JP2017538432A - フェノール基質の対応するカテコール生成物への酵素的変換のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
チロシナーゼは、天然に広く分布しているポリフェノールオキシダーゼ酵素の型であり、いくつかの生物学的機能および生物工学的適用を有する。分子酸素の存在下で、チロシナーゼは、反応の2つの型を触媒する:モノフェノールのo−ジフェノールへのヒドロキシル化(モノフェノラーゼ活性)およびo−ジフェノールのo−キノンへのその後の酸化(ジフェノラーゼ活性)。反応性キノンは、皮膚および毛髪色素沈着、果実の褐変ならびに植物および節足動物における創傷治癒を担う巨大分子メラニンに自家重合(非酵素的に)する。チロシナーゼは、広範な基質特異性を有し、フェノールおよびジフェノール(カテコール)の多くの型を受け入れ得る。置換フェノールの中で、それは、3−および4−置換フェノールに働き得るが、2−置換フェノールは、その酵素の競合的阻害剤である。
「フェノール基質」は、非置換または置換フェノール、特に、3−置換または4−置換フェノールを意味する。置換基の例は、ハロゲンまたはヒドロキシアルキル置換基を含む。ヒドロキシアルキル置換基の例は、ヒドロキシメチルおよびヒドロキシエチル置換基、特に、4−ヒドロキシメチルおよび4−ヒドロキシエチル置換基を含む。典型的には、3−置換または4−置換フェノールは、3−ハロフェノールまたは4−ハロフェノールである。ハロフェノールの例は、ヨードフェノール、ブロモフェノール、クロロフェノール、およびフルオロフェノールを含む。好ましくは、フェノールは、チロソールである。好ましくは、フェノール基質は、水性環境におけるそれらの最大溶解度までの濃度で提供される。一実施形態では、フェノール基質は、チロソール、3−ハロフェノール、および4−ハロフェノールから選択される。一実施形態では、フェノール基質は、チロソールおよび4−ハロフェノールから選択される。
青枯病菌(Ralstonia solanacearum)チロシナーゼ酵素アミノ酸配列(配列番号1)
(NP_518458)
(gi 30407127)
材料および方法
チロシナーゼの株、増殖条件および精製
4−フルオロフェノール、4−ブロモフェノール、4−クロロフェノール、および4−ヨードフェノールなどの様々なモノフェノール基質をSigma−Aldrich(Dublin,Ireland)から購入した。4−ブロモフェノール、および4−ヨードフェノールのストック溶液(1M)を100%エタノール中で調製し、その後の作業液(working solution)を50mMリン酸カリウムバッファー(pH7)中でさらに希釈した。同様に、4−フルオロフェノールおよび4−クロロフェノールのストック溶液(500mM)を脱イオン水中で調製し、作業ストック(working stock)を50mMホスフェートバッファー中で調製した。チロソールをTCI Europe(Belgium)から購入し、ストックを50mMホスフェートバッファー中で調製した。アスコルビン酸およびアスコルビン酸ナトリウム塩(AA)(o−キノンをo−ジフェノールに還元するために使用される)を生物学的変換アッセイ直前に脱イオン水中で調製した。
ハロフェノールの対応するハロカテコールへの生物学的変換を、精製酵素(WTおよび改変型変異体)を使用して行った。様々な濃度(5、10、および20mM)のハロフェノール生物学的変換をシェーカーインキュベーター中で30℃および200rpmで20mLの作業体積を有する100mL三角フラスコ中で行った。チロソールのヒドロキシチロソールへの生物学的変換を精製酵素、細胞を含まない溶解物または全細胞を使用して行った。様々な濃度(75、100、150および175mM)のチロソール生物学的変換をシェーカーインキュベーター中で30℃および200〜250rpmで100mLの作業体積を有する500mLバッフル付き三角フラスコ中で行った。1mMの基質あたり2μg/mLの酵素濃度を、1:2の基質対アスコルビン酸ナトリウム比で試験した。ヒドロキシチロソールへの100mMチロソールの生物学的変換を、上で特定した条件を使用して市販のキノコチロシナーゼ(Sigma,Ireland)を使用しても行った。試料(450μL)を様々な時点で取り出し、50μLの氷冷1N HClに直ちに加えた。試料を遠心分離し(12,000g)、Whatman Mini−UniPrep(商標)syringeless filters(0.45μ Whatman Inc.NJ,USA)を使用してろ過し、20μLの試料体積を全てのHPLC注入に使用した。
ろ過された試料を5μm ACE5 C18カラム(25cm×4.6mm ID;Apex Scientific,Ireland)およびHewlett−Packard(Palo Alto,CA,USA)Agilent 1100 Series Diode Array Detectorを備えたHP 1100器械を使用してHPLCによって分析した。試料を1.0mL/分の流速でリン酸(0.1%、v/v)およびメタノール混合物を使用して22℃で、均一濃度で溶出した。リン酸とメタノールとの比は、4−フルオロフェノールに関して70:30であり、4−クロロ−、4−ブロモ−、および4−ヨードフェノールに関して50:50であった。
Claims (14)
- フェノール基質の対応するカテコール生成物への酵素的変換のための方法であって、前記フェノール基質は、チロソールおよび4−ハロフェノールから選択され、前記方法は、反応混合物中でフェノール基質を青枯病菌(Ralstonia solanacearum)チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体と、前記酵素が前記フェノール基質の少なくとも一部を前記カテコール生成物に変換することを可能にするのに十分な期間インキュベートするステップを含むことを特徴とする方法。
- 前記フェノール基質は、チロソールであり、前記カテコール生成物は、ヒドロキシチロソールであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記フェノール基質は、ハロフェノールであり、前記カテコール生成物は、ハロカテコールであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記反応混合物は、アスコルビン酸またはそのナトリウム塩を含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応混合物は、20〜350mMアスコルビン酸を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記青枯病菌チロシナーゼ酵素の前記機能的誘導体は、175mMチロソールのヒドロキシチロソールへの100%変換の能力がある青枯病菌チロシナーゼ酵素の改変型変異体であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 青枯病菌チロシナーゼ酵素の前記機能的誘導体は、RVC10、RV145およびC10_N322Sからなる群から選択される改変型酵素であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体を発現する細菌からの抽出物として提供されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体を発現する細菌として提供されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、精製された酵素として提供されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、細胞抽出物の形態での粗製混合物として提供されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 基質濃度は、少なくとも75mMであることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カテコール生成物は、酵素的変換ステップ後に前記反応混合物を冷却することによって前記反応混合物中に存在する不純物から分離されることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カテコール生成物は、酵素的変換ステップ後に前記反応混合物を冷蔵するまたは凍結させることによって前記反応混合物中に存在する不純物から分離されることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
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