KR20230150337A - 하이드록시티로솔을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 티로솔에서 하이드록시티로솔(HTS)로 효소적으로 반응시켜 HTS를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 반응 출발 물질이 i) 티로솔, ii) 에리소르브산 및 에리소르베이트로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 iii) 서열 번호 2 및 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 옥시다제를 함유하고, HTS가 반응 출발 물질로부터 단리되는 것을 특징으로 한다.

Description

하이드록시티로솔을 제조하는 방법

본 발명은 반응 혼합물이 i) 티로솔 및 ii) 에리소르브산 및 에리소르베이트로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 iii) 서열 번호 2 및 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 옥시다제를 포함하고, HTS가 반응 혼합물로부터 단리되는 것을 특징으로 하는, 티로솔에서 하이드록시티로솔(HTS)로의 효소적 전환에 의해 HTS를 제조하는 방법에 관한 것이다.

하이드록시티로솔(HTS; 3,4-디하이드록시페닐에탄올; CAS 번호 10597-60-1)은 효과적인 항산화제이며, 건강에 대해 긍정적인 효과를 가지고 있기 때문에 최근 많은 관심의 대상이 되고 있다. HTS는 지중해식 식사의 유효 성분인 것으로 간주된다. 유럽 식품 안전청(EFSA: European Food Safety Authority)은 적어도 5 mg의 1일 용량의 HTS를 권장하면서, 올리브에서 유래한 폴리페놀에 대해 긍정적인 건강 정보 표시를 허용하였다. HTS의 염증 억제 효과도 기술되었다. 또한, 시험관내에서 HTS가 비브리오(Vibrio) 속, 살모넬라(Salmonella) 속 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속의 몇몇 균주에 대한 것과 같이, 호흡 통로 및 위장관의 병원균의 병원체에 대해 항미생물 특성을 가지며, 사용되는 용량이 예컨대, 암피실린과 같은 항생제의 것과 경쟁할 가능성이 매우 높을 수 있다는 것을 보여주는 연구가 존재한다. 상기 물질은 추가로 신경보호 및 항증식성 및 아폽토시스 촉진 효과게 기여한다. 이러한 특성은 HTS가 제약, 식품 보충제, 기능성 식품 또는 아니면 화장품에 사용되는 매우 큰 관심의 대상이 되고, 수요가 많은 물질이라는 것을 의미한다.

지금까지 시중에서 이용가능한 HTS는 주로 올리브, 올리브 잎 또는 올리브 오일 생산에서 수득되는 폐수에서 나오며, 추출물 형태로 공급되고; 이들 제품 중 HTS의 비율은 일반적으로 매우 낮다. 그 예로는 HTS 함량이 12% 미만인 HIDROX^® 또는 약 4.5% HTS를 함유하는 OPEXTAN™이 있다.

올리브에서 천연 HTS를 단리시키는 것 뿐만 아니라, 상기 물질을 합성적으로 제조하는 방법도 기술되었다.

예를 들어, TN SN03042 A1 또는 문헌 [Allouche et al. (2004), J. Agric. Food Chem. 52: 267-273]에 의한 상응하는 간행물에는 올리브 오일 폐수로부터의 HTS의 추출 및 정제가 기술되어 있다.

하기 일반 화학식 (1)의 반응물을 pH < 3에서 알루미늄 화합물 및 수성 하이드록시카복실산의 존재하에서 반응시키고, 형성된 HTS를 추출에 의해 단리시키는 것인, HTS의 화학적 제조 방법이 예를 들어, EP 2 774 909 B1에 개시되어 있다:

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또한, HTS를 제조하는 생명공학 방법도 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 화학식에 따라 티로솔을 대기 산소의 존재하에서 하이드록실화하여 HTS를 수득할 수 있다:

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예를 들어, EP 3 234 164 B1에는 아스코르브산을 포함하는 반응 혼합물 중에서의 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)으로부터의 티로시나제 효소 또는 이의 기능성 유도체를 이용한 티로솔에서 HTS로의 효소적 전환 방법이 기술되어 있고, 여기서 기능성 유도체는 야생형 티로시나제 효소와 비교하면 1 내지 5개의 아미노산 변이를 갖는, R. 솔라나세아룸(R. solanacearum)으로부터의 티로시나제 효소의 조작된 변이체이고, 여기서 상기 변이 또는 각각의 변이는 아미노산의 삽입, 부가, 결실 및 치환으로부터 선택된다.

EP 3 234 164 B1에는 활성이 27.6 g/L(199.7 mM)의 티로솔 기질, 30.8 g/L(199.7 mM) HTS, 및 최대 0.4 M 농도의 아스코르브산의 나트륨 염에 의해 억제되지 않는 티로시나제가 개시되어 있다. 생체변환에서, 진탕 플라스크 규모(실험실 규모)로 E. 콜라이(E. coli)에서 재조합 수단에 의해 제조되고, 무세포 용해물 형태로 사용되는 R. 솔라나세아룸 티로시나제의 조작된 변이체에 의해 300 mM의 아스코르브산의 나트륨 염(티로솔 반응물 대비 2배 몰 과량)의 존재하에서 150 mM 티로솔을 HTS로 전환시킬 수 있었다. 티로솔 기질인 1 mM 티로솔 1 L당 효소 용량이 2 mg일 때(즉, 150 mM 티로솔당 300 mg의 효소인 매우 높은 고용량), 전환이 완료될 때까지의 반응 시간은 약 6 h였다.

따라서, EP 3 234 164 B1에 개시된 방법은 산업적 용도에 부적합하다. 티로시나제의 생산가능성은 실험실 규모로만 개시되었다. 티로솔 반응물의 사용량은 150 mM로 비교적 적고, 티로시나제 생산 세포의 무세포 용해물을 제조하여야 했다.

CN 101624607 B에는 25 g/L(180 mM) 티로솔이 50 g/L(284 mM) 아스코르브산의 존재하에(티로솔 대 아스코르브산의 몰비: 1:1.57) 옥시다제에 의해 HTS로 전환되고, HTS가 나노여과, 칼럼 크로마토그래피, 추출 및 증류에 의한 다단계 프로세스로 단리되는 방법이 개시되어 있다. 상기 조건하에서 88.3% 순도로 HTS를 수득하였다. 더 높은 순도의 HTS는 더 높은 순도의 HTS를 단리시키기 위해 지지체 상에 옥시다제를 복합적으로 고정화시키고, 상기 언급된 프로세스를 사용하는 또 다른 칼럼 크로마토그래피 작동을 통해서만 수득될 것이다.

당업자에 의하면 CN 101624607 B로부터의 방법은 개시내용에 일부 결함이 있는 것으로 간주될 것이다. 옥시다제 효소의 유래 기점이 충분히 개시되어 있지 않다. 마찬가지로 경제적 실현가능성에 중요한 효소 제조 방법에 대한 정보도 없다. 더욱이, 제품 순도를 측정하는 방법에 대한 세부 정보도 없다.

결과적으로 CN 101624607 B에 개시된 방법은 산업적 용도로의 적합성은 불충분하다. 티로솔 반응물 사용량은 최대 180 mM(배치 1 kg당 25 g의 티로솔)로 비교적 낮고, 1.57배 몰 과량의 아스코르브산은 매우 높다. 고정화된 효소를 이용하는 생체변환의 경우, 먼저 효소를 복합 방식으로 정제하여야 하고, 이어서, 티로솔 반응물의 사용량은 고정화되지 않은 효소를 사용하는 배치에서보다 훨씬 적다. 더욱이, HTS는 상기 방법에서 5 단계, 즉, 나노여과, 크로마토그래피, 용출액의 에틸 아세테이트 추출, 추출물 증류 및 또 다른 칼럼 크로마토그래피 작동에 걸쳐 워크 업되어야 한다. HTS의 생명공학 생산의 경제적 실현가능성을 개선시키기 위해서는 상기 비용 결정 인자는 CN 101624607 B에 개시된 방법의 개선을 필요로 한다.

문헌 [Li et al. (2018), ACS Synth. Biol. 7: 647-654]에는 티로솔의 생체변환에 기초하지 않은 HTS의 생합성 제조 경로가 기술되어 있다.

본 발명의 목적은 선행 기술에 비해 개선되고, 경제적 실현가능성이 더 높으며, 간단한 방식으로 및 고순도로 하이드록시티로솔을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 목적은 반응 혼합물이 i) 티로솔 및 ii) 에리소르브산 및 에리소르베이트로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및 iii) 서열 번호 2 및 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 옥시다제를 포함하고, 하이드록시티로솔(HTS)이 반응 혼합물로부터 단리되는 것을 특징으로 하는, 티로솔에서 HTS로의 효소적 전환에 의해 HTS를 제조하는 방법에 의해 달성된다.

본 발명의 맥락에서 사용되는 에리소르브산은 일반적으로 바람직하게, D-에리소르브산이다. 에리소르베이트는 에리소르브산의 염, 바람직하게, 나트륨 염, 소듐 D-에리소르베이트, 더욱 바람직하게, 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O이다. 에리소르브산 또는 이의 염은 반응에서 보조제이며, 이는 또한 이하 "보호 물질"이라는 용어로도 지칭된다. 상기 용어가 사용된 이유는 보호 물질의 존재하에서는 HTS가 티로솔 산화의 최종 생성물이고, 즉, HTS는 "보호되는" 반면, 보호 물질의 부재하에서는 HTS가 추가로 산화되기 때문이다. 보호 물질은 제품의 안정화에 기여하는 물질로 정의된다.

(이는 또한 이하 단백질 (iii)로도 지칭되는) 옥시다제의 특징은

(1) 옥시다제 활성을 갖고, 즉, 대기 산소의 존재하에서 심지어 > 0.2 M 농도에서도 티로솔을 전환시킬 수 있고, 상기 반응 동안 심지어 > 0.4 M의 고농도에서도 에리소르브산 또는 에리소르베이트를 견딜 수 있고,

(2) 서열 번호 2(RscK60 옥시다제)의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열을 갖고,

여기서 서열 번호 2는 NCBI 단백질 데이터베이스에서 수탁 번호 CCF97399.1로 식별되는 단백질인 것이다.

아미노산 서열이 폴리페놀 옥시다제/카테콜 옥시다제로 주석이 달린고, 서열 번호 2에 개시된 서열과 상동성이라는 것은 아미노산 1부터 아미노산 543까지의 전체 서열 범위에 걸쳐 서열 번호 2와 적어도 86%, 바람직하게, 적어도 90% 및 더욱 바람직하게, 적어도 94%의 서열 동일성이 존재한다는 것을 의미하고, 여기서 상동성 아미노산 서열 중의 각 변이는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 부가, 결실 및 치환으로부터 선택된다. 서열 번호 2와의 상동체는 KEGG 데이터베이스에서 번호 EC 1.10.3.1로 식별되는 효소 클래스(카테콜 옥시다제; 디페놀 옥시다제; o-디페놀라제; 폴리페놀 옥시다제; 피로카테콜 옥시다제; 도파 옥시다제; 카테콜라제; o-디페놀:산소 옥시도리덕타제; o-디페놀 옥시도리덕타제)로부터 선택된다. 상동성 아미노산 서열은 바람직하게, 서열 번호 3이며, 이는 또한 이하 RscK60-del 옥시다제로도 지칭된다. 즉, 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열이 서열 번호 3인 것을 특징으로 하는 HTS를 제조하는 방법이 바람직하다. 서열 번호 2와 서열 번호 3의 상동성은 91.3%인데, 이는 RscK60 옥시다제의 서열이 47개의 아미노산만큼 더 길기 때문이다.

서열 동일성은 서열 번호 2에서 폴리페놀 옥시다제/카테콜 옥시다제로 주석이 달린 아미노산 서열의 아미노산 위치 1 내지 543과 동일한 상동성 아미노산 서열의 백분율(%)로서 정의되며, 여기서 상동성 아미노산 서열 중의 각 변이는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 부가, 결실 및 치환으로부터 선택된다.

본 발명은 서열 번호 2에, 또는 서열 번호 2와 상동성인 변이체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하고, 옥시다제 활성을 갖는, 소위 축퇴 유전자 코드로 불리는 것에 기초하여 구상가능한 서열 번호 1의 DNA 서열의 모든 조작된 변이체를 포함한다.

본 발명의 방법은 추가로 HTS의 수율을 최대화시키기 위해 보호 물질로서, 에리소르브산, 또는 이의 저렴한 염 중 하나, 예컨대, 나트륨 염인 소듐 D-에리소르베이트, 또는 이의 일수화물, 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O를 포함하는 것을 특징으로 한다. 실시예 3의 표 3에 제시된 바와 같이, 티로솔은 소듐 D-에리소르베이트 부재하에 반응 혼합물 중에서 단시간 이내에 완전히 전환되었지만, HTS 수율은 40%로 낮았다. 따라서, HTS는 반응 혼합물에서 분명히 분해되었다. 그에 반해, 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O의 존재하에 병행 반응 혼합물에서, 사용된 티로솔은 HTS로 완전히 변환되었다. 따라서, 보호 물질인 소듐 D-에리소르베이트는 HTS의 분해를 방지하였다.

본 결과는 먼저 RscK60-del 옥시다제가 E. 콜라이에서 재조합 효소로서 효율적으로 생산될 수 있고, 세포 분해 없이 재현탁된 세포의 형태로 티로솔을 HTS로 생체변환시키는 데 직접적으로 적합하다는 것을 보여주는 것으로, 이는 방법의 경제적 실현가능성에 있어서 한 가지 중요한 요소이다. 실험의 추가의 예상치 못한 결과와 현재까지 설명되지 않은 결과는 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O의 첨가가 RscK60-del 옥시다제에 의한 티로솔의 HTS로의 생체변환에서 수율을 최대화시키는 데 효과적인 수단을 구성한다는 것이다.

본 발명에서 에리소르브산 또는 에리소르베이트의 사용량은 첫 번째로는 반응 혼합물 중 티로솔 반응물의 투여량에 의존하고, 두 번째로는 에리소르브산 또는 에리소르베이트에 대한 효소의 내성에 의존한다.

예를 들어, EP 3 234 164 B1 및 CN 101624607 B와 같은 선행 기술에는 HTS 수율을 최대화하기 위해 아스코르브산을 보호 물질로 사용하는 HTS를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 아스코르브산은 또한 선행 기술에서 티로시나제 억제제로도 알려져 있는데, 이는 보호 물질과 티로솔 반응물의 사용량, 둘 모두 제한하는 바, 이에 방법의 경제적 실현가능성을 제한한다. 아스코르브산의 최대 사용량은 0.4 M의 농도에서의 것이었다. 추가로, EP 3 234 164 B1에서 티로솔 대 아스코르브산의 몰비는 1:2였다. CN 101624607 B에서 티로솔 대 아스코르브산의 몰비는 1:1.57이었다. 이는 두 방법 모두 티로솔 반응물 대비 상대적으로 높은 아스코르브산 사용을 수반하며, 이는 방법의 경제적 실현가능성에 부정적인 영향을 미친다는 것을 의미한다.

놀랍게도, 실시예 4 내지 7에 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법에서 에리소르베이트는 옥시다제의 활성을 억제시키지 않으면서 0.8 M을 초과하는 농도, 즉, 아스코르브산 또는 이의 염에 대해 알려진 것보다 훨씬 더 높은 농도로 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 선행 기술과 비교하여, 이는 훨씬 더 높은 농도의 티로솔을 HTS로 전환시킬 수 있으며, 이는 방법의 경제적 실현가능성에 중요한 요소이다.

이러한 이유에서 HTS를 제조하는 방법은 바람직하게는 반응 혼합물이 적어도 0.4 M, 더욱 바람직하게, 적어도 0.6 M 및 특히 바람직하게, 적어도 0.8 M 농도로 에리소르브산 또는 에리소르베이트를 함유하는 것을 특징으로 한다.

표 6에 제시된 바와 같이, 96.5%의 몰 수율로, 사용된 티로솔을 사실상 완전히 HTS로 전환시킬 수 있다. EP 2 774 909 B1과 같은 선행 기술과 비교하여, RscK60 옥시다제 또는 상응하는 상동체 및 보호 물질로서 에리소르브산 또는 에리소르베이트를 사용하는 본 발명의 방법은 예상치 못한 개선을 이루는데, 이는 > 200 mM 티로솔을 완전히 전환시키는 데 티로솔 대비 1:1의 몰비로 보호 물질을 사용하는 것이면 충분한 반면, 선행 기술에 따르면, 150 mM 티로솔을 전환시키기 위해서는 2배 몰 과량의 아스코르브산 나트륨이 필요하였다. 따라서, 티로솔의 생체변환에서 고수율로 HTS를 제조하기 위해서는 RscK60 옥시다제 또는 이의 상응하는 상동체와 함께 조합된 에리소르베이트 또는 에리소르브산이 아스코르베이트 및 조작된 티로시나제 변이체보다 훨씬 더 우수한 적합하다.

표 7에 제시된 바와 같이, 생체변환을 통해 434 mM 티로솔(60 g/L)의 사용량으로부터 433 mM(66.7 g/L) HTS를 수득하였고, 이는 몰 수율 99.7%에 상응하는 값이었다. 표 8은 724 mM(100 g/L) 티로솔의 사용량으로부터 707 mM(109 g/L) HTS가 수득되었다고, 이는 몰 수율 97.6%에 상응하는 값이었다는 것을 보여준다. 이는 각각 단 175 mM 및 180 mM 티로솔만이 HTS로 전환된 것이 EP 3 234 164 B1 및 CN 101624607 B와 같은 선행 기술 문헌 내용에 비하여 뚜렷한 개선을 이룬다.

생체변환의 목적은 티로솔 반응물을 HTS 생성물로 최대로, 즉, 티로솔 사용량 대비 HTS의 최대 수율로 전환시키는 것이다. 사용된 티로솔의 몰량 기준으로 HTS 생체변환 수율이 > 80%, 바람직하게, > 90%, 더욱 바람직하게, > 95% 및 특히 바람직하게, 100%인 것이 바람직하다. 수율은 실시예 2에 기술된 바와 같이, 티로솔 및 HTS의 정량적 HPLC에 의해 측정된다.

본 발명의 방법은 추가로 반응 혼합물에 대기 산소, 압축 공기 또는 순산소 형태로 산소가 공급되어야 한다는 점을 특징으로 한다. 산소는 예를 들어 인큐베이션 진탕기 상에서 진탕시키거나(실험실 규모) 또는 교반함으로써 수동적 도입을 통해 여기에 도입될 수 있다. 산소는 또한 스파징 튜브를 통한 압축 공기 또는 산소의 능동적 도입에 의해, 또는 아니면 수동 및 능동적 도입의 조합에 의해 도입될 수도 있다. 수동적 및 능동적 도입의 조합에 의한 산소 도입이 바람직하다.

추가로, 본 발명에 따른 방법은 정의된 pH 및 온도 조건하에서 수행된다. 반응 혼합물의 pH 범위는 5.0 내지 8.5가 바람직하고; 더욱 바람직하게는 5.5 내지 8.0, 및 더욱 바람직하게는 6.0 내지 7.5이다. 바람직한 온도 범위는 20℃ 내지 60℃, 더욱 바람직하게, 25℃ 내지 50℃ 및 특히 바람직하게, 30℃ 내지 40℃이다.

티로솔 반응물이 HTS 생성물로 완전히 전환될 때까지의 반응 시간은 반응물 사용량 및 효소 사용량에 의존하며, 6 h 이하, 바람직하게, 25 h 이하, 더욱 바람직하게, 50 h 이하, 및 특히 바람직하게, 80 h 이하이다.

제조용 반응 혼합물의 규모는 적어도 0.5 L, 바람직하게, 적어도 50 L, 더욱 바람직하게, 500 L 및 특히 바람직하게, 적어도 5000 L이다.

단백질의 옥시다제 활성을 몰량으로 측정하는 데 이용가능한 시험은 다양하게 존재한다.

예를 들어, L-DOPA 기질(3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌, CAS 번호 59-92-7)의 도파크롬 발색단(CAS 번호 3571-34-4)으로의 산화를 475nm의 파장에서 모니터링하는 것인, 문헌 [Behbahani et al. (1993), Microchemical J. 47: 251-260]에 개시된 L-DOPA 시험을 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예 2(L-DOPA 시험)에 기술된 바와 같이, 이를 위해 4 mg의 단백질을 함유하는 일정량의 효소 용액(세포 현탁액, 단리된 세포, 세포 균질액 또는 무세포 효소 추출물)을 10 mM L-DOPA를 함유하는 일정량의 KPi 완충제(50 mM 인산칼륨, 1mM EDTA, pH 6.5)를 혼합한다. 시험 배치를 37℃ 및 140 rpm에서 인큐베이션시킨다. 0, 30, 60 및 120 min 후, 시험 배치의 분취량을 취하고, 예를 들어, 원심분리를 통해 고체 성분을 분리하고, 475 nm에서 분광광도법에 의해 상청액의 흡광도를 측정한다.

실시예 2에 기술된 바와 같이, 옥시다제 활성은 또한 HPLC 시험에서 검출 및 정량화될 수 있다. 시험 배치는 배치 부피 매 10 mL당 KPiE 완충제(50 mM 인산칼륨, 10 mM EDTA, pH 6.5) 중 0.4 mg/mL의 단백질(또는 상응하는 양의 세포 현탁액, 단리된 세포, 세포 균질액 또는 무세포 효소 추출물), 5.1 mM 티로솔 및 0 또는 10 mM 소듐 D-에리소르베이트를 함유한다. 시험 배치를 30℃ 및 140 rpm에서 인큐베이션시킨다. 0, 1, 2 및 4 h 후, 시험 배치의 분취량을 취하고, 반응을 정지시키기 위해 10%(v/v) 진한 H₃PO₄를 각 경우에 즉시 첨가한다. 예를 들어, 원심분리에 의해 고체 성분을 분리한 후, 상청액은 상응하게 보정된 (당업자에게 공지되어 있거나, 실시예 2에 더 자세히 기술되어 있는) HPLC에 의해 티로솔 및 HTS를 측정하는 데 사용된다.

효소 활성은 세포를 재단리시키지 않고(세포 현탁액), 또는 세포를 재단리시킨 후(단리된 세포) 배양 브로쓰에서 직접 측정될 수 있다. 추가로, 효소 활성은 세포 분해 후 세포 균질액에서 측정될 수 있으며, 이 경우 세포 균질액은 배양 브로쓰로부터 직접 생성되거나, 세포 재단리 후에 생성될 수 있다. 추가로, 효소 활성은 또한 예를 들어, 원심분리에 의해 균질액으로부터 입자성 세포 성분을 제거함으로써 세포 추출물에서 측정될 수 있다. 마지막으로, 효소는 그 자체로 공지된 방식, 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피에 의해 세포 추출물로부터 단리될 수 있고, 효소 활성 측정을 위해 정제된 단백질로 사용될 수 있다.

효소 활성은 바람직하게는 배양 브로쓰로부터, 재단리 후의 세포로부터, 또는 세포 균질액으로부터, 더욱 바람직하게, 배양 브로쓰로부터, 또는 재단리 후의 세포로부터 직접, 및 특히 바람직하게, 배양 브로쓰로부터 직접 측정된다.

문헌 [Remenant et al. (2012), J. Bact. 194: 2742-2743]에 의해 공개된 균주 랄스토니아 솔라나세아룸 K60(진뱅크(GenBank) CAGT01000120.1)에 대한 유전 정보에서, cds는 NCBI 단백질 데이터베이스 수탁 번호 CCF97399.1의 단백질(서열 번호 2)을 코딩하며, 서열 번호 1에 의해 식별되었고, 이는 진뱅크 로커스 태그(GenBank Locus Tag) RSK60_20060005, nt 3460-5091을 통해 접근가능하다. 그 안에 있는 단백질에 할당된 기능은 "추정 폴리페놀 옥시다제, 카테콜 옥시다제"의 기능이었다. 그러나, 주석에서 비롯된 단백질의 효소 기능은 지금까지 실험적으로 조사되지 않았는 바, 이에 지금까지 특지화되지 않다. 폴리페놀 옥시다제/카테콜 옥시다제라는 주석에 기초하여, 본 발명에서는 서열 번호 1의 DNA 서열을 갖는 cds를 rscK60-cds로 식별하였고, 서열 번호 2의 단백질 서열을 갖는 단백질을 RscK60 옥시다제로 식별하였다.

놀랍게도, 서열 번호 2를 갖는 서열 번호 1에 의해 코딩된 단백질(RscK60 옥시다제)과 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열 모두 본 발명의 옥시다제 활성을 갖고, 즉, > 0.4 M 농도에서 에리소르브산 또는 에리소르베이트에 의해 억제되지 않고, 대기 산소 존재하에서 티로솔을 HTS로 전환시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.

EP 3 234 164 B1(문헌 [Salanoubat et al. 2002, Nature 415: 497-502], [Hernandez-Romero et al. 2006, FEBS J. 273: 257-270], [Molloy et al. 2013, Biotechnol. and Bioengineering 110: 1849-1857])에 개시된 R. 솔라나세아룸 균주 GMI1000으로부터의 티로시나제, 또는 상기 효소의 조작된 변이체 또한 티로솔에서 HTS로의 생체변환을 위해 사용될 수 있기 때문에, 서열 비교를 수행하였다. 폴리페놀 옥시다제/카테콜 옥시다제 주석이 달린 RscK60 옥시다제의 아미노산 서열(서열 번호 2)과 EP 3 234 164 B1로부터의 R. 솔라나세아룸 GMI1000 유래의 티로시나제(진뱅크 수탁 번호 NP_518458) 비교시, 뚜렷한 차이가 발견되었다. 상동성은 85%에 불과하며, 그 이유는 R. 솔라나세아룸 K60 유래의 폴리페놀 옥시다제/카테콜 옥시다제 주석이 달린 RscK60 옥시다제의 서열이 R. 솔라나세아룸 GMI1000 유래의 티로시나제의 서열보다 47개의 아미노산만큼 더 길고, 추가로 34개의 추가의 아미노산이 상이하기 때문이다.

서열 번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열을 갖는 단백질은 특히 산업 규모로 HTS를 제조하는 데 특히 적합한데, 그 이유는 하기와 같다:

- 제조 목적의 옥시다제가 1 L 이상의 규모로 발효를 통해 제조될 수 있다.

- > 0.2 M 농도의 티로솔이 HTS로 전환된다.

- 보호 물질, 즉, 에리소르브산 또는 에리소르베이트는 아스코르브산 또는 이의 아스코르베이트 염과 달리 HTS 분해를 방지하기 위해 > 0.4 M 의 농도로 사용할 수 있다.

- 혼합물 중 티로솔 반응물 대 에리소르브산 또는 에리소르베이트의 몰비는 1:1 내지 1:1.2에 불과한데, 이는 티로솔 대 아스코르브산 또는 아스코르베이트의 몰비가 1:1.57 내지 1:2인 선행 기술과 비교하면 본 방법에 비용 절감 효과가 있다.

- 옥시다제는 추가의 후처리 없이 발효조 브로쓰 형태로 사용될 수 있으며, 이는 발효조 세포의 재단리 및 후처리에 대한 값비싼 비용이 들지 않는다.

요약하면, 본 발명의 옥시다제를 제공함으로써 HTS를 더 높은 경제적 실현가능성하에 생물공학적으로 제조할 수 있다.

옥시다제 활성을 갖는 단백질 (iii) 및 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열은 발효에 의해, 또는 아미노산 서열의 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.

티로솔에서 HTS로의 효소적 전환에 의해 HTS를 제조하는 방법은 바람직하게 옥시다제(iii)가 E. 콜라이에서의 발현에 의해 재조합 수단에 의해 제조되는 것을 특징으로 한다.

발효는 최대 세포 밀도 및 세포 배양물 중에서 생산되는 단백질/효소의 최대 활성 활성을 달성하기 위해 옥시다제 효소 발현을 위한 유전자 구성물을 함유하는 미생물 생산 균주가 정의된 배양 배지, 온도, pH, 산소 공급 및 배지 혼합 조건하에서 성장하도록 유도함으로써 실험실 규모로 또는 산업 규모로 세포 배양물을 생산하기 위한 프로세스 단계이다. "실험실 규모" 또는 "산업 규모"라는 용어는 단지 배양 크기에서만 차이가 난다. 예를 들어, 배치 부피가 1000 mL 미만인 것은 실험실 규모로 지칭되고(예를 들어, 진탕 플라스크 배양으로 기술), 배치 부피가 1000 mL를 훨씬 초과할 경우, 산업 규모로 지칭된다.

발효를 위해, 먼저 유전자 구성물의 cds(서열 번호 1), 조작된 변이체 RscK60-del의 cds(서열 번호 1의 nt 142-1632), 서열 번호 2와 상동성인 단백질을 코딩하는 cds, 또는 시험하고자 하는 단백질의 cds를 발현 벡터로 클로닝하여 유전자 구성물을 제조하고, 이는 유전자 구성물이 클로닝된 cds로부터 단백질을 발현하기 위한 모든 정보를 함유한다는 것을 의미한다.

당업자는 적합한 유전자 구성물을 제조하는 다양한 방법을 알고 있다. EP 2 670 837 A1에 개시된 발현 벡터 pKKj가 바람직하다. pKKj는 공지된 tac 프로모터를 함유하며, 이로써, tac 프로모터에 기능적으로 연결된 코딩 유전자 서열의 발현은 IPTG 유도제(이소프로필-β-티오갈락토시드) 첨가에 의해 유도될 수 있다. 본 발명의 유전자 구성물은 pRscK60(도 1) 및 pRscK60-del(도 2)이다.

이어서, 단백질 제조에 적합한 미생물(생산 숙주) 내로 상응하는 유전자 구성물을 공지된 방식으로 형질전환시켜 상응하는 옥시다제에 대한 생산 균주를 제조한다. 생산 숙주는 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 종으로부터 선택되고, 특히 바람직하게는 E. 콜라이 K12 JM105 균주(DSMZ 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈 게엠베하(DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)로부터 균주 번호 DSM 3949하에 상업적으로 이용가능)로부터의 미생물이다. 생산 균주는 더욱 바람직하게, E. 콜라이 JM105 x pRscK60-del이다.

RscK60 옥시다제, 또는 서열번호 2와 상동성인 옥시다제는 생산 균주를 배양배지에서 배양함으로써 발현된다. 배양은 (당업자에게 공지되어 있고, 실시예 3에 기술되어 있는 바와 같은) 진탕 플라스크 배양에 의한 실험실 규모, 또는 (당업자에게 공지되어 있고, 실시예 4에 기술되어 있는 바와 같은) 발효에 의한 산업적 규모일 수 있고, 분취량의 생성된 배양 브로쓰의 옥시다제 활성을 조사할 수 있다.

서열 번호 2 또는 서열 번호 2와 상동성인 서열인 본 발명의 옥시다제를 제조하는 발효 방법에서, 먼저 생산 균주의 바이오매스가 형성되고, 두 번째로 옥시다제가 형성된다. 바이오매스 및 옥시다제의 형성은 여기서 시간상 상관관계가 있을 수 있거나, 또는 아니면 제1 발효 단계에서 바이오매스가 형성된 후, 유전자 발현의 유도제에 의해 제2 단계에서 효소 생산이 시작된다는 점에서 시간상 서로 분리된 것일 수 있다. 바이오매스 및 옥시다제의 형성이 시간상 서로 분리되어 있고, 옥시다제 생산이 유도제에 의해 시작되는 것인, 실시예 4에 개시된 바와 같은 발효 방법이 바람직하다. 바람직한 유도제는 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토시드)이다.

티로솔에서 HTS로의 효소적 전환에 의해 HTS를 제조하는 방법은 바람직하게 옥시다제(iii)가 산업적 규모의 발효에 의해, 더욱 바람직하게, 1 L 초과, 특히 바람직하게, 10 L 초과, 특히 바람직하게, 1000 L 초과 및 추가로 바람직하게, 5000 L 초과의 발효 부피로 발효함으로써 제조되는 것을 특징으로 한다.

"배양," "성장" 및 "발효," 및 또한 예를 들어, "배양 배지," "성장 배지" 및 "발효 배지"라는 용어는 본 발명의 맥락에서 동의어로 사용된다. "배양 브로쓰" 또는 "발효조 브로쓰"라는 용어는 옥시다제(iii)를 함유하는 세포 및 세포 배양 배지를 함유하는, 발효의 최종 생성물을 지칭한다.

배양 배지는 실제 미생물 배양으로부터 당업자에게 친숙하다. 이는 전형적으로 탄소원(C 공급원), 질소원(N 공급원), 및 세포 성장 및 옥시다제 생산을 최적화시키는, 예컨대, 비타민, 염, 미량 원소와 같은 첨가물로 구성된다.

C 공급원은 바이오매스 형성을 위해 생산 균주에 의해 이용될 수 있는 공급원이다. 바람직한 C 공급원은 글루코스이다.

N 공급원은 바이오매스 형성을 위해 생산 균주에 의해 이용될 수 있는 공급원이다. 바람직한 N 공급원은 기체 형태 또는 NH₄OH와 같은 수용액의 암모니아, 또는 아니면 이의 염, 예를 들어, 황산암모늄 또는 염화암모늄이다. N 공급원은 또한 바람직하게는 효모 추출물, 프로테오스 펩톤 또는 액체 형태이거나, 또는 아니면 CSD로 불리는 건조 형태의 옥수수 침지액을 비롯한 복합 아미노산 혼합물을 포함한다.

배양은 회분식 모드로 불리는 방식으로 수행될 수 있으며, 여기서는 배양 배지에 생산 균주의 스타터 배양물을 접종한 후, 영양원을 더 이상 공급하지 않고 세포 성장이 진행된다.

배양은 또한 실시예 4에 개시된 바와 같이 유가식 모드로 불리는 방식으로 수행될 수 있으며, 여기서는 회분식 모드의 초기 성장 단계 후에, 영양원 소비를 보충하기 위해 상기 영양원이 추가로 공급된다. 피드는 C 공급원, N 공급원, 생산에 중요한 하나 이상의 비타민, 또는 바람직하게는 Cu(II) 이온을 비롯한 미량 원소, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 피드 성분은 혼합물로서 함께, 또는 아니면 개별 피드로 별개로 계량될 수 있다. 추가로, 유도제가 피드에 첨가될 수도 있다. 피드는 연속적으로 또는 부분적으로(불연속적으로), 또는 아니면 연속 및 불연속 공급의 조합으로 공급될 수도 있다. 유가식 모드에 의한 배양이 바람직하다.

피드에서 바람직한 C 공급원은 글루코스이다.

C 공급원은 바람직하게는 생산 단계 동안 발효조 중 탄소원의 함량이 10 g/L를 초과하지 않도록 계량되어 배양물에 첨가된다. 2 g/L, 더욱 바람직하게, 0.5 g/L, 특히 바람직하게, 0.1 g/L의 최대 농도가 바람직하다.

피드 중 바람직한 N 공급원은 기체 형태 또는 NH₄OH와 같은 수용액의 암모니아이다.

첨가되는 추가의 매질 첨가물은 인, 염소, 나트륨, 마그네슘, 질소, 칼륨, 칼슘, 철 원소의 염 및 미량의(즉, μM 농도의) 몰리브덴, 붕소, 코발트, 망간, 아연, 구리 및 니켈 원소의 염일 수 있다. 추가로, 유기산(예컨대, 아세테이트, 시트레이트), 아미노산(예컨대, 이소류신) 및 비타민(예컨대, 비타민 B1, 비타민 B6)을 배지에 첨가할 수 있다.

배양은 생산 균주의 성장 및 유전자 발현을 촉진하는 pH 및 온도 조건하에서 수행된다. 유용한 pH 범위는 pH 5 내지 pH 9이다. pH 5.5 내지 pH 8의 pH 범위가 바람직하다. pH 6.0 내지 pH 7.5의 pH 범위가 특히 바람직하다.

생산 균주의 성장에 바람직한 온도 범위는 20℃ 내지 40℃이다. 25℃ 내지 37℃의 온도 범위가 특히 바람직하고, 28℃ 내지 34℃의 온도 범위가 특히 바람직하다.

생산 균주는 임의적으로 산소 공급 없이(혐기성 배양) 또는 아니면 산소 공급(호기성 배양)하에 성장할 수 있다. 산소를 이용한 호기성 배양이 바람직하다.

호기성 배양의 경우, 적어도 10%(v/v), 바람직하게, 적어도 20%(v/v) 및 더욱 바람직하게, 적어도 30%(v/v)의 산소 함량 포화가 확립된다. 배양물에서 산소 포화도는 가스 공급과 교반 속도의 조합을 통해 자동으로 선행 기술에 따라 조절된다.

압축 공기 또는 순산소 도입으로 산소 공급은 보장된다. 압축 공기 도입에 의한 호기성 배양이 바람직하다. 호기성 배양에서 압축 공기 공급에 유용한 범위는 0.05 vvm 내지 10 vvm이다(vvm: 분당 발효 부피 1 리터당 압축 공기 리터량로 기록되는 발효 배치 내로의 압축 공기 주입량). 0.2 vvm 내지 8 vvm, 더욱 바람직하게, 0.4 내지 6 vvm 및 특히 바람직하게, 0.8 내지 5 vvm으로 압축 공기를 도입하는 것이 바람직하다.

최대 교반 속도는 2500 rpm, 바람직하게, 2000 rpm 및 더욱 바람직하게, 1800 rpm이다.

IPTG 첨가에 의해 단백질 생산이 유도된다. IPTG를 적어도 0.1 mM, 더욱 바람직하게, 적어도 0.2 mM 및 특히 바람직하게, 적어도 0.4 mM의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다. 유도제는 1 분량으로, 다회 분량으로 분할되어, 또는 아니면 연속적으로 첨가될 수 있다. IPTG 유도제는 1 분량으로 첨가되는 것이 바람직하다.

IPTG는 발효 시작 시점에 바로 또는 발효조 중의 세포 밀도가 특정 임계값에 도달한 후에 첨가될 수 있다. OD₆₀₀으로 지칭되는 세포 밀도는 여기서 600 nm에서 발효조 브로쓰 1 mL당 흡광도(OD₆₀₀: 발효조 브로쓰 1 mL당 600 nm에서의 광학 밀도)를 측정함으로써 광도법에 의해 공지된 방식으로 측정된다. 10/mL의 OD₆₀₀, 더욱 바람직하게는 30/mL의 OD₆₀₀ 및 특히 50/mL의 OD₆₀₀으로 IPTG를 첨가하는 것이 바람하다.

배양 시간은 10 h 내지 100 h이다. 20 h 내지 70 h의 배양 시간이 바람직하다. 25 h 내지 50 h의 배양 시간이 바람직하다.

상기 기술된 방법에 의해 수득된 배양 배치는 RscK60 옥시다제 또는 상응하는 상동체를 함유한다. 옥시다제는 추가로 추가의 후처리 없이 본 발명의 방법에서 발효조 브로쓰로서 직접, 세포 재단리 후 세포 현탁액으로서, 발효조 브로쓰로부터 직접 또는 세포 재단리 후 세포 분해 후 세포 균질액으로서, 무세포 효소 추출물로서, 또는 아니면 그로부터 정제된 효소로서 사용될 수 있다. 추가의 후처리 없이 발효조 브로쓰로서, 세포 재단리 후 세포 현탁액으로서, 또는 세포 분해 후 세포 균질액으로서 본 발명의 방법에서 옥시다제를 직접 사용하는 것이 바람직하다. 추가의 후처리 없이 발효조 브로쓰로서, 또는 세포 재단리 후 세포 현탁액으로서 본 발명의 방법에서 옥시다제를 직접 사용하는 것이 특히 바람직하다. 추가의 후처리 없이 발효조 브로쓰로서 본 발명의 방법에서 옥시다제를 직접 사용하는 것이 특히 바람직하다.

배양은 티로솔에서 HTS로의 변환에 기초하여 최대 효소 활성을 갖는 세포 배양물을 제조하는 것으로 목표로 (실시예 3에 기술된 바와 같은) 진탕 플라스크 배양에 의해 실험실 규모로, 또는 (실시예 4에 기술된 바와 같은) 발효에 의해 산업적 규모로 이루어질 수 있다. 최대 효소 활성은 먼저 우수한 세포 성장을 촉진하는 성장 배지에 의해, 및 임의적으로, 효소 생산을 선택적으로 자극하는 추가 첨가물에 의해 달성된다. 효소 생산을 자극하는 공지된 방법은 실시예 1에서 사용된 발현 벡터 pKKj에 존재하는 바와 같은 유도성 프로모터를 갖는 유전자 구성물을 기반으로 한다. 발현 벡터 pKKj의 용도는 예를 들어, EP 2 670 837 A1에 개시되어 있다. pKKj는 공지된 tac 프로모터를 특징으로 한다. tac 프로모터에 기능적으로 연결된 유전자의 발현은 IPTG 유도제(이소프로필-β-티오갈락토시드) 첨가에 의해 크게 증진될 수 있다.

효소 활성을 증가시키는 추가 수단은 효소 활성의 보조인자를 첨가하는 것이다. 본 발명의 RscK60 유전자에 대해서는 유전자 서열만이 알려져 있고, 효소 활성에 대한 실험적 연구는 전혀 알려져 있지 않기 때문에, 효소 활성을 증진시키는 다양한 수단을 조사하였다. RscK60 유전자를 폴리페놀 옥시다제/카테콜 옥시다제로서 주석을 다는 것이 효소 활성의 금속 의존성을 시사하였다. 예를 들어, 배양 배지 중 Cu(II) 이온의 첨가가 효소 생산에 미치는 효과를 조사하였다. 놀랍게도 Cu(II) 이온의 농도가 상승함에 따라 효소 활성은 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(실시예 3). RscK60 옥시다제는 여기서 예를 들어, EP 3 234 164 B1에서는 효소 생산을 위해 이의 구리에 대한 의존성이 알려져 있음에도 불구하고 효소 수율을 증가시키기 위해 Cu(II) 이온을 사용하지 않은 선행 기술과는 다르다(문헌 [Hernandez-Romero et al. (2006), FEBS J. 273: 257-270], [Molloy et al. (2013), Biotechnol. and Bioengineering 110: 1849-1857]).

오픈 리딩 프레임(ORF, cds와 동의어, 코딩 서열)은 시작 코돈으로 시작하고, 정지 코돈으로 끝나며, 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 또는 RNA 영역을 지칭한다. ORF는 또한 정지 코돈이 아미노산으로 번역되지 않는 코딩 영역으로도 지칭된다.

Cds는 비코딩 영역으로 둘러싸여 있다. 유전자는 생물학적 활성 RNA 생산에 필요한 모든 기본 정보를 포함하는 DNA 부분을 지칭한다. 유전자는 전사에 의한 단일 가닥 RNA 카피의 생성 기점이 되는 DNA 섹션, 및 상기 복제 작업의 조절에 관여하는 발현 신호를 포함한다. 발현 신호는 예를 들어, 적어도 하나의 프로모터, 전사 시작, 번역 시작 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 가능한 추가 표현 신호로는 종결인자 및 하나 이상의 오퍼레이터가 있다.

유전자 구성물은 본 발명의 맥락에서 유전자의 cds가 추가 유전 요소(예컨대, 프로모터, 종결인자, 선별 마커, 복제 기점)에 연결되어 있는 고리형 DNA 분자(플라스미드, 발현 벡터)를 지칭한다. 유전자 구성물의 유전 요소를 통해 먼저 세포 성장 동안 이는 염색체외에서 유전되고, 유저자에 의해 코딩된 단백질이 생성된다.

약어 WT(Wt)는 야생형을 나타낸다. 야생형 유전자는 자연적으로 진화하여 야생형 게놈에 존재하는 유전자 형태를 지칭한다. Wt 유전자의 DNA 서열은 예컨대, NCBI와 같은 데이터베이스에서 공개적으로 이용가능하다.

효소의 조작된 변이체/기능성 유도체/유전적으로 생성된 변이체는 돌연변이를 통해, 즉, Wt 유전자의 DNA로부터의 뉴클레오티드 서열에서의 변이 결과로서 생성되고, 변형된 단백질 서열을 가진 효소를 유도하는 효소 변이체를 정의하며, 여기서 변형된 단백질 서열은 원래의 효소 기능이 보존되는 한, 아미노산의 삽입, 부가, 결실 및 치환으로부터의 임의의 원하는 변이를 포함할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 HTS를 제조하는 방법은 바람직하게, 생체변환 프로세스이고, 더욱 바람직하게, 하기 작동 단계로 구성된다: 제1 단계에서, 재조합 형태의 옥시다제 효소가 발효에 의해 제조되고, 제2 단계에서, 생성된 발효조 브로쓰를 반응 혼합물에서 추가의 후처리 없이 직접 티로솔 반응물(출발 물질) 및 추가 보조제와 함께 반응시키고, 제3 단계에서, HTS 생성물을 용매를 이용하여 추출한 후, 증류에 의해 용매를 제거함으로써 추가의 작업 단계 없이, 반응 혼합물로부터 단리시킨다.

생체변환은 효소 촉매작용 하에서의 반응물의 생성물로의 변환으로 정의된다.

추출은 반응 혼합물을 그 안에서 불용성인 액체(추출용 용제)와 혼합하고, 반응 생성물이 추출용 용제로 전달되는 프로세스 단계로 정의된다. 반응 혼합물과 프로세스 단계를 분리(상 분리)한 후, 추출용 용제를 제거하여 생성물을 단리시킬 수 있다.

유전학 및 생물정보학에서의 주석은 실험적 발견 또는 컴퓨터 지원 예측에서 비롯될 수 있는 기능적 할당을 지칭한다. DNA 서열의 주석은 특히 해당 서열의 코딩된 단백질을 포함하는 단백질 코딩 영역(cds)을 기술한다.

바람직한 실시양태에서, 티로솔에서 HTS로의 효소적 전환에 의해 HTS를 제조하는 방법은 옥시다제 제조를 위한 발효는 적어도 0.02 mM, 더욱 바람직하게, 적어도 0.1 mM, 특히 바람직하게, 적어도 0.2 mM 및 특히 바람직하게, 적어도 0.5 mM 농도의 Cu(II) 이온의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 한다. Cu(II) 이온은 본원에서 임의의 공지된 Cu(II) 염에 의해, 예를 들어, 황산 Cu(II), 염화 Cu(II), 아세트산 Cu(II) 또는 질산 Cu(II)에 의해 제공될 수 있으며, 무수 형태 또는 오수화물 형태(CuSO₄ x 5 H₂O)의 황산 Cu(II)가 바람직하다.

배양 배지 중 Cu(II) 이온의 함량이 증가하면 효소 활성의 수율이 상승될 수 있다는 이점이 있다.

표 2(실시예 3)에 요약된 바와 같이, CuSO₄ x 5 H₂O 형태의 Cu(II) 이온으로 배양 배지를 보충함으로써 옥시다제 효소 활성이 10배 이상 증가하였다. 따라서, HTS 제조에 적합한 효소 제조를 최적화하기 위해 배양 배지를 Cu(II) 이온으로 보충하는 것은 선행 기술에는 아직 기술되지 않은 효율적인 방법을 구성한다.

더욱이, 옥시다제 제조를 위한 발효로부터의 발효조 브로쓰는 추가의 후처리 없이 HTS를 제조하는 방법에서 직접 사용하는 것이 바람직하다.

실시예 4의 표 4에 제시된 바와 같이, RscK60-del 옥시다제는 E. 콜라이에서 재조합 수단에 의해 산업적 용도로 제조될 수 있고, 티로솔에서 HTS로의 생체변환에서 세포를 추가로 단리시키거나, 또는 분해하지 않고 발효조 브로쓰로서 직접 사용될 수 있다. 발효조 세포의 투여량이 충분히 높은 경우, 티로솔은 HTS를 생성물로 하여 선행 기술에 비해 매우 높은 180 mM 농도로 정량적으로 전환되었다(표 5). 보호 물질로서 아스코르브산을 사용하는 선행 기술과 비교하면 예상외로, 1:1 몰비의 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O 보호 물질의 투여량은 HTS 분해를 억제시키기에 충분하였다.

경제적 실현가능성을 최대화하기 위해, 티로솔은 생체변환에서 최대 농도로 전환되어 HTS를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, HTS를 제조하는 방법은 티로솔이 200 mM 초과, 더욱 바람직하게, 400 mM 초과, 특히 바람직하게, 700 mM 초과의 농도로 사용되는 것을 특징으로 한다.

HTS 제조 방법에서 티로솔 대 에리소르브산 또는 에리소르베이트 사용량의 몰비는 1:1.50 이하, 더욱 바람직하게, 1:1.2 이하, 특히 바람직하게, 1:1 이하, 및 특히 바람직하게, 1:0.5 이하인 것인 바람직하다.

추가로, HTS를 제조하는 방법, 반응 혼합물 중 옥시다제를 제조하기 위한 발효로부터의 발효조 브로쓰의 부피 비율은 최대 90%, 더욱 바람직하게, 50% 이하인 것이 바람직다.

HTS를 제조하는 방법은 바람직하게 사용된 티로솔 중 적어도 90%가 HTS로 전환될 때까지 일정 시간 동안 반응 혼합물을 반응시키는 것을 특징으로 한다.

특별히 필요한 시간은 티로솔 투여량에 의존한다. 이는 HPLC에 의해 티로솔 및 HTS의 양을 측정함으로써 결정된다(설명에 대해서는 실시예 2, HPLC 시험 참조).

예를 들어, 70 g/L 티로솔이 24 h 이내에 95% 정도로 전환되었다. 사용된 티로솔은 바람직하게는 24 h 이내에 적어도 80% 정도로 HTS로 전환된다.

HTS를 제조하는 본 발명의 방법에서, HTS는 바람직하게, 적어도 70%, 더욱 바람직하게, 적어도 90% 및 특히 바람직하게, 적어도 95%의 몰 수율로 티로솔로부터 제조되는 것이 바람직하다.

반응 혼합물로부터 HTS를 단리시키기 위해, 반응 혼합물을 중간 단계 없이 비혼화성 용매와 혼합하고, 상 분리 후, 생성물 함유 용매 상을 분리시킨다. HTS 추출에 적합한 용매는 EP 2 774 909 B1에 공지되어 있다. 추출에 바람직한 용매는 에틸 아세테이트(CAS 번호 141-78-6)이다. 에틸 아세테이트를 사용하는 추출은 바람직하게 반응 혼합물로부터 HTS가 완전히 제거될 때까지 원하는 만큼 자주 반복될 수 있다. 대안적으로, 에틸 아세테이트를 사용하는 추출은 또한 바람직하게 공지된 방식으로, 예를 들어, 역류 추출에 의해 연속적으로 수행될 수도 있다. 더 우수한 상 분리를 위해, 혼합물에 존재하는 단백질을 변성시키기 위하여 예를 들어, 황산으로 산성화하거나, 가열하거나, 또는 상기 두 조치의 조합으로 추출 전에 혼합물을 전처리할 수 있다.

HTS를 제조하는 방법은 바람직하게, HTS를 에틸 아세테이트로 추출하여 반응 혼합물로부터 단리시키는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게, 이어서, 에틸 아세테이트를 증류에 의해 분리시킨다.

추출은 바람직하게, 중성 pH, 즉, pH 6.5-7.5에서 수행된다.

용매(에틸 아세테이트)를 증류 제거한 후, HTS가 높은 수율 및 순도로 수득된다. 티로솔 사용량 기준으로 몰 수율은 바람직하게, > 60%, 더욱 바람직하게, > 70% 및 특히 바람직하게, > 80%이다. HTS를 제조하는 방법은 바람직하게 HTS가 반응 혼합물로부터 적어도 80%, 더욱 바람직하게, 적어도 90% 및 특히 바람직하게, 적어도 93%의 순도로 단리되는 것을 특징으로 한다.

분광광도법, NMR, 가스 크로마토그래피, HPLC, 질량 분광술, 중량 측정, 원소 분석 또는 아니면 상기 분석 방법의 조합을 포함하여 티로솔 반응물 및 HTS 생성물의 순도를 확인, 정량화 및 측정하기 위한 다양한 분석 방법이 이용가능하다.

요약하면, 및 실시예에 의해 입증된 바와 같이, 새로운 방법의 성분인 RscK60-del 옥시다제 또는 상동성 옥시다제 및 에리소르브산 또는 에리소르베이트를 사용하여 HTS를 제조하는 본 발명의 방법은 예컨대, EP 2 774 909 B1 및 CN 101624607 B와 같은 선행 기술에 비해 예상치 못한 개선을 보인다. 심지어 에리소르브산 또는 에리소르베이트 보호 물질의 사용량이 소량인 경우에도 상당량의 티로솔을 완전히 전환시키는 데 충분한 반면(실시예는 1:1 내지 1:1.2 몰비의 티로솔 대 에리소르베이트는 > 400 mM 티로솔을 완전히 전환시키는 데 충분), 선행 기술에 따르면, 150 mM 및 180 mM 티로솔을 전환시키기 위해서는 각각 티로솔 대비 2배 및 1.57배 몰 과량의 아스코르브산나트륨 또는 아스코르브산이 필요하였다. 결과적으로, 본 발명의 방법은 효율적이고 저렴하다. 이를 통해 예상치 못한 고부피 수율 및 고순도로 HTS를 제조할 수 있다.

본 발명의 방법은 추가로 저렴하고 간단한 프로세스 단계, 즉, 생체변환에서 RscK60-del 옥시다제 또는 상기 옥시다제의 상응하는 상동체를 생산하는 균주의 발효로부터 추가 작업 없이 세포 배양 브로쓰를 사용하는 단계, 및 반응 혼합물로부터 직접 추출하여 생성물을 단리시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.

도면의 간단한 설명
도 1은 실시예 1에서 제조된 4.5 kb 벡터 pRscK60을 보여주는 것이다.
도 2는 실시예 1에서 제조된 4.4 kb 벡터 pRscK60-del을 보여주는 것이다.

본 출원에서 사용된 약어:

cds(coding DNA sequence) 코딩 DNA 서열(상기 정의 참조)

nt 뉴클레오티드(들)

HTS 하이드록시티로솔

HPLC(high-performance liquid chromatography) 고성능 액체 크로마토그래피

본 발명은 하기 실시예에 의해 제한되지 않고 설명된다:

실시예 1 : 발현 벡터 pRscK60 및 pRscK60 - del 제조

RscK60 유전자의 cds의 단리를 위해, 랄스토니아 솔라나세아룸 K60 균주(DSMZ 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈 게엠베하에서 균주 번호 DSM 9544하에 상업적으로 이용가능)로부터의 게놈 DNA를 사용하였다.

추정 폴리페놀 옥시다제/카테콜 옥시다제를 코딩하는, 단리시키고자 하는 RscK60의 코딩 서열(이하 rscK60-cds으로 지칭, 서열 번호 1)은 이하 RscK60 옥시다제로 지칭되는 진뱅크 수탁 번호 CCF97399.1을 갖는 단백질(서열 번호 2)을 코딩하는 로커스 태그 CAGT01000120.1, nt 3460-5091(서열 번호 1)하에 NCBI(미국 국립 생물공학 정보 센터: National Center for Biotechnology Information) 뉴클레오티드 데이터베이스에 개시되어 있다.

폴리페놀 옥시다제/카테콜 옥시다제의 추정 cds로부터 하기 DNA 분획을 이용하여 벡터 pRscK60 및 pRscK60-del을 제조하였다:

- rsck60-cds: 서열 번호 1 nt 1 - nt 1632, 이하 RscK60 옥시다제로 지칭되는, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 코딩.

- rscK60-del-cds: 서열 번호 1 nt 142 - nt 1632, 이하 RscK60-del 옥시다제로 지칭되는, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 코딩. RscK60-del 옥시다제는 RscK60 옥시다제와 비교하여 47개의 아미노산만큼 N-말단이 말단절단된 단백질이다.

DNA 단편 rscK60-cds는 PCR 반응("Phusion™ High-Fidelity" DNA 폴리머라제, Thermo Scientific™)에서 1.6 kb 단편으로서 단리되었다. 이를 위해, R. 솔라나세아룸 K60 균주로부터의 게놈 DNA 및 프라이머 rsck60-1f(서열 번호 4) 및 rsck60-2r(서열 번호 5)을 사용하였다.

DNA 단편 rscK60-del-cds는 PCR 반응("Phusion™ High-Fidelity" DNA 폴리머라제, Thermo Scientific™)에서 1.5 kb 단편으로서 단리되었다. 이를 위해, R. 솔라나세아룸 K60 균주로부터의 게놈 DNA 및 프라이머 rsck60-3f(서열 번호 6) 및 rsck60-2r(서열 번호 5)을 사용하였다.

프라이머 rsck60-1f는 RscK60 옥시다제의 cds의 출발점에서 시작하여 23개 뉴클레오티드(nt)와 인접해 있는 EcoRI 절단 부위를 함유한다(서열 번호 1에서 nt 1-23).

프라이머 rsck60-2r은 RscK60 옥시다제의 cds의 3' 영역으로부터 24개의 뉴클레오티드(nt)와 인접해 있는 HindIII 절단 부위를 함유한다(서열 번호 1에서 nt 1609-1632, 역 상보적 형태).

프라이머 rsck60-3f는 RscK60 옥시다제의 5' 영역으로부터 24개의 뉴클레오티드(nt)와 인접해 있는 EcoRI 절단 부위를 함유한다(서열 번호 1에서 nt 142-165).

PCR 생성물을 EcoRI(프라이머 rsck60-1f 및 rsck60-3f에 존재) 및 HindIII(프라이머 rsck60-2r에 존재)으로 절단하고, EcoRI 및 HindIII로 미리 절단된 pKKj 발현 벡터에 클로닝하였다. 이로써, 4.5 kb 발현 벡터 pRscK60(도 1) 및 4.4 kb 발현 벡터 pRscK60-del(도 2)을 수득하였다.

EP 2 670 837 A1에 개시된 발현 벡터 pKKj는 발현 벡터 pKK223-3의 유도체이다. pKK223-3의 DNA 서열은 수탁 번호 M77749.1하에 진뱅크 유전자 데이터베이스에 개시되어 있다. 4.6 kb 플라스미드로부터 약 1.7 kb(M77749.1에 개시된 DNA 서열의 bp 262 - 1947)를 제거하여 2.9 kb 발현 벡터 pKKj를 수득하였다.

실시예 2: 분석 시험

세포 현탁액 및 단리된 세포:

진탕 플라스크에서(실시예 3) 또는 발효조에서(실시예 4) 배양된 세포를 분석 시험을 위해 추가 단리 없이 세포 현탁액(배양 브로쓰, 발효조 브로쓰)으로 직접 사용하거나, 또는 세포를 단리시켰다.

현탁액을 원심분리(10 min, 15,000 rpm, SS34 로터가 장착된 Sorvall RC5C 원심분리기)하여 현탁액(배양 브로쓰, 발효조 브로쓰)으로부터 세포를 단리시켰다. 생성된 세포 펠릿을 0.9%(w/v) NaCl로 1회 세척하였다. 단리된 세포로 추가로 사용하기 위해, 100 mL 배양물로부터의 세포 펠릿을 20 mL의 KPi 완충제(50 mM 인산칼륨, 1 mM EDTA, pH 6.5) 중에 현탁시켰다.

세포 균질액 제조:

세포 균질액을 제조하기 위해, MP 바이오메디컬즈(MP Biomedicals)의 FastPrep-24™ 5G 세포 균질화기를 사용하였다. 2 x 1 mL의 세포 현탁액을 제조사가 미리 제작한 유리 비드("Lysing Matrix B")가 있는 1.5 mL 튜브에서 분해하였다(각 경우 30 sec 간격으로 쉬는 시간을 두고 6000 rpm의 진탕 빈도로 3 x 20 sec).

효소 추출물 제조:

원심분리(10 min, 15,000 rpm, SS34 로터가 장착된 Sorvall RC5C 원심분리기)하고, 생성된 상청액을 단리시켜 세포 균질액으로부터 무세포 효소 추출물을 제조하였다.

샘플의 단백질 함량 측정:

제조업체의 지침에 따라 "큐비트^® 단백질 검정 키트(Qubit^® Protein Assay Kit)"를 사용하여 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)의 큐비트 3.0 형광계를 이용하여 세포 현탁액, 단리된 세포, 세포 균질액 또는 효소 추출물의 단백질 함량을 측정하였다.

옥시다제 효소 활성 측정(L- DOPA 시험):

475 nm 파장에서 L-DOPA 효소 기질(3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌, CAS 번호 59-92-7)의 도파크롬 발색단(CAS 번호 3571-34-4)으로의 산화를 모니터링하는 광도 측정 시험을 이용하여 옥시다제 효소 활성을 측정하였다(문헌 [Behbahani et al. (1993), Microchemical J. 47: 251-260]). 세포 현탁액(예컨대, 발효조에서 제조 진행을 모니터링), 단리된 세포, 세포 균질액 또는 무세포 효소 추출물을 이용하여 효소 시험을 수행하였다.

시험 배치는 100 mL 에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 8 mL 배치 부피로 4 mL의 KPi 완충제, 10 mM L-DOPA(Sigma-Aldrich) 및 4 mL의 시험하고자 하는 샘플(세포 현탁액, 단리된 세포, 세포 균질액 또는 무세포 효소 추출물)을 함유하였다.

진탕 플라스크 배양물로부터 샘플을 시험하고자 할 경우, 세포를 먼저 세포 펠릿 단리를 위해 25 mL의 진탕 플라스크 혼합물을 원심분리(10 min, 15,000 rpm, SS34 로터가 장착된 Sorvall RC5C 원심분리기)하여 농축시키고, 생성된 세포 펠릿을 단리된 세포, 세포 균질액 또는 무세포 효소 추출물 제조를 위해 상기 기술된 바와 같이 사용하였고, 추가 사용을 위해, 시험하고자 하는 샘플의 부피를 KPi 완충제를 이용하여 4 mL가 되도록 조정하였다.

발효로부터의 샘플을 시험하고자 할 경우, 1.6 mL의 발효 배치를 세포 현탁액으로서 직접, 또는 단리된 세포, 세포 균질액 또는 무세포 효소 추출물 제조를 위해 상기 기술된 바와 같이 사용하였고, 추가 사용을 위해, 시험하고자 하는 샘플의 부피를 KPi 완충제를 이용하여 4 mL가 되도록 조정하였다.

시험하고자 하는 각 샘플을 첨가하여 반응을 시작하였다. 시험 배치를 진탕기(Infors)에서 37℃ 및 140 rpm에서 인큐베이션시켰다. 0 min, 30 min, 60 min 및 120 min 시점에 1 mL 분취물을 취하고, 즉시 5 min 동안 13,000 rpm에서 원심분리(Heraeus™ Fresco™ 21 원심분리기, Thermo Scientific™)하고, 475 nm에서 상청액의 흡광도를 측정하였다(Genesys™ 10S UV-VIS 분광광도계, Thermo Scientific™).

1 단위(U)의 옥시다제 활성은 시험 조건하에 L-DOPA로부터 1 ㎛ol 도파크롬/min을 생성하는 효소의 양으로 정의된다(도파크롬의 흡광 계수 ε_{475 nm} = 0.37 x 10⁴ L x Mol^{- 1} x cm^-1).

비(specific) 옥시다제 활성은 측정된 샘플(세포 추출물, 균질액 또는 세포 현탁액)의 총 단백질 1 mg당의 옥시다제 효소 활성을 기준으로 계산하였다(U/mg(단백질)).

L-DOPA 시험에 의해 측정된 (비) 옥시다제 활성은 이하 L-DOPA 시험에서의 (비) 옥시다제 활성으로 지칭된다.

HPLC에 의한 티로솔 및 HTS by HPLC 측정( HPLC 시험):

티로솔에서 HTS로의 시험 생체변환을 분석 규모로 수행하였다.

티로솔 용액: 7 mg의 티로솔(Sigma-Aldrich, 시험에서 최종 농도 5.1 mM)을 측량하여 100 mL 에를렌마이어 플라스크에 넣고, 4.9 mL KPiE 완충제(50 mM 인산칼륨, 10 mM EDTA, pH 6.5) 중에 용해시키고, 0.1 mL의 1 M 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O(Sigma-Aldrich, 시험에서 최종 농도 10 mM)로 보충하였다. 비교 목적으로 개별 시험으로, 소듐 D-에리소르베이트를 첨가하지 않고 5 mL KPiE 완충제 중에 7 mg의 티로솔을 용해시켰다.

시험 배치: 진탕 플라스크에서 배양된 세포 현탁액 50 mL, 또는 발효조에서 배양된 세포 10 mL를 5 mL의 KPiE 완충제 중에 현탁시키고, 반응 시점시 티로솔 용액에 첨가하였다. 시험 배치(부피 10 mL)를 진탕기(Infors)에서 30℃ 및 140 rpm에서 인큐베이션시켰다. 0 h, 1 h, 2 h 및 4 h 시점에 각 샘플을 1 mL씩 취하고, 반응을 정지시키기 위해, 각 경우에서 즉시 진한 H₃PO₄ 0.1 mL와 혼합하였다. 원심분리(5 min, 13,000 rpm, Heraeus™ Fresco™ 21 원심분리기, Thermo Scientific™) 후, HPLC에 의한 티로솔 및 HTS 측정을 위해 각 경우에서 상청액 1 mL를 분배하였다.

티로솔 및 HTS의 HPLC 분석:

티로솔 및 HTS를 정량적으로 측정하기 위해, 각각 티로솔 및 HTS에 대하여 보정된 HPLC 방법을 사용하였다. 보정을 위한 참조 물질 티로솔 및 HTS는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터의 것이었다. 다이오드 어레이 검출기가 장착된 애질런트 인피니티 II HPLC(Agilent Infinity II HPLC)를 사용하였다. 검출기의 파장을 274 nm로 설정하였다. 추가로, 길이 250 mm, 내부 직경 4.6 mm, 입자 크기 5 ㎛의 페노메넥스(Phenomenex)의 Luna C18(2) 칼럼을 칼럼 오븐에서 30℃ 온도가 되도록 조정하였다. 용리제 A: 1 L H₂O 중 5 mL의 H₃PO₄. 용리제 B: 아세토니트릴. 1 mL/min 유속으로 5 min 내에 5%에서 10% 용리제 B, 이어서, 15 min 내에 10%에서 16% 용리제 B인 구배 모드로 분리를 수행하였다. 티로솔 머무름 시간: 13.9 min; HTS 머무름 시간: 10 min.

본 발명의 맥락에서 반응 수율은 반응 조건하에서 HTS(생성물)로 전환되는 티로솔(반응물)의 사용량으로 정의된다. 수율은 부피를 기준으로 한 생성물의 절대량(mM 또는 g/L)인 부피 수율로, 또는 생성물의 상대 수율(%)(이는 또한 백분율(%) 수율로도 지칭)로 기록될 수 있고, 즉, 절대 수율은(티로솔(반응물)의 경우 138.2 g/mol, HTS(생성물)의 경우, 154.2 g/mol인 분자량을 고려하여) 사용된 티로솔(반응물)을 기준으로 한다.

실시예 3 : 진탕 플라스크 배양에 의한 E. 콜라이에서의 RscK60 및 RscK60 -del 옥시다제 발현

플라스미드 DNA를 단리시키기 위해, 실시예 1로부터의 발현 벡터 pRscK60 및 pRscK60-del을 각각 클로닝 용도로 사용되는 상업적으로 이용가능한 E. 콜라이 균주 NEB^® 10-베타(New England Biolabs)으로 형질전환시켰다. LBamp 배지(10 g/L 트립톤, GIBCO^™, 5 g/L 효모 추출물(BD Biosciences), 5 g/L NaCl, 100 mg/L 암피실린) 중에서 배양하여 형질전환으로부터의 각 클론에 대해 세포 배양물을 제조하고(37℃, 120 rpm, Infors 트레이 진탕기), 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 DNA 단리 키트(QIAprep^® Spin Miniprep Kit, Qiagen)를 이용하여 세포로부터 플라스미드 DNA를 단리시켰다.

발현 벡터 pRscK60 및 pRscK60-del의 플라스미드 DNA를 공지된 방법에 의해 E. 콜라이 K12 균주 JM105로 형질전환시켰다. E. 콜라이 JM105 균주는 DSMZ 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐즈 게엠베하로부터 균주 번호 DSM 3949하에 상업적으로 이용가능하다.

형질전환을 위한 클론을 Lbamp 플레이트(10 g/L 트립톤, GIBCO^™, 5 g/L 효모 추출물(BD Biosciences), 5 g/L NaCl, 15 g/L 아가, 100 mg/mL 암피실린)에서 선택하였고, 이는 각각 JM105 x pRscK60 및 JM105 x pRscK60-del로 식별하였다. 사용된 대조군은 pKKj 벡터가 형질전환된 E. 콜라이 JM105(E. 콜라이 JM105 x pKKj)였고, 형질전환체는 그로부터 동일한 방식으로 생성되었다.

30 mL의 Lbamp 배지(10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L NaCl, 100 mg/mL 암피실린) 중 E. 콜라이 균주 JM105 x pKKj, JM105 x pRscK60 및 JM105 x pRscK60-del의 각 클론에 대한 사전 배양물을 제조하였다(37℃ 및 120 rpm에서 밤새도록 배양, Infors 트레이 진탕기).

2 mL의 각 사전배양물을 15 g/L 글루코스, 0.5 mM CuSO₄ x 5 H₂O 및 100 mg/L 암피실린으로 보충된 100 mL의 SM3 배지(1 L 에를렌마이어 플라스크)의 본 배양물을 위한 접종물로서 사용하였다. 세포 밀도 OD₆₀₀이 2.0에 도달할 때까지 본 배양물을 30℃ 및 140 rpm에서 진탕시켰다(OD₆₀₀: 600 nm에서 흡광도 측정에 의한 세포 밀도의 광도계 측정). 이어서, IPTG 유도제(이소프로필-β-티오갈락토시드, 최종 농도 0.4 mM, Sigma-Aldrich)를 첨가하고, 혼합물을 30℃ 및 140 rpm에서 밤새도록 진탕시켰다.

SM3 배지 조성: 12 g/L K₂HPO₄, 3 g/L KH₂PO₄, 5 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.3 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.015 g/L CaCl₂ x 2 H₂O, 0.002 g/L FeSO₄ x 7 H₂O, 1 g/L Na₃ 시트레이트 x 2 H₂O, 0.1 g/L NaCl; 5 g/L 펩톤(Oxoid); 2.5 g/L 효모 추출물(BD Biosciences); 0.005 g/L 비타민 B1(Sigma-Aldrich); 1 mL/L 미량 원소 용액.

미량 원소 용액 조성: 0.15 g/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 2.5 g/L H₃BO₃, 0.7 g/L CoCl₂ x 6 H₂O, 0.25 g/L CuSO₄ x 5 H₂O, 1.6 g/L MnC1₂ x 4 H₂O, 0.3 g/L ZnSO₄ x 7 H₂O.

이어서, 진탕 플라스크 배양으로부터의 세포를 사용하여 HPLC 시험 및 광도 측정 L-DOPA 시험에 의해 효소 활성을 확인하였다.

RscK60 옥시다제의 활성과 RscK60 - del 옥시다제의 활성 비교:

HPLC 시험을 위해, E. 콜라이 JM105 x pRscK60(세포 밀도 OD₆₀₀ = 6.4/mL) 및 JM105 x pRscK60-del(세포 밀도 OD₆₀₀ = 5.9/mL) 균주의 50 mL의 진탕 플라스크 배양물로부터의 세포를 원심분리에 의해 단리시키고, 각 경우에서, 5 mL의 KPiE 완충제 중에 현탁시켰다. 각 경우에서, 5 mL의 단리되고, 재현탁된 세포를 실시예 2에 기술된 HPLC 시험에서 사용하였다.

2번의 HPLC 시험을 수행하였다. 한 배치는 10 mL 배치 부피로, KPiE 완충제 중에 용해된, 상기 기술된 진탕 플라스크 배양물로부터의, 5 mL의 단리되고, 재현탁된 JM105 x pRscK60-del 세포, 7 mg의 티로솔(배치에서 최종 농도 5.1 mM), 4.9 mL KPiE 완충제 및 0.1 mL의 1 M 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O를 함유하였다(실시예 2의 HPLC 시험 참조). 두 번째 배치는 유사하게 10 mL 배치 부피로, KPiE 완충제 중에 용해된, 상기 기술된 진탕 플라스크 배양물로부터의, 5 mL의 단리되고, 재현탁된 JM105 x pRscK60 세포, 7 mg의 티로솔, 4.9 mL의 KPiE 완충제 및 0.1 mL의 1 M 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O를 함유하였다. 배치를 진탕기(Infors)에서 30℃ 및 140 rpm에서 인큐베이션시켰다. 0 h, 2 h, 4 h 및 6 h 후 시험으로부터 샘플을 취하고, HPLC에 의해 분석하였다. 결과는 표 1에 기록되어 있다.

광도 측정 L- DOPA 시험:

광도 측정 L-DOPA 시험에 의해 비교 균주 JM105 x pKKj와의 비교에 의해 JM105 x pRscK60-del 균주의 효소 활성을 측정하였다. 두 균주의 세포에 대해, 세포 균질액을 제조하고(실시예 2에 기술된 바와 같이 세포 분해), 효소 기질로서 L-DOPA를 이용하여 L-DOPA 시험에서 시험하였다. 효소 기질로서 L-DOPA를 이용하여 L-DOPA 시험에서 측정된 비 효소 활성은 E. 콜라이 JM105 x pRscK60-del 균주의 세포 균질액의 경우, 1.5 mU/mg이고, JM105 x pKKj 대조군 균주의 경우, 0 mU/mg이었다.

배양 배지 중 Cu(II) 농도 변화:

진탕 플라스크 배양에서 RscK60-del 효소 활성의 최적화를 위한 예비 실험에서, 다양화된 한 파라미터는 배양 배지 중 Cu(II) 농도였다. SM3 배양 배지에 Cu(II) 이온을 보충하는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다. 0.25 mg/L CuSO₄ x 5 H₂O와 함께 미량 원소 용액을 첨가하여 얻은 SM3 배양 배지(배양 배지 중 최종 농도 1 μM)는 본질적으로 오직 낮은 함량의 Cu(II) 이온만을 함유하였다.

상기 기술된 바와 같이, CuSO₄ x 5 H₂O가 0 mM 내지 0.5 mM의 농도로 추가로 첨가된 SM3 배지, 15 g/L 글루코스, 100 mg/L 암피실린 중에서 E. 콜라이 JM105 x pRscK60-del 균주를 진탕 플라스크 배양하여 Cu(II) 이온이 RscK60-del 옥시다제의 효소 활성에 미치는 효과를 시험하였다. 배치로부터의 세포를 L-DOPA 시험에 의해 활성을 측정하기 위한 세포 균질액으로서 사용하였다(표 2).

소듐 D- 에리소르베이트가 HTS 안정성에 미치는 효과:

HPLC 시험을 위해, E. 콜라이 JM105 x pRscK60-del 균주(세포 밀도 OD₆₀₀ = 4.7/mL)의 2 x 50 mL 진탕 플라스크 배양물로부터의 조합된 세포를 원심분리에 의해 단리시키고, 10 mL의 KPiE 완충제 중에 재현탁시켰다. 각 경우에서, 5 mL의 단리되고, 재현탁된 세포를 실시예 2에 기술된 HPLC 시험에서 사용하였다.

2번의 비교 시험 생체변환을 수행하였다. 한 배치는 10 mL 배치 부피로 상기 기술된 진탕 플라스크 배양물로부터의, 5 mL의 단리되고, 재현탁된 JM105 x pRscK60-del 세포, 7 mg의 티로솔(배치에서 최종 농도 5.1 mM) 및 5 mL의 KPiE 완충제를 함유하였다. 두 번째 배치는 유사하게 10 mL 배치 부피로, KPiE 완충제 중에 용해된, 5 mL의 단리되고, 재현탁된 JM105 x pRscK60-del 세포, 7 mg의 티로솔, 4.9 mL의 KPiE 완충제 및 0.1 mL의 1 M 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O를 함유하였다(실시예 2의 HPLC 시험 참조). 배치를 진탕기(Infors)에서 30℃ 및 140 rpm에서 인큐베이션시켰다. 0 h, 1 h, 및 4 h 후 시험으로부터 샘플을 취하고, HPLC에 의해 분석하였다. 결과는 표 3에 기록되어 있다.

실시예 4: 발효에 의한 E. 콜라이에서의 RscK60 - del 옥시다제의 발효

발효를 위해, E. 콜라이 JM105 x pRscK60-del 균주를 사용하였다. 사토리우스 BBI 시스템즈 게엠베하(Sartorius BBI Systems GmbH)로부터의 바이오스탯 B(Biostat B) 발효조(작동 부피 2 L).

진탕 플라스크 사전배양:

아가 플레이트로부터 1 L 배플형 에를렌마이어 플라스크 중 2 x 100 mL의 LBamp 배지에 JM105 x pRscK60-del 균주를 접종하고, 최대로는 세포 밀도 OD₆₀₀이 2/mL - 4/mL가 되 때까지 7-8 h 동안 30℃에서 및 120 rpm 속도로 인큐베이션 진탕기(Infors)에서 인큐베이션시켰다.

사전발효조:

40 g/L 글루코스 및 100 mg/L 암피실린으로 보충된 1.5 L의 FM2 배지에 7.5 mL의 진탕 플라스크 사전배양물을 접종하였다. 발효 조건은 하기와 같았다: 온도 30℃; pH 7.0으로 일정하게 유지(하기 기술되는 바와 같이 25% NH₄OH 및 6.8 N H₃PO₄로 자동 보정); H₂O 중 4% v/v 스트로크톨(Struktol) J673(Schill & Seilacher)의 자동 계량에 의한 기포 제어; 교반기 속도 450-1300 rpm; 1.7 vvm(vvm: 분당 발효 부피 1 리터당 압축 공기 리터량로 기록되는 발효 배치 내로의 압축 공기 주입량)의 멸균 필터에 의해 멸균된 압축 공기로 지속적인 환기; pO₂ ≥ 50%. 부분 산소압 pO₂는 교반기 속도를 통해 제어되었다. 16 h의 발효 시간 후에 45/mL - 60/mL의 세포 밀도 OD₆₀₀이 달성되었다.

발효조 제조:

20 g/L 글루코스, 0.5 mM CuSO₄ x 5 H₂O 및 100 mg/L 암피실린으로 보충된 1.35 L의 FM2 배지(pH 7.0)에 150 mL의 사전발효조 배양물을 접종하였다. 발효 조건은 하기와 같았다: 온도 30℃; pH 7.0으로 일정하게 유지(하기 기술되는 바와 같이 25% NH₄OH 및 6.8 N H₃PO₄로 자동 보정); H₂O 중 4% v/v 스트로크톨 J673(Schill & Seilacher)의 자동 투여에 의한 기포 제어; 교반기 속도 450 - 1300 rpm; 1.7 vvm으로 지속적인 환기; pO₂ ≥ 50%. 부분 산소압 pO₂는 교반기 속도를 통해 제어되었다. 발효 시간은 30-32 h였다.

FM2 배지: (NH₄)₂SO₄, 5 g/L; NaCl, 0.50 g/L; FeSO₄ x 7 H₂O, 0.075 g/L; Na₃ 시트레이트, 1 g/L, MgSO₄ x 7 H₂O, 0.30 g/L, CaCl₂ x 2 H₂O, 0.015 g/L, KH₂PO₄, 1.50 g/L, 비타민 B1(Sigma-Aldrich), 0.005 g/L; 펩톤(Oxoid), 5.00 g/L; 효모 추출물(BD Biosciences), 2.50 g/L; 미량 원소 용액, 10 mL/L(실시예 2에서 사용된 것에 상응).

발효조의 pH는 처음에 25% NH₄OH 용액을 펌핑하여 7.0으로 조정하였다. 발효 동안, pH는 25% NH₄OH, 또는 6.8 N H₃PO₄로 자동 보정하여 7.0 값으로 유지하였다. 접종을 위해, 150 mL의 사전발효조 배양물을 발효조 베슬로 펌핑하였다. 이로써, 시작 부피는 1.5L였다. 시작시, 배양물을 350 rpm으로 교반하고, 1.7 vvm의 환기 속도로 살포하였다. 상기 시작 조건하에, 접종 전에 산소 프로브를 보정하여 100% 포화도가 되도록 만들었다.

발효 동안 O₂ 포화도(pO₂) 표적 값은 50%로 조정하였다. O₂ 포화도가 표적 값 아래로 하락한 후, O₂ 포화도를 표적 값으로 되돌리기 위해 폐쇄 루프 제어 캐스케이드를 시작하였다. 교반기 속도는 연속적으로 증가되었다(최대 1500 rpm까지).

30℃ 온도에서 발효를 수행하였다. 발효조 중 글루코스 함량이 일단 처음의 20 g/L로부터 약 5 g/L로 하락하고 나면, 60%(w/w) 글루코스 용액을 연속적으로 공급하였다. 발효조 중 글루코스 농도가 이후에는 다시 2 g/L를 초과하지 않도록 공급 속도를 조정하였다. YSI(미국 오하이오주 옐로우 스프링스 소재)로부터의 글루코스 분석기를 이용하여 글루코스를 측정하였다.

일단 발효조에서의 표적 밀도가 OD₆₀₀ 50/mL - 60/mL에 도달하고 나면(발효 시간 7.5 h), IPTG 유도제(최종 농도 0.4 mM)의 단일 첨가에 의해 옥시다제 RscK60-del 발현이 시작되도록 하였다. 총 발효 시간 30 h에 상응하는 유도 22.5 h 후, 발효를 정지시키고, 효소 활성(L-DOPA 시험) 및 분석 규모의 티로솔에서 HTS로의 전환(HPLC 시험)을 실시예 2에 기술된 바와 같이 발효 배치 샘플에서 정량화하였다. 상기 두 시험에서 모두, 발효조 브로쓰를 추가의 후처리 없이 직접 사용하였다. 남은 발효조 브로쓰를 50 mL 분취량으로 분배하고, 냉동시키고, 추후 실험을 위해 -20℃에서 보관하였다.

L-DOPA 시험에서 5 mg/mL의 단백질 농도로 1.6 mL의 발효조 브로쓰를 사용하였을 때, 효소 기질로서 L-DOPA를 이용하여 추가의 후처리 없이 수행하였을 때 발효조 브로쓰의 비 효소 활성(L-DOPA 시험)은 28.4 mU/mg 단백질이었다.

소듐 D-에리소르베이트의 존재하에서 효소 활성을 측정하기 위한 HPLC 시험(실시예 2)에서, 발효 시간 30 h 후 HPLC 시험에서 100 ㎕ 발효조 브로쓰(OD₆₀₀ 63.8/mL)를 사용하여 10 mL 시험 배치 중 실제 세포 밀도는 0.64/mL였다. 0 h, 1 h, 2 h 및 4 h 후 시험으로부터 샘플을 취하고, HPLC에 의해 티로솔 및 HTS 함량을 분석하고, 수율(%), 즉, HTS로 전환된 티로솔의 비율을 측정하였다(HTS 백분율(%)). 4 h 인큐베이션 후, 사용된 티로솔 중 99.4%가 HTS로 전환되었다(표 4 참조).

추가 배치에서, 방법의 경제적 실현가능성에 중요한, E. 콜라이 균주 JM105 x pRscK60-del의 발효조 세포의 티로솔에서 HTS로의 생체변환에의 적합성을 최단 기간내 최대 농도에서 티로솔 전환과 관련하여 조사하였다(시공간 수율).

100 mL 에를렌마이어 플라스크 중 249 mg의 티로솔(최종 농도 180 mM) 및 389 mg의 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O(180 mM)의 초기 충전물을 1 mL의 KPi 완충제 중에 용해시키고, 반응을 시작시키기 위해 RscK60-del 옥시다제 발현 JM105 x pRscK60-del 세포의 발효조 브로쓰 9 mL를 추가의 후처리 없이 첨가하였다. 배치 부피는 10 mL였다. 티로솔 대 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O의 몰비는 1:1이었다. 배치에서 실제로 측정된 반응 pH는 6.7이었다. 배치를 진탕기(Infors)에서 30℃ 및 140 rpm에서 인큐베이션시켰다. 0 h, 2 h 및 4 h 후 샘플링 및 (실시예 2에 기술된 바와 같이) HPLC에 의한 분석을 수행하였다. 반응 진행 과정은 표 5에 제시되어 있다.

실시예 5 : HTS 제조

실험 1: 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O의 존재하에 티로솔 대 소듐 D-에리소르베이트의 몰비 1:1에서 RscK60-del 옥시다제를 발현하는 JM105 x pRscK60-del 발효조 세포를 이용한 30 g/L 티로솔의 생체변환.

100 mL 에를렌마이어 플라스크 중 300 mg의 티로솔(최종 농도 220 mM) 및 475.4 mg의 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O(220 mM)의 초기 충전물을 5 mL의 KPiE 완충제 중에 용해시키고, 반응을 시작시키기 위해 실시예 4로부터의 E. 콜라이 K12 JM105 x pRscK60-del 균주의 발효조 브로쓰 5 mL를 추가의 후처리 없이 첨가하였다. 배치 부피는 10 mL였다. 티로솔 대 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O의 몰비는 1:1이었다. 배치에서 실제로 측정된 반응 pH는 6.7이었다. 배치를 진탕기(Infors)에서 30℃ 및 140 rpm에서 인큐베이션시켰다. 0 h, 3 h 및 24 h 후 샘플링 및 HPLC에 의한 분석(실시예 2)을 수행하였다. 반응 진행 과정은 표 6에 제시되어 있다.

실험 2: 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O의 존재하에 (티로솔 대 소듐 D-에리소르베이트의 몰비 1:1.2) RscK60-del 발효조 세포를 이용한 60 g/L 티로솔의 생체변환.

100 mL 에를렌마이어 플라스크 중 600 mg의 티로솔(최종 농도 434 mM) 및 1126 mg의 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O(521 mM)의 초기 충전물을 5 mL의 KPiE 완충제 중에 현탁시켰다. 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O는 상기 조건하에서 우수한 용해도를 보였지만, 티로솔은 현탁액에서만 반응할 수 있었다. 반응을 시작시키기 위해 실시예 4로부터의 E. 콜라이 K12 JM105 x pRscK60-del 균주의 발효조 브로쓰 5 mL를 추가의 후처리 없이 첨가하였다. 배치 부피는 10 mL였다. 티로솔 대 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O의 몰비는 1:1.2였다. 배치를 진탕기(Infors)에서 30℃ 및 140 rpm에서 인큐베이션시켰다. 0 h, 3 h 및 24 h 후 샘플링 및 HPLC에 의한 분석(실시예 2)을 수행하였다. 반응 진행 과정은 표 7에 제시되어 있다.

실험 3: 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O의 존재하에 (티로솔 대 소듐 D-에리소르베이트의 몰비 1:1.2) RscK60-del 발효조 세포를 이용한 100 g/L 티로솔의 생체변환.

100 mL 에를렌마이어 플라스크 중1000 mg의 티로솔(최종 농도 724 mM) 및 1885 mg의 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O(872 mM)의 초기 충전물에 5 mL의 KPiE 완충제 중에 1 mL의 KP2 완충제(500 mM 인산칼륨, 10 mM EDTA, pH 6.5), 및 실시예 4로부터의, RscK60-del 옥시다제를 발현하는 세포 JM105 x pRscK60의 발효조 브로쓰 9 mL를 추가의 후처리 없이 첨가하였다. 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O는 상기 조건하에서 우수한 용해도를 보였지만, 티로솔은 현탁액에서만 반응할 수 있었다. 배치 부피는 10 mL였다. 티로솔 대 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O의 몰비는 1:1.2였다. 배치를 진탕기(Infors)에서 37℃ 및 140 rpm에서 인큐베이션시켰다. 3 h, 6 h, 24 h 및 29 h 후 샘플링 및 HPLC에 의한 분석(실시예 2)을 수행하였다. 시간에 따른 생체변환의 진행 과정은 표 8에 제시되어 있다.

실시예 6 : HTS 추출

실시예 5 실험 2로부터의 생체변환물 6.5 mL를 매회 10 mL의 에틸 아세테이트(에틸 에타노에이트, CAS 번호 141-78-6)를 이용하여 4회 추출하고, 상 분리 후, 상부 에틸 아세테이트 상을 제거하고, 조합하였다. 조합된 에틸 아세테이트 상(부피 40 mL)을 실시예 2에 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 티로솔 및 HTS의 존재에 대해 분석하였지만, 오직 HTS만 검출할 수 있었다. HPLC 분석에 기초하면, HTS 순도는 97%였다.

HTS 몰 수율을 계산하였다. 티로솔 반응물의 사용량은 390 mg(6.5 mL의 60 g/L 티로솔 배치)이었고, 이는 2.8 mmol의 티로솔(티로솔 분자량: 138.2 g/mol)에 상응하는 양이었다. 수율이 100%라고 하면, 결과는 2.8 mmol HTS였고, 이는 431.8 mg(HTS 분자량: 154.2 g/mol)에 상응하는 양이었다. HPLC에 의해 측정한 결과, HTS는 404.8 mg인 것으로 관측되었고, 이는 이론상 수율의 93.8%에 상응하는 양이었다.

추출물의 용매를 회전식 증발기(Buchi Rotavapor R-205)(배쓰 온도 62℃, 감압 500 mbar)에서 분리하고, 감압을 통해 용매 잔류물을 제거하였다. 남은 갈황색 오일의 중량을 측정하였다. 수율은 400 mg이었고, 이는 HPLC로 측정된 수율과 잘 일치하는 것으로 나타났다.

실시예 7 : 제조 규모의 HTS 생산

재킷이 있는 1 L 열안정성 유리 베쓸(Diehm)을 호스 연결구를 통해 온도 조절 장치(Lauda)에 연결하고, 온도를 37℃로 조정하였다. 유리 베쓸 중의 35 g의 티로솔(최종 농도 507 mM) 및 65.6 g의 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O(607 mM)의 초기 충전물에 250 mL의 KP3 완충제(50 mM 인산칼륨, 5 mM EDTA, pH 6.5), 및 E. 콜라이 K12 JM105 x pRscK60-del 균주의 발효조 브로쓰(실시예 4) 250 mL를 추가의 후처리 없이 첨가하였다. 티로솔 대 소듐 D-에리소르베이트 x H₂O의 몰비는 1:1.2였다. 배치 부피는 0.5 L였다. 자기 교반기를 사용하여 혼합을 수행하였다. 산소 공급을 위해 유리관을 통해 배치에 압축 공기를 도입하였다. 자기 교반기와 살포를 시작하여 반응을 시작시켰다. 0 h, 3 h, 6 h, 및 24 h 후 샘플링 및 HPLC(실시예 2)에 의한 분석을 수행하였다. 상기 시점에 티로솔이 100% 전환되었다. 시간에 따른 생체변환의 진행 과정은 표 9에 요약되어 있다.

반응 시작 시점에서의 506.5 mM 티로솔의 사용량 기준으로 458 mM HTS의 몰 수율은 90.4%였다.

HTS 단리를 위해, 0.5 L의 생체변환물을 먼저 30 min 동안 자기 교반기와 함께 혼합하면서, 80℃에서 인큐베이션시킨 후, 입자성 물질을 분리하기 위해 30 min 동안 4000 rpm에서 원심분리하였다(Heraeus Megafuge 1.0 R). 에틸 아세테이트를 이용하여 상청액을 3회에 걸쳐 추출하였다. 1차 추출은 1 L의 에틸 아세테이트를 이용하여 수행하고, 2차 및 3차 추출은 각각 0.5 L의 에틸 아세테이트를 이용하여 수행하였다. 에틸 아세테이트 상을 조합하여 2 L의 추출물을 수득하였다.

잔류 에틸 아세테이트를 제거하기 위해, 에틸 아세테이트를 회전식 증발기(Buchi Rotavapor R-205)에서 먼저 270 mbar의 감압 및 60℃의 온도에서, 및 이어서, 20 mbar의 감압 및 85℃의 온도에서 증류시켰다. 에틸 아세테이트를 제거하였을 때, 34.1 g의 잔류물이 남았고, 이는 본 프로세스의 HTS 생성물에 상응하는 것이었다. 순도를 측정하기 위해, HTS 생성물 32 mg을 계량하고 1 mL의 H₂O 중에 용해시키고(농도 32 mg/mL), HPLC에 의해 분석하였다. HPLC 분석 결과, HTS 함량은 30 mg/mL였고, 이는 계량된 HTS 생성물 32 mg의 양 기준으로 순도 93.8%에 상응하는 것이었다.

HTS의 수율을 계산하였다. 티로솔 반응물의 사용량은 35 g이었다. 분자량 차이(티로솔의 경우, 138.2 g/mol, HTS의 경우, 154.2 g/mol)를 고려하면, 39 g의 HTS 최대 수율이 예상되었다. 순도 93.8%를 고려하면, 34.1 g의 HTS 생성물은 31.9 g의 HTS를 함유하였다. 전체 프로세스에서 이는 39 g의 HTS의 달성가능한 최대 수율 기준으로 81.7% 수율에 상응하는 것이었다.

발명의효과

본 발명에 의해 선행 기술에 비해 개선되고, 경제적 실현가능성이 더 높으며, 간단한 방식으로 및 고순도로 하이드록시티로솔을 제조할 수 있는 방법을 달성할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Wacker Chemie AG <120> Method for producing a hydroxytyrosol <130> HTS <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1632 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1632) <223> rscK60 cds <400> 1 atgcatcgcc ccccgcttgc ggtcggacgt ttcttttcta cattgaagtg cccgctgcac 60 atcgcatcgc cgggcttccg ggtggctggc tttcctgcgc cgccccacac caacaccaac 120 ggactcatcc aggagaaatc aatggtcgtg cgtagaacgg tgctgaaggc aatcgccgga 180 accagtgtcg ccacggtatt cgcgggcaag ctgaccggtc tctccgctat tgctgccgat 240 gcggccccct tgctggtacg gcgcaacctg cacggcatga agctggacga cccggacctg 300 tcggcctacc gcgagttcgt cagcatcatg aaaagcaaga accagacgca gccgctgagc 360 tggctcggct acgccaacca gcacggctcg ctcaacggtg gcttcaagta ctgcccgcac 420 ggcgattggt acttcctgcc ctggcaccgc ggcttcatgc tgatgtacga acgggccgtg 480 gctgcgctca ccggctacaa gtcattcgcc atgccgtact ggaactggac cgaagaccgc 540 ctgctgcccg aagccttcac cgccaagacc tacaacggca agccgaaccc gctctacgtg 600 cccaaccgga acgatctgac cggtccctat gccctcaccg 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Leu Met Tyr Glu Arg Ala Val 145 150 155 160 Ala Ala Leu Thr Gly Tyr Lys Ser Phe Ala Met Pro Tyr Trp Asn Trp 165 170 175 Thr Glu Asp Arg Leu Leu Pro Glu Ala Phe Thr Ala Lys Thr Tyr Asn 180 185 190 Gly Lys Pro Asn Pro Leu Tyr Val Pro Asn Arg Asn Asp Leu Thr Gly 195 200 205 Pro Tyr Ala Leu Thr Asp Ala Ile Val Gly Gln Lys Glu Val Met Asp 210 215 220 Lys Ile Tyr Ala Glu Thr Asn Phe Glu Val Phe Gly Thr Ser Arg Ser 225 230 235 240 Val Asp Arg Ser Val Gln Pro Pro Leu Val Gln Asn Ser Leu Asp Pro 245 250 255 Lys Trp Val Pro Met Gly Gly Gly Thr Gln Gly Ile Leu Glu Arg Thr 260 265 270 Pro His Asn Thr Val His Asn Asn Ile Gly Ala Phe Met Pro Thr Ala 275 280 285 Ala Ser Pro Arg Asp Pro Val Phe Met Met His His Gly Asn Ile Asp 290 295 300 Arg Val Trp Ala Thr Trp Asn Ala Leu Gly Arg Lys Asn Ser Thr Asp 305 310 315 320 Pro Leu Trp Leu Gly Met Lys Phe Pro Asn Asn Tyr Ile Asp Pro Gln 325 330 335 Gly Arg Tyr Tyr Thr Gln Gly Val Ser Asp Leu Leu Ser Thr Glu Ala 340 345 350 Leu Gly Tyr Arg Tyr Asp Val Met Pro 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(1)..(496) <223> RscK60-del Oxidase <400> 3 Met Val Val Arg Arg Thr Val Leu Lys Ala Ile Ala Gly Thr Ser Val 1 5 10 15 Ala Thr Val Phe Ala Gly Lys Leu Thr Gly Leu Ser Ala Val Ala Ala 20 25 30 Asp Ala Ala Pro Leu Arg Val Arg Arg Asn Leu His Gly Met Lys Met 35 40 45 Asp Asp Pro Asp Leu Ser Ala Tyr Arg Glu Phe Val Gly Ile Met Lys 50 55 60 Gly Lys Asp Gln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Leu Gly Phe Ala Asn Gln 65 70 75 80 His Gly Thr Leu Asn Gly Gly Tyr Lys Tyr Cys Pro His Gly Asp Trp 85 90 95 Tyr Phe Leu Pro Trp His Arg Gly Phe Val Leu Met Tyr Glu Arg Ala 100 105 110 Val Ala Ala Leu Thr Gly Tyr Lys Thr Phe Ala Met Pro Tyr Trp Asn 115 120 125 Trp Thr Glu Asp Arg Leu Leu Pro Glu Ala Phe Thr Ala Lys Thr Tyr 130 135 140 Asn Gly Lys Thr Asn Pro Leu Tyr Val Pro Asn Arg Asn Glu Leu Thr 145 150 155 160 Gly Pro Tyr Ala Leu Thr Asp Ala Ile Val Gly Gln Lys Glu Val Met 165 170 175 Asp Lys Ile Tyr Ala Glu Thr Asn Phe Glu Val Phe Gly Thr Ser Arg 180 185 190 Ser Val Asp Arg Ser Val Arg Pro Pro Leu Val Gln Asn Ser Leu Asp 195 200 205 Pro Lys Trp Val Pro Met Gly Gly Gly Asn Gln Gly Ile Leu Glu Arg 210 215 220 Thr Pro His Asn Thr Val His Asn Asn Ile Gly Ala Phe Met Pro Thr 225 230 235 240 Ala Ala Ser Pro Arg Asp Pro Val Phe Met Met His His Gly Asn Ile 245 250 255 Asp Arg Val Trp Ala Thr Trp Asn Ala Leu Gly Arg Lys Asn Ser Thr 260 265 270 Asp Pro Leu Trp Leu Gly Met Lys Phe Pro Asn Asn Tyr Ile Asp Pro 275 280 285 Gln Gly Arg Tyr Tyr Thr Gln Gly Val Ser Asp Leu Leu Ser Thr Glu 290 295 300 Ala Leu Gly Tyr Arg Tyr Asp Val Met Pro Arg Ala Asp Asn Lys Val 305 310 315 320 Val Asn Asn Ala Arg Ala Glu His Leu Leu Ala Leu Phe Lys Thr Gly 325 330 335 Asp Ser Val Lys Leu Ala Asp His Ile Arg Leu Arg Ser Val Leu Lys 340 345 350 Gly Glu His Pro Val Ala Thr Ala Val Glu Pro Leu Asn Ser Ala Val 355 360 365 Gln Phe Glu Ala Gly Thr Val Thr Gly Ala Leu Gly Ala Asp Val Gly 370 375 380 Thr Gly Ser Thr Thr Glu Val Val Ala Leu Ile Lys Asn Ile Arg Ile 385 390 395 400 Pro Tyr Asn Val Ile Ser Ile Arg Val Phe Val Asn Leu Pro Asn Ala 405 410 415 Asn Leu Asp Val Pro Glu Thr Asp Pro His Phe Val Thr Ser Leu Ser 420 425 430 Phe Leu Thr His Ala Ala Gly His Asp His His Ala Leu Pro Ser Thr 435 440 445 Met Val Asn Leu Thr Asp Thr Leu Lys Ala Leu Asn Ile Arg Asp Asp 450 455 460 Asn Phe Ser Ile Asn Leu Val Ala Val Pro Gln Pro Gly Val Ala Val 465 470 475 480 Glu Ser Ser Gly Gly Val Thr Pro Glu Ser Ile Glu Val Ala Val Ile 485 490 495 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer forward <220> <221> primer_bind <222> (1)..(33) <223> rsck60-1f <400> 4 ttaagaattc atgcatcgcc ccccgcttgc ggt 33 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer reverse <220> <221> primer_bind <222> (1)..(34) <223> rsck60-2r <400> 5 atataagctt tcaaatgacg gcgacctcga tcga 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer forward <220> <221> primer_bind <222> (1)..(34) <223> rsck60-3f <400> 6 ttaagaattc atggtcgtgc gtagaacggt gctg 34

Claims (13)

1. 티로솔에서 하이드록시티로솔(HTS)로의 효소적 전환에 의해 HTS를 제조하는 방법으로서, 반응 혼합물이
   i) 티로솔, 및
   ii) 에리소르브산 및 에리소르베이트로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물, 및
   iii) 서열 번호 2 및 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 옥시다제
   를 포함하고,
   HTS가 반응 혼합물로부터 단리되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 서열 번호 2와 상동성인 아미노산 서열이 서열 번호 3인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 옥시다제가 E. 콜라이(E. coli)에서의 발효에 의해 재조합 수단에 의해서 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
4. 제3항에 있어서, 옥시다제 제조를 위한 발효가 적어도 0.02 mM 농도의 Cu(II) 이온의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 옥시다제 제조를 위한 발효로부터의 발효조 브로쓰가 HTS를 제조하는 방법에서 추가의 후처리 없이 직접 사용되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 티로솔이 200 mM 초과의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물이 에리소르브산 또는 에리소르베이트를 적어도 0.4 M의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 티로솔 대 에리소르브산 또는 에리소르베이트의 몰비가 1:1.50 이하인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물 중, 옥시다제 제조를 위한 발효로부터의 발효조 브로쓰의 부피 비율이 최대 90%인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물이, 사용되는 티로솔 중 적어도 90%가 HTS로 전환될 때까지 일정 시간 동안 반응하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, HTS가 적어도 70%의 몰 수율로 티로솔로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, HTS가 에틸 아세테이트를 이용하는 추출에 의해 반응 혼합물로부터 단리되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, HTS가 적어도 80%의 순도로 반응 혼합물로부터 단리되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.