DE102012101153A1 - Verfahren zur biotechnologischen herstellung von organischen säuren durch mindestens einen hefestamm - Google Patents

Verfahren zur biotechnologischen herstellung von organischen säuren durch mindestens einen hefestamm Download PDF

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DE102012101153A1
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von organischen Säuren durch mindestens einen Hefestamm, wobei als Substrat mindestens ein nachwachsender Rohstoff verwendet wird.

Description

  • Dicarbonsäuren wie Fumarat (wörtlich: Salz der Fumarsäure; im Kontext der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe "Fumarat" und "Fumarsäure" synonym verwendet), die im Tricarbonsäurezyklus von Lebewesen vorkommen und eine wichtige Rolle im Stoffwechsel vieler Organismen einnehmen, besitzen vielfältige industrielle Anwendungsmöglichkeiten.
  • Fumarsäure ist für zahlreiche Anwendungen in der Lebensmittelindustrie interessant und wird als Säuerungsmittel E 297, als Ersatz für Weinsäure in Getränken und Backpulver verwendet. Fumarsäure kann als Building block als Ausgangsmaterial zur Polymerherstellung genutzt werden, als Beizmittel beim Färben, in der Herstellung von ungesättigten Polyesterharzen, Farben, Lacken sowie zur Herstellung mehrwertiger Alkohole und Papierleimungsmittel. Ebenso ist die chemische Konversion von Fumarsäure in Bernsteinsäure oder Maleinsäure möglich. Die Monoethyl- und Dimethylester von Fumarsäure finden Anwendung in Medikamenten gegen Psoriasis (Schuppenflechte).
  • Fumarsäure wird zurzeit großtechnisch durch die Isomerisierung von Maleinsäure hergestellt, die wiederum aus Maleinsäureanhydrid gewonnen. Das Ausgangsmaterial für Maleinsäureanhydrid ist vorrangig petrochemisch gewonnenes Benzen, aber auch Mischungen aus n-Butanen. Da Fumarat hauptsächlich durch chemische Umwandlung aus petrochemischen Edukten gewonnen wird, bestehen schon seit den 1940er Jahren große Bemühungen, diese Verfahren, durch mikrobielle Verfahren, unter Nutzung nachwachsender Rohstoffe sowie pflanzlicher oder tierischer Abprodukte, zu ersetzen. Dabei wurde insbesondere mit filamentösen Pilzen der Gattung Rhizopus experimentiert, die bei Verwendung von Glucose als Substrat bis zu 97,7 g Fumarat pro Liter Medium erzeugen können (Murray 2011).
  • Dagegen ist die biotechnologische Herstellung von Fumarsäure mit Hefen in der Literatur kaum beschrieben. Im Gegensatz zu filamentösen Pilzen oder auch vielen Bakterien besitzen Hefen Eigenschaften, die besonders vorteilhaft für biotechnologische Fermentationsverfahren Verfahren sind. Dabei sind folgende Aspekte besonders erwähnenswert:
    • • einfache Kultivierbarkeit im Vergleich zu filamentösen Pilzen, da keine Pelletbildung erforderlich ist,
    • • hohe genetische Stabilität der eingesetzten Produktionsstämme,
    • • geringere Anfälligkeit gegenüber Sauerstoffunterversorgung,
    • • hohe Widerstandsfähigkeit der Hefezellen gegenüber mechanischen Scherkräften,
    • • Auslösung der Produktbildungsphase häufig durch Stickstoff-, Phosphor- oder Schwefelauszehrung,
    • • Breites Spektrum an nutzbaren Substraten (Kohlenhydrate, Lipide, Polyole), was den Einsatz von Mischsubstraten sowie Substratwechsel, beispielsweise zwischen Wachstums- und Produktionsphase, ermöglicht, was zu erhöhten Ausbeuten und/oder zu geringeren Produktionskosten führen kann.
  • Die Gewinnung von Fumarsäure durch Fermentation mit Hefen ist nur für wenige Stämme beschrieben. Die wenigen vorliegenden Veröffentlichungen beschreiben ausschließlich die Verwendung von n-Paraffinen und sind auf den Schüttelkolbenmaßstab beschränkt.
  • So wurde die Hefeart Candida hydrocarbofumarica (später taxonomisch als Candida blankii eingeordnet) als geeignet für die Fumaratproduktion identifiziert (Furukawa et al. 1978).
  • Untersuchungen mit dem Stamm C. hydrocarbofumarica Et-15-2 führten bei Verwendung von n-Paraffinen als Substrat zu Produktkonzentrationen von 30–50 g/l Fumarat bei Produktivitäten von 0,2–0,3 g/l·h.
  • In der Patentschrift der italienischen Fa. Liquichimica ( US 4013508 ) wird die Gewinnung von Fumarat als Intermediat zur Produktion von L-Asparaginsäure in einem zweistufigen Prozess beschrieben, wobei die in der ersten Stufe realisierte Fumaratproduktion mit C. hydrocarbofumarica ATCC20473 die höchsten beschriebenen Produktkonzentrationen und Produktivitäten für Hefen zeigt, mit bis zu 57 g/l Fumarat und 0,8 g/l·h (Tab. 2). Dabei kommen als Substrat n-Paraffine mit bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 13 bis 18 Kohlenstoffatomen zum Einsatz. Spätere Arbeiten mit diversen C. blankii Stämmen führten zu eher moderaten Ergebnissen (33–36 g/l Fumarat).
  • Ferner beschreibt die Literatur Versuche zur Ertüchtigung der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae für die Bildung von Fumarsäure (Kaclikova et al. 1992), wobei die Mutante S. cerevisiae EF2 isoliert wurde, welche in sehr geringem Umfang Fumarat (0,25 g/l) akkumuliert.
  • Nachteilig bei allen beschriebenen Verfahren mit Hefen ist, dass ausschließlich endliche Ressourcen in Form von n-Paraffinen eingesetzt werden. Deren wirtschaftliche Verfügbarkeit sowie deren Akzeptanz ist nicht auf Dauer gesichert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, alternative Verfahren zur Herstellung von organischen Säuren, bevorzugt Fumarat, bereitzustellen. Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahren zur Herstellung von organischen Säuren, bevorzugt Fumarat, bereitzustellen, bei welchen nachwachsende Rohstoffe verwendet werden können. Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Vorteile mindestens eines Hefestamms für die Produktion organsicher Säuren, bevorzugt Fumarat, verfügbar zu machen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Aufgaben werden mit einem Verfahren gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Die Unteransprüche geben bevorzugte Ausführungsformen an.
  • Demnach ist ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von organischen Säuren durch mindestens einen Hefestamm vorgesehen, wobei als Substrat mindestens ein nachwachsender Rohstoff verwendet wird.
  • Hefen sind einzellige Pilze, die sich durch Sprossung oder Teilung (Spaltung) vermehren. Die meisten gehören der Abteilung der Schlauchpilze (Ascomycota) an. Der Begriff "Hefe" für einzellige Pilze wird häufig in Abgrenzung zu den filamentösen Pilzen verwendet, zu denen beispielsweise Schimmelpilze wie Rhizopus zählen.
  • Bevorzugt sollen unter dem Begriff "Hefestämme" Stämme der Gattungen Saccharomyces; Schizosaccharomyces; Wickerhamia; Debayomyces; Hansenula; Hanseniaspora; Pichia; Kloeckera; Candida; Zygosaccharomyces; Ogataea; Kuraishia; Komagataella; Yarrowia; Metschnikowia; Williopsis; Nakazawaea; Kluyveromyces; Cryptococcus; Torulaspora; Torulopsis; Bullera; Rhodotorula; Sporobolomyces; Pseudozyma; Saccharomycopsis; Saccharomycodes; Trichosporon und/oder Trichoderma verstanden werden.
  • Unter dem Begriff "Nachwachsender Rohstoff", wie hier verwendet, werden organische Rohstoffe verstanden, die zumindest mittelbar aus land- und forstwirtschaftlicher Produktion oder bei denen es sich um biogene Abfallprodukte handelt. Im Gegensatz hierzu werden in den bekannten hefebasierten Verfahren zur Herstellung von Dicarbonsäuren ausschließlich endliche Ressourcen in Form von petrochemischen Produkten (z.B. n-Paraffine) eingesetzt.
  • Mit dem Begriff "organische Säuren" sind hier bevorzugt organische Säuren des Citratzyklus gemeint, also Citrat, Isocitrat, a-Ketoglutarat, Succinat, Fumarat, Malat und Oxalacetat.
  • Bevorzugt ist vorgesehen, dass das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Glucose, Fructose, Saccharose, Galactose, Lactose, Maltose, Sorbose, Xylose, Arabinose, Trehalose, Ethanol, Glycerol, Erythritol, Ölsaure, Raps-, Soja- und/oder Sonnenblumenöl.
  • Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Substrat um Glucose, die beispielsweise durch enzymatischen Abbau von Stärke oder Cellulose erzeugt werden kann. Ebenso bevorzugt ist Glycerol, das beispielsweise durch Umesterung bei der Biodieselproduktion anfällt (ca. 100 kg pro Tonne Biodiesel).
  • Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass die Herstellung der organischen Säuren unter aeroben Bedingungen in Submerskultur erfolgt.
  • Die Kultivierung erfolgt stammspezifisch bei pH-Werten von 3–8 und einer Temperatur von 20°C bis 40°C, vorzugsweise bei pH 5–7 sowie Temperaturen von 26°C bis 33°C.
  • Weiterhin ist bevorzugt vorgesehen, dass die Herstellung der organischen Säuren als Submerskultur im Batch-Betrieb, im Fed-Batch-Betrieb, im Repeated Fed-Batch Betrieb oder im kontinuierlichen Betrieb erfolgt.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei den zu produzierenden organischen Säuren um mindestens eine C4-Dicarbonsäure. Ganz besonderes bevorzugt handelt es sich dabei um Fumarat.
  • Weiterhin ist bevorzugt vorgesehen, dass mindestens ein Hefestamm der Gattung Candida zugehört. Besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass mindestens ein Hefestamm den Arten Candida rugosa und/oder Candida blankii zugehört.
  • Bevorzugte Ausführungsformen betreffen dabei die Stämme Candida rugosa IFO 0731, Candida spec. ATCC 20473, Candida blankii CBS 7205, Candida blankii MUCL 29808, Candida blankii MUCL 29842, Candida blankii MUCL 30066, Candida blankii MUCL 30304, Candida blankii MUCL 30304, Candida blankii IF01973, Candida blankii IHEM 4004, Candida blankii MYA 3435, Candida blankii CBS 6788, und Candida blankii CBS 6833.
  • Wie bereits erwähnt erfolgt die Kultivierung stammspezifisch bei pH-Werten von 3–8 und einer Temperatur von 20°C bis 40°C, vorzugsweise bei pH 5–7 sowie Temperaturen von 26°C bis 33°C. Es ist daher ein Neutralisierungsmittel erforderlich, um die durch die erzeugten organischen Säuren bedingte pH-Absenkung zu kontrollieren.
  • Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass mindestens ein Hefestamm gentechnisch modifiziert ist. Solche eine genetische Modifikation kann bevorzugt so gewählt sein, dass sie
    • a) mindestens ein homologes Protein nicht, weniger stark oder aber in dysfunktionaler Form exprimiert,
    • b) mindestens ein homologes Protein überexprimiert oder ständig exprimiert, und/oder
    • c) mindestens ein heterologes Protein exprimiert,
    und zwar dergestalt, dass dadurch die Quantität, Qualität und/oder Zusammensetzung der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellenden organischen Säuren verbessert wird.
  • Dabei ist bevorzugt vorgesehen, dass mindestens ein Neutralisierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe enthaltend CaCO3, Ca(OH)2, KOH, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, NH4OH, (NH4)2CO3, NH4HCO3 und Gemischen dieser Substanzen verwendet wird.
  • Besonders bevorzugt ist der Einsatz von in wässriger Form verwendbaren Neutralisationsmitteln, ausgewählt aus KOH, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, NH4OH, (NH4)2CO3 und NH4HCO3 vorgesehen.
  • Solche Neutralisationsmittel weisen besondere Vorteile auf. So sind sie leichter Handhabbarm weisen eine einfache Dosierbarkeit auf, da sie flüssig zudosierbar sind und keine Ungenauigkeiten durch nicht oder schlecht lösliche Bestandteile heraufbeschwören, und sind einfacher steril zu halten.
  • In der folgenden Tabelle sind die bevorzugten in wässriger Form verwendbaren Neutralisationsmittel gezeiugt.
    Substanz Löslichkeit in g/l [20 °C]
    KOH 1120
    NaOH 1090
    Na2CO3 217
    NaHCO3 96
    NH4OH 520 [1 bar NH3]
    (NH4)2CO3 320
    NH4HCO3 220
    Tab. 1: bevorzugt verwendete Neutralisierungsmittel
  • Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Neutralisationsmittel um Na2CO3.
  • Weiterhin ist erfindungsgemäß die Verwendung mindestens eines Hefestamms zur biotechnologischen Herstellung von organischen Säuren vorgesehen, wobei als Substrat mindestens ein nachwachsender Rohstoff verwendet wird. Es versteht sich, dass die in Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren oben geschilderten Merkmale und Rückfallpositionen auch in Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung als offenbart gelten sollen.
  • Experimente
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die im Folgenden diskutierten Experimente genauer erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Figuren nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken.
  • In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Der Wildtyp- Stamm Candida blankii IFO 1973 wurde jeweils auf YPD-Agarplatten folgender Zusammensetzung für 24 bis 48 Stunden bei 30°C kultiviert:
    Hefeextrakt 10 g/l
    Pepton 20 g/l
    Glucose 20 g/l
    Agar 20 g/l
  • Von den gewachsenen Agarkulturen wurden jeweils 2 bis 3 Impfösen auf 50 ml sterilisiertes, mit destilliertem Wasser hergestelltes Nährmedium folgender Zusammensetzung überimpft:
    KH2PO4 0,5 g/l
    MgSO4 × 7H2O 0,5 g/l
    K2HPO4 0,5 g/l
    NH4Cl 3 g/l
    MnSO4 × H2O 500 µg/l
    ZnSO4 × 7H2O 5 mg/l
    FeSO4 × 7H2O 10 mg/l
    Hefeextrakt 0,4 g/l
    CaCl2 10 mg/l
    Glucose 40 g/l
    Calciumcarbonat 40 g/l
  • Die Vorkultur wurde in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, bei 30°C, bei pH 5,5–7, für 48 h auf einer Schüttelapparatur bei einer Schüttelfrequenz von 160 rpm kultiviert.
  • Von der Vorkultur erfolgte jeweils die Überimpfung von 5 ml Inokulum auf 50 ml, sterilisiertes, mit destilliertem Wasser hergestelltes Nährmedium (Zusammensetzung siehe oben). Durch regelmäßige Substratnachdosierung wurde die Glucose-Konzentration während der Kultivierung in einem Bereich von 40 bis 60 g/l gehalten.
  • Die Kultivierung erfolgte unter sterilen Bedingungen bei einer Temperatur von 30°C und einer Schüttelfrequenz von 160 rpm. Der pH-Wert wurde in einem Bereich unterhalb von pH 5,5 mit 15% NaOH, sowie oberhalb von pH 7,0 mit HCl (2N) korrigiert.
    Kulturdauer [h] Fum [g/l] Suc [g/l] Mal [g/l] Cit + Iso [g/l] KG [g/l] OD 600 Selektivität [%] Produktivität [g/l·h]
    335 48,5 4,3 3,2 0,3 1,6 137,1 83,9 0,14
    Tab. 2: Fumarat-Produktion von Candida blankii IFO1973 (Fum = Fumarat, Suc = Succinat, Mal = Malat, Cit = Citrat, Iso = Isocitrat, KG = Ketoglutarat).
  • Für Fumarat konnte eine Selektivität von über 80%, eine Produktkonzentration von 48,5 g/l sowie eine Produktivität von 0,14 g/l·h gezeigt werden (siehe Tabelle 2).
  • Beispiel 2
  • Die Kultivierung der Wildtyp-Stämme Candida blankii IFO 1973, Candida blankii CBS 7205, Candida blankii MUCL 29808, Candida blankii MUCL 29842, Candida blankii MUCL 30066, Candida blankii MUCL 30304, Candida blankii MUCL 30304, Candida blankii IFO1973, Candida blankii IHEM 4004, Candida blankii MYA 3435, Candida blankii CBS 6788, Candida blankii CBS 6833 erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • In Tabelle 3 sind die Produktkonzentrationen nach 92, 187 und 260 h Kulturzeit dargestellt. Die höchsten Fumarat-Konzentrationen lagen mit 25,5 g/l (C. blankii CBS 6833), 24,2 g/l (C. spec. ATCC 20473) und 23,9 g/l (C. blankii MUCL 29808) vor (siehe Tabelle 3). Die höchsten Selektivitäten für Fumarat konnten mit 87,3 % (C. blankii MUCL 29842) und 86,8 % (C. spec. ATCC 20473) bestimmt werden. Die größte Produktivität erreichte hier C. blankii MUCL 29842, mit 0,23 g/l·h, sowie C. blankii CBS 7205, mit 0,22 g/l·h.
    Stamm Kultur dauer [h] Fum [g/l] Suc [g/l] Mal [g/l] Cit + Iso [g/l] KG [g/l] OD 600 Selektivität Fumarat [%] Produktivität Fumarat [g/l·h]
    C. blankii CBS 7205 92 20,2 2,3 0,8 0,0 3,4 138,9 75,6 0,22
    C. blankii MUCL 29808 187 23,9 2,1 3,6 0,0 0,0 152,1 80,7 0,13
    C. blankii MUCL 29842 92 21,4 1,3 0,7 0,0 1,2 146,0 87,3 0,23
    C. blankii MUCL 30304 260 15,6 4,1 5,4 0,0 3,0 65,7 55,5 0,06
    C. blankii IHEM 4004 260 16,0 1,7 2,8 0,0 2,5 99,2 69,5 0,06
    C. blankii CBS 6788 92 18,0 1,3 0,8 0,0 2,3 142,0 80,4 0,20
    C. blankii CBS 6833 165 25,5 2,0 2,9 0,0 1,2 143,8 80,8 0,15
    C. blankii IFO1973 236 22,2 1,7 2,8 0,0 2,7 173,3 75,6 0,09
    C. spec. ATCC 20473 144 24,2 1,2 2,2 0,0 0,3 141,6 86,8 0,17
    Tab.3: Kultivierungsdauer und Ergebnisse der Fumarat-Produktion mit Stämmen von Candida blankii (Fum = Fumarat, Suc = Succinat, Mal = Malat, Cit = Citrat, Iso = Isocitrat, KG = Ketoglutarat).
  • Beispiel 3
  • Mit dem Stamm Candida blankii IFO 1973 erfolgte die Kultivierung wie im Beispiel 1 beschrieben. Zur Regulierung des pH-Wertes wurden entweder 15%ige NaOH, Na2CO3 (200 g/l), 30 g/l CaCO3, (NH4)2CO3 oder Kombinationen dieser eingesetzt.
  • Eine erfolgreiche Produktion von Fumarat mit einer Vielfalt an verschiedenen flüssigen oder/und festen Neutralisationsmitteln konnte gezeigt werden.
    Verwendete Neutralisationsmittel Kultur dauer [h] Fum [g/l] Suc [g/l] Mal [g/l] Cit + Iso [g/l] KG [g/l] OD 600 Selektivität Fumarat [%] Produktivität Fumarat [g/l·h]
    NaOH 817 14,0 1,3 3,4 0,0 1,7 160,8 66,5 0,02
    CO Na2 3 335 23,6 1,4 1,9 0,0 0,6 135,6 86,0 0,07
    NaOH CaCO3 817 37,8 3,0 5,0 0,5 1,9 112,9 77,6 0,05
    Na2CO3 CaCO3 189 12,0 0,4 0,5 0,0 1,3 121,6 83,7 0,06
    (NH4)2CO3 CaCO3 189 9,1 0,6 0,3 0,0 0,5 125,0 86,1 0,05
    Ca(OH2) CaCO3 189 8,2 0,3 1,1 0,0 1,1 160,4 74,7 0,04
    CaCO3 335 35,1 3,2 2,7 201,0 0,9 125,6 82,8 0,10
    Tab.4: Verwendete Neutralisationsmittel oder Kombinationen von Neutralisationsmitteln und Ergebnisse der Fumarat-Produktion mit Candida blankii IFO 1973 (Fum = Fumarat, Suc = Succinat, Mal = Malat, Cit = Citrat, Iso = Isocitrat, KG = Ketoglutarat)
  • Beispiel 4
  • Mit dem Stamm Candida rugosa IFO 0731 erfolgte eine Kultivierung im Schüttelkolbenmaßstab wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Abweichend von Beispiel 1 wurden in der Vor- und Hauptkultur das YNB-Medium mit Vitaminen und ohne Aminosäuren (No. 291940; Fa. BD Difco) eingesetzt. Abweichend von Beispiel 1 wurde raffiniertes Rapsöl als Substrat verwendet.
  • Die Kultivierung erfolgte unter sterilen Bedingungen bei einer Temperatur von 30°C und einer Schüttelfrequenz von 140 rpm. Der pH-Wert wurde in einem Bereich unterhalb von pH 5,5 mit 15% NaOH korrigiert.
  • Nach 214 Stunden betrug die Menge an gebildeter Fumarsäure 22,7 g/l. An weiteren Säuren wurden 2,6 g/l Ketoglutarat; 5,2 g/l Malat und 5,8 g/l Succinat gebildet. Dies entsprach einer Selektivität für Fumarsäure von 62%. Die Produktivität betrug 0,1 g/l·h. Im Kultivierungszeitraum wurden 29 g/l Biomasse gebildet.
  • LITERATUR
    • Murray, M. -Y. (2011) Comprehensive Biotechnology, Second Edition. Volume 3 Industrial Biotechnology and Commodity Products. Elsevier
    • Furukawa T, de Miranda LR, Matsuyoshi T (1978) Fermentative Production of Fumaric Acid from n-Paraffins by Candida blankii. J Ferment Technol 56, 546–549.
    • Kaclikova E, Lachowicz TM, Gbelska Y, Subik J (1992) Fumaric acid overproduction in yeast deficient in fumarase. FEMS Microbiology Letters 91, 101–106.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • US 4013508 [0008]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Furukawa et al. 1978 [0006]
    • Kaclikova et al. 1992 [0009]

Claims (13)

  1. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von organischen Säuren durch mindestens einen Hefestamm, wobei als Substrat mindestens ein nachwachsender Rohstoff verwendet wird.
  2. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Glucose, Fructose, Saccharose, Galactose, Lactose, Maltose, Sorbose, Xylose, Arabinose, Trehalose, Ethanol, Glycerol, Erythritol, Ölsaure, Raps-, Soja- und/oder Sonnenblumenöl.
  3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Herstellung der organischen Säuren unter aeroben Bedingungen in Submerskultur erfolgt.
  4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Herstellung der organischen Säuren als Submerskultur im Batch-Betrieb, im Fed-Batch-Betrieb, im Repeated Fed-Batch Betrieb oder im kontinuierlichen Betrieb erfolgt.
  5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den zu produzierenden organischen Säuren um mindestens eine C4-Dicarbonsäure handelt.
  6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den zu produzierenden organischen Säuren mindestens um Fumarat handelt.
  7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei mindestens ein Hefestamm der Gattung Candida zugehört.
  8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei mindestens ein Hefestamm den Arten Candida rugosa und/oder Candida blankii zugehört.
  9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei mindestens ein Hefestamm gentechnisch modifiziert ist.
  10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei mindestens ein Neutralisierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe enthaltend CaCO3, Ca(OH)2, KOH, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, NH4OH, (NH4)2CO3, NH4HCO3 und Gemischen dieser Substanzen.
  11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Neutralisierungsmittel in wässriger Form verfügbar ist.
  12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei dem Neutralisierungsmittel um Na2CO3 handelt.
  13. Verwendung mindestens eines Hefestamms zur biotechnologischen Herstellung von organischen Säuren, wobei als Substrat mindestens ein nachwachsender Rohstoff verwendet wird.
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