的非人类转基因动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物。
18.来源于根据权利要求10到16中任一项的非人类转基因动物或其后代的组织或器官型脑片培养物。
19.根据权利要求10到16的非人类转基因动物、或根据权利要求17的细胞系或原代细胞培养物、或根据权利要求18的组织或器官型脑片培养物作为模型在研究化合物对精神病行为的作用中的用途。
20.根据权利要求10到16的非人类转基因动物、或根据权利要求17的细胞系或原代细胞培养物、或根据权利要求18的组织或器官型脑片培养物在测试化合物的GLYT1特异性抑制作用中的用途。
21.根据权利要求10到16的非人类转基因动物、或根据权利要求17的细胞系或原代细胞培养物、或根据权利要求18的组织或器官型脑片培养物作为模型在研究抑制突触NMDA受体功能的效果中的用途。
22.评估GLYT1功能对NMDA受体活化的体内影响的方法，所述方法包括在权利要求10到16中任一项的非人类转基因动物中测定NMDA受体活性、突触可塑性和行为——包括学习和记忆，并将此NMDA受体活性、突触可塑性和行为与对照的相比较。
23.测试GLYT1抑制剂化合物增强NMDA受体活性的能力的方法，所述方法包括向权利要求10到16的非人类转基因动物、或根据权利要求17的细胞系或原代细胞培养物、或根据权利要求18的组织或器官型脑片培养物施予GLYT1抑制剂化合物，确定化合物的效果——包括评价行为、电生理学和组织学，和与对照的行为、电生理学和组织学相比较。
24.测试GLYT1抑制剂化合物增强NMDA受体活性的能力的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求10到16中任一项的非人类转基因动物、或根据权利要求17的细胞系或原代细胞培养物、或根据权利要求18的组织或器官型脑片培养物或组织，以及用于确定化合物是否表现出增强NMDA受体活性的能力的手段。
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