JP2011188803A

JP2011188803A - 変異型還元酵素

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Publication number: JP2011188803A
Application number: JP2010057490A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Asako; 弘之朝子
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2010-03-15
Filing date: 2010-03-15
Publication date: 2011-09-29
Anticipated expiration: 2030-03-15
Also published as: JP5724194B2

Abstract

【課題】光学活性である化合物やその中間体等を製造する為に工業的に利用される還元酵素による還元反応における、反応時間の短縮および反応効率の向上を図るための、熱安定性に優れた還元酵素の提供。
【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異を含む１つ以上のアミノ酸変異（但し、５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異とのいずれのアミノ酸変異も含まない。）を有すること以外には、特定な配列からなるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素。
【選択図】なし

Description

本発明は、変異型の還元酵素等に関する。

本発明は、還元反応、特にαケト酸の還元反応等に利用可能な改変型の還元酵素（即ち、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素）、その遺伝子及びそれらの利用に関するものである。
還元酵素は、基質を還元する能力を有し、近年、例えば、医農薬の有効成分となる化合物やその中間体、特に光学活性である化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用されている。そして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有する酵素（野生型還元酵素）が知られている（例えば、特許文献１参照）。
このような、光学活性である化合物やその中間体等を製造する為に工業的に利用される還元酵素は、当該酵素による還元反応における反応生成物の光学純度が高いこと、基質の絶対立体配置に対する当該酵素の認識性が高いこと、温度・ｐＨ・溶媒・圧力等の各種反応条件に対する安定性が高いこと等の性能を備えていることが望ましい。中でも温度に対する還元酵素の安定性（即ち、熱安定性）が高いと、反応温度を高くすることが可能となり、反応速度を高めるだけでなく、反応中の還元酵素の失活を軽減することができる（例えば、非特許文献１参照）。

Applied Microbiology Biotechnology、８０、８０５−８１２（２００８）

特開２００７−６８５０３

そこで、反応時間の短縮および反応効率の向上を図るうえで、熱安定性に優れた還元酵素の開発が切望されている。

本発明者は、このような状況下鋭意検討を行った結果、ある種の野生型還元酵素のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸が他の特定のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する還元酵素（即ち、改変型還元酵素）が優れた熱安定性を示すことを見い出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異を含む１つ以上のアミノ酸変異（但し、５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異とのいずれのアミノ酸変異も含まない。）を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素（以下、本発明酵素と記すこともある。）；
２）前項１記載の酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド（以下、本発明遺伝子と記すこともある。）；
３）前項２記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
４）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有することを特徴とする前項３記載のベクター；
５）前項２記載のポリヌクレオチド又は前項３若しくは４記載のベクターを含有することを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
６）２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに、前項５記載の形質転換体又はその処理物を作用させる工程を含むことを特徴とする（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）；
７）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンをセリンに置換する工程を含むことを特徴とする方法。但し、５６番目のグリシンをシステインに置換する工程と１１５番目のバリンをイソロイシンに置換する工程と２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と４２番目のヒスチジンをロイシンに置換する工程とのいずれの工程も含まない。（以下、本発明酵素改変方法と記すこともある。）；
８）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、７３番目から７５番目までの、スレオニンをコードするコドンを、セリンをコードするコドンに置換する工程を含むことを特徴とする方法。但し、１６６番目から１６８番目までの、グリシンをコードするコドンを、システインをコードするコドンに置換する工程と３４３番目から３４５番目までの、バリンをコードするコドンを、イソロイシンをコードするコドンに置換する工程と７９番目から８１番目までの、トリプトファンをコードするコドンを、アルギニンをコードするコドンに置換する工程と１２４番目から１２６番目までの、ヒスチジンをコードするコドンを、ロイシンをコードするコドンに置換する工程とのいずれの工程も含まない。（以下、本発明遺伝子改変方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。

本発明により、医農薬の有効成分となる化合物やその中間体、特に光学活性である化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用される、熱安定性に優れた還元酵素等が提供可能となる。そして、本発明酵素を利用すれば、反応時間の短縮および反応効率の向上が可能となる。

本明細書に記載される発明は記載されている特定の方法論、プロトコール、及び、試薬に限定されず、可変であると考えられる。また、本明細書で用いる用語は単に特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと考えられる。
特に断りの無い限り、本明細書で用いる全ての技術用語、及び、化学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明を実施又は試験する上で、本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法、及び、材料のいずれを用いてもよいが、以下、好ましい方法、装置、及び、材料を記載する。

以下、更に詳細に本発明を説明する。

本出願において、例えば「T25S」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目（「25」：アミノ酸配列のＮ末端からの位置番号）のスレオニン（「T」：一文字表記）がセリン（「S」：一文字表記）に置換されるアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有する酵素を意味している。

本発明酵素において「基質を還元する能力」（以下、還元酵素活性と記すこともある。）は、例えば、水の存在下、酵素と、基質となるαケト酸（具体的には例えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル）及びＮＡＤＰＨの両者とを混合し、次いで当該混合物を３０℃で保温した後、得られた反応液中で消費されたＮＡＤＰＨの量を、当該反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定することができる。

本発明において「熱安定性」とは、例えば、５０℃で１時間の保温処理を行った後の還元酵素活性の残存率が、同様に処理した野生型還元酵素の還元酵素活性の残存率よりも高いことを意味する。

本発明酵素は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異を含む１つ以上のアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有する。
尚、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有する酵素（野生型還元酵素）は、市販のヤマダジーマ・ファリノサ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａｆａｒｉｎｏｓａ）ＩＦＯ０１９３株（独立行政法人製品評価技術基盤機構から購入可能）由来の公知の還元酵素である。

本発明酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本発明遺伝子と記すこともある。）を取得するには、例えば、以下の方法を用いればよい。

まず、野生型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、野生型遺伝子と記すこともある。）を取得する。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラークローニング第２版（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年、等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じて、ヤマダジーマ・ファリノサ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａｆａｒｉｎｏｓａ）ＩＦＯ０１９３株から取得することができる。具体的には、ヤマダジーマ・ファリノサ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａｆａｒｉｎｏｓａ）ＩＦＯ０１９３株から「新細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年）に記載された方法に準じてｃＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、且つ、適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２で示される塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するポリヌクレオチド等を増幅することにより、本発明遺伝子を調製する。
ここで、ヤマダジーマ・ファリノサ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａｆａｒｉｎｏｓａ）ＩＦＯ０１９３株由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、且つ、配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行えば、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドが増幅される。増幅されたポリヌクレオチドを回収することにより、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）を調製することができる。

次いで、部位特異的変異導入法に基づき、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）に特定の部位特異的変異（尚、本発明での部位特異的変異は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、７３番目から７５番目までの、スレオニンをコードするコドンを、セリンをコードするコドンに置換するような部位特異的変異を含む。）を導入することにより、本発明遺伝子を調製することができる。
ここで「部位特異的変異導入法」としては、例えば、ＯｌｆｅｒｔＬａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ９６１２５−１２８１９９０）、Ｓｍｉｔｈら（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ３１Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．ａｎｄＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ，ＡＰｌｅｎｕｍ：ＮｅｗＹｏｒｋ）、Ｖｌａｓｕｋら（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、Ｈｏｓ．Ｎ．Ｈｕｎｔら（Ｇｅｎｅ７７５１１９８９）等の方法や、Ｍｕｔａｎ−ＥｘｐｒｅｓｓＫｍ（宝酒造社製）、ＴａＫａＲａＬａＰＣＲｉｎｖｉｔｒｏＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（宝酒造社製）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＮＥＮ社製）等の市販キットの利用を挙げることができる。

具体的には例えば、ＯｌｆｅｒｔＬａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ９６１２５−１２８１９９０）の方法を用いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異を含む１つ以上のアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを調製するには、まず、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）を、例えば、Ｊ．ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラークローニング第２版（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年等に記載される方法に準じて調製する。
次いで、得られたベクター（ＤＮＡ）を鋳型にして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列における２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマーとして用い、配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。ここで、ＰＣＲ反応の条件としては、例えば、９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間、次いで５０℃にて２分間、更に７５℃にて３分間保温する処理を２０サイクル行い、最後に７５℃で８分間保温する条件を挙げることができる。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、得られたＤＮＡ断片に、配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）と、配列番号４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを加え、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。増幅されたＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った配列番号２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）とライゲーション反応を行うことにより、目的とする本発明遺伝子を得ることができる。

本発明酵素としては、１つ以上のアミノ酸変異（例えば、１つのアミノ酸変異）を含むが、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異の他に、他のアミノ酸変異を含むことができる。

前記の「１つ以上のアミノ酸変異」としては、例えば、１つのアミノ酸変異等を挙げることができる。

前記の「１つのアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異を挙げることができる。

本発明酵素を取得するには、本発明遺伝子を微生物等の宿主細胞中で発現させることができるベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより形質転換体を作製する。次いで作製された形質転換体を通常の細胞培養方法に従い培養すればよい。このようにして、本発明酵素を大量に製造し、取得することができる。

本発明ベクターは、本発明遺伝子を含有する。
本発明ベクターの調製は、本発明遺伝子を、本発明遺伝子が導入される宿主細胞において利用可能なベクター例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーを持つベクター（以下、基本ベクターと記すこともある。）に通常の遺伝子工学的手法に準じて、組み込むことにより構築すればよい。
ここで「基本ベクター」としては、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等を挙げることができる。また、出芽酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のベクター、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルス等を挙げることができる。また、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを挙げることができる。
尚、本発明ベクターを、自律複製起点を含むベクター（具体的には例えば、酵母用ベクターｐＡＣＴ２、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４等）を用いて構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。

本発明ベクターは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有してもよい。このようなベクターを用いることにより、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有する形質転換体を作製することもできる。

本発明遺伝子を微生物等の宿主細胞中で発現させることができるベクターを、宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより、形質転換体を作製する。次いで作製された形質転換体を通常の細胞培養方法に従い培養することにより、本発明酵素を大量に製造し、取得することができる。
本発明遺伝子を微生物等の宿主細胞中で発現させることができるベクターは、本発明遺伝子の上流に、微生物等の宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上記のような基本ベクターに組み込むことにより調製すればよい。
ここで、「機能可能な形で結合させ（る）」とは、本発明遺伝子が導入される微生物等の宿主細胞において、プロモーターの制御下に本発明遺伝子が発現されるように、当該プロモーターと本発明遺伝子とを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すＤＮＡを挙げることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（ｌａｃＰ）、トリプトファンオペロンのプロモーター（ｔｒｐＰ）、アルギニンオペロンのプロモーター（ａｒｇＰ）、ガラクトースオペロンのプロモーター（ｇａｌＰ）、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター（λ−ｐＬ、λ−ｐＲ）等を挙げることができる。また、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター等を挙げることができる。また、宿主細胞が出芽酵母である場合には、例えば、ＡＤＨ１プロモーター（尚、ＡＤＨ１プロモーターは、例えば、ＡＤＨ１プロモーター及び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５〔ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＦｕｎｄａｔｉｏｎから入手可能、Ａｍｍｅｒｅｒら、ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１ｐａｒｔ（ｐ．１９２−２０１）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。）等を挙げることができる。
また、宿主細胞において機能するプロモーターを予め保有する基本ベクターを使用する場合には、前記プロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で結合するように、上記のプロモーターの下流に本発明遺伝子を挿入すればよい。例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ等である場合には、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられている。当該クローニング部位に本発明遺伝子を挿入することにより得られるベクターを動物細胞へ導入することにより、当該動物細胞において本発明遺伝子を発現させることができる。これらのベクターには予めＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉを欠失したＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えば、ＣＯＳ細胞等に当該ベクターを導入すると、細胞内でベクターのコピー数が非常に増大し、結果として当該ベクターに組み込まれた本発明遺伝子を大量発現させることもできる。また上記の酵母用ベクターｐＡＣＴ２はＡＤＨ１プロモーターを有しており、当該ベクター又はその誘導体のＡＤＨ１プロモーターの下流に本発明遺伝子を挿入すれば、本発明遺伝子を、例えば、ＣＧ１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能なベクターが構築できる。

宿主細胞としては、微生物の場合には、例えば、真核生物、原核生物等を挙げることができる。好ましくは、例えば、大腸菌等を挙げることができる。当該宿主細胞に、通常の遺伝子工学的方法により、上記のようなベクターを導入することにより、宿主細胞を形質転換することができる。
本発明ベクターを宿主細胞へ導入する方法は、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用すればよい。大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；「モレキュラー・クローニング第２版（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等の通常の方法を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等の通常の遺伝子導入法を挙げることができる。また、酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｙｅａｓｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等で用いられるリチウム法の通常の方法を挙げることができる。尚、ウイルスをベクターとして用いる場合には、上記のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、本発明遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、当該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。

本発明形質転換体を選抜するには、例えば、本発明ベクターと同時にマーカー遺伝子が導入された宿主細胞を、マーカー遺伝子の性質に応じた方法によって培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、当該選抜薬剤が添加された培地を用いて、本発明ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。薬剤耐性を付与する遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、当該栄養要求性に対応する栄養素を含まない最少培地を用いて、本発明ベクターが導入された細胞を培養すればよい。また本発明遺伝子を宿主細胞で発現させることが可能な本発明ベクターを導入した場合には、本発明酵素の酵素活性に基づく検出方法を用いることもできる。

本発明遺伝子が宿主細胞の染色体内に位置する本発明形質転換体を取得するには、例えば、まず本発明ベクターとマーカー遺伝子を有するベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これらを前述の方法で宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。また、例えば、まず上記のような選抜薬剤を付与する遺伝子をマーカー遺伝子として有する本発明ベクターを前述の方法によって宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上継代培養した後、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を選抜し取得することもできる。導入された本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入された本発明遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーやプローブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、前記本発明遺伝子の存在を検出すればよい。当該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。

本発明遺伝子又は本発明ベクターを含有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養は、通常の細胞培養方法によって行えばよい。
本発明形質転換体が微生物である場合には、例えば、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。

炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。

窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。

有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。

更に、tacプロモーター、trcプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。

本発明形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行えばよい。例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げられる。
培養温度は、当該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５℃〜約４０℃である。培地のｐHは約６〜約８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。

本発明形質転換体の培養物から本発明酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用すればよい。例えば、次のような方法を挙げることができる。

まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明酵素を精製することができる。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャムファルマシアバイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌＧ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、本発明酵素を含む画分を選抜するには、例えば、本発明における還元酵素活性の存在有無又はその程度に基づき選抜すればよい。勿論、基質となるαケト酸（具体的には例えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル）を不斉還元して対応するヒドロキシ酸を優先的に生産する能力を測定することにより選抜してもよい。

本発明製造方法は、２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに、本発明形質転換体又はその処理物を作用させる工程を含む。
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルとしては、下記式（１）で示される化合物が例示される。

（式中、Ｒ¹は、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等のＣ１−Ｃ８アルキル基を表す。）
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルとしては、具体的には例えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸メチル、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル、２−オキソ−４−フェニル酪酸プロピル、２−オキソ−４−フェニル酪酸オクチル等を挙げることができる。これらのエステルは、例えば、Tetrahedron(1985) 41(2) 467-72に記載される方法又はこれに準じて製造すればよい。
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルとしては、例えば、式（１）で示される化合物の２位のオキソ基が、不斉的に水酸基に還元された（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸のＣ１−Ｃ８アルキルエステル化合物を挙げることができる。

上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記すこともある。）、又は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと記すこともある。）の存在下に行われる。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。当該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物を挙げることができる。

上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物を挙げることができる。

上記方法における反応は、例えば、水、２−オキソ−４−フェニル酪酸エステル、及び、ＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを、本発明酵素或いはそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要により更に有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。

上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。

反応の終点は、例えば、反応液中の２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルの量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。

反応液からの（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法を挙げることができる。

本発明酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いることができる。

具体的な形態としては、例えば、本発明形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物を挙げることができる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物を挙げることができる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明酵素等を閉じ込める方法）を挙げることができる。

尚、本発明形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、未処理状態の形質転換体を用いる方法よりも当該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法の方が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン、抗生物質）を挙げることができる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明酵素の還元酵素活性を失活させず、且つ、反応系への残留、汚染等の影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。

また、本発明製造方法は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下に行われ、２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルの不斉還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ⁺と記す）又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ⁺と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤ⁺又はＮＡＤＰ⁺は、ＮＡＤ⁺又はＮＡＤＰ⁺を還元型（ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ⁺又はＮＡＤＰ⁺をＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
ＮＡＤ⁺又はＮＡＤＰ⁺を、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等を挙げることができる。
また、ＮＡＤ⁺又はＮＡＤＰ⁺を、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素を持つ微生物又は該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。更にまた、ＮＡＤ⁺又はＮＡＤＰ⁺を、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。

さらに、本発明の（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法では、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のようなＮＡＤ⁺又はＮＡＤＰ⁺を、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。
この形質転換体において、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両者遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換する方法等を挙げることができる。更に、一方の遺伝子又は両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入してもよい。
尚、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築してもよい。

本発明酵素改変方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンをセリンに置換する工程を含む。但し、５６番目のグリシンをシステインに置換する工程と１１５番目のバリンをイソロイシンに置換する工程と２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と４２番目のヒスチジンをロイシンに置換する工程とのいずれの工程も含まない。
本発明酵素改変方法に含まれる工程は、前述の説明（例えば、本発明酵素及び本発明遺伝子の調製に関する説明）及び後述の実施例（例えば、本発明遺伝子の作製：部位特異的変異の導入）と同様な方法に準じて行なえばよい。

本発明遺伝子改変方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、７３番目から７５番目までの、スレオニンをコードするコドンを、セリンをコードするコドンに置換する工程を含む。但し、１６６番目から１６８番目までの、グリシンをコードするコドンを、システインをコードするコドンに置換する工程と３４３番目から３４５番目までの、バリンをコードするコドンを、イソロイシンをコードするコドンに置換する工程と７９番目から８１番目までの、トリプトファンをコードするコドンを、アルギニンをコードするコドンに置換する工程と１２４番目から１２６番目までの、ヒスチジンをコードするコドンを、ロイシンをコードするコドンに置換する工程とのいずれの工程も含まない。
本発明遺伝子改変方法に含まれる工程は、前述の説明（例えば、本発明酵素及び本発明遺伝子の調製に関する説明）及び後述の実施例（例えば、本発明遺伝子の作製：部位特異的変異の導入）と同様な方法に準じて行なえばよい。

以下、実施例を挙げて更に詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
遺伝子のクローニング、プラスミドの構築の方法は「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ａｍｐ；Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法を参考として引用できる。以下に、クローニング等の工程の詳細を説明する。

実施例１（野生型還元酵素の遺伝子（即ち、野生型遺伝子）の調製）
（１−１）染色体ＤＮＡ（Ａ）の調製
２本の５００ｍｌフラスコに培地（水１００ｍｌにグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５ｇ、酵母エキス０．３ｇ及び麦芽エキス０．３ｇを溶解し、２ＮのＨＣｌでｐＨを６に調整したもの）を各々１００ｍｌずつ入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。ここに同組成の培地中で培養（３０℃、４８時間、振盪培養）したヤマダジーマ・ファリノサ（Yamadazyma farinosa）ＩＦＯ１９３株の培養液を各々０．３ｍｌずつ加え、３０℃で７２時間振盪培養した。その後、得られた培養液を遠心分離（８０００rpm、１０分）し、生じた沈殿を集めた。この沈殿を０．８５％食塩水５０ｍｌで洗浄・回収することにより、３．６４ｇの湿菌体を得た。
得られた湿菌体から、QIAprep Genomic-tip System (Qiagen社製)を用いて細胞内ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ａ）と記すこともある。）を得た。

（１−２）野生型還元酵素の遺伝子（即ち、野生型遺伝子）を含有するベクターの調製（ベクターｐＴｒｃＲｙｆの構築）
（１）本発明ベクターの調製
配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、前記染色体ＤＮＡ（Ａ）を鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PLUS PCR Systemを使用)

［反応液組成］
ｃＤＮＡライブラリー原液１μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）４μｌ
センスプライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）０．４μｌ
５ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈＭｇＣｌ）１０μｌ
Expand High Fidelity PLUS Taq polymerase ０．５μｌ（２．５Ｕ）
超純水３３．７μｌ

［反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃（０．２５分間）‐５５℃（０．５分間）‐７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９４℃（０．２５分間）‐５５℃（０．５分間）‐７２℃（１．０分間＋５秒／サイクル）のサイクルを２０回行い、更に７２℃で７分間保持した。

得られたＰＣＲ反応液を一部とり、これをアガロースゲル電気泳動に供したところ、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
残りのＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）を加え、約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）により２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。

このようにして精製して得られた２種の酵素消化ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションした後、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
形質転換処理されたE．coli DH5αを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養した。形成されたコロニーを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。得られた培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドの各々の一部をNcoIとXbaIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、酵素消化物を電気泳動に供したところ、取り出されたプラスミドには前記約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドを「ベクターｐＴｒｃＲＹＦ」と記す。）

実施例２（補酵素再生酵素の遺伝子の調製）
（２−１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを調製するための準備
Bacillus megaterium ＩＦＯ１２１０８株を、滅菌したＬＢ培地１００ｍｌ中で培養することにより、菌体０．４ｇを得た。得られた菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属のマニュアルに記載された方法に従って染色体ＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡ（Ｂ）と記す。）を精製した。

（２−２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製
The Journal of Biological Chemistry Vol.264, No.11, 6381-6385(1989)に記載されたBacillus megaterium ＩＷＧ３由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を基にして、配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを合成した。
配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーとし、且つ、前記染色体ＤＮＡ（Ｂ）を鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。(ロシュ・ダイアグノスティック社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用)

［反応液組成］
染色体ＤＮＡ原液１μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ）０．４μｌ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）各０．７５μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈＭｇＣｌ）５μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ（３．５ｘ１０３Ｕ／ｍｌ）０．３７５μｌ
超純水４１．７２５μｌ

［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回、更に７２℃で７分間保持した。

得られたＰＣＲ反応液を一部とり、これをアガロースゲル電気泳動に供したところ、約９５０ｂｐのＤＮＡ断片のバンドが検出された。
得られたＰＣＲ反応液とInvitrogen社製TOPOTMTA cloningキットVer.Eとを用いて、ＰＣＲにより得られた約９５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR Product挿入サイト」にライゲーションした後、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
形質転換処理されたE．coli DH5αを、Ｘ−ｇａｌ４％水溶液３０μｌ及び０．１Ｍ IPTG３０μｌが塗布された、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養した。形成されたコロニーのうち白いコロニーを１個とり、このコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３０℃、２４時間）。得られた培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドの一部を制限酵素（EcoRI）で消化した後、酵素消化物を電気泳動に供したところ、取り出されたプラスミドには前記約９５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、このプラスミドを「ベクターｐＳＤＧＤＨ１２」と記す。）

次に、ベクターｐＳＤＧＤＨ１２に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果を配列番号８に示す。尚、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いてベクターｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。

得られたベクターｐＳＤＧＤＨ１２のＤＮＡを２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ）により２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。一方、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ）により２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。

このようにして精製して得られた２種の酵素消化ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションした後、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換した。
形質転換処理されたE．coli DH5αを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養した。形成されたコロニーを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。得られた培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。取り出されたプラスミドの各々の一部をＢａｍＨＩとＸｂａＩとの２種類の制限酵素により２重消化した後、酵素消化物を電気泳動に供したところ、取り出されたプラスミドには前記約９５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。以下、このプラスミドを「ベクターｐＴｒｃＳＤＧＤＨ１２」と記す。

実施例３（本発明遺伝子の作製：部位特異的変異の導入）
（３−１）部位特異的変異導入操作
配列番号２で示される塩基配列を基にして、２５番目のスレオニンを、セリンに変換するための変異プライマーとして、配列番号５、９に示すように、各アミノ酸に対応する各種合成オリゴヌクレオチド（変異プライマー）を合成した。アミノ酸置換部位と対応する配列番号及び塩基配列を表１に示す。

配列番号５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（１−２）で精製されたベクターｐＴｒｃＲＹＦを鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ａ）と記す。

［反応液組成］
ｐＴｒｃＲＹＦベクター溶液１．７μｌ
ｄＮＴＰｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属）１μｌ
センスプライマー（５０μＭ）０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属）５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ（上記Ｋｉｔに付属）１μｌ
超純水４１．５μｌ

［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。

得られたＰＣＲ反応液（Ａ）に、ＤｐｎＩｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αを形質転換した。

（３−２）変異体の塩基配列決定
（３−１）で得られた形質転換体の各々からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（本発明ベクターであるＴ２５Ｓ）を含有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を取得した。

実施例４本発明遺伝子及び補酵素再生酵素遺伝子を含有する形質転換体の調製（ベクターｐＴｒｃＴ２５Ｓ／Ｇ（本発明）の構築）

（４−１）ベクターｐＴｒｃＴ２５Ｓ／Ｇ（本発明）の調製
配列番号３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ＮｃｏＩ含む）と配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ＢａｍＨＩ含む）とをプライマーに用いて、前記（６−３）で精製された変異型遺伝子を含むベクターＴ２５ＳＷ２７ＲＧ５６ＣＶ１１５Ｉを鋳型にして、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行う。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲＳｙｓｔｅｍを使用）

［反応液組成］
鋳型ベクター液１μｌ
ｄＮＴＰ−ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属）１μｌ
センスプライマー（５０μＭ）０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）０．４μｌ
５ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属）１０μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ（上記Ｋｉｔに付属）０．５μｌ
超純水３６．７μｌ

［ＰＣＲ反応条件］
上記反応液組成の反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃（１０秒間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１分間）のサイクルを２５回した後、７２℃で７分間保持する。

ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）により２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。一方、ベクターｐＴｒｃＳＤＧＤＨ１２を２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）により２重消化した後、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製する。

このようにして精製して得られた２種の酵素消化ＤＮＡ断片の各々を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションした後、得られたライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換する。
形質転換処理されたE．coli DH5αを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養する。形成されたコロニーを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養する（３７℃、２４時間）。得られた培養菌体の各々からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出す。取り出されたプラスミドの各々の一部をＮｃｏＩとＢａｍＨＩとの２種類の制限酵素により２重消化した後、酵素消化物を電気泳動に供し、取り出されたプラスミドには前記約１０００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認する。以下、このベクターを「ベクターｐＴｒｃＴ２５Ｓ／Ｇ」（本発明）と記す。

実施例５（本発明酵素の熱安定性）
実施例３で得られた本発明形質転換体を、０．１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、これを３７℃で２４時間振盪培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（８０００×ｇ、５分）することにより、沈殿として湿菌体を回収した。回収された湿菌体に１ｍｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えた後、得られた混合物に含まれる菌体をガラスビ−ズを用いて破砕した。得られた破砕液を遠心分離（１２０００×ｇ、１０分）することにより、上清液を粗酵素液として得た。
得られた粗酵素液の還元酵素活性が略同じになるように、粗酵素液を０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した後、５０℃及び５５℃で１時間保温した後、残存する還元酵素活性を測定した。測定された還元酵素活性の値を、４℃で保存された本発明酵素の還元酵素活性の値（対照）を１００％とした相対値（還元酵素活性の残存率）を算出した。
尚、還元酵素活性の測定方法は、以下のとおりであった。基質として２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを用いた。具体的には、２．７ｍＭの２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル液を１５０μｌ、希釈した粗酵素液を１０μｌ、０．５ｍＭのＮＡＤＰＨ液を４０μｌ、を混合した。得られた混合物を３０℃で保温した後、得られた反応液中で消費されたＮＡＤＰＨ量を、当該反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定した。還元酵素活性は１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨを酸化させる酵素量を１ユニットとした。その結果を表５に示す。

実施例６（本発明酵素の熱安定性）
実施例３で得られたベクターｐＴｒｃＴ２５Ｓを含むＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、これを３０℃で２４時間振盪培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（８０００×ｇ、１０分）することにより、沈殿として湿菌体を０．９g回収した。
２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルを０．５ｇ、前記の湿菌体を０．９ｇ、ＮＡＤＰ^＋を１．０ｍｇ、グルコースを０．７５ｇ、グルコース脱水素酵素を２．５ｍｇ（１８６ユニット）（アマノエンザイム社製）、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１０ｍｌ及び酢酸ブチル２．５ｇを混合し、当該混合物を３０℃で１６．５時間攪拌した。その結果、２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルを５２６ｍｇ得た。得られた２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの光学純度を測定したところ（Ｒ）体が１００％ｅ．ｅ．であった。

（含量分析条件）
カラム：ＤＢ−１（０．５３ｍｍ×３０ｍ、１．５μｍ）（Ｊ＆ＷＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
カラム温度：５０℃（０分）→４℃／分→１７０℃（０分）→３０℃／分→２９０℃（４分）
キャリアーガス：ヘリウム（カラム流量：１０ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ

（光学純度測定条件）
カラム：Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｄｅｘ−ＣＢ（０．３２ｍｍ×２５ｍ、０．２５μｍ）（アステック社製）
カラム温度：１００℃（０分）→２℃／分→１８０℃（０分）
キャリアーガス：ヘリウム（圧力５５Ｋｐａ）
検出器：ＦＩＤ
スプリット比：１/５０
尚、生成物の絶対立体配置は（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルの標品と比較することにより決定する。

［配列表フリ−テキスト］

配列番号：３に記載される塩基配列は、野生型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマー
配列番号：４に記載される塩基配列は、野生型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマー
配列番号：５に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマー
配列番号：６に記載される塩基配列は、補酵素再生酵素の遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマー
配列番号：７に記載される塩基配列は、補酵素再生酵素の遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマー
配列番号：９に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマー
配列番号：１０に記載される塩基配列は、変異型遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用プライマ−

Claims

配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンがセリンに置換されるアミノ酸変異を含む１つ以上のアミノ酸変異（但し、５６番目のグリシンがシステインに置換されるアミノ酸変異と１１５番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異と２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と４２番目のヒスチジンがロイシンに置換されるアミノ酸変異とのいずれのアミノ酸変異も含まない。）を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素。
請求項１記載の酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
請求項２記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。
酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有することを特徴とする請求項３記載のベクター。
請求項２記載のポリヌクレオチド又は請求項３若しくは４記載のベクターを含有することを特徴とする形質転換体。
２−オキソ−４−フェニル酪酸エステルに、請求項５記載の形質転換体又はその処理物を作用させる工程を含むことを特徴とする（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エステルの製造方法。
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２５番目のスレオニンをセリンに置換する工程を含むことを特徴とする方法。但し、５６番目のグリシンをシステインに置換する工程と１１５番目のバリンをイソロイシンに置換する工程と２７番目のトリプトファンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異と４２番目のヒスチジンをロイシンに置換する工程とのいずれの工程も含まない。
配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、７３番目から７５番目までの、スレオニンをコードするコドンを、セリンをコードするコドンに置換する工程を含むことを特徴とする方法。但し、１６６番目から１６８番目までの、グリシンをコードするコドンを、システインをコードするコドンに置換する工程と３４３番目から３４５番目までの、バリンをコードするコドンを、イソロイシンをコードするコドンに置換する工程と７９番目から８１番目までの、トリプトファンをコードするコドンを、アルギニンをコードするコドンに置換する工程と１２４番目から１２６番目までの、ヒスチジンをコードするコドンを、ロイシンをコードするコドンに置換する工程とのいずれの工程も含まない。