CN102906261A

CN102906261A - 突变型还原酶

Info

Publication number: CN102906261A
Application number: CN201180024089XA
Authority: CN
Inventors: 朝子弘之
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2010-03-15
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2013-01-30
Also published as: WO2011115288A1

Abstract

本发明提供包含这样的氨基酸序列并且具有良好的热稳定性的还原酶及其他，在所述氨基酸序列中，野生型还原酶的氨基酸序列中的特定氨基酸被其他特定的氨基酸置换。

Description

突变型还原酶

技术领域

本发明涉及突变型还原酶及其他。

背景技术

本发明涉及修饰的还原酶(其是具有使底物还原的能力的酶)、编码其的多核苷酸及其应用，所述还原酶可以用于还原反应，尤其是用于α-酮酸的还原反应。

还原酶具有使底物还原的能力，并且近年来，其已经用于生产例如用作药物或农药的活性成分的化合物、或其中间体、并且特别是光学活性化合物或其中间体的有机合成反应。作为这样的还原酶，例如，包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列且具有使底物还原的能力的酶(野生型还原酶)是已知的(例如，参见EP1762625A1)。

这样的还原酶，在工业上用于生产光学活性化合物或其中间体等，其需要具有下述特性：在使用该酶的还原反应中反应产物的光学纯度高，该酶对底物的绝对构型具有高识别能力，并且该酶在诸如温度、pH、溶剂和压力的各种反应条件下具有高稳定性。特别地，如果还原酶具有针对温度的高稳定性(即，热稳定性)，则升高反应温度将是可能的。因此，高的热稳定性可以不仅引起反应速率升高而且减少反应过程中还原酶的失活(例如，参见Applied Microbiology Biotechnology，80，805-812(2008))。

发明内容

在这样的情形中，强烈需要研发具有良好的热稳定性的还原酶以便缩短反应时间并且提高反应效率。

本发明提供还原酶，所述还原酶包含在特定的野生型还原酶的氨基酸序列中特定的氨基酸用不同的特定氨基酸置换的氨基酸序列并且具有良好的热稳定性(即，修饰的还原酶)。

具体地，本发明提供下述1)至41)。

1)酶，

所述酶包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括下述氨基酸突变：位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，或位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；并且

所述酶具有使底物还原的能力；

2)酶，

所述酶包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变；并且

所述酶具有使底物还原的能力(以下在一些情形中还称为本发明的酶1)；

3)根据上述2)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；

4)根据上述2)或3)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；

5)根据上述2)至4)中任一项所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

6)根据上述2)至5)中任一项所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

7)根据上述2)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变选自下述氨基酸突变组1：

<氨基酸突变组1>

(1-1)下述两个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；

(1-2)下述两个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；

(1-3)下述两个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

(1-4)下述两个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

(1-5)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；

(1-6)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

(1-7)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

(1-8)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

(1-9)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

(1-10)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

(1-11)下述四个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

(1-12)下述四个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

(1-13)下述四个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

(1-14)下述四个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和

(1-15)下述五个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(d)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(e)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

8)包含编码上述2)至7)中任一项所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸1)；

9)酶，

所述酶包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，但不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变；并且

所述酶具有使底物还原的能力(以下在一些情形中还称为本发明的酶2)；

10)根据上述9)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；

11)根据上述9)或10)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

12)根据上述9)至11)中任一项所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

13)根据上述11)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变选自下述氨基酸突变组2：

<氨基酸突变组2>

(2-1)下述两个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；

(2-2)下述两个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

(2-3)下述两个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

(2-4)下述三个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

(2-5)下述三个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

(2-6)下述三个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和

(2-7)下述四个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

14)包含编码上述11)至13)中任一项所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸2)；

15)酶，

所述酶包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，但是既不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，也不包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；并且

所述酶具有使底物还原的能力(以下在一些情形中还称为本发明的酶3)；

16)根据上述15)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

17)根据上述15)或16)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

18)根据上述15)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变选自下述氨基酸突变组3：

<氨基酸突变组3>

(3-1)下述两个氨基酸突变：(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

(3-2)下述两个氨基酸突变：(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和

(3-3)下述三个氨基酸突变：(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

19)包含编码上述15)至18)中任一项所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸3)；

20)酶，

所述酶包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述任何氨基酸突变：位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；并且

所述酶具有使底物还原的能力(以下在一些情形中还称为本发明的酶4)；

21)根据上述20)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

22)根据上述20)所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变是下述两个氨基酸突变：(a)位置42的组氨酸变为亮氨酸的氨基酸突变，和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

23)包含编码上述20)至22)中任一项所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸4)；

24)酶，

所述酶包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述氨基酸任何突变：位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；并且

所述酶具有使底物还原的能力(以下在一些情形中还称为本发明的酶5)；

25)包含编码上述24)所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸5)；

26)包含上述8)，14)，19)，23)，或25)所述的多核苷酸的载体(以下在一些情形中还称为本发明的载体)；

27)根据上述26)所述的载体，所述载体还包含下述多核苷酸，所述多核苷酸包含编码下述蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，所述蛋白具有将氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为其还原形式的能力；

28)包含上述8)，14)，19)，23)或25)所述的多核苷酸或上述26)或27)所述的载体的转化体(以下在一些情形中还称为本发明的转化体)；

29)生产(R)-2-羟基-4-苯基丁酸酯的方法，所述方法包括允许上述28)所述的转化体或其处理的产物作用在2-氧代-4-苯基丁酸酯上的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的生产方法)；

30)修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括下述步骤：在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，将位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，将位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，将位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤，或将位置25的苏氨酸置换为丝氨酸的步骤；

31)修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的修饰酶的方法1)；

32)修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，但不包括将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的修饰酶的方法2)；

33)修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，但是既不包括将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，也不包括将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的修饰酶的方法3)；

34)修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤，但是不包括下述任何步骤：将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，和将所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的修饰酶的方法4)；

35)修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸置换为丝氨酸的步骤，但是不包括下述任何步骤：将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，和将所述氨基酸序列中位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤(以下在一些情形中还称为本发明的修饰酶的方法5)；

36)修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括：

将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤；

将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤；

将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤；

将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的步骤；或

将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75处编码苏氨酸的密码子置换为编码丝氨酸的密码子的步骤；

37)修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤(以下在一些情形中还称为本发明用于修饰多核苷酸的方法1)；

38)修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，但不包括将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤(以下在一些情形中还称为本发明用于修饰多核苷酸的方法2)；

39)修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤，但是既不包括将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，也不包括将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤(以下在一些情形中还称为本发明用于修饰多核苷酸的方法3)；

40)修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的步骤，但是不包括下述任何步骤：将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，和将核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤(以下在一些情形中还称为本发明用于修饰多核苷酸的方法4)；以及

41)修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75处编码苏氨酸的密码子置换为编码丝氨酸的密码子的步骤，但是不包括下述任何步骤：将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤，和将所述核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的步骤(以下在一些情形中还称为本发明用于修饰多核苷酸的方法5)。

根据本发明，可以提供具有良好的热稳定性的还原酶，该还原酶用于生产用作药物或农药的活性成分的化合物、其中间体等、并且特别是光学活性化合物或其中间体及其他的有机合成反应。在上述反应中使用本发明的酶，减少反应时间并且提高反应效率将变得可能。

实施本发明的方式

本说明书中所述的发明不限于本文所述的具体的方法、流程和试剂，认为其是可以更改的。另外，本说明书中所用的术语仅用于描述具体的实施方案，并且它们不意欲限制本发明的范围。

本说明书中所用的所有的技术术语和化学数据具有与本发明所属的领域技术人员通常所理解的意思相同的意思，除非另外指明。与本说明书所述的那些方法和材料相似或等价的任何方法和材料都可以用来实施或检验本发明。下文将描述优选的方法、装置和材料。

以下，将更详细地描述本发明。

在本申请中，例如，术语“G56C”意指包含除了具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56(“56”是从所述氨基酸序列的N端数起的位置号)的甘氨酸(“G”是表示甘氨酸的单个字母)置换为半胱氨酸(“C”是表示半胱氨酸的单个字母)的氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的酶。

例如，术语“V115I”用来意指包含除了具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115(“115”是从所述氨基酸序列的N端数起的位置号)的缬氨酸(“V”是表示缬氨酸的单个字母)置换为异亮氨酸(“I”是表示异亮氨酸的单个字母)的氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的酶。

例如，术语“W27R”用来意指包含除了具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27(“27”是从所述氨基酸序列的N端数起的位置号)的色氨酸(“W”是表示色氨酸的单个字母)置换为精氨酸(“R”是表示精氨酸的单个字母)的氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的酶。

例如，术语“H42L”用来意指包含除了具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42(“42”是从所述氨基酸序列的N端数起的位置号)的组氨酸(“H”是表示组氨酸的单个字母)置换为亮氨酸(“L”是表示亮氨酸的单个字母)的氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的酶。

例如，术语“T25S”用来意指包含除了具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置25(“25”是从所述氨基酸序列的N端数起的位置号)的苏氨酸(“T”是表示苏氨酸的单个字母)置换为丝氨酸(“S”是表示丝氨酸的单个字母)的氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的酶。

本发明的酶的“使底物还原的能力”(以下还称为还原酶活性)可以通过将所述酶与作为底物的α-酮酸(其中具体的实例是乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯)和NADPH在存在水的条件下混合，然后在30℃温育该混合物，然后利用反应溶液在340nm的吸光度作为指标来定量所得到的反应溶液中消耗的NADPH的量而测量。

在本发明中，术语“良好的热稳定性”用来意指，例如，在50℃进行温育处理1小时后特定的还原酶残余的还原酶活性比率高于以上述相同方式处理的野生型还原酶残余的还原酶活性比率。

本发明的酶包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，所述一个或多个氨基酸突变包括下述氨基酸突变：位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，或位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。

本发明的酶1包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。

本发明的酶2包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。

本发明的酶3包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述氨基酸突变：位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，和位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。

本发明的酶4包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述氨基酸突变：位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。

本发明的酶5包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述氨基酸突变：位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；并且具有使底物还原的能力。

应该注意到，包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶(即，野生型还原酶)是已知的来源于商购的Yamadazymafarinosa IFO 0193菌株(其可从国家技术和评估学会(一个独立的行政机构)获得)。

为了得到包含编码本发明的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为本发明的多核苷酸)，例如，可以使用下述方法：

首先，得到包含编码野生型还原酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中还称为野生型多核苷酸)。例如，按照在由ColdSpring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)1989年出版的J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis；Molecular Cloning 2nd edition(分子克隆第2版)中所述的常规基因工程方法，可以从Yamadazyma farinosa IFO 0193菌株得到这样的野生型多核苷酸。具体地，按照“Shin-Saibo Kogaku JikkenProtocols(New Cell Engineering Experimental Protocols(新细胞工程实验方法))”(由东京大学(University of Tokyo)医学院肿瘤学系、ShujunshaCo.，Ltd.1993年编写)所述的方法，由Yamadazyma farinosa IFO 0193菌株制备cDNA文库。使用所制备的cDNA文库作为模板，并且还使用适当的引物，进行PCR，以扩增包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，包含编码关于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸缺失、置换或添加的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸，包含关于SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有一个或多个核苷酸缺失、置换或添加的核苷酸序列的多核苷酸等，由此制备本发明的多核苷酸。

此处，如果使用来源于Yamadazyma farinosa IFO 0193菌株的cDNA文库作为模板并且还使用包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR，则扩增包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸。通过回收所扩增的多核苷酸，可以制备包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)。

随后，按照定点诱变，向包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)中引入特定的定点突变，从而制备本发明的多核苷酸。上述定点突变包括：

将编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的定点突变；

将编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的定点突变；

将编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的定点突变；

将编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的定点突变；和

将编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75处编码苏氨酸的密码子置换为编码丝氨酸的密码子的定点突变。

本文所用的“定点诱变”的实例包括：Olfert Landt等人.(Gene(基因)96，125-128，1990)，Smith等人.(Genetic Engineering(基因工程)31Setlow，J.和Hollaender，A Plenum：New York)，Vlasuk等人.(Experimental Manipulation of Gene Expression(基因表达的实验操作)，Inouye，M.：Academic Press，New York)，Hos.N.Hunt等人.(Gene 77，51，1989)等的方法；和商购试剂盒如Mutan-Express Km(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)、TaKaRa La PCR体外诱变试剂盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)和QuickChange II定点诱变试剂盒(由Stratagene Corporation制造)的应用。

具体地，为了制备编码除在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一个或多个氨基酸突变包括将位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的氨基酸突变，例如，通过使用Olfert Landt等人.(Gene(基因)96，125-128，1990)的方法制备，首先，按照例如由Cold Spring HarborLaboratory(冷泉港实验室)1989年出版的J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis；Molecular Cloning 2nd edition(分子克隆第2版)中所述的方法制备包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)。

然后，将得到的载体(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含编码在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列的寡核苷酸)作为一条引物，并且还使用包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的寡核苷酸作为另一条引物，通过PCR扩增DNA片段。关于PCR反应的条件，例如，进行在94℃温育5分钟，然后，进行在94℃温育1分钟、然后50℃2分钟、然后75℃3分钟的进行20个循环。最后，进行在75℃温育8分钟。纯化这样扩增的DNA片段。然后，将包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)和包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后将这样消化的片段连接到包含含有SEQID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)中，所述载体(DNA)已经进行了用限制酶的相同消化，从而得到本发明所需要的多核苷酸1。

本发明的酶1的氨基酸序列在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸突变，例如，1-5个氨基酸突变，优选2-5个氨基酸突变，更优选3-5个氨基酸突变，特别优选4或5个氨基酸突变，或5个氨基酸突变。本发明的酶1的氨基酸序列可以不仅包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，而且还包括其他氨基酸突变，例如，1-4个其他氨基酸突变，优选2-4个其他氨基酸突变，更优选3或4个其他氨基酸突变，或4个其他氨基酸突变。

上述“其他氨基酸突变”的实例包括：(1)在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；(2)在SEQ IDNO：1的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(3)在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(4)在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

上述“一个或多个氨基酸突变”的实例包括一个氨基酸突变、两个氨基酸突变、三个氨基酸突变、四个氨基酸突变和五个氨基酸突变。

上述“一个氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“一个氨基酸突变”的酶1的具体实例是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸是半胱氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

上述“两个氨基酸突变”的实例包括：(1)下述两个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变；(2)下述两个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(3)下述两个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(4)下述两个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“两个氨基酸突变”的酶1的具体实例包括：(1)包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸和位置115的氨基酸为异亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(2)包含SEQID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸和位置27的氨基酸为精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(3)包含SEQID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和(4)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

上述“三个氨基酸突变”的实例包括：(1)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(2)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(3)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(4)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(5)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和(6)下述三个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样的“三个氨基酸突变”的酶1的具体实例包括：(1)包含SEQID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置27的氨基酸为精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(2)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(3)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(4)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(5)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和(6)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

上述“四个氨基酸突变”的实例包括：(1)下述四个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(2)下述四个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；(3)下述四个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和(4)下述四个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样的“四个氨基酸突变”的酶1的具体实例包括：(1)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(2)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(3)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和(4)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

上述“五个氨基酸突变”的实例是下述五个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(d)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(e)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样的“五个氨基酸突变”的酶1的具体实例是(1)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的氨基酸为半胱氨酸、位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

具体地，为了制备编码除在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，例如，通过使用Olfert Landt等人.(Gene(基因)96，125-128，1990)的方法制备，首先，按照例如由Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)1989年出版的J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis；Molecular Cloning 2nd edition(分子克隆第2版)中所述的方法制备包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)。

然后，将得到的载体(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含编码在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO：17的核苷酸序列的寡核苷酸)作为一条引物，并且还使用包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的寡核苷酸作为另一条引物，通过PCR扩增DNA片段。关于PCR反应的条件，例如，进行在94℃温育5分钟，然后，进行在94℃温育1分钟、然后50℃2分钟、然后75℃3分钟的进行20个循环。最后，进行在75℃温育8分钟。纯化这样扩增的DNA片段。然后，将包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)和包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后将这样消化的片段连接到包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)中，所述载体(DNA)已经进行了用限制酶的相同消化，从而得到本发明所需要的多核苷酸2。

本发明的酶2的氨基酸序列在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸突变，例如，1-4个氨基酸突变，优选2-4个氨基酸突变，更优选3或4个氨基酸突变，或4个氨基酸突变。本发明的酶2的氨基酸序列可以不仅包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，而且还包括其他氨基酸突变，例如，1-3个其他氨基酸突变，优选2或3个其他氨基酸突变，或3个其他氨基酸突变，或4个其他氨基酸突变。

然而，本发明的酶2不包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变。

上述“其他氨基酸突变”的实例包括：(1)在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(2)在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(3)在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

上述“一个或多个氨基酸突变”的实例包括一个氨基酸突变、两个氨基酸突变、三个氨基酸突变和四个氨基酸突变。

上述“一个氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“一个氨基酸突变”的酶2的具体实例是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的氨基酸是异亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

上述“两个氨基酸突变”的实例包括：(1)下述两个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；(2)下述两个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(3)下述两个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“两个氨基酸突变”的酶2的具体实例包括：(1)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置27的氨基酸为精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(2)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和(3)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

上述“三个氨基酸突变”的实例包括：(1)下述三个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；(2)下述三个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和(3)下述三个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“三个氨基酸突变”的酶2的具体实例包括：(1)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；(2)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和(3)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

上述“四个氨基酸突变”的实例是这样的四个氨基酸突变(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样的“四个氨基酸突变”的酶2的具体实例是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的氨基酸为异亮氨酸、位置27的氨基酸为精氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

具体地，为了制备编码除在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，例如，通过使用Olfert Landt等人.(Gene(基因)96，125-128，1990)的方法制备，首先，按照例如由Cold Spring HarborLaboratory(冷泉港实验室)1989年出版的J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis；Molecular Cloning 2nd edition(分子克隆第2版)中所述的方法制备包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)。

然后，将得到的载体(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含编码在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列的寡核苷酸)作为一条引物，并且还使用包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的寡核苷酸作为另一条引物，通过PCR扩增DNA片段。关于PCR反应的条件，例如，进行在94℃温育5分钟，然后，进行在94℃温育1分钟、然后50℃2分钟、然后75℃3分钟的进行20个循环。最后，进行在75℃温育8分钟。纯化这样扩增的DNA片段。然后，将包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)和包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后将这样消化的片段连接到包含含有SEQID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)中，所述载体(DNA)已经进行了用限制酶的相同消化，从而得到本发明所需要的基因3。

本发明的酶3的氨基酸序列在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸突变，例如，1-3个氨基酸突变，优选2或3个氨基酸突变，或3个氨基酸突变。本发明的酶3的氨基酸序列可以不仅包括SEQ IDNO：1的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，而且还包括其他氨基酸突变，例如，1或2个其他氨基酸突变，或2个其他氨基酸突变。

然而，本发明的酶3不包含下述氨基酸突变：SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变和位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变。

上述“其他氨基酸突变”的实例包括：(1)在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(2)在SEQ IDNO：1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

上述“一个或多个氨基酸突变”的实例包括一个氨基酸突变、两个氨基酸突变和三个氨基酸突变。

上述“一个氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“一个氨基酸突变”的酶3的具体实例是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27的氨基酸是精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

上述“两个氨基酸突变”的实例包括：(1)下述两个氨基酸突变：(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；和(2)下述两个氨基酸突变：(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“两个氨基酸突变”的酶3的具体实例包括：(1)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27的氨基酸为精氨酸和位置42的氨基酸为亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶；和(2)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27的氨基酸为精氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

上述“三个氨基酸突变”的实例是下述三个氨基酸突变：(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“三个氨基酸突变”的酶3的具体实例是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27的氨基酸为精氨酸、位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

具体地，为了制备编码除在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，例如，通过使用Olfert Landt等人.(Gene(基因)96，125-128，1990)的方法制备，首先，按照例如由Cold Spring HarborLaboratory(冷泉港实验室)1989年出版的J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis；Molecular Cloning 2nd edition(分子克隆第2版)中所述的方法制备包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)。

然后，将得到的载体(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含编码在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的组氨酸置换为亮氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列的寡核苷酸)作为一条引物，并且还使用包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的寡核苷酸作为另一条引物，通过PCR扩增DNA片段。关于PCR反应的条件，例如，进行在94℃温育5分钟，然后，进行在94℃温育1分钟、然后50℃2分钟、然后75℃3分钟的进行20个循环。最后，进行在75℃温育8分钟。纯化这样扩增的DNA片段。然后，将包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)和包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后将这样消化的片段连接到包含含有SEQID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)中，所述载体(DNA)已经进行了用限制酶的相同消化，从而得到本发明所需要的多核苷酸4。

本发明的酶4的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸突变，例如，1或2个氨基酸突变，并且优选2个氨基酸突变。本发明的酶4的氨基酸序列可以不仅包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，而且还包括其他氨基酸突变，例如，另一个氨基酸突变。

然而，本发明的酶4不包含下述氨基酸突变：位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，和位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变。

上述“其他氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

上述“一个或多个氨基酸突变”的实例包括一个氨基酸突变和两个氨基酸突变。

上述“一个氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“一个氨基酸突变”的酶4的具体实例是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的氨基酸是亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

上述“两个氨基酸突变”的实例是下述两个氨基酸突变：(a)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“两个氨基酸突变”的酶4的具体实例是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的氨基酸为亮氨酸和位置25的氨基酸为丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

具体地，为了制备编码除在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变，例如，通过使用Olfert Landt等人.(Gene(基因)96，125-128，1990)的方法制备，首先，按照例如由Cold Spring HarborLaboratory(冷泉港实验室)1989年出版的J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis；Molecular Cloning 2nd edition(分子克隆第2版)中所述的方法制备包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)。

然后，将得到的载体(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含编码在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸置换为丝氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的寡核苷酸)作为一条引物，并且还使用包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的寡核苷酸作为另一条引物，通过PCR扩增DNA片段。关于PCR反应的条件，例如，进行在94℃温育5分钟，然后，进行在94℃温育1分钟、然后50℃2分钟、然后75℃3分钟的进行20个循环。最后，进行在75℃温育8分钟。纯化这样扩增的DNA片段。然后，将包含含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)和包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通过PCR扩增DNA片段。将扩增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后将这样消化的片段连接到包含含有SEQID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的载体(DNA)中，所述载体(DNA)已经进行了用限制酶的相同消化，从而得到本发明所需要的多核苷酸5。

本发明的酶5的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸突变，例如，1个氨基酸突变。本发明的酶5的氨基酸序列可以不仅包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变，而且还包括其他氨基酸突变。

然而，本发明的酶5不包含下述氨基酸突变：位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变。

上述“一个或多个氨基酸突变”的实例是一个氨基酸突变。

上述“一个氨基酸突变”的实例是SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。本发明具有这样“一个氨基酸突变”的酶5的具体实例是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置25的氨基酸是丝氨酸的氨基酸序列并且具有使底物还原的能力的酶。

为了得到本发明的酶，制备能够在宿主细胞如微生物中表达本发明的多核苷酸的载体。然后，将这样制备的载体引入到要转化其的宿主细胞中，以制备转化体。随后，所制备的转化体可以通过常规的细胞培养方法进行培养。因此，本发明的酶可以大量生产并且可以获得。

本发明的载体包含本发明的多核苷酸。

为了制备本发明的载体，按照常规的基因工程方法，本发明的多核苷酸可以结合在可用于要引入本发明的多核苷酸的宿主细胞的载体中，例如，结合在包含在宿主细胞中可复制的遗传信息的载体中，可以自主复制，可以从该宿主细胞分离或纯化，并且具有可检测的标记(以下在一些情形中还称为基本载体)，由此构建本发明的载体。

本文所用的“基本载体”的实例在使用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主细胞的情形中包括载体pUC119(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)和噬菌粒pBluescript II(由Stratagene Corporation制造)。另外，在使用芽殖酵母作为宿主细胞的情形中，所述基本载体的实例包括载体pGBT9，pGAD424和pACT2(由Clontech Laboratories，Inc.制造)。此外，在使用哺乳动物细胞作为宿主细胞的情形中，所述基本载体的实例包括：载体，如pRc/RSV和pRc/CMV(由Invitrogen制造)；包括自主复制起点的病毒来源的载体，如牛乳头瘤病毒载体pBPV(由Amersham Pharmacia BiotechInc.制造)和EB病毒载体pCEP4(由Invitrogen制造)；以及病毒，如痘苗病毒。此外，在使用昆虫细胞作为宿主细胞的情形中，所述基本载体的实例包括昆虫病毒，如杆状病毒。

如果使用包含自主复制起点的载体(具体地，酵母载体pACT2，牛乳头瘤病毒载体pBPV，EB病毒载体pCEP4等)构建本发明的载体，则当将其引入到宿主细胞中时，所构建的载体在宿主细胞中保持为附加体。

本发明的载体可以进一步包含含有编码具有将氧化的β-腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为其还原形式的能力的蛋自的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。使用这样的载体，还可能制备转化体，所述转化体进一步包含含有编码具有将氧化的β-腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为其还原形式的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。

将能够允许本发明的多核苷酸在宿主细胞如微生物中表达的载体引入到要转化其的宿主细胞中，以制备转化体。随后，所制备的转化体可以通过常规的细胞培养方法进行培养，以致本发明的酶可以大量生产并且可以获得。

能够允许本发明的多核苷酸在诸如微生物的宿主细胞中表达的载体可以这样制备：通过将在诸如微生物的宿主细胞中有功能的启动子以有功能的方式结合到本发明的多核苷酸的上游位点，然后将这样得到的产物结合到上述基本载体中。

表述“以有功能的方式结合……”用在此处意指将启动子与本发明的多核苷酸结合，以使本发明的多核苷酸可以在该启动子的控制下在引入本发明的多核苷酸的宿主细胞(诸如微生物)中表达。在宿主细胞中有功能的启动子的实例是在引入该启动子的宿主细胞中表现出启动子活性的DNA。当宿主细胞是大肠杆菌时，这样的启动子的实例包括大肠杆菌乳糖操纵子启动子(lacP)，色氨酸操纵子启动子(trpP)，精氨酸操纵子启动子(argP)，半乳糖操纵子启动子(galp)，tac启动子，T7启动子，T3启动子，λ噬菌体启动子(λ-pL，λ-pR)。另外，当宿主细胞是动物细胞或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)时，启动子的实例包括劳斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus，RSV)启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子，猿猴病毒(SV40)早期或晚期启动子，和小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子。并且，当宿主细胞是芽殖酵母时，启动子的实例是ADH1启动子(其中所述ADH1启动子可以通过常规的基因工程方法由包含ADH1启动子或终止子的酵母表达载体pAAH5[可获自Washington Research Foundation；Ammerer等人，Method in Enzymology(酶学方法)，101part(p.192-201)]制备)。

此外，当使用原始包含在宿主细胞中有功能的启动子的基本载体时，本发明的多核苷酸可以插入到上述启动子的下游位点，以使上述启动子可以以有功能的方式结合本发明的多核苷酸。例如，当启动子为pRc/RSV，pRc/CMV等时，克隆位点建立在动物细胞中有功能的启动子的下游。将通过将本发明的多核苷酸插入到前述克隆位点中得到的载体引入到动物细胞中，以允许本发明的多核苷酸在所述动物细胞中表达。在这些载体中，先前已经结合了SV40自主复制起点(ori)。因此，如果将这样的载体引入到已经转化了ori-缺陷的SV40基因组的培养的细胞中，如COS细胞中，则在所述细胞中载体的拷贝数显著增加，并且结果，结合在所述载体中的本发明的多核苷酸可以大量表达。并且，前述酵母载体pACT2具有ADH1启动子。因此，如果将本发明的多核苷酸插入到所述载体或其衍生物的ADH1启动子的下游位点，则还可以构建这样的载体，所述载体允许本发明的多核苷酸在芽殖酵母如CG1945(由Clontech Laboratories，Inc.制造)中大量表达。

在使用微生物作为宿主细胞的情形中，微生物的实例包括真核生物和原核生物。优选的实例是大肠杆菌。可以通过按照常规基因工程方法将上述载体引入到宿主细胞中而转化该宿主细胞。

作为将本发明的载体引入到宿主细胞中的方法，取决于所述宿主细胞的类型，可以应用一般的引入方法。当使用大肠杆菌作为宿主细胞时，可以应用一般方法，如Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)1989年出版的J.Sambrook，E.F.Frisch，T.Maniatis；“Molecular Cloning 2ndedition(分子克隆第2版)”中所述的氯化钙法和电穿孔法。另外，当使用哺乳动物细胞或昆虫细胞作为宿主细胞时，可以应用一般的基因转移方法，诸如磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法和脂转染法。并且，当使用酵母作为宿主细胞时，可以应用作为酵母转化试剂盒(由ClontechLaboratories，Inc.制造)等中所用的锂法的一般方法。此外，当使用病毒作为载体时，可以按照上述一般的基因转移方法将病毒基因组引入到宿主细胞中。备选地，还可以通过用包含已经插入了本发明的基因的病毒基因组的病毒粒子感染宿主细胞而将这样的病毒基因组引入到所述宿主细胞中。

为了选择本发明的转化体，例如，其中与本发明的载体同时引入了标记基因的宿主细胞可以通过适于所述标记基因的特性的方法进行培养。例如，当所述标记基因是赋予对所选的药物的药物抗性的基因时，所述所选的药物对宿主细胞表现出致死活性，其中已经引入了本发明的载体的宿主细胞可以在添加了所述所选药物的培养基中培养。赋予药物抗性的基因与所选药物的这样的组合的实例包括新霉素抗性-赋予基因和新霉素的组合，潮霉素抗性-赋予基因和潮霉素的组合，以及杀稻瘟素S抗性-赋予基因和杀稻瘟素S的组合。并且，当所述标记基因是补充宿主细胞的营养缺陷的基因时，其中已经引入了本发明的载体的细胞可以在不包含与所述营养缺陷相对应的营养物的最低培养基中培养。此外，当引入能够允许本发明的多核苷酸在宿主细胞中表达的本发明的载体时，也可以应用基于本发明的酶的酶活性的检测方法。

为了获得本发明的转化体，例如，其中本发明的多核苷酸位于宿主细胞的染色体中，首先将本发明的载体和包含标记基因的载体用限制酶等消化以使其转化为线性形式。然后，将这些线性形式通过上述方法引入到宿主细胞中。随后，一般将宿主细胞培养数周，并且可以基于所引入的标记基因的表达水平选择目的转化体，然后可以得到目的转化体。备选地，将包含赋予上述所选的药物抗性的基因作为标记基因的本发明的载体通过上述方法引入到宿主细胞中。随后，将所述细胞在添加了所选药物的培养基传代培养数周或更多周，然后，将以群落形式存活的所选药物抗性-克隆进行纯化培养，以选择并且得到本发明的转化体，其中本发明的多核苷酸被引入到所述宿主细胞的染色体中。为了验证所引入的本发明的多核苷酸已经结合到宿主细胞的染色体中，可以按照常规基因工程方法制备细胞的基因组DNA。然后，可以按照其中使用本发明的基因的部分核苷酸序列作为引物或探针的PCR、Southern杂交等在所制备的基因组DNA中检测本发明的基因的存在。本转化体可以以冷冻状态保存，并且需要时，可以将其融化并使用。因此，可以省略为每次实验制备转化体的操作，并且还可以使用其特性和处理条件已经提前验证的转化体进行检测。

包含本发明的多核苷酸或本发明的载体的转化体(即，本发明的转化体)可以按照常规细胞培养方法进行培养。

当本发明的转化体是微生物时，例如，其可以在各种类型的培养基中培养，所述培养基适当地包含通常在微生物的常规培养中所用的碳源、氮源、有机盐或无机盐等。

碳源的实例包括：糖如葡萄糖、糊精和蔗糖；糖醇如甘油；有机酸如延胡索酸、柠檬酸和丙酮酸；动物油；植物油；和糖蜜。这样的碳源通常以基于培养液的总体积约0.1％(w/v)至30％(w/v)的量添加到培养基中。

氮源的实例包括：天然有机氮源，如肉提取物，蛋白胨，酵母提取物，麦芽提取物，大豆粉，玉米浆(corn steep liquor)，棉籽粉，干酵母和酪蛋白氨基酸；无机酸如氨基酸的铵盐和硝酸钠；无机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵和磷酸铵；有机酸的铵盐如延胡索酸铵和柠檬酸铵；和尿素。这些物质中，有机酸的铵盐、天然有机氮源、氨基酸等在多种情形中也可以用作碳源。这样的氮源通常以基于培养液的总体积约0.1％(w/v)至30％(w/v)的量添加到培养基中。

有机盐和无机盐的实例包括：如钾、钠、镁、铁、锰、钴和锌的氯化物；硫酸盐；乙酸盐；碳酸盐；和磷酸盐。具体的实例包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁，硫酸锰，氯化钴，硫酸锌，硫酸铜，乙酸钠，碳酸钙，磷酸二氢钾，和磷酸氢二钾。这样的有机盐和/或无机盐通常以基于培养液的总体积约0.0001％(w/v)至5％(w/v)的量添加到培养基中。

此外，在用这样的基因转化的转化体的情形中，在所述基因中，别乳糖-诱导型启动子如tac启动子、trc启动子或lac启动子与本发明的多核苷酸可操作性连接，例如，可以向培养基中加入少量的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂用于诱导本发明的酶的生产。

本发明的转化体可以按照培养诸如微生物的宿主细胞中常规所用的方法进行培养。培养方法的实例包括：液体培养如试管震荡培养，往复振荡培养，发酵罐培养和池培养；和固体培养。

培养的温度可以在转化体可以生长的范围内适当变化。通常为约15℃至约40℃。培养基的pH优选在约pH 6至约pH 8的范围内。培养时间取决于培养条件而不同。通常，优选为约1天至约5天。

作为从本发明的转化体的培养产物中纯化本发明的酶的方法，可以应用蛋白的常规纯化中所用的方法，例如，可以应用下述方法。

首先，通过离心等从转化体的培养产物收集细胞。然后，通过物理分解法如超声波处理、Dyno-磨处理(Dyno-mill treatment)和弗氏细胞压碎器处理或通过用表面活性剂或裂解酶如溶菌酶的化学分解法或通过其他方法将所收集的细胞分解。通过离心、膜滤器过滤等将杂质从得到的分解的细胞溶液中去除，以制备不含细胞的提取物，并且然后将制备的提取物通过适当的分离和纯化方法如阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水性层析、凝胶过滤层析和金属螯合层析分级，以纯化本发明的酶。

层析中所用的载体(carrier)的实例包括不溶的聚合物载体，诸如其中已经引入羧甲基(CM)基团、二乙基氨基乙基(DEAE)基团、苯基基团或丁基基团的纤维素，糊精或琼脂糖。也可以用商购的载体-填充柱。这样的商购的载体-填充柱的实例包括Q-Sepharose FF，苯基Sepharose HP(商品名，由Amersham Pharmacia Biotech K.K.制造)和TSK-凝胶G3000SW(商品名，由Tosoh Corporation制造)。

当选择包含本发明的酶的级分时，可以基于存在或不存在本发明的还原酶活性或其程度选择所述级分。还可以通过测量不对称地还原作为底物的α-酮酸(具体为乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯等)以及优先产生相对应的羟酸的能力而选择所述级分。

本发明的生产方法包括允许本发明的转化体或其处理的产物作用在2-氧代-4-苯基丁酸酯上的步骤。

2-氧代-4-苯基丁酸酯的一个实例是由下式(1)所示的化合物：

[式1]

其中R¹表示C1-C8烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基或辛基。

2-氧代-4-苯基丁酸酯的具体实例包括甲基2-氧代-4-苯基丁酸酯，乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯，丙基2-氧代-4-苯基丁酸酯，和辛基2-氧代-4-苯基丁酸酯。例如，这些酯可以通过Tetrahedron(1985)，41(2)，467-72所述的方法或其等价的方法制备。

(R)-2-羟基-4-苯基丁酸酯的一个实例是(R)-2-羟基-4-苯基丁酸的C1-C8烷基酯化合物，其中由式(1)所示的化合物的2-位的氧代基团被不对称地还原成羟基基团。

上述方法通常在存在水和还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下在一些情形中还称为NADH)或还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下在一些情形中还称为NADPH)的条件下进行。在该步骤中所用的水可以是缓冲的水溶液。用于所述缓冲的水溶液的缓冲剂的实例包括：碱金属磷酸盐如磷酸钠和磷酸钾；碱金属乙酸盐如乙酸钠水溶液和乙酸钾；以及它们的混合物。

在上述方法中，有机溶剂可以与水共存。可以与水共存的有机溶剂的实例包括：醚类，如叔丁基甲醚、二异丙醚和四氢呋喃；酯类，如甲酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯和丙酸丁酯；烃类，如甲苯、己烷、环己烷、庚烷和异辛烷；醇类，如甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇和叔丁醇；有机硫化合物，如二甲亚砜；酮类，如丙酮；腈类，如乙腈；以及它们的混合物。

进行上述方法中的反应，例如，在需要时进一步包含有机溶剂等的条件下，通过搅拌、震荡等混合水、2-氧代-4-苯基丁酸酯和NADH或NADPH以及本发明的酶、生产本发明的酶的转化体、或其处理的产物而进行。

可以适当选择在上述方法的反应过程中的pH。通常在pH 3-10的范围内。可以适当选择反应温度。从原料和产物的稳定性以及反应速率来看，通常在0℃至60℃的范围内。

反应的终点可以通过液相色谱等追踪反应溶液中的2-氧代-4-苯基丁酸酯的量而确定。可以适当选择反应时间。通常在0.5小时至10天的范围内。

可以通过通常已知的方法从反应溶液回收(R)-2-羟基-4-苯基丁酸酯。

从反应溶液回收(R)-2-羟基-4-苯基丁酸酯的方法的实例是通过将反应溶液进行诸如有机溶剂萃取和浓缩的后处理而纯化反应溶液的方法，需要时，后处理与柱层析、蒸馏等组合。

本发明的酶、生产其的转化体、或其处理的产物可以以各种形式用在上述方法中。

具体形式的实例包括本发明的转化体的培养产物、所述转化体的处理的产物、不含细胞的提取物、粗纯化的蛋白、纯化的蛋白、及其固定的产物。此处，所述转化体的处理的产物的实例包括冻干的转化体、有机溶剂-处理的转化体、干转化体、转化体-分解的产物、转化体的自溶产物、转化体的超声波-处理的产物、转化体提取物、和转化体的碱-处理的产物。得到的固定的产物的方法的实例包括载体结合(bonding)法(其是将本发明的酶等吸附到无机载体如硅胶或陶瓷、纤维素、离子交换树脂上的方法)和截留法(其是将本发明的酶等截留在聚合物的网络结构中的方法，所述聚合物诸如聚丙烯酰胺、含硫的多糖凝胶(例如，交叉菜聚糖凝胶)、海藻酸凝胶、琼脂凝胶等)。

对于使用本发明的转化体的工业生产，使用杀死的转化体的产物的方法比使用未处理的转化体的方法更优选，因为前一种方法对生产仪器的限制很少。对于这一目的，杀死的方法的实例包括物理杀菌法(加热、干燥、冷冻、光线、超声波、过滤和配电)，以及使用化学药物(碱、酸、卤素、氧化剂、硫磺、硼、砷、金属、醇、苯酚、胺、硫化物、醚、醛、酮、氰基(cyan)和抗生素)的杀菌法。通常，需要从前述杀菌方法中选择这样的处理方法，所述方法以尽可能低的水平使本发明的酶的还原酶活性失活，并且对反应系统的影响很小，诸如残留的作用和污染。

本发明的生产方法在存在NADH或NADPH的条件下进行，并且随着2-氧代-4-苯基丁酸酯的不对称还原反应的进展，NADH或NADPH被转化为氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下称为NAD⁺)或氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下称为NADP⁺)。作为转化的结果产生的NAD⁺或NADP⁺可以通过具有将NAD⁺或NADP⁺转化为其还原形式(NADH或NADPH)的能力的蛋白恢复为初始的NADH或NADPH。因此，在上述方法中，这样具有将NAD⁺或NADP⁺转化为NADH或NADPH的能力的蛋白可以在反应系统中共存。

这样具有将NAD⁺或NADP⁺转化为NADH或NADPH的能力的蛋白的实例包括葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、氨基酸脱氢酶和有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)。

当具有将NAD⁺或NADP⁺转化为NADH或NADPH的能力的蛋白是葡萄糖脱氢酶时，在一些情形中，该蛋白的活性可以通过在反应系统中共存葡萄糖等而得以加强，并且，例如，葡萄糖等可以添加到反应溶液中。

所述蛋自可以本身是酶，或可以在反应系统中以具有该酶的微生物的形式或所述微生物的处理的产物的形式共存。此外，也可以是包含具有编码具有将NAD⁺或NADP⁺转化为NADH或NADPH的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的转化体或其处理的产物。此处，处理的产物意指关于“转化体的处理的产物”所述的产物。

本发明用于生产(R)-2-羟基-4-苯基丁酸酯的方法还可以使用包含具有编码具有将NAD⁺或NADP⁺转化为NADH或NADPH的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸和本发明的多核苷酸二者的转化体进行，所述具有将NAD⁺或NADP⁺转化为NADH或NADPH的能力的蛋白诸如葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、氨基酸脱氢酶和有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)。

将该转化体的两种多核苷酸引入到宿主细胞中的方法的实例包括将包含这两种多核苷酸的单一载体引入宿主细胞的方法，和用通过将这两种多核苷酸分别引入到不同来源的多个载体中制备的重组载体转化宿主细胞的方法。此外，这两种多核苷酸中的一种多核苷酸或两种多核苷酸也可以被引入到宿主细胞的染色体中。

作为将包含这两种多核苷酸的单一载体引入到宿主细胞中的方法，例如，可以通过将与表达控制相关的区域如启动子或终止子与前述多核苷酸中的每一种连接而构建重组载体。备选地，可以构建重组载体来表达包含多个顺反子的操纵子，诸如乳糖操纵子。

用于修饰本发明的酶的方法是用于修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法。本发明的方法包括在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，将位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，将位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，将位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤，或将位置25的苏氨酸置换为丝氨酸的步骤。

用于修饰本发明的酶的方法1是用于修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤。

用于修饰本发明的酶的方法2是用于修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，但不包括将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤。

用于修饰本发明的酶的方法3是用于修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，但是不包括下述步骤：将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，和将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤。

用于修饰本发明的酶的方法4是用于修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤，但是不包括下述步骤：将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，和将所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤。

用于修饰本发明的酶的方法5是用于修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸置换为丝氨酸的步骤，但是不包括下述步骤：将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，和将所述氨基酸序列中位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤。

用于修饰本发明的酶的方法中所包括的步骤可以按照前述解释(例如，关于制备本发明的酶和本发明的多核苷酸的解释)和与前述实施例(例如，Production of Polynucleotide of the Present Invention：Introduction ofSite-Directed Mutations(本发明的多核苷酸的制备：定点突变的介绍))中所述的那些方法相似的方法进行。

用于修饰本发明的多核苷酸的方法是用于修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括：

将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75处编码苏氨酸的密码子置换为编码丝氨酸的密码子的步骤。

用于修饰本发明的多核苷酸的方法1是一种用于修饰包含编码SEQID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤。

用于修饰本发明的多核苷酸的方法2是一种用于修饰包含编码SEQID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，但不包括将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤。

用于修饰本发明的多核苷酸的方法3是一种用于修饰包含编码SEQID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤，但是不包括下述步骤：将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，和将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤。

用于修饰本发明的多核苷酸的方法4是一种用于修饰包含编码SEQID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的步骤，但是不包括下述步骤：将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，和将核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤。

用于修饰本发明的多核苷酸的方法5是一种用于修饰包含编码SEQID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75处编码苏氨酸的密码子置换为编码丝氨酸的密码子的步骤，但是不包括下述步骤：将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，将核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤，和将所述核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的步骤。

用于修饰本发明的多核苷酸的方法中所包括的步骤可以按照前述解释(例如，关于制备本发明的酶和本发明的多核苷酸的解释)和与前述实施例(例如，Production of Polynucleotide of the Present Invention：Introduction of Site-Directed Mutations(本发明的多核苷酸的制备：定点突变的介绍))中所述的那些方法相似的方法进行。

实施例

以下，将在实施例中更详细地描述本发明。然而，这些实施例不意欲限制本发明。

对于基因克隆和质粒构建，可以引用″Molecular Cloning：A LaboratoryManual 2nd edition(分子克隆：实验室手册第2版)″(1989)，冷泉港实验室出版，ISBN 0-87969-309-6，″Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学方法)″(1987)，John Wiley & amp；Sons，Inc.ISBNO-471-50338-X等中所述的方法作为参考。下面将详细描述诸如克隆的步骤：

实施例1(制备编码野生型还原酶的多核苷酸(即，野生型多核苷酸))

(1-1)制备染色体DNA(A)

向两个500-ml烧瓶的每一个中，加入100ml培养基(培养基通过将2g葡萄糖、0.5g聚胨、0.3g酵母提取物和0.3g麦芽提取物溶解在100ml水中，然后用2N HCl将其pH调节为pH 6而制备)，然后将所述烧瓶在121℃灭菌15分钟。向这些烧瓶的每一个中，加入0.3ml在相同组成的培养基中培养(30℃，48小时，振荡培养)的Yamadazyma farinosa IFO193菌株的培养液，然后在30℃振荡培养72小时。然后，将得到的培养液离心(8000rpm，10分钟)，并且收集所产生的沉淀物。将该沉淀物用50ml0.85％盐水洗涤并且回收，以得到3.64g湿细胞。

使用QIAprep Genomic-tip System(由Qiagen K.K.制造)，从这样得到的湿细胞得到细胞内DNA(以下在一些情形中还称为染色体DNA(A))。

(1-2)制备包含编码野生型还原酶的多核苷酸(即，野生型多核苷酸)的载体(构建载体pTrcRyf)

(1)制备本发明的载体

使用包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO：4的寡核苷酸引物作为引物，并且还使用上述染色体DNA(A)作为模板，利用下述反应溶液组成并在下述反应条件下进行PCR(使用由RocheDiagnostics K.K.制造的扩增高保真度PLUS PCR系统(Expand HighFidelity PLUS PCR System))。

[反应溶液组成]

[反应条件]

将包含上述组成的反应溶液的容器放置在PERKINELMER-GeneAmp PCR系统9700上，并且加热至94℃(2分钟)，然后，重复下述循环10次：94℃(0.25分钟)，55℃(0.5分钟)和72℃(1.5分钟)，然后，重复下述循环20次：94℃(0.25分钟)，55℃(0.5分钟)和72℃(1.0分钟+5秒/循环)，再然后，将反应溶液保持在72℃7分钟。

然后，收集得到的PCR反应溶液的等分试样，然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果，检测到约1000bp的DNA片段的条带。

将两种类型的限制酶(NcoI和XbaI)添加到剩余的PCR反应溶液中，并且将约1000bp的DNA片段进行双重消化。然后，纯化酶消化的DNA片段。

另一方面，将载体pTrc99A(由Pharmacia制造)用两种类型的限制酶(NcoI和XbaI)双重消化，然后纯化酶消化的DNA片段。

将通过上述纯化得到的这样的酶消化的两种类型的DNA片段彼此混合，用T4 DNA连接酶彼此连接。然后，用得到的连接液转化大肠杆菌(E.coli)DH5α。

将转化的大肠杆菌DH5α在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养。将形成的菌落接种到灭菌的LB培养基(2ml)(含有50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在试管中进行振荡培养(37℃，17小时)。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由Qiagen制造)从得到的培养的细胞收集质粒。将收集的质粒的每份等分试样分别用两种类型的限制酶NcoI和XbaI双重消化，然后将酶消化物进行电泳。结果，证实上述约1000bp的DNA片段已经插入到所收集的质粒中(以下，该质粒称为“载体pTrcRYF”)。

实施例2(制备编码辅酶-再生酶的多核苷酸)

(2-1)制备包含编码具有将氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转化为其还原形式的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的预备步骤

将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)IFO 12108菌株在100ml灭菌的LB培养基中培养，以得到0.4g细胞。使用Qiagen Genomic Tip(由Qiagen制造)按照其中所包含的手册所述的方法从所得到的细胞纯化染色体DNA(以下还称为染色体DNA(B))。

(2-2)制备包含编码具有将氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转化为其还原形式的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸

基于Journal of Biological Chemistry(生物化学杂志)卷264，No.11，6381-6385(1989)所述的编码来源于巨大芽孢杆菌IWG3的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列的核苷酸序列，合成包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列的寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列的寡核苷酸引物。

使用包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列的寡核苷酸引物和包含SEQID NO：7的核苷酸序列的寡核苷酸引物作为引物，并且还使用上述染色体DNA(B)作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Roche Diagnostics K.K.制造的Expand High Fidelity PCR System(扩增高保真度PCR系统))。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将包含上述组成的反应溶液的容器放置在PERKINELMER-GeneAmp PCR系统2400上，并且加热至97℃(2分钟)，然后，重复下述循环10次：97℃(0.25分钟)，55℃(0.5分钟)和72℃(1.5分钟)，然后，重复下述循环20次：97℃(0.25分钟)，55℃(0.5分钟)和72℃(2.5分钟)，再然后，将反应溶液保持在72℃7分钟。

然后，收集得到的PCR反应溶液的等分试样，然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果，检测到约950bp的DNA片段的条带。

使用得到的PCR反应溶液和由Invitrogen制造的TOPOTMTA克隆试剂盒Ver.E，将作为PCR的结果得到的约950bp的DNA片段与pCR2.1-TOPO载体的已存在的“PCR产物插入位点”连接，然后用得到连接液转化大肠杆菌DH5α。

将转化的大肠杆菌DH5α在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养，在该培养基上已经涂上了30μl 4％X-gal水溶液和30μl 0.1MIPTG。从形成的菌落中分离一个白色的菌落，然后，将该菌落接种到灭菌的LB培养基(2ml)(含有50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在试管中振荡培养(30℃，24小时)。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由Qiagen制造)从得到的培养的细胞收集质粒。将收集的质粒的每份等分试样分别用限制酶(EcoRI)消化，然后将酶消化物进行电泳。结果，证实上述约950bp的DNA片段已经插入到所收集的质粒中(以下，该质粒称为“载体pSDGDH12”)。

分析插入到载体pSDGDH12中的DNA片段的核苷酸序列。所得到的序列显示在SEQ ID NO：8中。应该注意，通过进行序列反应来进行对插入到前述载体中的DNA片段的核苷酸序列的分析，其中将载体pSDGDH12用作模板，并且使用染料终止子循环测序FS现成的反应试剂盒(Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit)(由PerkinElmer，Inc.制造)，然后用DNA测序仪373A(由PerkinElmer，Inc.制造)分析所得到的DNA的核苷酸序列。

将所得到的载体pSDGDH12的DNA用两种类型的限制酶(BamHI和XbaI)双重消化，然后纯化酶消化的DNA片段。另一方面，将载体pTrc99A(由Pharmacia制造)用两种类型的限制酶(BamHI和XbaI)双重消化，然后纯化酶消化的DNA片段。

将通过上述纯化得到的这样的酶消化的两种类型的DNA片段彼此混合，用T4DNA连接酶彼此连接。然后，用得到的连接液转化大肠杆菌DH5α。

将转化的大肠杆菌DH5α在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养。将形成的菌落接种到灭菌的LB培养基(2ml)(含有50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在试管中进行振荡培养(37℃，17小时)。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由Qiagen制造)从得到的培养的细胞收集质粒。将收集的质粒的每份等分试样分别用两种类型的限制酶BamHI和XbaI双重消化，然后将酶消化物进行电泳。结果，证实上述约950bp的DNA片段已经插入到所收集的质粒中(以下，该质粒称为“载体pTrcSDGDH12”)。

实施例3(制备本发明的多核苷酸1：定点突变介绍)

(3-1)定点诱变的操作

关于用于将位置25的苏氨酸转化为丝氨酸、将位置27的色氨酸转化为精氨酸、将位置42的组氨酸转化为亮氨酸、将位置56的甘氨酸转化为半胱氨酸、和将位置115的缬氨酸转化为异亮氨酸的突变引物，基于SEQ ID NO：2的核苷酸序列，合成各种类型的合成的寡核苷酸(突变引物)，它们对应如在SEQ ID NOs：5，9，10，11，12，13，14，15，16和17中所示的单个氨基酸。与所置换的氨基酸位点相对应的SEQ ID NOs和核苷酸序列显示在表1中。

表1

使用包含SEQ ID NO：14的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：15的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(1-2)中纯化的载体pTrcRYF作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(A)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将包含上述组成的反应溶液的容器放置在PERKINELMER-GeneAmp PCR系统2400上，并且在95℃温育1分钟，然后，重复下述循环12次：95℃(50秒)，55℃(1分钟)和68℃(5分钟)。然后，将其保存在4℃。

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(A)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

并且，使用两种类型的寡核苷酸组合作为引物，即，包含SEQ ID NOS：5和9，SEQ ID NOS：10和11，SEQ ID NOS：12和13，或SEQ ID NOS：16和17的核苷酸序列的寡核苷酸，在前述反应溶液组成和反应条件下进行PCR。然后，向每份所得到的PCR反应溶液中加入1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用每种温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(3-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(3-1)中得到的每个转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定每个突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含突变体载体(作为G56C的本发明的载体)的转化体(即，本发明的转化体)和包含其他突变体载体(T25S，W27R，H42L和V115I)的转化体。

实施例4(制备双重突变体多核苷酸)

(4-1)制备双重突变体载体T25SW27R(参照实施例)

使用包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：19的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，并且还使用在上述(1-2)中纯化的载体pTrcRYF作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(B)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(B)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(4-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(4-1)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含双重突变体载体T25SW27R(参照实施例)的转化体。

(4-3)制备突变体载体T25SH42L(参照实施例)

使用包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：13的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，并且还使用在上述(3-2)中纯化的载体T25S作为模板，在下述反应溶液组成和在下述反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(C)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(C)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(4-4)确定突变体的核苷酸序列

从在(4-3)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含双重突变体载体T25SH42L(参照实施例)的转化体。

(4-5)制备双重突变体载体(T25SG56C(本发明)，W27RG56C(本发明)，H42LG56C(本发明)，G56CV115I(本发明)，W27RH42L(参照实施例)，和H42LV115I(参照实施例))

模板载体和引物的组合显示在表2中。以与上述(4-3)和(4-4)中所述的相同的方法，得到分别具有双重突变体载体(本发明的载体T25SG56C，W27RG56C，H42LG56C或G56CV115I)的转化体(即，本发明的转化体)。

表2

实施例5(制备三重突变体多核苷酸)

(5-1)定点诱变的操作

使用包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：13的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(4-2)中纯化的载体T25SW27R作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(D)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(D)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(5-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(5-1)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含三重突变体载体T25SW27RH42L(参照实施例)的转化体。

(5-3)制备三重突变体载体(T25SW27RG56C(本发明)，T25SH42LG56C(本发明)，T25SG56CV115I(本发明)，W27RH42LG56C(本发明)，W27RG56CV115I(本发明)，和H42LG56CV115I(本发明)

模板载体和引物的组合显示在表3中。以与上述(5-1)和(5-2)中所述的相同的方法，得到分别具有三重突变体载体(本发明的载体T25SW27RG56C，T25SH42LG56C，T25SG56CV115I，W27RH42LG56C，W27RG56CV115I，或H42LG56CV115I)的转化体(即，本发明的转化体)。

表3

实施例6(制备四重突变体多核苷酸)

(6-1)定点诱变的操作

使用包含SEQ ID NO：14的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：15的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(5-2)中纯化的载体T25SW27RH42L作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(E)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(E)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(6-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(6-1)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含四重突变体载体(本发明的载体T25SW27RH42LG56C)的转化体(即，本发明的转化体)(参见表4)。

(6-3)制备四重突变体载体(T25SW27RG56CV115I，T25SH42LG56CV115I，W27RH42LG56CV115I)

模板载体和引物的组合显示在表4中。以与上述(6-1)和(6-2)中所述的相同的方法，得到分别具有四重突变体载体(本发明的载体T25SW27RG56CV115I，T25SH42LG56CV115I，或W27RH42LG56CV115I)的转化体(即，本发明的转化体)(参见表4)。

表4

实施例7(制备四重突变体多核苷酸)

(7-1)定点诱变的操作

使用包含SEQ ID NO：16的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：17的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(6-2)中纯化的载体T25SW27RH42LG56C作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(F)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(F)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(7-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(7-1)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含四重突变体载体(本发明的载体T25SW27RH42LG56CV115I)的转化体(即，本发明的转化体)。

实施例8制备包含本发明的多核苷酸1和编码辅酶-再生酶的多核苷酸的转化体(构建载体(pTrcT25SW27RG56CV115I/G(本发明)，pTrcT25SH42LG56CV115I/G(本发明)，pTrcW27RH42LG56CV115I/G(本发明)，和pTrcT25SW27RH42LG56CV115I/G(本发明))

(8-1)制备载体pTrcT25SW27RG56CV115I/G(本发明)

使用包含SEQ ID NO：3(包含NcoI)的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：20(包含BamHI)的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(6-3)中纯化的包含突变体多核苷酸的载体T25SW27RG56CV115I作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由RocheDiagnostics K.K.制造的扩增高保真度PCR系统(Expand High Fidelity PCRSystem))。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将包含上述组成的反应溶液的容器放置在PERKINELMER-GeneAmp PCR系统2400上，并且加热到94℃(2分钟)，然后，重复下述循环25次：94℃(10秒)，55℃(0.5分钟)和72℃(1分钟)，并且然后，将反应溶液保持在72℃7分钟。

将通过纯化PCR反应溶液得到的PCR-扩增的DNA片段用两种类型的限制酶(NcoI和BamHI)双重消化，然后纯化酶消化的DNA片段。另一方面，将载体pTrcSDGDH12用两种类型的限制酶(NcoI和BamHI)双重消化，然后纯化酶消化的DNA片段。

将已经通过上述纯化得到的这样酶消化的两种类型的DNA片段用T4DNA连接酶彼此连接。然后，用得到的连接溶液转化大肠杆菌DH5α。

将转化的大肠杆菌DH5α在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养。将形成的菌落接种到灭菌的LB培养基(2ml)(含有50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在试管中进行振荡培养(37℃，24小时)。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由Qiagen制造)从得到的培养的细胞的每一个中收集质粒。将收集的质粒的每份等分试样分别用两种类型的限制酶NcoI和BamHI消化，然后将酶消化物进行电泳。结果，证实上述约1000bp的DNA片段已经插入到所收集的质粒中。以下，该载体称为“载体pTrcT25SW27RG56CV115I/G”(本发明)。

(8-2)制备四重突变体载体(pTrcT25SH42LG56CV115I/G(本发明))，四重突变体载体(pTrcW27RH42LG56CV115I/G(本发明))，和四重突变体载体(pTrcT25SW27RH42LG56CV115I/G(本发明))

使用T25SH42LG56CV115I，W27RH42LG56CV115I或T25SW27RH42LG56CV115I作为模板载体，通过与上述(8-1)中所述相同的方法得到具有单个突变体载体(本发明的载体pTrcT25SH42LG56CV115I/G，pTrcW27RH42LG56CV115I/G和pTrcT25SW27RH42LG56CV115I/G)的转化体(即，本发明的转化体)。

实施例9(本发明的酶1的热稳定性)

将在实施例3-7中得到的16种类型的本发明的转化体分别接种在灭菌的LB培养基(2ml)(含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素)中，并且然后在37℃进行振荡培养24小时。培养后，将得到的培养液离心(8000×g，5分钟)，回收湿细胞形式的沉淀物。然后，向回收的湿细胞中加入1ml 0.5M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，并且将得到的混合物中所包含的细胞用玻璃珠破碎。将得到的细胞破碎液离心(12000×g，10分钟)，以得到粗酶液形式的上清。

将粗酶液分别用0.5M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)稀释，以使所得到的粗酶液可以具有几乎相同水平的还原酶活性。之后，将每种粗酶液在50℃和55℃温育1小时，然后测量剩余的还原酶活性。基于在4℃保存的本发明的酶的还原酶活性值(对照)(将其定义为100％)，计算所测量的还原酶活性的相对值(还原酶活性的残留比例)。

测量还原酶活性的方法如下。使用乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯作为底物。具体地，将150μl 2.7mM乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯溶液，10μl稀释的粗酶液，和40μl 0.5mM NADPH溶液彼此混合。将得到的混合物在30℃温育，然后通过使用所述反应溶液在340nm的吸光度作为指示剂，通过定量NADPH而测量在所得到的反应溶液中消耗的NADPH的量。关于还原酶活性，每分钟氧化1 μmol NADPH的酶的量定义为1单位。结果显示在表5中。

表5

实施例10(制备本发明的转化体和还原反应)

将包含在实施例8中得到的载体pTrcT25SW27RG56CV115I/G的大肠杆菌HB101转化体接种在灭菌的LB培养基(100ml)(含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在37℃进行振荡培养24小时。培养后，将得到的反应溶液离心(8000×g，10分钟)，回收湿细胞形式的沉淀物。这样，得到约0.9g回收的湿细胞。

将3.0g乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯，0.9g上述湿细胞，3.0mg NADP⁺，4.5g葡萄糖，30ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，和6.0g乙酸丁酯彼此混合，然后将这样得到的混合物在30℃搅拌9小时。在搅拌操作过程中，向上述混合物中逐渐加入2M碳酸钠水溶液，以使所述混合物具有pH 7.0。随后，向该混合物中加入50ml乙酸乙酯，然后将得到的混合物离心以得到有机层。将该有机层用硫酸镁脱水，然后将乙酸丁酯和乙酸乙酯蒸馏掉，以得到2.5g乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯。测量所得到的乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯的光学纯度。结果，(R)形式具有99％e.e.的光学纯度。

(用于含量分析的条件)

柱：DB-1(0.53mm×30m，1.5μm)(由J & W Scientific制造)

柱温：50℃(0min)→4℃/min→170℃(0min)→30℃/min→290℃(4min)

载气：氦(柱流速：10ml/min)

检测器：FID

(用于测量光学纯度的条件)

柱：Chirasil-Dex-CB(0.32mm×25m，0.25μm)(由Astec Co.，Ltd.制造)

柱温：100℃(0min)→2℃/min→180℃(0min)

载气：氦(压力：55Kpa)

检测器：FID

分流比：1/50

应该注意到，通过与(R)-乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯的制剂比较而确定产物的绝对构型。

实施例11(制备本发明的多核苷酸2：定点突变介绍)

(11-1)定点诱变的操作

关于用于将位置25的苏氨酸转化为丝氨酸、将位置42的组氨酸转化为亮氨酸和将位置115的缬氨酸转化为异亮氨酸的突变引物，基于SEQID NO：2的核苷酸序列，合成各种类型的合成的寡核苷酸(突变引物)，它们对应如在SEQ ID NOs：5，9，12，13，16和17中所示的单个氨基酸。与所置换的氨基酸位点相对应的序列号和核苷酸序列显示在表6中。

表6

使用包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(1-2)中纯化的载体pTrcRYF作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(G)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(G)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

并且，使用两种类型的寡核苷酸组合作为引物，即，包含SEQ ID NOs：12和13，或SEQ ID NOs：16和17的核苷酸序列的寡核苷酸，在前述反应溶液组成和反应条件下进行PCR。然后，向每份所得到的PCR反应溶液中加入1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用每种所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(11-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(11-1)中得到的每个转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定每个突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含突变体载体(作为V115I的本发明的载体)的转化体(即，本发明的转化体)和包含其他突变体载体(T25S和H42L)的转化体。

实施例12(制备双重突变体多核苷酸)

(12-1)制备双重突变体载体T25SW27R(参照实施例)

使用包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：19的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，并且还使用在上述(1-2)中纯化的载体pTrcRYF作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(H)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(H)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(12-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(12-1)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含双重突变体载体T25SW27R(参照实施例)的转化体。

(12-3)制备突变体载体T25SH42L(参照实施例)

使用包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：13的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，并且还使用在上述(11-2)中纯化的载体T25S作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(I)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(I)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(12-4)制备双重突变体载体(T25SV115I(本发明)，W27RH42L(参照实施例)，W27RV115I(本发明)，和H42LV115I(本发明))

模板载体和引物的组合显示在表7中。以与上述(12-3)中所述的相同的方法，得到分别具有双重突变体载体(本发明的突变体载体T25SV115I，W27RH42L，W27RV115I，或H42LV115I)的转化体。

表7

实施例13(制备三重突变体多核苷酸)

(13-1)定点诱变的操作

使用包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：13的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(12-2)中纯化的载体T25SW27R作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(J)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(J)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(13-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(13-1)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含三重突变体载体(T25SW27RH42L)的转化体。

(13-3)制备三重突变体载体(T25SW27RV115I(本发明)，T25SH42LV115I(本发明)，和W27RH42LV115I(本发明))

模板载体和引物的组合显示在表8中。以与上述(13-1)和(13-2)中所述的相同的方法，得到分别具有三重突变体载体(本发明的载体T25SW27RV115I，T25SH42LV115I，或W27RH42LV115I)的转化体(即，本发明的转化体)。

表8

实施例14(制备四重突变体多核苷酸)

(14-1)定点诱变的操作

使用包含SEQ ID NO：16的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：17的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(13-2)中纯化的载体T25SW27RH42L作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(K)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(K)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(14-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(14-1)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含四重突变体载体(本发明的载体T25SW27RH42LV115I)的转化体(即，本发明的转化体)。

表9

实施例15制备包含本发明的多核苷酸2和编码辅酶-再生酶的多核苷酸的转化体(构建载体(pTrcT25SW27RH42LV115I/G))

(15-1)制备载体pTrcT25SW27RG56CV115I/G(本发明)

使用包含SEQ ID NO：3(包含NcoI)的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：20(包含BamHI)的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(14-3)中纯化的包含突变体多核苷酸的载体T25SW27RH42LV115I作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由RocheDiagnostics K.K.制造的扩增高保真度PCR系统(Expand High Fidelity PCRSystem))。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将转化的大肠杆菌DH5α在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养。将形成的菌落接种到灭菌的LB培养基(2ml)(含有50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在试管中进行振荡培养(37℃，24小时)。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由Qiagen制造)从得到的培养的细胞的每一个中收集质粒。将收集的质粒的每份等分试样分别用两种类型的限制酶NcoI和BamHI消化，然后将酶消化物进行电泳。结果，证实上述约1000bp的DNA片段已经插入到所收集的质粒中。以下，该载体被称为“载体pTrcT25SW27RH42LV115I/G”(本发明)。

实施例16(本发明的酶2的热稳定性)

将在实施例11-14中得到的8种类型的本发明的转化体分别接种在灭菌的LB培养基(2ml)(含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素)中，并且然后在37℃进行振荡培养24小时。培养后，将得到的培养液离心(8000×g，5分钟)，回收湿细胞形式的沉淀物。然后，向回收的湿细胞中加入1ml 0.5M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，并且将得到的混合物中所包含的细胞用玻璃珠破碎。将得到的细胞破碎液离心(12000×g，10分钟)，以得到粗酶液形式的上清。

测量还原酶活性的方法如下。使用乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯作为底物。具体地，将150μl 2.7mM乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯溶液，10μl稀释的粗酶液，和40μl 0.5mM NADPH溶液彼此混合。将得到的混合物在30℃温育，然后通过使用所述反应溶液在340nm的吸光度作为指示剂，通过定量NADPH而测量在所得到的反应溶液中消耗的NADPH的量。关于还原酶活性，每分钟氧化1μmol NADPH的酶的量定义为1单位。结果显示在表10中。

表10

实施例17(制备本发明的转化体和还原反应)

将包含在实施例14中得到的载体pTrcT25SW27RH42LV115I的大肠杆菌DH5α转化体接种在灭菌的LB培养基(100ml)(含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在30℃进行振荡培养24小时。培养后，将得到的反应溶液离心(8000×g，10分钟)，回收0.9g湿细胞形式的沉淀物。

将0.1g乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯，0.9g上述湿细胞，1.0mgNADP⁺，0.15g葡萄糖，2.5mg(186单位)葡萄糖脱氢酶(由AmanoEnzyme Inc.制造)，10ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，和2.5g乙酸丁酯彼此混合，然后将这样得到的混合物在30℃搅拌24小时。结果，得到92mg乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯。测量所得到的乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯的光学纯度。结果，(R)形式具有97％e.e.的光学纯度。

(用于含量分析的条件)

柱：DB-1(0.53mm×30m，1.5μm)(由J & W Scientific制造)

柱温：50℃(0min)→4℃/min→170℃(0min)→30℃/min→290℃(4min)

载气：氦(柱流速：10ml/min)

检测器：FID

(用于测量光学纯度的条件)

柱：Chirasil-Dex-CB(0.32mm×25m，0.25μm)(由Astec Co.，Ltd.制造)

柱温：100℃(0min)→2℃/min→180℃(0min)

载气：氦(压力：55Kpa)

检测器：FID

分流比：1/50

实施例18(制备本发明的多核苷酸3：定点突变介绍)

(18-1)定点诱变的操作

关于用于将位置27的色氨酸转化为精氨酸和将位置42的组氨酸转化为亮氨酸的突变引物，基于SEQ ID NO：2的核苷酸序列，合成各种类型的合成的寡核苷酸(突变引物)，它们对应如在SEQ ID NOs：10，11，12和13中所示的单个氨基酸。与所置换的氨基酸位点相对应的序列号和核苷酸序列显示在表11中。

表11

使用包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：11的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(1-2)中纯化的载体pTrcRYF作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(L)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(L)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

并且，使用两种类型的寡核苷酸组合作为引物，即，包含SEQ ID NOs：12和13的核苷酸序列的寡核苷酸，在前述反应溶液组成和反应条件下进行PCR。然后，向每份所得到的PCR反应溶液中加入1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用每种所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(18-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(18-1)中得到的每个转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定每个突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含突变体载体(作为W27R的本发明的载体)的转化体(即，本发明的转化体)和包含其他突变体载体(H42L)的转化体。

实施例19(制备双重突变体多核苷酸)

(19-1)制备双重突变体载体T25SW27R(本发明)

使用包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：19的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，并且还使用在上述(1-2)中纯化的载体pTrcRYF作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(M)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(M)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(19-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(19-1)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含双重突变体载体T25SW27R(本发明)的转化体(即，本发明的转化体)。

(19-3)制备突变体载体W27RH42L(本发明)

使用包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：11的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，并且还使用在上述(18-2)中纯化的载体H42L作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(N)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(N)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(19-4)确定突变体的核苷酸序列

从在(19-3)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含双重突变体载体W27RH42L(本发明)的转化体(即，本发明的转化体)。实施例20(制备三重突变体多核苷酸)

(20-1)定点诱变的操作

使用包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：13的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(19-2)中纯化的载体T25SW27R作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(O)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(O)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(20-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(20-1)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含三重突变体载体T25SW27RH42L(本发明)的转化体(即，本发明的转化体)。

实施例21制备包含本发明的多核苷酸3和编码辅酶-再生酶的多核苷酸的转化体(构建载体(pTrcT25SW27RH42L/G))

(21-1)制备载体pTrcT25SW27RH42L/G(本发明)

使用包含SEQ ID NO：3(包含NcoI)的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：20(包含BamHI)的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(20-2)中纯化的包含突变体多核苷酸的载体T25SW27RH42L作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由RocheDiagnostics K.K.制造的扩增高保真度PCR系统(Expand High Fidelity PCRSystem))。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将转化的大肠杆菌DH5α在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养。将形成的菌落接种到灭菌的LB培养基(2m1)(含有50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在试管中进行振荡培养(37℃，24小时)。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由Qiagen制造)从得到的培养的细胞的每一个中收集质粒。将收集的质粒的每份等分试样分别用两种类型的限制酶NcoI和BamHI消化，然后将酶消化物进行电泳。结果，证实上述约1000bp的DNA片段已经插入到所收集的质粒中。以下，该载体被称为“载体pTrcT25SW27RH42L/G”(本发明)。

实施例22(本发明的酶3的热稳定性)

将在实施例18-20中得到的4种类型的本发明的转化体分别接种在灭菌的LB培养基(2m1)(含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素)中，并且然后在37℃进行振荡培养24小时。培养后，将得到的培养液离心(8000×g，5分钟)，回收湿细胞形式的沉淀物。然后，向回收的湿细胞中加入1ml 0.5M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，并且将得到的混合物中所包含的细胞用玻璃珠破碎。将得到的细胞破碎液离心(12000×g，10分钟)，以得到粗酶液形式的上清。

应用下述测量还原酶活性的方法。使用乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯作为底物。具体地，将150μl 2.7mM乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯溶液，10μl稀释的粗酶液，和40μl 0.5mM NADPH溶液彼此混合。将得到的混合物在30℃温育，然后通过使用所述反应溶液在340nm的吸光度作为指示剂，通过定量NADPH而测量在所得到的反应溶液中消耗的NADPH的量。关于还原酶活性，每分钟氧化1μmol NADPH的酶的量定义为1单位。结果显示在表12中。

表12

实施例23(制备本发明的转化体和还原反应)

将包含在实施例20中得到的载体pTrcT25SW27RH42L的大肠杆菌DH5α转化体接种在灭菌的LB培养基(100ml)(含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在30℃进行振荡培养24小时。培养后，将得到的反应溶液离心(8000×g，10分钟)，回收0.8g湿细胞形式的沉淀物。

将0.1g乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯，0.8g上述湿细胞，1.0mg NADP⁺，0.15g葡萄糖，2.5mg(186单位)葡萄糖脱氢酶(由Amano Enzyme Inc.制造)，10ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，和2.5g乙酸丁酯彼此混合，然后将这样得到的混合物在30℃搅拌24小时。结果，得到105mg乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯。测量所得到的乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯的光学纯度。结果，(R)形式具有98％e.e.的光学纯度。

(用于含量分析的条件)

柱：DB-1(0.53mm×30m，1.5μm)(由J & W Scientific制造)

柱温：50℃(0min)→4℃/min→170℃(0min)→30℃/min→290℃(4min)

载气：氦(柱流速：10ml/min)

检测器：FID

(用于测量光学纯度的条件)

柱：Chirasil-Dex-CB(0.32mm×25m，0.25μm)(由Astec Co.，Ltd.制造)

柱温：100℃(0min)→2℃/min→180℃(0min)

载气：氦(压力：55Kpa)

检测器：FID

分流比：1/50

实施例24(制备本发明的多核苷酸4：定点突变介绍)

(24-1)定点诱变的操作

关于用于将位置25的苏氨酸转化为丝氨酸和将位置42的组氨酸转化为亮氨酸的突变引物，基于SEQ ID NO：2的核苷酸序列，合成各种类型的合成的寡核苷酸(突变引物)，它们对应如在SEQ ID NOs：5，9，12和13中所示的单个氨基酸。与所置换的氨基酸位点相对应的SEQ ID NOs和核苷酸序列显示在表13中。

表13

使用包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(1-2)中纯化的载体pTrcRYF作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(P)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(P)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(24-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(24-1)中得到的每个转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定每个突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含突变体载体(作为H42L的本发明的载体)的转化体(即，本发明的转化体)和包含其他突变体载体(T25S)的转化体。

实施例25(制备双重突变体多核苷酸)

(25-1)制备双重突变体载体T25SH42L(本发明)

使用包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO：13的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，并且还使用在上述(24-2)中纯化的载体T25S作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(Q)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(Q)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(25-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(25-1)中得到的转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含双重突变体载体T25SH42L(本发明)的转化体(即，本发明的转化体)。

实施例26制备包含本发明的多核苷酸4和编码辅酶-再生酶的多核苷酸的转化体(构建载体(pTrcT25SH42L/G))

(26-1)制备载体pTrcT25SH42L/G

使用包含SEQ ID NO：3(包含NcoI)的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：18(包含BamHI)的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(25-1)中纯化的包含突变体多核苷酸的载体T25SH42L作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Roche DiagnosticsK.K.制造的扩增高保真度PCR系统(Expand High Fidelity PCR System))。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将转化的大肠杆菌DH5α在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养。将形成的菌落接种到灭菌的LB培养基(2ml)(含有50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在试管中进行振荡培养(37℃，24小时)。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由Qiagen制造)从得到的培养的细胞的每一个中收集质粒。将收集的质粒的每份等分试样分别用两种类型的限制酶NcoI和BamHI双重消化，然后将酶消化物进行电泳。结果，证实上述约1000bp的DNA片段已经插入到所收集的质粒中。以下，该载体被称为“载体pTrcT25SH42L/G”(本发明)。

实施例27(本发明的酶4的热稳定性)

将在实施例24-25中得到的两种类型的本发明的转化体分别接种在灭菌的LB培养基(2ml)(含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素)中，并且然后在37℃进行振荡培养24小时。培养后，将得到的培养液离心(8000×g，5分钟)，回收湿细胞形式的沉淀物。然后，向回收的湿细胞中加入1ml 0.5M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，并且将得到的混合物中所包含的细胞用玻璃珠破碎。将得到的细胞破碎液离心(12000×g，10分钟)，以得到粗酶液形式的上清。

应用下述测量还原酶活性的方法。使用乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯作为底物。具体地，将150μl 2.7mM乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯溶液，10μl稀释的粗酶液，和40μl 0.5mM NADPH溶液彼此混合。将得到的混合物在30℃温育，然后通过使用所述反应溶液在340nm的吸光度作为指示剂，通过定量NADPH而测量在所得到的反应溶液中消耗的NADPH的量。关于还原酶活性，每分钟氧化1μmol NADPH的酶的量定义为1单位。结果显示在表14中。

表14

实施例28(制备本发明的转化体和还原反应)

将包含在实施例26中得到的载体pTrcT25SH42L的大肠杆菌DH5α转化体接种在灭菌的LB培养基(100ml)(含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在30℃进行振荡培养24小时。培养后，将得到的反应溶液离心(8000×g，10分钟)，回收0.9g湿细胞形式的沉淀物。

将0.5g乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯，0.9g上述湿细胞，1.0mg NADP⁺，0.75g葡萄糖，2.5mg(186单位)葡萄糖脱氢酶(由Amano Enzyme Inc.制造)，10ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，和2.5g乙酸丁酯彼此混合，然后将这样得到的混合物在30℃搅拌16.5小时。结果，得到489mg乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯。测量所得到的乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯的光学纯度。结果，(R)形式具有100％e.e.的光学纯度。

(用于含量分析的条件)

柱：DB-1(0.53mm×30m，1.5μm)(由J&W Scientific制造)

柱温：50℃(0min)→4℃/min→170℃(0min)→30℃/min→290℃(4min)

载气：氦(柱流速：10ml/min)

检测器：FID

(用于测量光学纯度的条件)

柱：Chirasil-Dex-CB(0.32mm×25m，0.25μm)(由Astec Co.，Ltd.制造)

柱温：100℃(0min)→2℃/min→180℃(0min)

载气：氦(压力：55Kpa)

检测器：FID

分流比：1/50

实施例29(制备本发明的多核苷酸5：定点突变介绍)

(29-1)定点诱变的操作

关于用于将位置25的苏氨酸转化为丝氨酸的突变引物，基于SEQ IDNO：2的核苷酸序列，合成各种类型的合成的寡核苷酸(突变引物)，它们对应如在SEQ ID NOS：5和9中所示的单个氨基酸。与所置换的氨基酸位点相对应的序列号和核苷酸序列显示在表15中。

表15

使用包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(1-2)中纯化的载体pTrcRYF作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由Stratagene Corporation制造的QuikChange II定点诱变试剂盒(QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit))。所得到的PCR反应溶液称为PCR反应溶液(R)。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将1μl DpnI限制酶(包含在前述试剂盒中)加入到所得到的PCR反应溶液(R)中，然后将混合的溶液在37℃温育1小时。然后，用所得到的温育的溶液转化大肠杆菌DH5α。

(29-2)确定突变体的核苷酸序列

从在(29-1)中得到的每个转化体提取载体，然后通过双脱氧法确定每个突变位点的核苷酸序列，以便证实已经按照设计那样引入突变。因此，得到包含突变体载体(作为T25S的本发明的载体)的转化体(即，本发明的转化体)。

实施例30制备包含本发明的多核苷酸5和编码辅酶-再生酶的多核苷酸的转化体(构建载体pTrcT25S/G(本发明))

(30-1)制备载体pTrcT25S/G(本发明)

使用包含SEQ ID NO：3(包含NcoI)的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO：20(包含BamHI)的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，还使用在上述(6-3)中纯化的包含修饰的基因的载体T25SW27RG56CV115I作为模板，在下述反应溶液组成和反应条件下进行PCR(使用由RocheDiagnostics K.K.制造的扩增高保真度PCR系统(Expand High Fidelity PCRSystem))。

[反应溶液组成]

[PCR反应条件]

将转化的大肠杆菌DH5α在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养。将形成的菌落接种到灭菌的LB培养基(2ml)(含有50μg/ml氨苄青霉素)中，然后在试管中进行振荡培养(37℃，24小时)。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由Qiagen制造)从得到的培养的细胞的每一个中收集质粒。将收集的质粒的每份等分试样分别用两种类型的限制酶NcoI和BamHI消化，然后将酶消化物进行电泳。结果，证实上述约1000bp的DNA片段已经插入到所收集的质粒中。以下，该载体被称为“载体pTrcT25S/G”(本发明)。

实施例31(本发明的酶5的热稳定性)

将在实施例29中得到的本发明的转化体接种在灭菌的LB培养基(2ml)(含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素)中，并且然后在37℃进行振荡培养24小时。培养后，将得到的培养液离心(8000×g，5分钟)，回收湿细胞形式的沉淀物。然后，向回收的湿细胞中加入1ml 0.5M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，并且将得到的混合物中所包含的细胞用玻璃珠破碎。将得到的细胞破碎液离心(12000×g，10分钟)，以得到粗酶液形式的上清。

应用下述测量还原酶活性的方法。使用乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯作为底物。具体地，将150μl 2.7mM乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯溶液，10μl稀释的粗酶液，和40μl 0.5mM NADPH溶液彼此混合。将得到的混合物在30℃温育，然后通过使用所述反应溶液在340nm的吸光度作为指示剂，通过定量NADPH而测量在所得到的反应溶液中消耗的NADPH的量。关于还原酶活性，每分钟氧化1μmol NADPH的酶的量定义为1单位。结果显示在表16中。

表16

实施例32(本发明的酶5的热稳定性)

将包含在实施例29中得到的载体pTrcT25S的大肠杆菌DH5α转化体接种在灭菌的LB培养基(100ml)(含有0.1mM IPTG和50μg/ml氨苄青霉素)中，并且然后在30℃进行振荡培养24小时。培养后，将得到的培养液离心(8000×g，10分钟)，回收0.9g湿细胞形式的沉淀物。

将0.5g乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯，0.9g上述湿细胞，1.0mg NADP⁺，0.75g葡萄糖，2.5mg(186单位)葡萄糖脱氢酶(由Amano Enzyme Inc.制造)，10ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，和2.5g乙酸丁酯彼此混合，并且将这样得到的混合物在30℃搅拌16.5小时。结果，得到526mg乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯。测量所得到的乙基2-羟基-4-苯基丁酸酯的光学纯度。结果，(R)形式具有100％e.e.的光学纯度。

(用于含量分析的条件)

柱：DB-1(0.53mm×30m，1.5μm)(由J & W Scientific制造)

柱温：50℃(0min)→4℃/min→170℃(0min)→30℃/min→290℃(4min)

载气：氦(柱流速：10ml/min)

检测器：FID

(用于测量光学纯度的条件)

柱：Chirasil-Dex-CB(0.32mm×25m，0.25μm)(由Astec Co.，Ltd.制造)

柱温：100℃(0min)→2℃/min→180℃(0min)

载气：氦(压力：55Kpa)

检测器：FID

分流比：1/50

工业适用性

按照本发明，可以提供具有良好热稳定性的还原酶，该还原酶用于生产用作药物或农药的活性成分的化合物、或其中间体等、并且特别是光学活性化合物或其中间体以及其他的有机合成反应。使用本发明的酶，使缩短反应时间并且提高反应效率成为可能。

序列表Free Text

SEQ ID NO；3

扩增野生型基因的PCR引物

SEQ ID NO；4

扩增野生型基因的PCR引物

SEQ ID NO；5

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO；6

扩增辅酶-再生酶基因的PCR引物

SEQ ID NO；7

扩增辅酶-再生酶基因的PCR引物

SEQ ID NO：9

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：10

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：11

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：12

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：13

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：14

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：15

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：16

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：17

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：18

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：19

扩增修饰的基因的PCR引物

SEQ ID NO：20

扩增修饰的基因的PCR引物

Claims

1.酶，

所述酶具有使底物还原的能力。

2.酶，

所述酶具有使底物还原的能力。

3.根据权利要求2所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变。

4.根据权利要求2或3所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

7.根据权利要求2所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变选自下述氨基酸突变组1：

<氨基酸突变组1>

(1-15)下述五个氨基酸突变：(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(d)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(e)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

8.多核苷酸，其包含编码权利要求2至7中任一项所述酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

9.酶，

所述酶具有使底物还原的能力。

10.根据权利要求9所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变。

11.根据权利要求9或10所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

13.根据权利要求11所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变选自下述氨基酸突变组2：

<氨基酸突变组2>

(2-1)下述两个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变；

(2-2)下述两个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

(2-3)下述两个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；

(2-7)下述四个氨基酸突变：(a)位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(c)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(d)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

14.多核苷酸，其包含编码权利要求11至13中任一项所述酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

15.酶，

所述酶具有使底物还原的能力。

16.根据权利要求15所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变。

17.根据权利要求15或16所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

18.根据权利要求15所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变选自下述氨基酸突变组3：

<氨基酸突变组3>

(3-1)下述两个氨基酸突变：(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；

(3-2)下述两个氨基酸突变：(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变；和

(3-3)下述三个氨基酸突变：(a)位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，(b)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变，和(c)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

19.多核苷酸，其包含编码权利要求15至18中任一项所述酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

20.酶，

所述酶具有使底物还原的能力。

21.根据权利要求20所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变还包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

22.根据权利要求20所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸突变是下述两个氨基酸突变：(a)位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变和(b)位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变。

23.多核苷酸，其包含编码权利要求20至22中任一项所述酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

24.酶，

所述酶包含除了在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸突变之外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列等价的氨基酸序列，其中所述一个或多个氨基酸突变包括位置25的苏氨酸被丝氨酸置换的氨基酸突变，但是不包括下述任何氨基酸突变：位置56的甘氨酸被半胱氨酸置换的氨基酸突变，位置115的缬氨酸被异亮氨酸置换的氨基酸突变，位置27的色氨酸被精氨酸置换的氨基酸突变，和位置42的组氨酸被亮氨酸置换的氨基酸突变；并且

所述酶具有使底物还原的能力。

25.多核苷酸，其包含编码权利要求24所述酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

26.包含权利要求8，14，19，23或25所述的多核苷酸的载体。

27.根据权利要求26所述的载体，所述载体还包含下述多核苷酸，所述多核苷酸包含编码蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，所述蛋白具有将氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化为其还原形式的能力。

28.包含权利要求8，14，19，23或25所述的多核苷酸或权利要求26或27所述的载体的转化体。

29.生产(R)-2-羟基-4-苯基丁酸酯的方法，所述方法包括允许权利要求28所述的转化体或其处理产物作用在2-氧代-4-苯基丁酸酯上的步骤。

30.修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括下述步骤：在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，将位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，将位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，将位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤，或将位置25的苏氨酸置换为丝氨酸的步骤。

31.修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤。

32.修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，但不包括将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤。

33.修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，但是既不包括将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，也不包括将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤。

34.修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤，但是不包括下述任何步骤：将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，和将所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤。

35.修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中位置25的苏氨酸置换为丝氨酸的步骤，但是不包括下述任何步骤：将所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置换为半胱氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置115的缬氨酸置换为异亮氨酸的步骤，将所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置换为精氨酸的步骤，和将所述氨基酸序列中位置42的组氨酸置换为亮氨酸的步骤。

36.修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括：

37.修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤。

38.修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，但不包括将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤。

39.修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤，但是既不包括将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，也不包括将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤。

40.修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的步骤，但是不包括下述任何步骤：将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，和将所述核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤。

41.修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75处编码苏氨酸的密码子置换为编码丝氨酸的密码子的步骤，但是不包括下述任何步骤：将所述核苷酸序列中核苷酸166-168处编码甘氨酸的密码子置换为编码半胱氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸343-345处编码缬氨酸的密码子置换为编码异亮氨酸的密码子的步骤，将所述核苷酸序列中核苷酸79-81处编码色氨酸的密码子置换为编码精氨酸的密码子的步骤，和将所述核苷酸序列中核苷酸124-126处编码组氨酸的密码子置换为编码亮氨酸的密码子的步骤。