JP2004166594A - メタノール資化性菌を用いたｌ−リジンまたはｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】メタノール資化性菌のＬ−アミノ酸生産性、特にＬ−リジンまたはＬ−アルギニンの生産性を向上させる。
【解決手段】メチロバチラス属細菌で、Ｌ−リジンの排出能が発揮できるＬ−リジン排出系を導入する事によるループ領域と、６個の疎水性ヘリックスとを有し、かつ、Ｌ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質の改変体をコードするＤＮＡであって、
野生型タンパク質が持つループ領域を持たない変異型タンパク質をコードし、かつ、メタノール資化性菌に導入したときにＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進するＤＮＡ、具体的にはｌｙｓＥ２４をメチロバチラス属細菌などのメタノール資化生菌に導入する。
【選択図】 図２

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−リジン又はＬ−アルギニンの製造法、および同製造法に用いる微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イロソイシン、Ｌ−バリン及びＬ−フェニルアラニン等のＬ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、ペニシリウム属、キャンディダ属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの微生物は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。
【０００３】
上記のような微生物育種や製造法の改良により、Ｌ−アミノ酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要のいっそうの拡大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−アミノ酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
ところで、従来、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノールから発酵法によりＬ−アミノ酸を製造する方法としては、アクロモバクター属およびシュードモナス属（特許文献１）、プロタミノバクター属（特許文献２）、プロタミノバクター属及びメタノモナス属（特許文献３）、ミクロサイクラス属（特許文献４）、メチロバチルス属（特許文献５）、バチルス属（特許文献６）などに属する微生物を用いる方法が知られている。本発明者らはこれまで、人工変異による育種および組換えＤＮＡ技術を使って、メチロフィラス属細菌を用いたＬ−アミノ酸製造法の開発を行ってきた（特許文献７）。
【０００５】
近年、Ｌ−アミノ酸を特異的に微生物の菌体の外部に排出する機能を持つタンパク質および遺伝子が同定され、特にＶｒｌｊｉｃらは、コリネバクテリウム属細菌からＬ−リジンの菌体外への排出に関与する遺伝子を同定した（非特許文献１）。この遺伝子はｌｙｓＥと名付けられ、同遺伝子をコリネバクテリウム属細菌において増強させることによって、コリネバクテリウム属細菌のＬ−リジン生産能が向上することが報告されている（特許文献８）。また、ｌｙｓＥはＬ−リジンだけでなくＬ−アルギニンも排出することが示されている（非特許文献２）。また、エシェリヒア・コリにおいてアミノ酸排出タンパク質の発現量を上昇させることにより、いくつかのＬ−アミノ酸の生産性を向上させることができることが知られている（特許文献９）。例えば、エシェリヒア・コリにおいては、ＯＲＦ３０６遺伝子の発現を増強することによって、シスチン、システイン等の生産性が向上することが報告されている（特許文献１０）。
しかし、これまでメタノール資化性菌を用いたメタノールからの発酵法によるアミノ酸製造に、アミノ酸の排出過程が、大きな障壁であることを示した例はない。また、メタノール資化細菌で、排出活性を発揮できる、アミノ酸排出遺伝子についての報告はない。
【０００６】
【特許文献１】
特開昭４５−２５２７３号公報
【特許文献２】
特公昭４９−１２５５９０号公報
【特許文献３】
特開昭５０−２５７９０号公報
【特許文献４】
特開昭５２−１８８８６号公報
【特許文献５】
特開平４−９１７９３号公報
【特許文献６】
特開平３−５０５２８４号公報
【特許文献７】
国際公開パンフレット第００／６１７２３号
【特許文献８】
国際公開パンフレット第９７／２３５９７号
【特許文献９】
特開平２０００−１８９１８０号
【特許文献１０】
欧州特許公開第８８５９６２号公報
【非特許文献１】
Ｖｒｌｊｉｃ Ｍ．， Ｓａｈｍ Ｈ．， Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２２：８１５−８２６（１９９６）
【非特許文献２】
Ｂｅｌｌｍａｎｎ Ａ．， Ｖｒｌｊｉｃ Ｍ．， Ｐａｔｅｋ Ｍ．， Ｓａｈｍ Ｈ．， Ｋｒａｍｅｒ Ｒ．， Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７：１７６５−１７７４（２００１）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安価に大量に入手可能なメタノールを用いて、効率良く、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンを製造する方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、メタノール資化性菌、とりわけメチロバチラス属細菌を利用してＬ−アミノ酸を製造する場合、Ｌ−アミノ酸の菌体外への排出過程が一つの障壁であること、そして、この障壁を打破する因子として、特にこの微生物にてアミノ酸の排出活性を発揮する遺伝子を取得することに成功し、これを利用することで効率の良いアミノ酸生産ができることを見いだした。
【０００９】
本発明者らは、既に知られているコリネバクテリウム属細菌由来のｌｙｓＥ遺伝子を、メタノール資化性菌に導入し、そのアミノ酸生産に及ぼす効果を調べたが、導入したｌｙｓＥ遺伝子には変異や欠損が生じ、ｌｙｓＥを機能させることはできなかった。排出を司るようなタンパク質は、細胞膜に組み込まれてその機能を発揮するため、タンパク質と膜の脂質組成などの状態とが両者で適切なものである必要がある。したがって、異種の生物に由来する膜タンパク質を、その機能を発揮する形で発現させることは困難であると考えられ、上述した結果は、それを裏付けるものであった。
【００１０】
本発明者らは、上記のＬ−アミノ酸の排出遺伝子に関する研究の過程において、偶然にもメタノール資化性菌において機能し得る変異遺伝子を取得した。また、同変異遺伝子を利用することで、メタノール資化性菌を用いたアミノ酸製造において、顕著な効果を見出した。
【００１１】
本発明は、上記のようにして完成するに至ったものであり、その要旨は以下のとおりである。
【００１２】
（１）ループ領域と、６個の疎水性ヘリックスとを有し、かつ、Ｌ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質の改変体をコードするＤＮＡであって、野生型タンパク質が持つループ領域を持たない変異型タンパク質をコードし、かつ、メタノール資化性菌に導入したときにＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進するＤＮＡが、発現可能な形態で導入され、かつ、Ｌ−リジンもしくはＬ−アルギニン生産能を有するメチロバチラス属細菌。
（２）前記変異タンパク質が実質的に疎水性ヘリックスのみからなる（１）記載のメチロバチラス属細菌
（３）前記変異タンパク質が６個の疎水性ヘリックスのすべてを有する（１）又は（２）に記載のメチロバチラス属細菌
（４）前記変異タンパク質がＮ末端から１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドとの複合体である（１）〜（３）のいずれか一項に記載のメチロバチラス属細菌
（５）前記タンパク質がＬｙｓＥタンパク質である（１）〜（４）のいずれか一項に記載のメチロバチラス属細菌
（６）前記ＬｙｓＥタンパク質がコリネ型細菌のＬｙｓＥタンパク質である（５）記載のメチロバチラス属細菌
（７）以下のタンパク質をコードするＤＮＡが、発現可能な形態で導入され、かつ、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有するメチロバチラス属細菌
（Ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、メタノール資化性菌においてＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のアミノ酸の細胞外への排出を促進する活性を有するタンパク質。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のメチロバチラス属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−リジン又はＬ−アルギニンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジン又はＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−リジンまたはＬ−アルギニンの製造法。
（９）前記培地がメタノールを主たる炭素源とすることを特徴とする（８）記載のＬ−リジン又はＬ−アルギニンの製造法。
【００１３】
本発明において、「Ｌ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進する」とは、本発明のＤＮＡを保持しないメタノール資化性菌に比べて、本発明のＤＮＡを保持するメタノール資化生菌を培養したときに培地中に排出されるＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の量を増大させることをいう。Ｌ−アミノ酸の細胞外への排出の促進は、その結果として、本発明のＤＮＡを保持しないメタノール資化性菌に比べて、本発明のＤＮＡを保持するメタノール資化生菌を培養したときに培地中に蓄積するＬ−アミノ酸濃度が高くなることによって観察される。また、Ｌ−アミノ酸の細胞外への排出の促進は、本発明のＤＮＡをメタノール資化性菌に導入したときに、細胞内のＬ−アミノ酸濃度が低下することによっても観察され得る。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、メタノール資化性菌に導入したときにＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進するＤＮＡであり、微生物のＬ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質の改変体をコードするＤＮＡである。
【００１６】
本発明のメチロバチラス属細菌とは、メチロバチラス属に属し、メタノールを主たる炭素源として生育することができる細菌であって、本発明のＤＮＡを導入することによってＬ−リジン又はＬ−アルギニン等のＬ−アミノ酸の細胞外への排出が促進される細菌である。具体的には、メチロバチラス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）、メチロバチラス・フラゲラタム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｌａｇｅｌｌａｔｕｍ）等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスとしては、Ｔ−１１株（ＮＣＩＭＢ １１３７５）、ＡＴＣＣ ２１２７６株、 ＡＴＣＣ ２１３７１株、ＡＴＲ８０株（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， （１９９４）、４２巻， ｐ６７−７２に記載）、Ａ５１３株（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， （１９９４）、４２巻， ｐ６７−７２に記載）等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスＮＣＩＭＢ １１３７５株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所 ＮＣＩＭＢ Ｌｔｓ．， Ｔｏｒｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏｎ １３５， Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ， Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ９ ８ＤＧ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。また、メチロバチラス・フラゲラタムとしては、ＫＴ株（Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， （１９８８）， １４９巻、ｐ４４１−４４６に記載）等が挙げられる。
【００１７】
本発明のメチロバチラス属細菌は、ループ領域と、６個の疎水性ヘリックスとを有し、かつ、Ｌ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、前記タンパク質がループ領域を持たないように、あるいは実質的に疎水性ヘリックスのみからなるように改変されたＤＮＡを導入することによって、取得することができる。「実質的に疎水性ヘリックスのみからなる」とは、変異型ＬｙｓＥがループ領域を完全に欠失しているか、あるいは一部を有していても、変異型ＬｙｓＥの機能に影響しない程度にループ領域のほとんどを欠失していることをいう。
【００１８】
本発明のメチロバチラス属細菌の一形態は、後記実施例に示すｌｙｓＥ２４と名付けられたＤＮＡが導入されたメチロバチラス属細菌である。ｌｙｓＥ２４は、コリネバクテリウム属細菌で報告されているｌｙｓＥ遺伝子のホモログとして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムから単離された遺伝子の変異体である。したがって、本発明のメチロバチラス属細菌に導入されたＤＮＡを、便宜的に「変異型ｌｙｓＥ」と称することがある。
【００１９】
ｌｙｓＥ遺伝子がコードするＬｙｓＥタンパク質は、６個の疎水性へリックス領域を有している。それらの疎水性へリックス領域のいくつかは膜貫通領域であると推定される。また、Ｎ末端から３番目と４番目の疎水性へリックス領域の間の領域は親水性であり、ループ構造をとると推定される。この親水性領域を本願発明においてはループ領域と呼ぶ。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型ｌｙｓＥの塩基配列及びＬｙｓＥタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号７及び８に示す。同アミノ酸配列において、疎水性へリックス領域は、５〜２０、３７〜５８、６７〜９３、１４６〜１６８、１８１〜２０３、２１１〜２３２に相当する。また、ループ領域は９４〜１４５に相当する。
【００２０】
本発明者らは、ｌｙｓＥ遺伝子はメタノール資化性菌においては致死的に働くが、ループ領域を持たない、あるいは実質的に疎水性ヘリックスのみからなるＬｙｓＥタンパク質の改変体をコードするＤＮＡは、メタノール資化性菌のＬ−リジン及び／又はＬ−アルギニンの細胞外への排出を促進することを見い出した。本発明のＤＮＡは、このような野生型ＬｙｓＥタンパク質が持つループ領域を持たない変異型ＬｙｓＥタンパク質、又は実質的に疎水性ヘリックスのみからなる変異型ＬｙｓＥタンパク質をコードする。
【００２１】
上記のような変異型ｌｙｓＥとしては、少なくとも一つ又は二つ以上の疎水性ヘリックスを有し、メタノール資化性菌に導入したときにＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進するものであれば特に制限されないが、具体的にはＮ末端から１番目〜６番目の疎水性ヘリックスのすべてを有する変異型ＬｙｓＥをコードするＤＮＡが挙げられる。より具体的には、Ｎ末端から１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドとをコードするＤＮＡが挙げられる。前記ｌｙｓＥ２４は、このような１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドとをコードする変異型ｌｙｓＥの一例である。ｌｙｓＥ２４遺伝子には、３番目の疎水性ヘリックスをコードする領域の下流に終止コドンが変異により導入されているが、後期実施例に示すように、この終止コドンよりも下流の領域を欠失させると、ｌｙｓＥ２４遺伝子を導入したメチロバチラス・グリコゲネスＮＣＩＭＢ １１３７５株はＬ−リジンを培地中に蓄積しなかった。このことから、１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドがそれぞれ別個に翻訳され、メチロバチラス・グリコゲネス株中で機能しているものと推定される。いずれにしても、ｌｙｓＥ２４遺伝子をメチロバチラス属細菌に導入すれば、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンの生産量が向上する。
【００２２】
前記のようなＬ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわちｌｙｓＥ遺伝子またはその相同遺伝子の供与微生物としては、それらの遺伝子の改変体がメタノール資化性菌中でＬ−リジン排出活性を発現することができるものを保持する微生物であれば、いかなる微生物でも利用できる。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。
【００２３】
メチロバチラス属細菌においてアミノ酸の排出遺伝子を増強する場合は、その遺伝子断片を、メチロバチラスで機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して、組換えＤＮＡを作製し、これをメチロバチラス属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。あるいは、トランスポゾンに搭載し、染色体への組み込みにより、また、メチロバチラス属細菌内で強力転写を誘導するようなプロモーターを、その遺伝子の上流に連結させることも可能である。
【００２４】
ｌｙｓＥを開示している文献（ＷＯ ９７／２３５９７）には、コリネ型細菌のｌｙｓＥ遺伝子をコリネ型細菌に導入した場合のみを提示している。そして、ＬｙｓＥを含む新しい排出系のタンパク質の構造体として、膜横断へリックスが６個のものを開示している。しかし、本発明者らは、メタノール資化性細菌においては、コリネ型細菌に由来するようなＬｙｓＥは全く機能しないことを確認した。更に、取得できた因子は、膜横断ヘリックス６個を１本のポリペプチドで構成しているコリネ型細菌の野生型ＬｙｓＥとは基本的な構造が異なる、新しい型の排出活性を発揮する因子であり、この因子は、先のｌｙｓＥ特許明細書からは全く類推できるものではない。
【００２５】
＜２＞本発明のメチロバチラス属細菌
本発明のメチロバチラス属細菌は、前記本発明のＤＮＡが発現可能な形態で導入され、かつ、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有するメチロバチラス属細菌である。Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有するメチロバチラス属細菌に本発明のＤＮＡを導入することによって得られる。また、本発明のＤＮＡが導入されたメチロバチラス属細菌に、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を付与することによっても、本発明のメチロバチラス属細菌を得ることができる。また、本発明のメチロバチラス属細菌は、本発明のＤＮＡが発現可能な形態で導入されたことによってＬ−リジン又はＬ−アルギニン生産能が付与されたものであってもよい。
【００２６】
Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有するメチロバチラス属細菌は、メチロバチラス属細菌の野生株にＬ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を付与することにより取得され得る。Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株の取得、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンの生合成系酵素が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、１９８６年５月３０日初版発行、第７７〜１００頁参照）。Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２７】
例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−ホモセリン、又はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを要求する変異株（特公昭４８−２８０７８号、特公昭５６−６４９９号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭５５−９７８４号、特開昭５６−８６９２号）、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。
【００２８】
また、Ｌ−アルギニン生産菌は、サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有する変異株；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有する変異株（特開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有する変異株（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐性を有する変異株（特開昭６２−２４０７５号）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有する変異株（特開平２−１８６９９５号）、５−アザウラシル、６−アザウラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシン、６−アザシトシン等に耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート、２−チオウラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシルに耐性な変異株（特開昭５７−１５０３８１号参照）、ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性な変異株（特開昭５２−１１４０９２号参照）、メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭５２−９９２８９号参照）、アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株（特公昭５１−６７５４号参照）、コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株（特開昭５８−９６９２号）、アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭５２−８７２９号参照）、アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性の変異株（特開昭５３−１４３２８８号参照）、及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭５３−３５８６号参照）として育種することができる。
【００２９】
次に、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素遺伝子の増強によってＬ−アミノ酸生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。
【００３０】
Ｌ−リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。
メチロバチラス属細菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、メチロバチラス属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをメチロバチラス属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をＤＤＰＳ、アスパルトキナーゼをＡＫ、アスパルトキナーゼＩＩＩをＡＫＩＩＩと略すことがある。
【００３１】
ＤＤＰＳをコードする遺伝子及びＡＫをコードする遺伝子の供与微生物としては、メチロバチラス属に属する微生物中でＤＤＰＳ活性及びＡＫ活性を発現することができる微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはＥ． ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））Ｋ−１２株及びメチロバチラス・グリコゲネスＮＣＩＭＢ １１３７５株等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳをコードする遺伝子（ｄａｐＡ、Ｒｉｃｈａｕｄ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ２９７（１９８６））及びＡＫＩＩＩをコードする遺伝子（ｌｙｓＣ、Ｃａｓｓａｎ， Ｍ．， Ｐａｒｓｏｔ， Ｃ．， Ｃｏｈｅｎ， Ｇ．Ｎ． ａｎｄ Ｐａｔｔｅ， Ｊ．Ｃ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６１， １０５２（１９８６））は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。以下、Ｅ． ｃｏｌｉ由来のｄａｐＡ及びｌｙｓＣを例として説明するが、本発明に用いる遺伝子は、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明に用いるＤＤＰＳ及びＡＫは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。Ｅ． ｃｏｌｉ由来の野生型ＤＤＰＳはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、Ｅ． ｃｏｌｉ由来の野生型ＡＫＩＩＩはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、メチロバチラス属細菌に導入するｄａｐＡ及びｌｙｓＣは、それぞれＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＤＤＰＳ及びＡＫＩＩＩをコードするものであることが好ましい。以下、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＤＤＰＳを「変異型ＤＤＰＳ」、変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡを「変異型ｄａｐＡ、又はｄａｐＡ^＊」と呼ぶことがある。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＥ． ｃｏｌｉ由来のＡＫＩＩＩを「変異型ＡＫＩＩＩ」、変異型ＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡを「変異型ｌｙｓＣ」と呼ぶことがある。
【００３３】
尚、本発明においては、ＤＤＰＳ及びＡＫは必ずしも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のＤＤＰＳはもともとＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られている。
【００３４】
Ｅ． ｃｏｌｉ由来の野生型ｄａｐＡの塩基配列を配列番号１３に、同塩基配列によってコードされる野生型ＤＤＰＳのアミノ酸配列を配列番号１４に例示する。
【００３５】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡとしては、１１８位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するＤＤＰＳをコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡとしては、３５２位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有するＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３６】
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、ｐＢＲ３２２、ｐＴＷＶ２２８、ｐＭＷ１１９、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００３７】
また、メチロバチラス属細菌で機能するベクターとは、例えばメチロバチラス属細菌で自律複製出来るプラスミドである。具体的には、広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０及びその誘導体、例えばｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｒｅｒｄｏｖ， Ａ．Ｙ．， Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ， Ｙ．Ｄ． Ｐｌａｓｍｉｄ， １９８６， １６， １６１−１６７）、あるいはｐＭＦＹ４２（ｇｅｎｅ， ４４， ５３（１９９０））、ｐＲＰ３０１、ｐＴＢ７０（Ｎａｔｕｒｅ， ２８７， ３９６， （１９８０））等が挙げられる。
【００３８】
ｄａｐＡ及びｌｙｓＣとメチロバチラス属細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、ｄａｐＡ及びｌｙｓＣを含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ｄａｐＡ及びｌｙｓＣは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。
【００３９】
変異型ＤＤＰＳをコードする変異型ｄａｐＡ及び変異型ＡＫＩＩＩをコードする変異型ｌｙｓＣを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドＲＳＦＤ８０が知られている（ＷＯ９５／１６０４２号）。同プラスミドで形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株は、ＡＪ１２３９６と命名され、同株は１９９３年１０月２８日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３９３６として寄託され、１９９４年１１月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８５９の受託番号のもとで寄託されている。ＲＳＦＤ８０は、ＡＪ１２３９６株から、公知の方法によって取得することができる。
【００４０】
上記のように調製した組換えＤＮＡをメチロバチラス属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４３． １９７（１９９７））が挙げられる。
【００４１】
ＤＤＰＳ活性及びＡＫ活性の増強は、ｄａｐＡ及びｌｙｓＣをメチロバチラス属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。メチロバチラス属細菌の染色体ＤＮＡ上にｄａｐＡ及びｌｙｓＣを多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ｄａｐＡ及び／又はｌｙｓＣをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のｄａｐＡ及ｌｙｓＣのコピー数が上昇する結果、ＤＤＰＳ活性及びＡＫ活性が増幅される。
【００４２】
ＤＤＰＳ活性及びＡＫ活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、ｄａｐＡ及ｌｙｓＣのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平１−２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ｄａｐＡ及ｌｙｓＣの発現が強化されることによってＤＤＰＳ活性及びＡＫ活性が増幅される。発現調節配列の増強は、ｄａｐＡ及ｌｙｓＣのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００４３】
遺伝子断片とベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８９）等に記載されている。
【００４４】
ＤＤＰＳ及びＡＫの増強に加えて、他のＬ−リジン生合成に関与する酵素を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（以上、ＷＯ９６／４０９３４号参照）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭６０−８７７８８号）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（特公平６−１０２０２８号）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。
【００４５】
また、メタノール資化性菌としてメチロフィラス・メチロトロファス由来のアスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素は、ＷＯ ００／６１７２３に開示されている。
【００４６】
さらに、本発明の微生物は、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（ＷＯ ９５／２３８６４参照）。
【００４７】
上記のＬ−リジン生合成に関与する酵素の活性を増強する手法は、Ｌ−アルギニンについても同様に適用することができる。
Ｌ−アルギニンは、例えば、アセチルオルニチンデアセチラーゼ活性、Ｎ−アセチルグルタミン酸−γ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、Ｎ−アセチルグルタモキナーゼ活性、及びアルギニノサクシナーゼ活性を増強することによって付与することができる（特公平５−２３７５０号）。
【００４８】
また、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＰ １ ０５７ ８９３ Ａ１）、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＥＰ ０ ９９９ ２６７ Ａ１）、カルバモイルリン酸シンセターゼ（ＥＰ １ ０２６ ２４７ Ａ１）、もしくはＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（特開昭５７−５６９３号参照）の活性を増強すること、又は、アルギニンリプレッサーをコードする遺伝子（ａｒｇＲ）を破壊することによって、Ｌ−アルギニン生産能を向上させることができる。
【００４９】
＜３＞Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンの製造
上記にようにして得られるＬ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有するメチロバチラス属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−リジン又はＬ−アルギニンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジン又はＬ−アルギニンを採取することにより、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンを製造することができる。
【００５０】
本発明で用いられる微生物は、通常メタノール資化性微生物の培養に用いられる方法で培養することができる。本発明で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられる。
【００５１】
メタノールを主たる炭素源として用いると、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンを安価に製造することができる。メタノールは、主たる炭素源として用いる場合は、培地中に０．００１〜３０％添加する。窒素源としては硫酸アンモニウムなどを培地に添加して用いる。これらの他に、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどの微量成分が少量添加される。
【００５２】
培養は、振とう培養又は通気撹拌培養などの好気条件下、ｐＨ５〜９、温度２０〜４５℃に保持して行われ、通常２４〜１２０時間で終了する。
培養物からのＬ−リジン又はＬ−アルギニンの採取は、通常イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
試薬は、特記しない限り和光純薬、又はナカライテスク社製のものを用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地もｐＨはＮａＯＨまたはＨＣｌで調整した。
【００５４】
（ＬＢ培地）
バクト・トリプトン（ディフコ社製） １０ｇ／Ｌ
酵母エキス（ディフコ社製） ５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ
ｐＨ７．０
［１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行った。］
【００５５】
（ＬＢ寒天培地）
ＬＢ培地
バクトアガー １５ｇ／Ｌ
［１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行った。］
【００５６】
（ＳＥＩＩ培地）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｎｅｎｅｒａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９） １２５， １３５， ３１５３−３１６４Ｓｉｌｍａｎ Ｎ． Ｊ．， Ｃａｒｖｅｒ Ｍ． Ａ． ＆ Ｊｏｎｅｓ Ｃ． Ｗ．参照。但し、若干の改変を加えた。）
Ｋ_２ＨＰＯ_４ １．９ｇ／Ｌ
ＮａＨ_２ＰＯ_４ １．５６ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ５ｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ５μｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ２５μｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２３μｇ／Ｌ
ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ７２ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ ９．７ｍｇ／Ｌ
ＣａＣＯ_３（関東化学製） ３０ｇ／Ｌ
メタノール ２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）
ｐＨ７．０
［メタノール以外は１２１℃、１５分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添加した。］
【００５７】
（ＳＥＩＩ寒天培地）
Ｋ_２ＨＰＯ_４ １．９ｇ／Ｌ
ＮａＨ_２ＰＯ_４ １．５６ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ５ｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ５μｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ２５μｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２３μｇ／Ｌ
ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ７２ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ ９．７ｍｇ／Ｌ
メタノール ０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）
ｐＨ７．０
バクトアガー（ディフコ社製） １５ｇ／Ｌ
［メタノール以外は１２１℃、１５分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添加した。］
【００５８】
【実施例１】
＜１＞ブレビバクテリウム属細菌由来のｌｙｓＥ遺伝子のメチロフィラス属細菌への導入
【００５９】
コリネバクテリウム属細菌で知られているＬ−リジンの排出を促進する遺伝子の相同遺伝子であるｌｙｓＥ遺伝子をブレビバクテリウム属細菌よりクローニングし、メチロフィラス属細菌での発現を試みた。
【００６０】
（１）ｐＲＳｌｙｓＥの構築
メチロフィラス属細菌にｌｙｓＥを導入するために、公知のプラスミドｐＲＳ（特表平３−５０１６８２号公報参照）を用いて、ｌｙｓＥ発現用プラスミドｐＲＳｌｙｓＥを構築した。ｐＲＳは、ＲＳＦ１０１０の誘導体である広宿主域ベクタープラスミドｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｒｅｒｄｏｖ， Ａ．Ｙ．， Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ， Ｙ．Ｄ． Ｐｌａｓｍｉｄ， １９８６， １６， １６１−１６７）に由来するｐＶＩＣ４０プラスミド（ＷＯ９０／０４６３６国際公開パンフレット、特表平３−５０１６８２号公報）より、同プラスミドが持つスレオニンオペロンをコードするＤＮＡ領域を削除してベクター部分のみを持つプラスミドである。
【００６１】
まず、ｐＲＳより、ｔａｃプロモーターを持つプラスミドｐＲＳｔａｃを図１に示す方法で構築した。ｐＲＳｔａｃプラスミドは、ｐＲＳベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルにて分離し、約８キロベースペア（以下、「ｋｂｐ」と記載）のＤＮＡ断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２（ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。一方、ｔａｃプロモーター領域を、ｐＫＫ２２３−３プラスミド（発現用ベクター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を鋳型とし、配列番号１および２に示すプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒のサイクルを３０サイクル行った）。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。増幅されたｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、あらかじプライマー中にデザインしておいた制限酵素サイト、すなわちＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した後、０．８％アガロースゲルにて分離し、約０．１５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２を用いて回収した。
【００６２】
上記のように調製したｐＲＳベクター消化物と、ｔａｃプロモーター領域断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、ｐＲＳｔａｃを得た。ｐＲＳベクター上のストレプトマイシン耐性遺伝子の転写方向とｔａｃプロモーターの転写方向が同じ向きになっているものを、ｐＲＳｔａｃとして選択した。
【００６３】
上記のようにして得たｐＲＳｔａｃを、Ｓｓｅ８３８７Ｉ（宝酒造製）およびＳａｐＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）で消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約９．０ｋｂｐのＤＡＮ断片を回収した。
【００６４】
また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ＡＴＣＣ１３８６９）より抽出した染色体を鋳型として、配列番号５および６に示すプライマーを用いたＰＣＲ法（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−９０秒）によりｌｙｓＥ遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。このとき、ｌｙｓＥ遺伝子がメチロフィラス属細菌中で発現可能となるように、ｌｙｓＥ遺伝子の翻訳開始コドンより９〜１５ｂｐ塩基を、メチロフィラス属細菌で機能することがわかっている配列（Ｗｙｂｏｒｎ， Ｎ． Ｒ．， Ｍｉｌｌｓ， Ｊ．， Ｗｉｌｌｉａｍｉｓ， Ｓ． Ｇ． ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， Ｃ．Ｗ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２４０， ３１４−３２２（１９９６））に変更するようにプライマーをデザインした。得られた断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＳａｐＩで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収し、０．８％アガロースゲルで回収した。
【００６５】
上記のように調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｌｙｓＥ遺伝子領域断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥを得た（図１）。ｐＲＳｌｙｓＥは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｌｙｓＥ遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【００６６】
（２）メチロフィラス属細菌へのｐＲＳｌｙｓＥの導入
上記のようにして得られたｐＲＳｌｙｓＥを、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４３． １９７ （１９９７））によりメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）に導入した。なお、対照として、ｐＲＳをｐＲＳｌｙｓＥと同様にしてＡＳ１株に導入した。その結果、対照として用いたｐＲＳでは１μｇのＤＮＡあたり数千個のコロニーを得たが、それに対してｐＲＳｌｙｓＥでは数個のコロニーしか得られなかった。
【００６７】
ｐＲＳｌｙｓＥが導入されたと思われる形質転換株よりプラスミドを抽出して塩基配列を調べたところ、調べたすべてのプラスミドにおいて、ｌｙｓＥをコードする領域内に自然変異が導入され、それらの変異のうちいくつかは、アミノ酸をコードするコドンが翻訳を停止させる停止コドンに置き換わるナンセンス変異が導入されていた。また、別のプラスミドではｌｙｓＥ遺伝子に欠失がみられた。これらのプラスミドに搭載されているｌｙｓＥは、いずれも、機能が失われていることが考えられた。また、このｌｙｓＥ遺伝子の機能を失わせるような形でｌｙｓＥをコードする領域の一部を意図的に欠失させたプラスミド（ｐＲＳｌｙｓＥΔ１）を作製し、メチロフィラス・メチロトロファスに導入を試みたところ、対照として用いたｐＲＳベクターと同等の頻度で導入できた。
前記ｐＲＳｌｙｓＥΔ１は、ｌｙｓＥをコードする領域内に存在するＰｖｕＩ（配列番号７の２０３−２０９位のＣＧＡＴＣＧを認識）からＭｌｕＩ（同４８５−４９１位のＡＣＧＣＧＴ）までの領域を欠失させたプラスミドであり、以下のようにして構築した。具体的には、ｐＲＳｌｙｓＥをＰｖｕＩおよびＭｌｕＩ（宝酒造製）にて消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて、混合し反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約１０ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造製）にて末端を平滑化した。これをＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２（宝酒造製）にて自己連結（セフルファイゲーション）させた。
上記の連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造社製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥΔ１プラスミドを得た。
【００６８】
以上のように、全長のｌｙｓＥ遺伝子を搭載するｐＲＳｌｙｓＥのメチロフィラス・メチロトロファスへの導入頻度は極めて低く、また機能を失わせるような変異が導入されたｌｙｓＥ変異遺伝子を持つプラスミドのみが導入できたことと併せて考えると、メチロフィラス・メチロトロファスにｌｙｓＥ遺伝子を導入することは致死的であると考えられた。このことは、ｌｙｓＥ遺伝子が異種の細菌においてＬ−リジンの排出に関して万能に機能するものではないことを示している。
【００６９】
変異が導入されたｐＲＳｌｙｓＥを持つメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株を、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩプレートに塗り広げ、３７℃にて１晩培養したのち、培地表面約０．３ｃｍ^２の菌体をかきとって２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３７℃にて３４時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。その結果、変異型ｌｙｓＥ遺伝子が導入されてもＬ−リジンの排出が促進されたと思われる株はほとんど得られなかった。
【００７０】
＜２＞メチロフィラス属細菌でＬ−リジン排出活性を示す遺伝子の取得
前項で述べたように、既知のｌｙｓＥ遺伝子はメチロフィラス属細菌中では致死的であることが示唆され、機能が失われたような変異型遺伝子が多く得られた。
【００７１】
変異が導入されたｐＲＳｌｙｓＥの解析を行ううちに、メチロフィラス属細菌中で機能する変異型ｌｙｓＥ遺伝子を取得することができた。
【００７２】
この変異型ｌｙｓＥ遺伝子をｌｙｓＥ２４遺伝子と命名した。ｌｙｓＥ２４遺伝子の塩基配列を解析したところ、この変異は、アミノ酸置換が起こる変異ではなく、ｌｙｓＥの翻訳領域内のほぼ中央に終止コドンが導入されるナンセンス変異であることがわかった。コリネバクテリウム属細菌のｌｙｓＥ遺伝子は６個の疎水性ヘリックスを持つ膜タンパク質であることが報告されている（Ｖｒｌｉｊｃ Ｍ．， Ｓａｈｍ Ｈ．， Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２２：８１５−８２６（１９９６））が、このｌｙｓＥ２４遺伝子は終止コドンが導入されているため、同遺伝子がコードするタンパク質は、野生型ｌｙｓＥ遺伝子がコードするＬｙｓＥタンパク質とは異なる構造を有し、この構造によってメチロフィラス属細菌中で機能することがわかった。
【００７３】
ｌｙｓＥ２４の塩基配列を決定した結果を配列番号９に示す。対照として野生型のｌｙｓＥの塩基配列を配列番号７に示した。ｌｙｓＥ２４では、配列番号７の３５５位のＧ（グアニン）のあとにＴ（チミン）が挿入されていた。このｌｙｓＥ２４を持つプラスミドをｐＲＳｌｙｓＥ２４と命名した（図１）。ｐＲＳｌｙｓＥ２４をあらためてＡＳ１株に導入したところ、ｐＲＳとほぼ同頻度でプラスミドが導入できた。プラスミド導入株について、＜１＞（２）と同様の方法で培養上清中のＬ−リジン濃度を測定した結果を、表１に示す。
【００７４】
【表１】

【００７５】
ｐＲＳｌｙｓＥ２４で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株はＡＪ１３８３０と命名され、同株は２００１年６月４日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３６９として寄託され、平成１４年５月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０４０の受託番号のもとで寄託されている。
【００７６】
尚、ｌｙｓＥ２４遺伝子から、前記変異により生成した終止コドンよりも下流の領域をさせたプラスミドすなわち、＜１＞（１）に記載のｐＲＳｌｙｓＥΔ１プラスミドを導入したＡＳ１株はＬ−リジンを培地中に蓄積しなかった。このことから、ｌｙｓＥ２４遺伝子では前半部分のペプチドだけでなく、後半部分のペプチドも発現し、複合体を形成しているものと考えられる。
【００７７】
【実施例２】
以上のようにコリネバクテリウム属細菌で知られているＬ−リジンの排出を促進する遺伝子の相同遺伝子であるｌｙｓＥ遺伝子は、メチロフィラス属細菌中では全く機能しないが、ｌｙｓＥ２４という改変体はメチロフィラス属細菌で機能することがわかった。そこで、次にメチロバチラス属細菌において、コリネバクテリウム属細菌のｌｙｓＥ遺伝子が機能するかどうか、また実施例１で得られたｌｙｓＥ２４が機能するかどうかを調べた。
【００７８】
（１）ｐＲＳｌｙｓＥ−Ｔｃの構築
メチロバチラス属細菌にコリネバクテリウム属細菌由来の野生型ｌｙｓＥを導入するために、まず実施例１にて構築したｐＲＳｌｙｓＥの薬剤耐性マーカーを、ストレプトマイシン耐性遺伝子からテトラサイクリン耐性遺伝子へと変更することにした。これは、使用したメチロバチラス属細菌はストレプトマイシンにもともと耐性を示すため、ストレプトマイシ耐性をマーカーとして使用することができないためである。
【００７９】
具体的には、まずｐＲＳｌｙｓＥを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、フェノール・クロロホルム混合溶液を加えて混合し、消化反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層の溶液を回収し、エタノール沈殿法にてＤＮＡ断片を回収した。これを０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離し、約１０ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ ｖｅｒ．２ （ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。
【００８０】
一方、テトラサイクリン耐性遺伝子領域は、ｐＲＫ３１０（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４） ２３９： ６２３−６６３に記載）を鋳型ＤＮＡとして、配列番号１１および１２に示すＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した（変性工程９４℃−２０秒、アニーリング工程５５℃−３０秒、伸長反応工程７２℃−６０秒の反応サイクルを３０サイクル実施した。）。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。増幅されたテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片はＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製後、エタノール沈澱法にて回収した。これを更に、あらかじプライマー中にデザインしておいた制限酵素サイト、すなわちＥｃｏＲＩで消化し、フェノール・クロロホルム混合液を加え、反応を停止させた。次に、この反応液を遠心分離し上層を回収し、エタノール沈澱法にてＤＮＡを回収した後、０．８％アガロースゲル電気泳動にて目的ＤＮＡ断片を分離し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
尚、テトラサイクリン耐性遺伝子は、ｐＲＫ３１０に代えて他のプラスミド、例えば、ｐＲＫ３１０の親プラスミドであるｐＲＫ２プラスミド（ＮＩＣＭＢからＮＩＣＭＢ１１９６８として入手可能。Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７５） １９０． １２２６−１２２８ または Ｐｌａｓｍｉｄ（１９８１） ５． １０−１９）を鋳型とし、上記と同様のＰＣＲ反応によっても、取得することができる。
【００８１】
上記のように調製したｐＲＳｌｙｓＥに由来するＤＮＡ断片と、テトラサイクリン耐性遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結させた。この反応液で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に出現したコロニーを、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振とう培養した。この培養液から、アルカリ−ＳＤＳ法にてプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して、そのプラスミドの構造を確認し、ｐＲＳｌｙｓＥ−Ｔｃを取得した。
【００８２】
（２）メチロバチラス属細菌へのｐＲＳｌｙｓＥ−Ｔｃの導入
上記のようにして得られたｐＲＳｌｙｓＥ−Ｔｃを、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４３． １９７ （１９９７））によりメチロバチラス・グリコゲネスＮＣＩＭＢ１１３７５株に導入した。なお、対照として、ｐＲＫ３１０をｐＲＳｌｙｓＥ−Ｔｃと同様にしてＮＣＩＭＢ１１３７５株に導入した。その結果、対照として用いたｐＲＫ３１０では１μｇのＤＮＡあたり数千個のコロニーを得たが、それに対してｐＲＳｌｙｓＥ−Ｔｃでは数個のコロニーしか得られなかった。このことから、メチロフィラス属細菌と同様に、メチロバチラス属細菌においてもコリネバクテリウム属細菌由来のｌｙｓＥ遺伝子は機能しないことがわかった。
【００８３】
（３）ｐＲＳｌｙｓＥ２４−Ｔｃの構築
次に、メチロバチラス属細菌においてｌｙｓＥ２４が機能するかどうかを確かめるために、実施例１にて構築したｐＲＳｌｙｓＥ２４プラスミドの薬剤耐性マーカーを、ストレプトマイシン耐性遺伝子からテトラサイクリン耐性遺伝子へと変更することにした。
具体的には、まずｐＲＳｌｙｓＥ２４を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、フェノール・クロロホルム混合溶液を加えて混合し、消化反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層の溶液を回収し、エタノール沈殿法にてＤＮＡ断片を回収した。これを０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離し、約１０ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ ｖｅｒ．２ （ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。
【００８４】
一方、テトラサイクリン耐性遺伝子断片は、前記と同様にして、配列番号１１及び１２のプライマーを用いたＰＣＲによりｐＲＫ３１０から同遺伝子領域を増幅し、ＥｃｏＲＩで消化することによって取得した。
【００８５】
上記のように調製したｐＲＳｌｙｓＥ２４に由来するＤＮＡ断片と、テトラサイクリン耐性遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結させた。この反応液で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し３７℃で一晩培養した。寒天培地上に出現したコロニーを、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振とう培養した。この培養液から、アルカリ−ＳＤＳ法にてプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して、そのプラスミドの構造を確認し、ｐＲＳｌｙｓＥ２４−Ｔｃを取得した。
【００８６】
（４）メチロバチラス属細菌へのｐＲＳｌｙｓＥ２４−Ｔｃの導入
上記のようにして得られたｐＲＳｌｙｓＥ２４−Ｔｃを、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４３． １９７ （１９９７））によりメチロバチラス・グリコゲネスＮＣＩＭＢ１１３７５株に導入した。なお、対照として、ｐＲＫ３１０をＮＣＩＭＢ１１３７５株に導入した。その結果、対照として用いたｐＲＫ３１０とほぼ同頻度でｐＲＳｌｙｓＥ２４−Ｔｃが導入できた。プラスミド導入株について＜１＞（２）と同様の方法で培養上清中のＬ−リジン濃度を測定した結果を、表２に示す。
【表２】

【００８７】ｌｙｓＥ２４遺伝子をメチロバチラス・グリコゲネスＮＩＣＭＢ１１３７５株に導入することによって、培地中にＬ−リジンが蓄積することがわかった。これは、Ｌ−リジンの排出が促進されたことによると考えられた。また、培養上清中の他のＬ−アミノ酸の濃度も調べたところ、ＮＣＩＭＢ１１３７５／ｐＲＳｌｙｓＥ２４−Ｔｃ株では、Ｌ−アルギニンが蓄積しており、ｌｙｓＥ２４はＬ−リジンだけでなく、Ｌ−アルギニン排出活性も持っていることがわかった。
【００８８】
以上の検討から、メチロフィラス属細菌で機能するｌｙｓＥ２４は、メチロバチラス属細菌でも機能することがわかった。
【００８９】
【実施例３】メチロバチラス・グリコゲネスへのＬ−リジン生合成系酵素遺伝子及びｌｙｓＥ２４遺伝子の導入
ｌｙｓＥ２４遺伝子をメチロバチラス・グリコゲネスＮＣＩＭＢ１１３７５株に導入することによって、培地中にＬ−リジンが蓄積することがわかった。これは、Ｌ−リジンの排出が促進されたことによると考えられた。
【００９０】
そこで、Ｌ−リジン生合成遺伝子が増強されたメチロバチラス・グリコゲネスにおけるｌｙｓＥ２４遺伝子導入の効果を調べた。
【００９１】
＜１＞ｄａｐＡ^＊遺伝子を持つプラスミドｐＲＳｄａｐＡの構築
Ｌ−リジン生合成系酵素遺伝子として、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子（ｄａｐＡ^＊）を持つプラスミドを作製した。
【００９２】
実施例１で作製したｐＲＳｔａｃをＳｓｅ８３８７ＩおよびＸｂａＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約８ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００９３】
ｄａｐＡ^＊遺伝子断片は、同遺伝子を含む公知のプラスミドＲＳＦＤ８０（ＷＯ９０／１６０４２号参照）を鋳型として、配列番号３および４に示すプライマーを用いたＰＣＲ法（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒）により増幅した。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。得られたｄａｐＡ^＊断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＸｂａＩで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収し、０．８％アガロースゲルで分離後、約０．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００９４】
上記のように調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｄａｐＡ^＊遺伝子領域断片を、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造社）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｄａｐＡプラスミドを得た。ｐＲＳｄａｐＡプラスミドは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｄａｐＡ^＊遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【００９５】
ｐＲＳｄａｐＡプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株はＡＪ１３８３１と命名され、同株は２００１年６月４日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３７０として寄託され、平成１４年５月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０４１の受託番号のもとで寄託されている。
【００９６】
＜２＞ｌｙｓＥ２４及びｄａｐＡ^＊を持つプラスミドｐＲＳｌｙｓＥ２４−ｄａｐＡ−Ｔｃの構築
ｌｙｓＥ２４とｄａｐＡ^＊の組み合わせ効果を評価するために、ｐＲＳｌｙｓＥ２４プラスミドにｄａｐＡ^＊遺伝子を挿入したプラスミドを、図２に示した方法で構築した。
実施例１で作製したｐＲＳｌｙｓＥ２４を制限酵素ＳａｐＩで消化し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）にて末端を平滑化した。また、ｄａｐＡ＊を持つプラスミドｐＲＳｄａｐＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｐＩで消化し、０．８％アガロースゲルにより約１ｋｂｐのｔａｃプロモーターおよびｄａｐＡ＊領域を含む断片を分離し、同断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ Ｖｅｒ２（宝酒造製）にて回収した。この断片を前記と同様に平滑化し、前記のｐＲＳｌｙｓＥ２４の消化物とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２（宝酒造製）にて連結した。
【００９７】
上記の連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、宝酒造社製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドを得た。
ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株はＡＪ１３８３２と命名され、同株は２００１年６月４日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３７１として寄託され、平成１４年５月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０４２の受託番号のもとで寄託されている。
【００９８】
次に、ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドの薬剤耐性マーカー遺伝子を、ストレプトマイシン耐性遺伝子からテトラサイクリン耐性遺伝子へと変更した。まず、ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、フェノール・クロロフォルム混合溶液を加えて混合し、消化反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層の溶液を回収し、エタノール沈殿法にてＤＮＡ断片を回収した。これを０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離し、約１１ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ ＴＲＡＰ ｖｅｒ．２ （ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。
【００９９】
一方、テトラサイクリン耐性遺伝子断片は、実施例１と同様にして、配列番号１１及び１２のプライマーを用いたＰＣＲによりｐＲＫ３１０から同遺伝子領域を増幅し、ＥｃｏＲＩで消化することによって取得した。
【０１００】
上記のように調製したｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡに由来するＤＮＡ断片と、テトラサイクリン耐性遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結させた。この反応液で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し３７℃で一晩培養した。寒天培地上に出現したコロニーを、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。この培養液から、アルカリ−ＳＤＳ法にてプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して、そのプラスミドの構造を確認し、ｐＲＳｌｙｓＥ−ｄａｐＡ−Ｔｃを取得した。
【０１０１】
（２）メチロバチラス・グリコゲネスＮＣＩＭＢ１１１３７５株へのｐＲＳｌｙｓＥ−ｄａｐＡ−Ｔｃの導入とアミノ酸の製造
上記の方法で得られたｐＲＳｌｙｓＥ−ｄａｐＡ−Ｔｃプラスミドを、エレクトロポレーション法によりメチロバチラス・グリコゲネスＮＣＩＭＢ１１１３７５株に導入した。得られた形質転換株（以下、「ＮＣＩＭＢ１１１３７５／ｐＲＳｌｙｓＥ−ｄａｐＡ−Ｔｃ」ともいう）、前記のｐＲＳｌｙｓＥ２４−Ｔｃが導入された株（以下、「ＮＣＩＭＢ１１１３７５／ｐＲＳｌｙｓＥ−Ｔｃ」ともいう）、および対照としてｐＲＫ３１０を導入した株（以下、「ＮＣＩＭＢ１１１３７５／ｐＲＫ３１０」ともいう）について、以下のように培養し、培養液上清中のＬ−アミノ酸濃度を調べた。
【０１０２】
各形質転換株を、１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＳＥＩＩプレートに塗り広げ、３０℃にて２晩培養したのち、培地表面約１０ｃｍ^２の菌体をかきとって１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３０℃にて６０時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。結果を表３に示す。ＮＣＩＭＢ／ｐＲＳｌｙｓＥ−ｄａｐＡ−Ｔｃ株では、ｐＲＳｌｙｓＥ２４−Ｔｃを導入した株と比較して、培地中のＬ−リジン蓄積量はさらに向上する事がわかった。つまり、ｌｙｓＥ２４遺伝子の導入により、排出における律速が解除され、ｄａｐＡ^＊遺伝子増強効果が相乗的に表れたと考えられる。
【０１０３】
【表３】

【０１０４】
【発明の効果】
本発明により、メタノール資化性菌のＬ−アミノ酸生産性、特にＬ−リジン及びＬ−アルギニンの生産性を向上させることができる。
【０１０５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ｔａｃプロモーターを持つプラスミドｐＲＳｔａｃ、及びｐＲＳｔａｃにｌｙｓＥ遺伝子又はｌｙｓＥ２４遺伝子が挿入されたプラスミドｐＲＳｌｙｓＥ及びｐＲＳｌｙｓＥ２４の構築を示す図。
【図２】ｌｙｓＥ２４遺伝子とｄａｐＡ^＊遺伝子を持つプラスミドｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡの構築を示す図。

Claims (9)

1. ループ領域と、６個の疎水性ヘリックスとを有し、かつ、Ｌ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質の改変体をコードするＤＮＡであって、野生型タンパク質が持つループ領域を持たない変異型タンパク質をコードし、かつ、メタノール資化性菌に導入したときにＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進するＤＮＡが、発現可能な形態で導入され、かつ、Ｌ−リジンもしくはＬ−アルギニン生産能を有するメチロバチラス属細菌。
2. 前記変異タンパク質が実質的に疎水性ヘリックスのみからなる請求項１記載のメチロバチラス属細菌。
3. 前記変異タンパク質が６個の疎水性ヘリックスのすべてを有する請求項１又は２に記載のメチロバチラス属細菌。
4. 前記変異タンパク質がＮ末端から１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドとの複合体である請求項１〜３のいずれか一項に記載のメチロバチラス属細菌。
5. 前記タンパク質がＬｙｓＥタンパク質である請求項１〜４のいずれか一項に記載のメチロバチラス属細菌。
6. 前記ＬｙｓＥタンパク質がコリネ型細菌のＬｙｓＥタンパク質である請求項５記載のメチロバチラス属細菌。
7. 以下のタンパク質をコードするＤＮＡが、発現可能な形態で導入され、かつ、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有するメチロバチラス属細菌。
   （Ａ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
   （Ｂ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、メタノール資化性菌においてＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のアミノ酸の細胞外への排出を促進する活性を有するタンパク質。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のメチロバチラス属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−リジン又はＬ−アルギニンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジン又はＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−リジン又はＬ−アルギニンの製造法。
9. 前記培地がメタノールを主たる炭素源とすることを特徴とする請求項８記載のＬ−リジン又はＬ−アルギニンの製造法。

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