WO2006059715A1

WO2006059715A1 - メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジン及びｌ－アルギニンの製造法

Info

Publication number: WO2006059715A1
Application number: PCT/JP2005/022180
Authority: WO
Inventors: Yoshiya Gunji; Hisao Ito
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2004-12-03
Filing date: 2005-12-02
Publication date: 2006-06-08
Also published as: JP2008043201A

Abstract

　ループ領域と、６個の疎水性ヘリックスとを有するコリネ型細菌のLysEタンパクをコードする塩基配列において、前記ループ領域をコードする領域が、終止コドンが３種類の翻訳の読み枠全てに存在するように改変された塩基配列を有し、かつメタノール資化性細菌に導入されたときに該細菌のＬ－リジンもしくはＬ－アルギニン又はこれらの両方のＬ－アミノ酸の細胞外への排出を促進するＤＮＡをメチロフィラス属細菌などのメタノール資化性細菌に導入し、得られた細菌をＬ－リジン及びＬ－アルギニンの生産に用いる。

Description

明細書

メタノール資化性細菌を用レ、たし -リジン及び L -アルギニンの製造法技術分野

[0001] 本発明は L リジン及び Z又は L アルギニンの細胞外への排出を促進する新規変異型 LysEタンパク質をコードする DNA、並びに該 DNAが導入されたメタノール資化性細菌に関する。本発明はまた、該メタノール資化性細菌を用いた発酵法による L リジン又は L アルギニンの製造法に関するものである。

背景技術

[0002] L リジン、 L グルタミン酸、 L—スレオ-ン、 L ロイシン、 L—イロソイシン、 L— ノリン及び L—フエ-ルァラニン等の L—アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバタテリゥム属、バチルス属、ェシエリヒア属、ストレプトミセス属、シユードモナス属、ァースロバクター属、セラチア属、ぺニシリウム属、キャンディダ属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの微生物は、生産性を向上させるために、自然界力分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。また、組換え DNA技術により L アミノ酸の生合成酵素を増強することによって、 L -ァミノ酸の生産能が向上した微生物も用いられている。

[0003] 上記のような微生物を用いることにより、 L アミノ酸の生産性はかなり高まってはいる力今後の需要のいっそうの拡大に応えるためには、さらに安価かつ効率的な L アミノ酸の製造法の開発が求められている。

[0004] ところで、従来、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノール力発酵法により L アミノ酸を製造する方法としては、ァクロモパクター属およびシユードモナス属 (特許文献 1)、プロタミノバクター属（特許文献 2)、プロタミノバクター属及びメタノモナス属 (特許文献 3)、ミクロサイクラス属 (特許文献 4)、メチロバチルス属 (特許文献 5 )、バチルス属 (特許文献 6)などに属する微生物を用いる方法が知られている。本発明者らはこれまで、人工変異による育種および組換え DNA技術を使って、メチロフィラス属細菌を用ヽた L アミノ酸製造法の開発を行つてきた (特許文献 7)。

[0005] ェシエリヒア'コリにおいてアミノ酸排出タンパク質の発現量を上昇させることにより、いくつかの L アミノ酸の生産性を向上させることができることが知られている（特許文献 8)。例えば、ェシエリヒア'コリにおいては、 ORF306遺伝子の発現を増強することによって、シスチン、システィン等の生産性が向上することが報告されている (特許文献 9)。

[0006] 近年、 L アミノ酸を特異的に微生物の菌体の外部に排出する機能を持つタンパク質および遺伝子がいくつか同定され、特に Vrljicらは、コリネバタテリゥム属細菌から L リジンの菌体外への排出に関与する遺伝子を同定した (非特許文献 1)。この遺伝子は lysEと名付けられ、同遺伝子をコリネパクテリゥム属細菌において増強させることによって、コリネバタテリゥム属細菌の L リジン生産能が向上することが報告されている（特許文献 10)。

[0007] 我々はこれまでに、上記 lysE遺伝子はメタノール資化性細菌に導入することができず、機能出来ないことを発見し、メタノール資化性細菌で L-リジン排出活性を発揮するような改変体 lysE遺伝子を取得した。我々は上記の改変体 lysE遺伝子を使うことで、 L-リジンを効率よく生産させることができることを明らかにし、メチロフイラス属細菌を用いた L—アミノ酸製造法の開発を行ってきた (特許文献 11)。しかし、この改変体 Ly sEである LysE24の L-リジン排出活性は充分でなぐさらに効率よく L-リジンを分泌させ、培地中に蓄積させ、生産するためにはさらなる排出活性の向上が望まれた。特許文献 1：特開昭 45 - 25273号公報

特許文献 2：特公昭 49— 125590号公報

特許文献 3：特開昭 50 - 25790号公報

特許文献 4:特開昭 52— 18886号公報

特許文献 5：特開平 4 - 91793号公報

特許文献 6：特開平 3 - 505284号公報

特許文献 7 :国際公開第 00Z61723号パンフレット

特許文献 8：特開 2000— 189180号公報

特許文献 9：欧州特許 885962号明細書

特許文献 10：国際公開第 97Z23597号パンフレット

特許文献 11 :特開 2004— 166594号公報非特許文献 1 : Molecular Microbiology 22:815-826(1996)

発明の開示

[0008] 本発明は、安価に大量に入手可能なメタノールを用いて、効率良ぐ L リジン又は L アルギニンを製造する方法を提供することを課題とする。

[0009] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、メタノール資化性細菌、とりわけメチロフイラス属細菌を利用して L—アミノ酸を製造する場合、 Lys E蛋白質をコードする DNAにおいてループ領域をコードする DNA領域に翻訳が完全に停止するように 3種類の翻訳の読み枠すべてに終止コドンが存在するような変異を導入した変異型 DNAを細菌に導入することによって、該細菌の L-リジンの分泌効率を向上することを見出した。このようなメタノール資化性細菌を利用することで効率の良い L-アミノ酸生産が可能であることを見出し、本発明を完成させた。

[0010] すなわち本発明は以下のとおりである。

(1)ループ領域と、 6個の疎水性へリックスとを有するコリネ型細菌の LysEタンパクをコードする塩基配列において、前記ループ領域をコードする領域力終止コドンが 3 種類の翻訳の読み枠全てに存在するように改変された塩基配列を有し、かつメタノール資化性細菌に発現可能な状態で導入されたときに該細菌による L リジンもしくは L アルギニン又はこれらの両方の L アミノ酸の細胞外への排出を促進する DNA

(2)前記終止コドン力 STGA,TAG,及び TAAから選択される（1)の DNA。

(3)前記終止コドン力配列番号 1における塩基番号 354〜393の領域に導入されたことを特徴とする（1)の DNA。

(4)前記メタノール資化性細菌力メチロフイラス属細菌、又はメチロバチルス属細菌である（1)〜（3)の!、ずれかの DNA。

(5) 前記 DNAが、下記（a)又は（b)に示す DNAである（1)〜（4)のいずれかの DN

A。

(a)配列番号 3に記載の塩基配列を含む DNA、

(b)配列番号 3に記載の塩基配列又は同塩基配列力調製され得るプローブとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、配列番号 3の塩基番号 373 〜383の配列を含み、かつ、メタノール資化性細菌に発現可能な状態で導入されたときに該細菌による L リジンもしくはしアルギニン又はこれらの両方の L アミノ酸の細胞外への排出を促進する DNA。

(6) (1)〜（5)のいずれかの DNA力発現可能な状態で導入され、かつ、 L リジン又は L アルギニン生産能を有するメタノール資化性細菌。

(7)メチロフイラス属細菌、又はメチロバチルス属細菌である（6)のメタノール資化性細菌。

(8) (6)又は（7)のメタノール資化性細菌を培地に培養し、培養物中に L—リジン又はし -アルギニンを生産蓄積させ、該培養物から L -リジン又は L -アルギニン酸を採取することを特徴とする L リジン又は L アルギニンの製造法。

(9)前記培地力 Sメタノールを主たる炭素源とすることを特徴とする（8)の L—リジン又はしァノレギニンの製造法。

図面の簡単な説明

[0011] [図 l]LysEタンパクの構造を示す図。

[図 2]終止コドンの導入位置の塩基配列 (配列番号 3の塩基 352— 386)及び各翻訳フレーム及び野生型のアミノ酸配列を示す図。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 以下、本発明を詳細に説明する。

< 1 >本発明の DNA

本発明の DNAは、ループ領域と、 6個の疎水性へリックスとを有するコリネ型細菌の LysEタンパクをコードする塩基配列にぉ、て、前記ループ領域をコードする領域力終止コドンが 3種類の翻訳の読み枠全てに存在するように改変された塩基配列を有し、かつメタノール資化性細菌に導入されたときに該細菌の L リジンもしくはしアルギニン又はこれらの両方の L アミノ酸の細胞外への排出を促進する DNAである。

[0013] lysE遺伝子がコードする LysEタンパク質は、 6個の疎水性へリックス領域を有している（Vrljic M., Sahm H.， Eggeling L. Molecular Microbiology 22:815-826(1996))。それらの疎水性へリックス領域のいくつかは膜貫通領域であると推定される。また、 N末端から 3番目と 4番目の疎水性へリックス領域の間の領域は親水性であり、ループ構造をとると推定される。この親水性領域を本願発明においてはループ領域と呼ぶ。ブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタムの野生型 lysEの塩基配列及び LysEタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号 1、 2に示す。配列番号 2のアミノ酸配列において、疎水性へリックス領域 1〜6はそれぞれ、アミノ酸番号 5〜20、 37〜58、 67〜93 、 146〜168、 181〜203、 211〜232の領域に相当する。また、ループ領域はアミノ酸番号 94〜145の領域に相当する。疎水性へリックス領域 1〜3を含む領域を配列番号 4に、疎水性へリックス領域 1〜3を含む領域を配列番号 5に示した。

本発明の DNAは、上記のような LysEタンパク質をコードする塩基配列において、ループ領域をコードする領域が、終止コドンが 3種類の翻訳の読み枠全てに存在するように改変された配列を有する。

LysEタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号 1の塩基配列が挙げられるが、 L-リジン排出能を有するタンパク質をコードする限り、配列番号 1の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズしうる配列であってもよい。なお、「ストリンジェントな条件」とは、通常のサザンノヽイブリダィゼーシヨンの洗ヽの条件である 60°C、 1 X SSC, 0. 1⁰/₀SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、 0. 1%S DSに相当する塩濃度で 1回、好ましくは 2回洗浄する条件が挙げられる。また、 L-リジン排出能を有するタンパク質をコードする限り、配列番号 1の塩基配列と 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%、特に好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相同な塩基配列を有する塩基配列であってもよ!/ヽ。またコリネ型細菌は、コリネ型細菌の種ゃ菌株によって lysEをコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、上記のようなストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズしうる配列であってもよぐ相同な塩基を有する塩基配列であってもよい。

ループ領域をコードする領域としては、配列番号 1の塩基配列の塩基番号 280〜4 35の領域、又はこれに相当する領域が挙げられる。

終止コドンとして具体的には、 TGA,TAA,又は TAGが挙げられる。「ループ領域をコードする領域力終止コドンが 3種類の翻訳の読み枠全てに存在するように改変された」とは、該領域に含まれる塩基に置換が導入されて終止コドンが 3種類の翻訳の読み枠全てに存在するようになったことや、該領域の 3種類の翻訳の読み枠全てに終止コドンが挿入されたことや、該領域が終止コドンが 3種類の翻訳の読み枠全てに存在するような別の配列に置換されたことを含む。なお、終止コドンは各読み枠において 2個以上存在してもよい。尚、このような 3種類の翻訳の読み枠全てに終止コドンが挿入された変異 ¾ hree-frame stop codonといい、タンパク質等の翻訳を完全に停止させ、目的タンパク質のみを効率よく発現させるために開発された技術であり、 (Ralf F.Petterssonら Gene ,24(1983) 15- 27) pEXPRESS等多くのタンパク質発現ベクターで応用されている。（Forman BMら Gene 1991 Aug 30;105(1)9— 15 )

[0015] 終止コドンの導入は、当業者に良く知られた方法にて部位特異的変異を行えばよいが、たとえば、 lysE遺伝子の該当領域を Promega社の部位特異的変異導入用べクター pSELECTTM-1に組込み、同社の部位特異変異導入キット Altered Sites™を用いて 3種類の終止コドンを導入することで、本発明の DNAを得ることができる。また、変異を含む配列を有する PCRプライマーを用いて、該当箇所を増幅する当業者によく知られたオーバーラップエクステンション PCR法を用いて、変異を含む lysE遺伝子を増幅してクロー-ングすることができる。（Urban, A" Neukirchen, S. and Jaeger, K. E., A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overla p extension PCR. Nucleic Acids Res, 25, 2227—8. (1997).)

なお、本発明の DNAは、既に 1つの終止コドンが導入されている lysE24遺伝子（特開 2004— 166594号公報）を利用して作製しても良い。

[0016] 本発明の DNAはメタノール資化性細菌に導入された場合に、該細菌による L-リジン又は L-アルギニンの排出を促進させる。

本発明において、「L—リジンもしくは L—アルギニン又はこれらの両方の Lーァミノ酸の細胞外への排出を促進する」とは、本発明の DNAをメタノール資化性細菌に導入したときに、該細菌によって培地中に排出される L リジンもしくは L アルギニン又はこれらの両方の L アミノ酸の量を増大させることを、う。 L アミノ酸の細胞外への排出の促進は、その結果として、本発明の DNAを保持しないメタノール資化性細菌に比べて、本発明の DNAを保持するメタノール資化性細菌を培養したときに培地中に蓄積する L アミノ酸濃度が高くなることによって観察される。また、 L アミノ酸の細胞外への排出の促進は、本発明の DNAをメタノール資化性細菌に導入したときに、細胞内の L -アミノ酸濃度が低下することによつても観察され得る。

[0017] 本発明の DNAは、 3種類の読み枠全てに終止コドンを有し、メタノール資化性細菌に導入したときにしリジンもしくはしアルギニン又はこれらの両方の細胞外への排出を促進するものであれば特に制限されないが、 N末端から 1番目〜3番目の疎水性へリックスを含むペプチドと、 4番目〜6番目の疎水性へリックスを含むペプチドの 2 つのペプチドをコードする DNAが好ましい。すなわち、終止コドンが導入されたことにより、 1番目〜3番目の疎水性へリックスを含むペプチドで翻訳がー且終結する力翻訳が再開してループ領域の下流の 4番目〜6番目の疎水性へリックスを含むぺプチドを生じさせるような DNAが好まし、。

lysE遺伝子のループ領域をコードする領域に終止コドンを導入しても、翻訳が再開して、下流の 4番目〜6番目の疎水性へリックスを含むペプチドが 1番目〜3番目の疎水性へリックスを含むペプチドとともに生じることが、本発明者らによってなされた以下の実験により強く示唆される。

[0018] すなわち、 lysE遺伝子の 4番目〜6番目の疎水性へリックスを含む領域を欠失した D NAが導入されたメチロフィラス'メチロトロファス AS1株は L リジンを培地中に蓄積しなかった。これに対し、特開 2004— 166594で示される lysE24遺伝子（ループ領域に一個の終止コドンを含む）や、本願の lysE24m5遺伝子（ループ領域の 3種類全ての読み枠に終止コドンを含む）が導入されたメチロフィラス'メチロトロファス AS1株は L— リジンを培地中に蓄積した。

このこと力ら、 1番目〜3番目の疎水性へリックスを含むペプチドと、 4番目〜6番目の疎水性へリックスを含むペプチドがそれぞれ別個に翻訳され、メチロフィラス'メチロトロファス中で機能しているものと推定される。

[0019] これまで、 LysE24蛋白質は N末端から 1番目〜3番目の疎水性へリックスを含むぺプチドと、 4番目〜6番目の疎水性へリックスを含むペプチドからなり、野生型の LysE蛋白質では 3番目の疎水性へリックスと 4番目のへリックスの間に存在するループ領域を持たな、ことが示唆されて、た（特開 2004— 166594)。これは 3番目の疎水性ヘリックスをコードする DNA領域の下流に存在する終止コドンで翻訳がー且停止し、その下流に存在するいずれかの開始コドン力翻訳が再開するためにそのような構造を持つと考えられるためである。これまで、複数ある翻訳再開位置については決定されていなかったが、以下の方法で再開位置を決定し、 LysE24の 1番目〜3番目の疎水性へリックスを含むペプチド（配列番号 4)と、 4番目〜6番目の疎水性へリックスを含むペプチド (配列番号 5)の配列を決定することができた。

すなわち、特開 2004— 166594で示される lysE24遺伝子において、翻訳の再開の際に開始コドンとして利用される可能性のあるコドンを改変してその影響を調べた。ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタムの野生型 lysEの塩基配列及び LysEタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号 1及び 2に示す。配列番号 2においてループ領域はァミノ酸番号 94〜 145の領域に相当する。 lysE24配列で 3番目の疎水性へリックスのすぐ下流に存在する終止コドンより下流側で、開始コドンとなりうるコドン、具体的には A TG, GTG, TTGの 3種をすベて列挙し、部位特異的変異導入によりその開始コドンをひとつずつ非開始コドンに置換した遺伝子を作成した。具体的には配列番号 1における 388〜390番目の GTG、同様に 394〜396番目の GTG、 400〜402番目の GT G、 427〜429番目の GTG、 436〜438番目の ATG、 442〜444番目の ATGの 6箇所を開始コドン候補とした。 4番目〜6番目の疎水性へリックスは LysEの活性に必須であると考えられ、 444番目より下流のコドンは 4番目の疎水性へリックスをコードする領域となるので候補外とした。翻訳の再開位置候補のコドンを GTGの場合は GTCに、 ATGの場合は CTGに置換した変異遺伝子を作成し、メチロフィラス 'メチロト口ファスに導入したところ、 394番目の G力ら 396番目の G (GTG)、 400番目の Gから 402番目の G (GTG)をそれぞれ GTCに置換した場合に L—リジンの分泌活性が大幅に減少し、それ以外の箇所を変更した場合、 L-リジンの分泌活性はあまり低下しな力つたこと力ら、この 394〜396番目の GTG、 400〜402番目の GTGの 2つのコドンの少なくとも一方あるいは両方が翻訳の再開位置であることがわ力つた。このことにもとづき、 1 番目〜3番目の疎水性へリックスを持つペプチドのアミノ酸配列は配列番号 4に示す配列になり、 4番目〜6番目の疎水性へリックスを持つペプチドのアミノ酸配列は配列番号 5に示す配列となる。なお、配列番号 5は 394〜396番目の GTGを再開位置とした場合の 4番目〜6番目の疎水性へリックスを持つペプチドのアミノ酸配列である。 [0021] したがって、ループ領域をコードする領域は、 394〜396番目の GTG、 400〜402 番目の GTGの 2つのコドンを有し、 3種類の終止コドンがこれらのコドンの 5，側に存在する配列が好ましい。すなわち、本発明の DNAは、配列番号 1の塩基配列又はその相同配列において、塩基番号 280〜393の領域に 3種類の読み枠それぞれの終止コドンが導入されたものであることが好ましぐ塩基番号 354〜393の領域に 3種類の読み枠それぞれの終止コドンが導入されたものであることがより好ましい。

[0022] 本発明の DNAの一形態は、後記実施例に示す lysE24m5と名付けられた DNA (配列番号 3)である。 lysE24m5は、上記 lysE24遺伝子の変異体である。本発明の DNA を、便宜的に「改良型 lysE24」と称することがある。ただし、本発明の DNAは lysE24を改変して得られる DNAには限られず、野生型 lysE遺伝子のループ領域をコードする領域に直接 3種類の読み枠の終止コドンを導入することによって得られるものも含まれる。

[0023] lysE24m5の DNAは、 LysE24遺伝子（配列番号 10)の終止コドン（塩基番号 373— 3 75)の下流にさらに他の 2種類の読み枠の終止コドンが続くように変異が導入されたものであり、翻訳が完全に停止するように 3種類の翻訳の読み枠すべてが終止コドンとなるような配列を有するものである。

なお、 LysE24は野生型の LysE遺伝子（配列番号 1)の 355位の G (グァニン）のあとに T (チミン）が挿入されて、野生型の LysEタンパクとは読み枠が異なる変異 (フレームシフト変異ともいう）が導入されたものである。

lysE24遺伝子は上述のように T残基が導入されることによって、フレームシフト変異が起こり、本来終止コドンとして機能しない配列番号 10 (変異型 LysE24)の塩基番号 373— 375番目 TGAが終止コドンとして機能している。

lysE24m5の DNAは、この TGAコドンの下流に仮に読み枠がずれて翻訳が行われた場合にも、終止コドンが出現するような変異を導入したものであり、即ち、配列番号 10 の 377— 379番目の acg、 381-383番目の caaをそれぞれ終止コドンに置換する変異を導入したものである。なお、 lysE24m5のループ領域に含まれる 3種類の終止コドンは、 TGA,TAG,TAA力選択される任意の組合わせの終止コドンに置換されてもよ!、。

[0024] 本発明の改良型 lysE24遺伝子は、ループ領域をコードする領域に 3種類の読み枠の終止コドンを含み、かつメタノール資化性細菌に導入された場合に、該細菌による L-リジン、又は L-アルギニンの排出を促進できる DNAである限り、配列番号 4のァミノ酸配列にお、て 1若しくは複数の位置での 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む配列を有するペプチド、および配列番号 5のアミノ酸配列において 1若しくは複数の位置での 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む配列を有するペプチドをコードする DNAであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる力具体的には 2から 30個、好ましくは、 2から 20個、より好ましくは 2から 10個である。

[0025] 本発明の DNAが配列番号 4又は 5のアミノ酸配列にぉ、てアミノ酸置換を含む配列をコードする DNAである場合、その置換は、タンパク質の活性が維持されるような保存的置換である。置換は、アミノ酸配列中の少なくとも 1残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。酵素タンパクの元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、 alaから ser又は thrへの置換、 argから gln、 his又は lysへの]^換、 asn力ら glu、 gln、 lys、 his又は aspへの置換、 asp»り asn、 glu又は ginへの換、 cys力ら ser又は alaへの換、 gin力ら asn、 glu、 lys、 his、 asp又は argへの置換、 glu力ら gly、 asn、 gln、 lys又は aspへの置換、 gly力ら proへの置換、 his力ら asn、 lys、 gl n、 arg又は tyrへの換、 ile力ら leu、 met、 val又は pheへの換、 leu力ら ile、 metゝ val 又は pheへの置換、 lys力ら asn、 glu、 gln、 his又は argへの置換、 met力ら ileゝ leu、 val又は pheへの置換、 phe力ら trp、 tyr、 met、 ile又は leuへの置換、 serから thr又は alaへの置換、 thrから ser又は alaへの置換、 trpから phe又は tyrへの置換、 tyrから his、 phe又は trpへの置換、及び、 valから met、 ile又は leuへの置換が挙げられる。

[0026] 上記のような改良型 lysE24遺伝子と実質的に同一の機能を有するホモログ DNAは、例えば部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の疎水性領域の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、改良型 lys E24の塩基配列（配列番号 3など）を改変することによって得られる。

[0027] また、上記のような改変された DNAは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号 3などの塩基配列を有する DNAをヒドロキシルァミン等でインビトロ処理する方法、及び該 DNAを保持する微生物、例えばェシェリヒア属細菌を、紫外線照射または N—メチル— N'— -トロ— N— -トロソグァ二ジン（ NTG)もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられて!/、る変異剤によって処理する方法が挙げられる。

変異処理された DNAを、メタノール資化性細菌で発現させ、 L-リジンまたは L-アルギニン排出活性を調べることにより、改良型 l_ysE24遺伝子と実質的に同一の機能を有する DNAが得られる。

また、上記 DNAを微生物に導入し、該微生物を変異処理して得られる微生物の中力 L-リジン又は L-アルギニンの排出活性が向上した細胞を選択し、例えば配列表の配列番号 3に記載の塩基配列又はその一部を有するプローブを用いてストリンジェントな条件下でノヽイブリダィゼーシヨンを行うことにより、改良型 lysE24遺伝子と実質的に同一の機能を有する DNAが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値ィ匕することは困難である力一例を示せば、相同性が高い DNA同士、例えば 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、特に好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相同性を有する DNA同士がハイブリダィズし、それより相同性が低い DNA同士がハイブリダィズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗いの条件である 60°C、 1 X SSC, 0. 1 %SDS、好ましくは、 0. 1 X SSC、 0. 1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件が挙げられる。相同性は BLASTを用いて検索出来る。 (//blast.genome.jp/ )

[0028] プローブとして、配列番号の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号の塩基配列に基づ!/、て作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号の塩基配列を含む DNA断片を铸型とする PCRによって作製することができる。プローブとして、 300bp程度の長さの DNA断片を用いる場合には、ハイブリダィゼーシヨンの洗いの条件は、 50°C、 2 X SSC、 0. 1%SDSが挙げられる

[0029] 改良型 lysE24遺伝子と実質的に同一の機能を有する DNAとして具体的には、配列番号 3に示す塩基配列と、好ましくは 50%以上、より好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%、特に好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつメタノール資化性細菌に導入したときに L-リジン、 L-アルギニンを排出する活性を向上させるする DNAが挙げられる。

[0030] なお、上記のような変異処理などによって得られる「改良型 lysE24遺伝子と実質的に同一の機能を有する DNA」は、元の「改良型 lysE24遺伝子」に含まれる 3種類の読み枠の終止コドンをそのまま保持したうえで、他の領域に塩基置換などが導入されたものが好ましい。例えば、配列番号 3に示す塩基配列を有する lysE24m5遺伝子と実質的に同一の機能を有する DNAは、配列番号 3に記載の塩基配列又は同塩基配列力も調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする DNAであつて、配列番号 3の塩基番号 373〜383の配列を含み、かつ、メタノール資化性細菌に導入されたときに該細菌の L リジンもしくはしアルギニン又はこれらの両方の L アミノ酸の細胞外への排出を促進する DNAであることが好ましい。

[0031] なお、本発明の DNAは国際公開第 97/23597号パンフレットゃ特開 2004— 16659 4号公報に記載された DNAとは全く異なるものであり、予期できな力つたものである。すなわち、野生型 lysEを開示している文献（国際公開第 97/23597号パンフレット）は、コリネ型細菌の野生型 lysE遺伝子をコリネ型細菌に導入した場合のみを提示してヽる。そして、排出されたアミノ酸として L リジンのみが示され、更に、 LysEタンパク質として、 6個の疎水性へリックスを含む 1本のポリペプチドを開示している。しかし、本発明者らは、メタノール資化性細菌に野生型 lysE遺伝子は導入できず、野生型 lysE 遺伝子は、メタノール資化性細菌で致死的に機能するものであることを見出していた。一方、本発明の DNAはループ領域に 3種類の読み枠の終止コドンを含むため、疎水性へリックス 6個を 1本のポリペプチドで構成している野生型 lysEとは基本的な構造が異なり、先の国際公開第 97/23597号パンフレットからは構造も効果も全く予想できるものではない。

また、特開 2004— 166594〖こは、塩基挿入により 1個の終止コドンが導入された lys E24遺伝子が開示されている力本発明の DNAはさらに 2個の終止コドンを付カ卩して 3 種類全ての読み枠に終止コドンが存在するように改変することで、さらに、リジン又はアルギニンの排出効果を高めたものである。通常、 3種類の全ての読み枠に終止コドンを導入した場合、タンパク質等の翻訳を完全に停止すると考えられており、 (Gene 24(1983)15-27)本発明の効果は全く予想外のことであり、先の該文献からは全く予想できるものではない。

なお、 lysE24の終止コドン後の疎水性へリックスの翻訳は翻訳共役によって起こつていることが推定されるが、翻訳共役の場合、上流側の遺伝子にコードされる蛋白質 (この場合疎水性へリックス 3本目まで)の翻訳量の増減が、下流側の遺伝子にコードされる蛋白質 (この場合は 4, 5, 6番目の疎水性へリックス）の合成量に顕著な影響を及ほすことは知られてい Ο力 (¾panjaard, R. A. and van Duin, J., Translational reinitia tion in the presence and absence of a Shine and Dalgarno sequence. Nucleic Acids R es, 17, 5501-7. (1989).)(Rex, G., Surin, B., Besse, G., Schneppe, B. and McCarthy, J. E., The mechanism of translational coupling in Escherichia coli. Higher order stru cture in the atpHA mRNA acts as a conformational switch regulating the access of d e novo initiating ribosomes. J Biol Chem, 269, 18118—27. (1994).)上流側の遺伝子にコードされる蛋白質の翻訳終止コドンに加えて、さらに別の読み枠の終止コドンを追加することで、下流側の翻訳量が上昇するは知られていない。したがって、本願の DNAの 3種類全ての読み枠に終止コドンを導入したことによる効果は全く予想できなかった。

[0032] < 2 >本発明のメタノール資化性細菌

本発明のメタノール資化性細菌は、前記本発明の DNAが発現可能な形態で導入され、かつ、 L リジン又は L アルギニン生産能を有するメタノール資化性細菌である。 L リジン又は L アルギニン生産能を有するメタノール資化性細菌に本発明の DNAを導入することによって得られる。また、本発明の DNAが導入されたメタノール資化性細菌に、 L リジン又は L アルギニン生産能を付与することによつても、本発明のメチロフイラス属細菌を得ることができる。また、本発明のメタノール資化性細菌は、本発明の DNAが発現可能な形態で導入されたことによって L—リジン又は L— アルギニン生産能が付与されたものであってもよい。

[0033] 本発明にお、てメタノール資化性細菌とは、メタノールを主たる炭素源として生育することができる細菌であって、本発明の DNAを導入することによって L—リジン又はしアルギニン等の L アミノ酸の細胞外への排出が促進される細菌である。具体的には、メチロフィラス'メチロトロファス（Methylophilus methylotrophus)等のメチロフイラス属細菌及び、メチロバチラス'グリコゲネス（Methylobacillus glycogenes)等のメチロバチラス属細菌が挙げられる。

[0034] メチロフィラス'メチロトロファスとしては、 AS1株（NCIMB10515)等が挙げられる。メチロフィラス'メチロトロファス AS1株（NCIMB10515)は、ナショナル 'コレクション'ォブ 'ィンダストウリアル'アンド 'マリン'バクテリア（National Collections of Industrial and Mari ne Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)から入手可能である。また、メチロバチラス 'グリコゲネスとしては、 T- 11株（NCIMB 11375)、 ATCC 21276株、 ATCC 21371株、 ATR80株（Ap pi. Microbiol. BiotechnoL, (1994)、 42卷， p67- 72に記載）、 A513株（Appl. Microbiol. BiotechnoL, (1994)、 42卷， p67-72に記載）等が挙げられる。メチロバチラス.グリコゲネス NCIMB 11375株は、ナショナル.コレクション.ォブ.インダストウリアル.アンド'マリン'ノクテリア (National Collections of Industrial and Marine Bacteriaゝ住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdo m)から入手可能である。

[0035] 上記のようなメタノール資化性細菌に、発現可能な状態で本発明の DNAを導入するためには、例えば、該 DNAを、メタノール資化性細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換え DNAを作製し、これをメタノール資化性細菌宿主に導入して形質転換すればょヽ。

メタノール資化性細菌で機能するベクターとは、また、メタノール資化性細菌で機能するベクターとは、例えばメチロフイラス属細菌、メチロバチルス属細菌で自律複製出来るプラスミドである。具体的には、広宿主域ベクターである RSF1010及びその誘導体、例えば pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-1 67)、あるいは pMFY42 (gene, 44, 53(1990))、 pRP301、 pTB70 (Nature, 287, 396, (19 80))等が挙げられる。

[0036] 改良型 lysE24遺伝子とメタノール細菌で機能するベクターを連結して組み換え DN Aを調製するには、改良型 lysE24遺伝子を含む DNA断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、 T4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。

[0037] 上記のように調製した組換え DNAをメチロフイラス属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレタトロポレーシヨン法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997))や接合法が挙げられる。

[0038] 本発明の DNAの導入は、該 DNAをメタノール資化性細菌の染色体 DNA上に 1コピ一、あるいは多コピー存在させることによつても達成できる。メタノール資化性細菌の染色体 DNA上に目的遺伝子を多コピーで導入するには、染色体 DNA上に多コピ一存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体 DNA上に多コピー存在する配列としては、トランスポゾン、繰返し配列、転移因子の端部に存在するインバーテッド ·リピート等が利用できる。また _Muファージゃトランスポゾンを用いて染色体上に変異型 LysE24遺伝子を多コピー転移させることによつても達成出来る。（欧州特許 0332488号明細書）

[0039] さらにアミノ酸排出活性を増強するためには、本発明の DNAを強力なプロモーター等に連結して導入することが好ましい。プロモーターの強度は、 RNA合成開始の頻度により定義される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例【ま、 Goldsteinらの論文 (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128)等に記載されている。また、国際公開 W000Z18935に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。例えばメタノール資化性細菌で強力に機能するプロモーターとしては、 lacプロモーター、 trpプロモーター、 trcプロモータ一、 tacプロモーター、ラムダファージの PRプロモーター、 PLプロモーター、 tetプロモーター、 amyEプロモーター、 spacプロモーター等が挙げられる。

[0040] さらに、リボソーム結合部位 (RBS)と開始コドンとの間のスぺーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換が mRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られている。したがって、本発明の DNAを翻訳効率が上昇するように改変された発現調節配列に連結して導入してもよヽ。 [0041] 本発明のメタノール資化性細菌はしリジン又はしアルギニンの生産能を有するが、メタノール資化性細菌に Lーリジン又はしアルギニン生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株の取得、 L リジン又は L アルギニンの生合成系酵素が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はェシエリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株)学会出版センター、 1986年 5月 30日初版発行、第 77〜： LOO頁参照)。 L—リジン又は L—アルギニン生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよぐ 2種又は 3種以上であつてもよい。また、増強される L アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、 2種又は 3 種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

[0042] 例えば、 L—リジン生産菌は、 L—ホモセリン、又は Lースレオニン及び Lーメチォ- ンを要求する変異株 (特公昭 48-28078号、特公昭 56-6499号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株 (特開昭 55-9784号、特開昭 56-8692号）、又はォキサリジン、リジンハイドロキサメート、 S- (2—アミノエチル）システィン、 γ—メチルリジン、 (X クロロカプロラタタム、 DL- a アミノー ε一力プロラタタム、 a アミノーラウリノレラタタム、ァスパラギン酸一アナログ、スルファ剤、キノイド、又は N ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。

[0043] また、 L—アルギニン生産菌は、サルファ剤、 2 チアゾールァラニン又は α—アミノ— βーヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有する変異株； 2—チアゾールァラニン而'性にカロえて、 L—ヒスチジン、 L—プロリン、 Lースレオニン、 L—イソロイシン、 Lーメチォニンまたは L トリブトファン要求性を有する変異株 (特開昭 54— 44096号）；ケトマロン酸、フルォロマロン酸又はモノフルォロ酢酸に耐性を有する変異株 (特開昭 5 7— 18989号）；アルギ-ノールに耐性を有する変異株 (特開昭 62— 24075号）；Χ グァニジン (Xは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体)に耐性を有する変異株 (特開平 2— 186995号）、 5 ァザゥラシノレ、 6 ァザゥラシル、 2 チォゥラシル、 5 フノレオロウラシル、 5—ブロモウラシル、 5—ァザシトシン、 6—ァザシトシン等に耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート、 2—チォゥラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び 6 ァザゥラシルに耐性な変異株 (特開昭 57-150381号参照）、ヒスチジンアナログ又はトリブトファンアナログに耐性な変異株 (特開昭 52-114092号参照）、メチ二オン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソ口イシイン、リジン、アデニン、グァニンまたはゥラシル (またはゥラシル前駆体)の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭 52-99289号参照）、アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株 (特公昭 51-67 54号参照）、コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株 (特開昭 58-969 2号）、アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株 (特開昭 52-8729号参照）、アルギニン、アルギ- ンヒドロキサメート、ホモアルギニン、 D—アルギニン、カナバニン而性、アルギニンヒドロキサメート及び 6 ァザゥラシル耐性の変異株 (特開昭 53-143288号参照）、及び、カナバニン耐性の変異株 (特開昭 53-3586号参照）として育種することができる。

[0044] 次に、 L—リジン又は L—アルギニン生合成系酵素遺伝子の増強によって Lーリジン又は L アルギニン生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。

[0045] L—リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びァスノルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。

メタノール資化性細菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びァスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及びァスバルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、メタノール資化性細菌で機能するべクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換え DNAを作製し、これをメチロフイラス属細菌の宿主に導入して形質転換すればょヽ。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及びァスバルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素を DDPS、ァスバルトキナーゼを AK、ァスパルトキナーゼ II Iを ΑΚΠΙと略すことがある。

[0046] DDPSをコードする遺伝子及び AKをコードする遺伝子の供与微生物としては、メタノ一ル資化性細菌に属する微生物中で DDPS活性及び AK活性を発現することができる微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的には E. coli (ェシエリヒア'コリ (Escherichi a coli)) K- 12株及びメチロフィラス'メチロトロファス AS1株（NCIMB10515)等が挙げられる。ェシエリヒア属細菌由来の DDPSをコードする遺伝子（dapA、 Richaud, F. et al. J . BacterioL, 297(1986))及び AKIIIをコードする遺伝子（lysC、 Cassan, M., Parsot, C. , Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986))は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、 E. coli K- 12等の微生物の染色体 DNAを铸型とする PCR法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。以下、 E. col油来の dapA及び lysCを例として説明するが、本発明に用いる遺伝子は、これらに限定されるものではない。

[0047] L リジン生産能を紆余するために用いる DDPS及び AKは、 L リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。 E. coli由来の野生型 DDPSは L リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、 E. coli由来の野生型 AKI IIは L リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがつて、メチロフイラス属細菌などのメタノール資化性細菌に導入する dapA及び lysCは、それぞれ L リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有する DDPS及び ΑΚΠΙをコードするものであることが好ましい。以下、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有する DDPSを「変異型 DDPS」、変異型 DDPSをコードする DN Aを「変異型 dapA、又は dapA*」と呼ぶことがある。また、 L リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有する E. coli由来の ΑΚΠΙを「変異型 ΑΚΠΙ」、変異型 ΑΚΠΙ をコードする DNAを「変異型 lysC」と呼ぶことがある。

[0048] 尚、本発明にお、ては、 DDPS及び AKは必ずしも変異型である必要はな、。例えば、コリネバタテリゥム属細菌由来の DDPSはもともと L リジンによるフィードバック阻害を受けな、ことが知られて、る。

[0049] L—リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型 DDPSをコードする DNAとしては、配列番号 13に示すアミノ酸配列において 118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有する DDPSをコードする DNAが挙げられる。また、 L—リジンによるフィードバック阻害を受けな、変異型 ΑΚΠΙをコードする DNAとしては、配列番号 15に示すアミノ酸配列において 352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有する ΑΚΠΙをコードする DNAが挙げられる。 [0050] これらの遺伝子のクローユングに使用されるプラスミドとしては、ェシエリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよぐ具体的には、 pBR322、 pTWV228、 pMW119、 pUC19等が挙げられる。

[0051] また、これらの遺伝子をメタノール資化性細菌に導入するためのベクターとしては、例えばメチロフイラス属細菌、メチロバチルス属細菌で自律複製出来るプラスミドである。具体的には、広宿主域ベクターである RSF1010及びその誘導体、例えば pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161—167)、あるいは pMF Y42 (gene, 44, 53(1990))、 pRP301、 pTB70 (Nature, 287, 396, (1980))等が挙げられる。

[0052] dapA及び lysCとメチロフイラス属細菌で機能するベクターを連結して組み換え DN Aを調製するには、 dapA及び lysCを含む DNA断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、 T4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。 dapA及び lysCは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよぐ同一のベクタ一に搭載してもよい。

[0053] 変異型 DDPSをコードする変異型 dapA及び変異型 ΑΚΠΙをコードする変異型 lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミド RSFD80が知られている（WO95/16042号)。同プラスミドで形質転換された E. coli JM109株は、 AJ12396と命名され、同株は 1993 年 10月 28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に受託番号 FERM P-13936として寄託され、 1994年 11月 1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP-4859 の受託番号のもとで寄託されている。 RSFD80は、 AJ12396株から、公知の方法によつて取得することができる。

[0054] RSFD80に含まれている変異型 dapAは、配列番号 12に示す野生型 dapAの塩基配列において塩基番号 598の Cが Tに変化した配列を有し、それによつて、コードされる変異型 DDPSは、配列番号 13に示すアミノ酸配列において 118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有する。また、 RSFD80に含まれている変異型 lysC は、配列番号 14に示す野生型 lysCの塩基配列において塩基番号 1055の Cが T変化した配列を有し、それによつて、コードされる変異型 ΑΚΠΙは、配列番号 15に示すアミノ酸配列において 352位のスレオニン残基力ソロイシン残基に置換された配列を有する。

[0055] 上記のように調製した組換え DNAをメチロフイラス属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレタトロポレーシヨン法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997))が挙げられる

[0056] DDPS活性及び AK活性の増強は、 dapA及び lysCをメチロフイラス属細菌の染色体 DNA上に多コピー存在させることによつても達成できる。メチロフイラス属細菌の染色体 DNA上に dapA及び lysCを多コピーで導入するには、染色体 DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体 DNA上に多コピー存在する配列としては、レぺッティブ DNA、転移因子の端部に存在するインバーティッド 'リピートが利用できる。あるいは、特開平 2-109985号公報に開示されているように、 dapA及び Z又は lysCをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体 DNA上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内の dap A及 lysCのコピー数が上昇する結果、 DDPS活性及び AK活性が増幅される。

[0057] DDPS活性及び AK活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、 dapA及 lysC のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによつても達成される

(特開平 1-215280号公報参照）。たとえば、 lacプロモーター、 trpプロモーター、 trc プロモーター、 tacプロモーター、ラムダファージの PRプロモーター、 PLプロモータ一、 tetプロモーター、 amyEプロモーター、 spacプロモーター等が強力なプロモータ一として知られている。これらのプロモーターへの置換により、 dapA及 lysCの発現が強化されることによって DDPS活性及び AK活性が増幅される。発現調節配列の増強は、 dapA及 lysCのコピー数を高めることと組み合わせてもよ!/、。

[0058] 遺伝子断片とベクターを連結して組換え DNAを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、 T4DNAリガーゼ等のリガ一ゼを用いて行うのが普通である。 DNAの切断、連結、その他、染色体 DNAの調製、 PCR、プラスミド DNAの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、 Sambrook, J., Frits ch, E. F.， and Maniatis, T.， "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold pring Harbor Laboratory Press, (198 9)等に記載されている。

[0059] L リジン生産能を付与するために、 DDPS及び AKの増強にカ卩えて、他の L リジン生合成に関与する酵素を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ (以上、 WO96/40934号参照）、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭 60-87788号）、ァスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（特公平 6-102028号）、ジァミノピメリン酸ェピメラーゼ遺伝子、ァスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素等のジァミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。

[0060] さらに、本発明のメタノール資化性細菌は、 L リジン生産能を高めるために、 Lーリジンの生合成経路から分岐して L リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損して、てもよ、。 L リジンの生合成経路力分岐して L リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼがある（WO 95/23864、特開 2004-254544号参照)。

[0061] 上記の L—リジン生合成に関与する酵素の活性を増強する手法は、 L—アルギニンについても同様に適用することができる。

すなわち、 L—アルギニン生産能は、例えば、ァセチルオル-チンデァセチラーゼ活性、 N ァセチルグルタミン酸— γ—セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、 Ν ァセチルダルタモキナーゼ活性、及びアルギニノサクシナーゼ活性を増強することによつて付与することができる（特公平 5— 23750号)。また、 Ν ァセチルグルタミン酸合成酵素の L アルギニンによるフィードバック阻害を解除することによって付与することが出来る。（特開 2002-253268号）

[0062] また、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ΕΡ 1 057 893 A1)、アルギ-ノコハク酸シンターゼ（ΕΡ 0 999 267 A1)、力ルバモイルリン酸シンセターゼ（ΕΡ 1 026 247 A1)、もしくは Ν ァセチルグルタミン酸シンターゼ (特開昭 57-5693号参照）の活性を増強すること、又は、アルギニンリプレッサーをコードする遺伝子（argR)を破壊することによつて、 L—アルギニン生産能を向上させることができる。（欧州特許 1154020号公報） [0063] < 3 >L—リジン又は L—アルギニンの製造

上記にょうにして得られる本発明の DNAが導入され、かっしリジン又は L アルギニン生産能を有するメタノール資化性細菌を培地に培養し、培養物 (培地または菌体内）中に L リジン又は L アルギニンを生産蓄積させ、該培養物力も L リジン又はしアルギニンを採取することにより、 L リジン又は L アルギニンを製造することができる。

[0064] 本発明で用いられる微生物は、通常メタノール資化性微生物の培養に用いられる方法で培養することができる。本発明で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機ィオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のヽずれでも用いられる。

[0065] メタノールを主たる炭素源として用いると、 L リジン又は L アルギニンを安価に製造することができる。メタノールは、主たる炭素源として用いる場合は、培地中に 0.001 〜30%添加する。窒素源としては硫酸アンモ-ゥムなどを培地に添カ卩して用いる。これらの他に、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどの微量成分が少量添加される。

[0066] 培養は、振とう培養又は通気撹拌培養などの好気条件下、 pH5〜9、温度 20〜45°C に保持して行われ、通常 24〜120時間で終了する。

培養物力の L—リジン又は L—アルギニンの採取は、通常イオン交換榭脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。

実施例

[0067] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

試薬は、特記しない限り和光純薬、又はナカライテスタ社製のものを用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地も pHは NaOHまたは HC1で調整した。

[0068] (LB培地）

トリプトン 'ペプトン (ディフコ社製） 10g/L 酵母エキス (ディフコ社製） 5g/L

NaCl 10g/L

pH7.0

[120°C、 20分間蒸気滅菌を行った。 ]

[0069] (LB寒天培地）

LB培地

パクトァガー 15g/L

[120°C、 20分間蒸気滅菌を行った。 ]

[0070] (SEII培地）

K HPO 1.9g/L

2 4

NaH PO 1.56g/L

2 4

MgSO · 7Η O 0.2g/L

4 2

(NH ) SO 5g/L

4 2 4

CuSO -5H O 5 /z g/L

4 2

nSO -5H O 25 ^ g/L

4 2

ZnSO - 7H O 23 ^ g/L

4 2

CaCl -2H O 72mg/L

2 2

FeCl -6H O 9.7mg/L

3 2

CaCO (関東化学製） 30g/L

3

メタノーノレ 2%(vol/vol)

pH7.0

[メタノール以外は 121°C、 15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添カロした。]

[0071] (SEII寒天培地）

K HPO 1.9g/L

2 4

NaH PO 1.56g/L

2 4

MgSO · 7Η O 0.2g/L

4 2

(NH ) SO 5g/L CuSO ·5Η O 5 g/し

4 2

MnSO -5H O 25 μ g/L

4 2

ZnSO - 7H O 23 μ g/L

4 2

CaCl -2H O 72mg/L

2 2

FeCl -6H O 9.7mg/L

メタノーノレ 0.5% (vol/vol)

pH7.0

ノクトァガー (ディフコ社製） 15g/L

[0072] [実施例 1]

< 1 >改良型 lysE24遺伝子の取得

メチロフイラス属細菌で L—リジンの排出を促進することが知られている lysE24遺伝子に改良をカ卩えた改良型 lysE遺伝子 (lysE24m5；配列番号 3)をクローユングし、メチロフイラス属細菌での発現を試みた。

[0073] (l) pRSlysE24m5の構築

メチロフイラス属細菌に l_ysE24m5を導入するために、 lysE24遺伝子が搭載されている pRSlysE24 (特開 2004— 166594参照）を用いて、 lysE24m5発現用プラスミド pRSly sE24m5を構築した。プラスミド pRSlysE24は pRSから構築されており、プラスミド pRSは、 RSF1010の誘導体である広宿主域ベクタープラスミド pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., T sygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161- 167)に由来する pVIC40プラスミド（国際公開 WO90/04636パンフレット、特表平 3-501682号公報）より、同プラスミドが持つスレオニンオペロンをコードする DNA領域を削除してベクター部分のみを持つプラスミドである。

pRSlysE24で形質転換された E.coli JM109株は AJ13830と命名され、同株は 2001年 6月 4日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（干 305-54 66 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM P-18369として寄託され、平成 14年 5月 13日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 F ERM BP-8040の受託番号のもとで寄託されている。

[0074] まず、プラスミド pRSlysE24より、 lysE24領域を欠失させて lysE24m5を搭載するためのベクターとした。 pRSl_ysE24を制限酵素 Sse8387Iおよび Saplで消化し、フエノール'クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にて DNAを回収後、 0.8%ァガロースゲルにて分離し、約 8キ口ベースペア（以下、「kbp」と記載）の DNA断片を EASY TRAP Ver.2 (DNA回収キット、宝酒造社製)を用いて回収した。

一方、 lysE24m5遺伝子断片は以下の方法で作成した。まず、 lysE24m5遺伝子の 5' 側断片を、 pRSlysE24プラスミドを铸型とし、配列番号 6および 7に示すプライマーを用いて PCRにより増幅した（変性 94°C-20秒、アニーリング 55°C-30秒、伸長反応 72°C-3 0秒のサイクルを 30サイクル行った）。 PCR反応には Pyrobest DNA polymerase (宝酒造社製）を使用した。増幅された lysE24m5遺伝子の 5，側 DNA断片を PCRprep (Prome ga社製）にて精製した。次に lysE24m5遺伝子の 3'側断片を同様にして PCR増幅した。ただしプライマーは配列番号 8および 9に示すプライマーを用いた。なお、配列番号 7及び 8のプライマーには 3種類の読み枠の終止コドンを導入するための配列が含まれている。次に、上記のようにして得た、 5'側断片と 3'側断片を 0.8%ァガロースゲルにて分離し、それぞれ約 0.5kbp、約 0.3kbpの DNA断片を EASY TRAP Ver.2を用いて回収した。回収した断片を混合し、これを铸型としてプライマーは配列番号 7および 10を用いて lysE24m5遺伝子断片を PCRにより増幅した（変性 94°C- 20秒、ァニーリング 60°C-30秒、伸長反応 72°C- 60秒のサイクルを 30サイクル行った）。上記のようにして得た lysE24m5遺伝子断片を 0.8%ァガロースゲルにて分離し、約 0.8kbpの DNA断片を EASY TRAP Ver.2を用いて回収した。

[0075] 上記のように調製した lysE24遺伝子断片を欠失させた pRSlysE24ベクター消化物と、 lysE24m5断片を、 DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でェシエリヒア'コリ（E.coli JM109 competent cells,宝酒造製）を形質転換し、 20mg/Lのストレプトマイシンを含む LB寒天培地に塗布し、 37°Cでー晚保温した。寒天培地上に出現したコロニーを 20mg/Lのストレプトマイシンを含む LB液体培地に接種し、 37°Cで 8時間振盪培養した。アルカリ— SDS法にて各培養液カゝらプラスミド DNAを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、 pRSlysE24m5を得た。

[0076] (2)メチロフイラス属細菌への pRSlysE24m5の導入

上記のようにして得られた pRSlysE24m5を、エレクト口ポレーシヨン法（Canadian Jour nal of Microbiology, 43. 197 (1997))によりメチロフィラス'メチロトロファス ASl株（NCI

MB10515)に導入した。なお、対照として、 pRSおよび pRSlysE24を pRSlySE24m5と同様に AS1株に導入した。

[0077] プラスミド導入株について、培養上清に含まれる L リジンおよび L アルギニン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー)で定量した。測定した結果を、表 1に示す。

[0078] [表 1] 菌株 L-リジンの生産量 (g/L) L-アルギニンの生産量（g/L)

ASl/pRS <0. 01 <0. 01

ASl/pRSlysE24 0. 1 0. 05

ASl/pRSlysE24m5 0. 15 0. 07

[0079] その結果、終止コドンが 3つ導入された lysE24m5変異遺伝子を導入したメチロフイラス属細菌は、 L-リジン、 L-アルギニン収率とも上昇することが明らかになった。

産業上の利用の可能性

[0080] 本発明により、メタノール資化性細菌の L アミノ酸生産性、特に L リジン及び L —アルギニンの生産性を向上させることができる。

Claims

請求の範囲

[1] ループ領域と、 6個の疎水性へリックスとを有するコリネ型細菌の LysEタンパクをコードする塩基配列において、前記ループ領域をコードする領域が、終止コドンが 3種類の翻訳の読み枠全てに存在するように改変された塩基配列を有し、かつメタノール資化性細菌に発現可能な状態で導入されたときに該細菌による L リジンもしくはしアルギニン又はこれらの両方の L アミノ酸の細胞外への排出を促進する DNA。

[2] 前記終止コドンが TGA,TAG,及び TAA力選択される請求項 1に記載の DNA。

[3] 前記終止コドンが、配列番号 1における塩基番号 354〜393の領域に導入されたことを特徴とする請求項 1に記載の DNA。

[4] 前記メタノール資化性細菌がメチロフイラス属細菌、又はメチロバチルス属細菌である請求項 1〜3のいずれか一項に記載の DNA。

[5] 前記 DNA力下記（a)又は（b)に示す DNAである、請求項 1〜4のいずれか一項に記載の DNA。

(a)配列番号 3に記載の塩基配列を含む DNA、

[6] 請求項 1〜5のいずれか一項に記載の DNA力発現可能な状態で導入され、かつ、 L リジン又は L アルギニン生産能を有するメタノール資化性細菌。

[7] メチロフイラス属細菌、又はメチロバチルス属細菌である、請求項 6に記載のメタノール資化性細菌。

[8] 請求項 6又は 7に記載のメタノール資化性細菌を培地に培養し、培養物中に Lーリジン又は L アルギニンを生産蓄積させ、該培養物から L リジン又は L アルギニン酸を採取することを特徴とする L リジン又は L アルギニンの製造法。

[9] 前記培地力タノールを主たる炭素源とすることを特徴とする請求項 8記載の Lーリジン又は L ァノレギニンの製造法。