SK285997B6

SK285997B6 - Baktéria patriaca do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje L-aminokyselinu, a spôsob výroby L-aminokyseliny fermentáciou

Info

Publication number: SK285997B6
Application number: SK1511-2000A
Authority: SK
Inventors: Mikhail Markovich Gusyatiner; Yuri Ivanovich Kozlov; Leonid Romanovich Ptitsyn; Irina Borisovna Altman; Elvira Borisovna Voroshilova; Yurgis Antanas Vladovich Iomantas; Tatyana Abramovna Yampolskaya
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2008-01-07
Also published as: SK15112000A3; CN1247783C; BR0004832A; RU2207376C2; CN1305002A; DE60011974D1; EP1092776B1; EP1092776A1; JP2001136991A; DE60011974T2

Abstract

Je opísaná baktéria patriaca do rodu Escherichia,ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje L-aminokyselinu, napr. L-treonín a kyselinu L-gutámovú. Tiež je opísaný spôsob výroby L-aminokyseliny fermentáciou a izolácia aminokyseliny z média.

Description

Predložený vynález sa týka spôsobu výroby L-aminokyseliny, konkrétne sa týka spôsobu výroby L-treonínu, kyseliny L-glutámovej, L-homoserínu, L-metionínu, L-arginínu, L-prolínu alebo L-izoleucínu použitím baktérie patriacej do rodu Escherichia.

Doterajší stav techniky

L-aminokyseliny ako napríklad L-treonín a kyselina L-glutámová sa bežne vyrábajú fermentačnými spôsobmi principiálne využívajúcimi koryneformné baktérie, ktoré patria do rodu Brevibacterium, Corynebacterium a Microbacterium, alebo sa využívajú ich mutanty („Amino Acid Fermentation“, Gakkai Shuppan Center, str. 195 - 215,1986).

Na druhej strane boli opísané techniky využívajúce techniky genetickej rekombinácie na šľachtenie bakteriálnych kmeňov produkujúcich L-aminokyseliny, ktoré patria do rodu Escherichia.

Bol napríklad opísaný spôsob výroby L-lyzínu použitím Escherichia coli, v ktorej boli gény kódujúce dihydrodipikolinát syntetázu a aspartokinázu znecitlivené proti spätnej inhibícii L-lyzínom a L-treonínom, a gény kódujúce diaminopimelát dehydrogenázu (alebo tetrahydrodipikolinát sukcinylázu a sukcinyldiaminopimelát deacylázu) boli zosilnené (WO 95/16042).

Hoci sa produktivita L-aminokysclín značne zlepšila šľachtením týchto uvedených mikroorganizmov alebo boli zlepšené produkčné spôsoby, je stále želateľné vyvinúť účinnejšie spôsoby výroby Laminokyselín, aby sa splnil očakávaný značne zvýšený budúci dopyt po aminokyselinách.

Pyruvát karboxyláza (pyruvát : oxid uhličitý ligáza (vytvárajúca ADP), EC 6.4.1.1) je enzým obsahujúci biotín. Katalyzuje karboxyláciu pyruvátu, čím sa vytvára oxaloacetát. Pyruvát karboxyláza nie je známa v Escherichia coli, ale Bacillus subtilis (Diesterhaft, M.D. a Freese, E., J. Biol. Chem., 248, č. 17, 6062 - 6070 (1973) a Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch, P.G. a ďalší, Microbiology, 144, 915 - 927 (1998) majú pyruvát karboxylázu a boli publikované nukleotidové sekvencie génov kódujúcich enzýmy.

Ďalej sú známe Corynebacterium glutamicum, v ktorom je zosilnená aktivita pyruvát karboxylázy, alebo Corynebacterium glutamicum, ktorého gén pyruvát karboxylázy je inaktivovaný (Peters-Wendisch, P.G. a ďalší, Microbiology, 144, 915 - 927 (1998)). Ale tieto mikroorganizmy boli vytvorené ako experimentálne materiály na štúdium enzýmov nevyhnutných na rast glukózy. Vzťah medzi aktivitou pyruvát karboxylázy a produktivitou L-aminokyselín nebol známy. Nebol známy ani pokus zaviesť gén pre pyruvát karboxylázu do baktérie patriacej do rodu Escherichia.

Cieľom vynálezu je poskytnúť spôsob výroby L-aminokyseliny, konkrétne L-treonínu, L-lyzínu, kyseliny L-glutámovej, L-homoserínu, L-metionínu, L-arginínu, L-prolínu alebo L-izoleucínu s vysokou účinnosťou.

Výsledkom usilovného výskumu na účely dosiahnutia opísaného cieľa bolo zistenie, že zavedenie génu, ktorý kóduje pyruvát karboxylázu (tu označovaný ako „pyc gén“), do baktérie patriacej do rodu Escherichia, môže zlepšiť produktivitu L-aminokyseliny touto baktériou. Tak sa skompletoval predložený vynález.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je baktéria patriaca do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje L-amino-kyselinu.

Predložený vynález poskytuje aj opísanú baktériu, v ktorej je gén kódujúci pyruvát karboxylázu odvodený od baktérie patriacej do rodu Bacillus.

Predložený vynález ďalej poskytuje opísanú baktériu, do ktorej je gén kódujúci pyruvát karboxylázu zavedený v malom počte kópií.

Ďalej predložený vynález poskytuje opísanú baktériu, pričom L-aminokyselina je vybraná zo skupiny zahŕňajúcej L-treonín, L-lyzín, kyselinu L-glutámovú, L-homoserín, L-metionín, L-arginín, L-prolín alebo L-izoleucín.

Predložený vynález poskytuje aj spôsob výroby L-aminokyseliny, ktorý zahŕňa kultiváciu uvedenej baktérie v médiu, produkciu a akumulovanie L-aminokyseliny v médiu a izoláciu L-aminokyseliny z média.

Predložený vynález ďalej poskytuje opísaný spôsob, pričom L-aminokyselina je vybraná zo skupiny zahŕňajúcej L-treonín, L-lyzín, kyselinu L-glutámovú, L-homoserín, L-metionín, L-arginín, L-prolín alebo L-izoleucín.

Výraz „produktivita L-aminokyseliny“ znamená, že baktéria produkuje a akumuluje L-aminokyselinu v médiu vo vyššom množstve ako jej zodpovedajúci kmeň divého typu.

V súlade s predloženým vynálezom je možné zlepšiť produktivitu L-aminokyseliny, ako L-treonínu, L-lyzínu, kyseliny L-glutámovej, L-homoserínu, L-metionínu, L-arginínu, L-prolínu alebo L-izoleucínu, v baktérii patriacej do rodu Escherichia. Ďalej môže byť predložený vynález využitý na šľachtenie producentov L-aminokyselín patriacich do rodu Escherichia.

Predložený vynález bude podrobne vysvetlený.

<1> Baktéria patriaca do rodu Escherichia transformovaná pyc génom

Baktéria patriaca do rodu Escherichia podľa predloženého vynálezu je baktéria transformovaná pyc génom. Príkladom baktérie patriacej do rodu Escherichia je Escherichia coli. Keďže pyc gén použitý podľa predloženého vynálezu nie je nejako konkrétne obmedzený, pokiaľ kóduje proteín majúci pyruvát karboxylázovú aktivitu, príklady pyc génu zahŕňajú pyc gén odvodený od baktérie patriacej do rodu Bacillus alebo pyc gén odvodený z koryneformných baktérií. Nukleotidové sekvencie pyc génu odvodeného od Bacillus subtilis (Genbank/EMBL/DDBJ č. Z97025, NID g2224758) a od Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch, P.G. a ďalší, Microbiology, 144, 915 - 927 (1998)) boli publikované. Preto je možné získať pyc gén PCR (polymerázovou reťazovou reakciou: White, T. J. a ďalší, Trends Genet., 5, 185 (1989)) použitím primerov syntetizovaných podľa nukleotidových sekvencií z chromozomálnej DNA baktérie patriacej do rodu Bacillus, ako napríklad Bacillus subtilis, alebo koryneformných baktérií, ako Corynebacterium glutamicum, ako templátu.

Transformanty Escherichia coli 44/pMW119-pycA, ktoré nesú pMW119-pycA obsahujúci pyc gén z Bacillus subtilis, boli uložené v ruskej národnej zbierke priemyselných mikroorganizmov (VKPM), depozit GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskva, Rusko, 30 augusta, 1999, pod registračným číslom VKPM B-7822, a preniesli sa z pôvodného depozitu do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody 1. septembra 2000.

Transformanty Escherichia coli MG442/pMWl 19-pycA, ktoré nesú pMW119-pycA obsahujúci pyc gén z Bacillus subtilis boli uložené v ruskej národnej zbierke priemyselných mikroorganizmov (VKPM), depozit GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskva, Rusko, 30 augusta, 1999, pod registračným číslom VKPM B-7821, a preniesli sa z pôvodného depozitu do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody 1. septembra 2000.

Mimochodom, gén kódujúci pyruvát karboxylázu Bacillus subtilis (pycA gén) sa klonoval, ako je opísané, spôsobom podľa predloženého vynálezu.

Najprv sa skonštruoval pycA gén-deficientný kmeň Bacillus subtilis. Potom sa použitím tohto kmeňa ako recipienta, pycA gén klonoval izoláciou DNA fragmentu, ktorý komplementuje citrátovú alebo aspartátovú auxotrofíu kmeňa, z genómovej DNA knižnice divého typu kmeňa Bacillus subtilis. Keďže Bacillus subtilis vytvára oxaloacetát prostredníctvom pyruvát karboxylázy, Bacillus subtilis nemôže rásť na minimálnom médiu, ak mu chýba tento enzým. Ale rast je možné opraviť pridaním L-aspartátu, L-glutamátu, citrátu alebo sukcinátu. Nukleotidová sekvenciapycA génu je znázornená ako sekv. č. 3 a aminokyselinová sekvencia, ktorá je kódovaná týmto génom, je znázornená ako sekv. č. 4.

PycA gén-deficientný kmeň je možné získať napríklad opísaným spôsobom. Čiastočný DNA fragment ylaP génu umiestneného na chromozóme hneď za pycA génom sa získa prostredníctvom PCR. Príkladmi primerov pre PCR sú oligonikleotidy so sekv. č. 1 a 2. Potom sa divý typ kmeňa Bacillus subtilis transformuje s plazmidovou DNA obsahujúcou získaný DNA fragment a markerový gén a nasleduje integrácia plazmidovej DNA do ylaP génu na chromozomálnej DNA prostredníctvom homologickej rekombinácie. Ďalej sa skonštruuje chromozomálna DNA knižnica získaného kmeňa použitím reštrikčného enzýmu, ktorý rozoznáva reštrikčné miesto vnútri pycA génu, napríklad Pstl. Rekombinantný plazmid obsahujúci markerový gén a čiastočný pycA génový fragment sa môže získať transfomáciou divého typu kmeňa Bacillus subtilis s knižnicou a selekciou klonov exprimujúcich markerový gén. Potom sa divý typ kmeňa Bacillus subtilis transformuje linearizovaným rekombinantným plazmidom a vyberú sa klony exprimujúce markerový gén, aby sa získal pycA gén-deficientný kmeň, v ktorom je plazmidová DNA integrovaná do pycA génu na chromozomálnej DNA kmeňa.

Transformácia baktérie patriacej do rodu Escherichia s pyc génom sa môže uskutočniť zavedením pyc génu do príslušného vektora, ktorý funguje v baktérii patriacej do rodu Escherichia, aby sa skonštruoval rekombinantný vektor, a zavedením tohto rekombinantného vektora do baktérie patriacej do rodu Escherichia.

Príkladom vektora jc plazmid, ako pBR322, pMW118, pUC18, pUC19 alebo podobne, fágový vektor, ako λ1059, λΒΠΟΙ, M13mp9 alebo podobne, a transpozón, ako Mu, TnlO alebo podobne. Ale podľa predloženého vynálezu je výhodný plazmid s malým množstvom kópií, ako pMW118 a pMW119, pretože transformant nesúci vektor môže byť nestabilný, ak je na zavedenie pycA génu použitý ako vektor plazmid s veľkým počtom kópií.

Zavedenie DNA do baktérie patriacej do rodu Escherichia sa môže uskutočniť napríklad spôsobom podľa D.A. Morrisona (Methods in Enzymology 68, 326 (19979) alebo spôsobom, v ktorom sa recipientné bakteriálne bunky ošetria chloridom vápenatým, aby sa zvýšila permeabilita pre DNA (Mandel, M. a Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) a podobne.

Príprava genomickej DNA, konštrukcia genomickej DNA knižnice, hybridizácia, PCR, príprava plazmidovej DNA, štiepenie a ligácia DNA, transformácia a podobne sa uskutočňujú v súlade so spôsobmi, ktoré sú priemernému odborníkovi v oblasti známe. Takéto spôsoby boli opísané v Sambrook,

J., Fritsche, E.F., Maniatis, T. v Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989).

Produktivita L-aminokyseliny baktériou patriacou do rodu Escherichia sa môže zlepšiť poskytnutím alebo zosilnením pyruvát karboxylázovej aktivity baktérie prostredníctvom transformácie baktérie s pyc génom. Je to pravdepodobne preto, že kyselina oxalooctová sa vytvára nielen z kyseliny fosfoenolpyruvátovej, ale aj z kyseliny pyruvátovej. Takže transport glukózovej (alebo sacharózovej) molekuly do bakteriálnej bunky, ktorý je sprostredkovaný systémom kyseliny fosfoenol-pyruvátovej, prebieha prostredníctvom spotreby jednej molekuly kyseliny fosfo-enolpyruvátovej, ktorá je sprevádzaná vytvorením jednej molekuly kyseliny pyruvátovej. Hoci vytváranie kyseliny pyruvátovej sa priamo nevyužíva na syntézu L-aminokyseliny v bakteriálnej bunke, je možné zvýšiť produktivitu L-aminokyseliny vytvorením kyseliny oxalooctovej z kyseliny pyruvátovej.

Ako baktéria patriaca do rodu Escherichia, do ktorej sa má zaviesť pyc gén, sa použije kmeň majúci schopnosť produkovať danú L-aminokyselinu. Alternatívne sa produktivita L-aminokyseliny môže poskytnúť baktérii patriacej do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná pyc génom. Mimochodom, pyc gén Escherichia coli ešte nie je známy, ak sa však neskôr v E. coli objaví, môže byť použitý.

Sú opísané príklady baktérií produkujúcich L-aminokyselinu, ktoré patria do rodu Escherichia.

(1) Baktérie produkujúce L-treonín

Príkladom baktérie produkujúcej L-treonín, ktorá patrí do rodu Escherichia, môže byť kmeň MG442 (uložený v ruskej národnej zbierke priemyselných mikroorganizmov (VKPM) depozit, GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskva, Rusko, pod registračným číslom VKPM B-1628) (USP 4278765; Guayatiner M.M. a ďalší, Genetika (v ruštine), 14, 947-956 (1978)). Kmeň MG442 sa získal ako mutant rezistentný proti L-treonínovému analógu, kyseline 2-amino-3-hydroxyvalérovej, a je aj izoleucín auxotrofný priepustného typu. Produkuje L-treonín a L-glutamát ako vedľajší produkt.

Alternatívne môže byť ako L-treonín produkujúci kmeň výhodne použitý transformant MG442, ktorý je transformovaný s pVIC40 (USP 5175107).

(2) Baktérie produkujúce L-lyzín

Príkladom baktérií produkujúcich L-lyzín, ktoré patria do rodu Escherichia, môžu byť rôzne baktérie opísané vo WO95/16042. Konkrétnym príkladom baktérií produkujúcich L-lyzín sú baktérie, v ktorých je zvýšená aspartokinázová aktivita a dihydrodipikolinát reduktázová aktivita, ako napríklad W3110(tyrA)RSFD80+pdapB.

(3) Baktérie produkujúce L-homoserín

Príkladom baktérií produkujúcich L-homoserín, ktoré patria do rodu Escherichia, môže byť kmeň 44 (thr B). Tento kmeň bol odvodený od známeho kmeňa C600 (thrB, leuB) (Appleyard R.K., Genetics, 39, 440 - 452 (1954)) ako Leu+ revertant. Výhodne je možné použiť transformantový kmeň 44, ktorý je transformovaný plazmidom obsahujúcim thrA gén kódujúci aspartokináza-homoserín dehydrogenázu I.

Kmeň Escherichia coli 44 je uložený v ruskej medzinárodnej zbierke priemyselných mikroorganizmov (VKPM), depozit GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskva, Rusko, od 23. septembra 1980, pod registračným číslom VKPM B-2175, a preniesol sa z pôvodného depozitu do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody 1. septembra 2000.

(4) Baktérie produkujúce kyselinu L-glutámovú

Príkladom baktérií produkujúcich kyselinu L-glutámovú, ktoré patria do rodu Escherichia, môže byť kmeň, ktorý je rezistentný proti L-valínu, napríklad Escherichia coli kmene Bil, K-12 (ATCC10798), B (ATCC11303) a W (ATCC9637).

(5) Baktérie produkujúce L-izoleucín

Príkladom baktérií produkujúcich L-izoleucín, ktoré patria do rodu Escherichia, môže byť kmeň TDH6/pVIC40, pMWD5 (Hashiguchi, K. a ďalší, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(4), 672 - 679 (1999)) alebo AJ12919, ktorýje opísaný v EPO 685 555 Al.

<2> Spôsob produkcie L-aminokyseliny

L-aminokyselinu je možné účinne vyrábať kultiváciou baktérie patriacej do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná pycA génom, ako bolo opísané, a produkuje L-aminokyselinu v príslušnom médiu, prostredníctvom produkcie a akumulovania L-aminokyseliny v médiu a izolácie L-aminokyseliny z média.

Príkladom L-aminokyseliny je výhodne L-treonín, L-lyzín, kyselina L-glutámová, L-homoserín, L-metionín, L-arginín, L-prolin alebo L-izoleucín. L-aminokyselinu j e možné vyrábať spôsobom podľa predloženého vynálezu buď samostatne, alebo ako zmes viac ako dvoch druhov L-aminokyselín.

V spôsobe podľa predloženého vynálezu sa kultivácia baktérie patriacej do rodu Eschericia, izolácia a purifikácia aminokyseliny z kvapalného média môžu uskutočňovať spôsobom podobným so spôsobmi bežnej metódy na produkciu aminokyseliny fermentáciou použitím baktérie. Médiom použitým na kultiváciu môže byť buď syntetické médium, alebo prirodzené médium, pokiaľ médium obsahuje vhodné množstvá zdroja uhlíka a dusíka a minerálov, a ak je to potrebné aj živín, ktoré použitá baktéria vyžaduje na rast. Zdroj uhlíka môže zahŕňať rôzne uhľovodíky, ako glukózu a sacharózu, a rôzne organické kyseliny. V závislosti od asimilačnej schopnosti použitej baktérie môže byť použitý alkohol zahŕňajúc etanol a glycerol. Ako zdroj dusíka sa používa amoniak, rôzne amónne soli, ako síran amónny, iné dusíkaté zlúčeniny, ako amíny, prirodzený zdroj dusíka, ako peptón, sójový hydrolyzát a poštiepené fermentatívne mikróby. Ako minerály sa používajú fosforečnan draselný, síran horečnatý, chlorid sodný, síran železitý, síran manganatý, uhličitan vápenatý.

Kultivácia sa výhodne uskutočňuje v aeróbnych podmienkach, ako pretrepávaná kultúra, a za prevzdušňovania a miešania kultúry. Teplota kultúry je zvyčajne 20 až 40 °C, výhodne 30 až 38 °C. pH kultúry je zvyčajne medzi 5 a 9, výhodne medzi 6,5 a 7,2. pH kultúry sa môže nastaviť amoniakom, uhličitanom vápenatým, rôznymi kyselinami, rôznymi zásadami a tlmivými roztokmi. Zvyčajne 1 až 3 dni kultivácie vedú k akumulovaniu cieľovej L-aminokyseliny v médiu.

Izolácia a purifikácia L-aminokyseliny sa môže uskutočňovať odstránením pevných časti, ako napríklad buniek, z média po kultivácii centrifigáciou alebo membránovou filtráciou, následne metódami iónovej výmeny, zakoncentrovávania a kryštalizačnou trakčnou metódou a podobne.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje schému konštrukcie Baciľlus subtilis pycA::KmR recipientného kmeňa na klonovanie pycA génu.

Obrázok 2 znázorňuje schému klonovaniapycA génu z Baciľlus subtilis 168.

Obrázok 3 znázorňuje schému konštrukcie plazmidu obsahujúceho pycA gén.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predložený vynález bude konkrétnejšie vysvetlený s odvolaním sa na príklady.

Príklad 1

Klonovanie pycA génu z Bacillu subtilis 168 kmeňa <1> Konštrukcia B. subtilis pycA::KmR recipientného kmeňa na klonovanie

Recipientný kmeň B. subtilis sa skonštruoval inzerčnou mutagenézou pycA génu. Fragment pycA génu sa klonoval v dvoch krokoch (pozri obrázky 1 a 2).

V databáze B. subtilis genómového sekvenčného projektu je jeden čítací rámec (ylaP) označený ako pycA gén, ktorý kóduje pyruvát karboxylázu. Oblasť umiestnená hneď zapycA génovým terminátorom sa klonovala PCR amplifikáciou použitím nasledujúceho páru oligonukleotidov: 5’-GATATAAGGGGACTTCAGAG a ’-GGCGCTTTATGCGTTTCAATC.

DNA fragmentu s dĺžkou 269 bp sa Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I zatupili konce a klonoval sa do Scal miesta pBR322 plazmidu v E. coli kmeni. Výsledný plazmid pBRPYCAl 1 sa poštiepil s Clal a ligoval sa s 1628bp DNA fragmentom nesúcim cat gén, ktorý sa získal poštiepením pC194 s Clal. Potom sa použitím získaného plazmidu pBRPYCAl lCmR3 transformoval kmeň Bacillus subtilis 168 trpC2 a selektovali sa Cm^R-klony. Plazmid pBRPYCAl lCmR3 sa nemôže autonómne replikovať v baktérii patriacej do rodu Bacillus, ale môže sa integrovať do chromozómu neďaleko pycA génu prostredníctvom homológie s 269bp DNA fragmentom. Kmeň sa označil ako B. subtilis trpC2 xyz::pBRPYCACmR3. Začlenený fragment niesol pBR322 replikón, tet gén kódujúci rezistenciu proti tetracyklínu odvodený od pBR322 a Cm^R marker.

Izolovala sa chromozomálna DNA z B. subtilis trpC2 xyz::pBRPYCACmR3 a použila sa na klonovanie distálnej časti pycA génu. Chromozomálna DNA, ktorá sa poštiepila s Pst! sa ligovala sama so sebou a transformovala sa do kmeňa E. coli TG1. Selektovali sa rekombinanty rezistentné proti tetracyklínu a chloramfenikolu. Z jedného rekombinanta sa izoloval plazmid a označil sa ako pPYCl. Plazmid pPYCl obsahoval jedno Bglll reštrikčné miesto, ktoré sa nachádzalo v pycA génovom fragmente. Toto miesto bolo použité na inzerciu 1818bp DNA fragmentu obsahujúceho marker kanamycínovej rezistenciu pre B. subtilis. Plazmid pPYCl sa poštiepil s Bglll a ligoval sa s pUC7KmR, ktorý bol poštiepený s BamHI, čím vznikol plazmid pPYCl ::KmR.

Inaktivácia pycA génu v divom type B. subtilis 168 trpC2 sa dosiahla transformáciou tohto kmeňa linearizovaným plazmidom pPYCl ::Km^R jednokrokovým postupom, následnou seleciou na Luria médiu obsahujúcom kanamycín. Km^R marker sa zaviedol do pycA génu na chromozomálnej DNA homologickou rekombináciou prostredníctvom dvojitého „crossoveru“.

Skonštruovaný kmeň B. subtilis pycA::Km^R trpC2 nerástol na Spizizenovom minimálnom médiu (Anagnostopoulos, C a Spizizen, J., J. Bacteriol., 81, 741 - 746 (1961) s tryptofánom, pokiaľ sa do tohto média nepridal citrát alebo aspartát.

Zloženie Spizizenovho minimálneho média

K₂HPO₄.3H₂O 18,3 g/1

KH₂PO₄ 6,0g/1 (NH₄)₂SO₄ 2,0g/1 citran sodný.5H₂O 1,2g/1

MgSO₄.7H₂O 0,2g/1 glukóza 10,0 g/1 pH 7,0

Kmeň B. subtilis trpC2 pycA::Km^R recE::Tc^R sa skonštruoval transdukciou inaktivovanej alely recE génu z kmeňa B. subtilis recE::TcR fágom E40 (obrázok 2). Na klonovanie pycA génu do B. subtilis bolo nevyhnutné inaktivovať rekombináciu v recipientnom kmeni. Skonštruovaný kmeň B. subtilis trpC2 pycA::Km^R recE::Tc^R bol použitý ako recipient na klonovaniepycA génu.

<2> Klonovanie B. subtilis prirodzeného pycA génu komplementárnou

PycA gén sa klonoval z kmeňa B. subtilis 168 trpC2. Chromozomálna DNA pripravená z kmeňa 168 trpC2 sa čiastočne poštiepila s EcoRI a ligovala sa s pCB20 (EmR) (darovaný Dr. Yu Jomantas, pozri Genetic transformation and expression L.O. Butler a ďalší, vyd. Intercept Ltd., PO Box 402, Wimbome, Dorset BH229T2, UK, 1989, str. 269-281), ktorý bol poštiepený s EcoRI. Potom sa trpC2 pycA::Km^R recE::Tc^R recipientný kmeň transformoval s ligačnou zmesou (obr. 2). Asp⁺, Em^R, Km^Rklony sa selektovali na Spizizenovom minimálnom médiu bez citrátu alebo aspartátu, ale s tryptofánom, erytromycínom a kanamycínom. Plazmid pPYCR3 nachádzajúci sa v jednom zo selektovaných klonov komplementoval pycA mutáciu, mal predpokladanú štruktúru a mal rovnaký Asp⁺, Em^R fenotyp po druhej transformácii.

<3> Klonovanie DNA fragmentu nesúceho pycA gén z kmeňa B. subtilis 168 trpC2 do plazmidov pUC18 a pUC19 s vysokým počtom kópií

Plazmid pPYCR3 sa poštiepil s HindlI a Scal a HindlI-Scal fragment (4414 bp) nesúci pycA gén s 5’ predchádzajúcou sekvenciou (zahŕňajúcou promótor a ribozóm viažuce miesto) sa klonoval do pUC18, ktorý bol poštiepený so Smal. Tak sa získal plazmid pUC18-pycA (horná časť obrázka 3). Ligačná reakcia sa uskutočňovala nasledovne. Deväťdesiat ng Smaí-poštiepeného pUC18 a 300 ng HindlI-Scal fragmentu (4414 bp), ktorý nesie pycA gén, a ktorý sa purifikoval agarózovou gólovou elektoroforézou, sa ligovalo s 2 jednotkami T4 DNA ligázy (Pharmacia, Švédsko) v 45 μΐ reakčnej zmesi s obsahom lx One-Phor-All tlmivého roztoku (Pharmacia, Švédsko) a 1 mM ATP.

E. coli TG1 sa transformoval s pUC18-pycA. Získané transformanty sa analyzovali použitím KpnI, Xbal, BamHI, HindlII a EcoRI endonukleáz. Všetky klony niesli pycA gén v opačnej orientácii proti lac promótora pUC18 plazmidu. Ale pycA gény klonované v pUC18 plazmide môžu byť exprimované pod kontrolou ich vlastného génového promótora.

Aby sa dostal pycA gén pod kontrolu lac promótora, klonoval sa potom KpnI-Xbal fragment pUC18-pycA do pUC19, ktorý bol poštiepený s KpnI-Xbal. Ale získané klony boli nestabilné a rekombinantný plazmid sa eliminoval počas krátkej doby (6 až 8 hodín) kultivácie.

<4> Klonovanie DNA fragmentu nesúcehopycA gén do nízkokópiového plazmidu pMWl 19

KpnI-Xbalfragment pUC18-pycA sa ligoval do nízkokópiového plazmidu pMWl 19, ktorý bol poštiepený s KpnI a Xbal (spodná časť obrázka 3). Ligačná reakcia sa uskutočňovala v 50 μΐ reakčnej zmesi obsahujúcej 60 ng pMWl 19 poštiepeného s KpnI-Xbal, 120 ng KpnI-Xbal fragmentu pUC18-pycA, ktorý bol purifíkovaný agarózovou gélovou elektroforézou, lx One-Phor-All tlmivého roztoku (Pharmacia, Švédsko), lmM ATP a 1 jednotky T4 DNA ligázy (Pharmacia, Švédsko).

Použitím ligačnej zmesi sa transformoval E. coli TG1. Výsledné transformanty sa analyzovali použitím Sací, KpnI, Xbal, BamHI, HindlII a EcoRI. Všetky klony niesli pycA gén pod kontrolou lac promótora plazmidu pMW119 a pod kontrolou ich vlastného promótora. Takto získaný kloň, z ktorého sa získal plazmid pMWl 19-pycA, sa označil TG1 (pMWl 19-pycA).

Príklad 2

Produkcia L-treonínu a kyseliny L-glutámovej

E. coli kmeň MG442 sa transformoval s plazmidom pMWl 19-pycA a selektovalo sa desať Amp^r

kolónií. Produktivity L-treonínu a kyseliny L-glutámovej kolóniami sa skúmali použitím nasledujúceho fermentačného média.
Zloženie fermentačného média
glukóza (sterilizuje sa oddelene)	60 g/1
(NH4)SO₄	15,0 g/1
kh₂po₄	1,5 g/1
MgSO₄.7H₂O	1,0 g/1
L-izoleucín	100 mg/1
tiamín	0,1 mg/1
CaCO₃ (sterilizuje sa oddelene)	20 g/1

Fermentácia sa uskutočňovala v testovacích skúmavkách (20 x 300 mm) pri 32 °C 72 hodín použitím rotačnej miešačky. Jedno očko každého z 10 klonov sa inokulovalo do testovacej skúmavky obsahujúcej 2,0 ml fermentačného média. Ako kontrola sa použilo 10 jednotlivých kolónií kmeňa MG442 bez plazmidu. Po fermentácii sa merali koncentrácie L-treonínu a kyseliny L-glutámovej naakumulovaných v médiu prostredníctvom chromatografie na tenkej vrstve. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Kloň č.	MG442 (kontrola)	MG442 (pMWl 19-pycA)
L-thr (g/1)	L-glu (g/1)	L-thr (g/1)	L-glu (g/1)
1	5,5	9,5	7,8	12,3
2	3,2	7,1	9,8	12,3
3	3,6	7,1	9,4	13,3
4	3,4	8,9	9,8	11,8
5	3,3	8,9	9,8	11,8
6	4,8	7,3	9,9	11,8
7	3,3	7,0	10,0	10,7
8	4,7	8,3	10,0	10,4
9	3,2	7,3	9,7	H,2
10	2,6	4,1	10,0	10,7
priemer	3,8	7,4	9,6	11,6

Príklad 3

Produkcia L-homoserínu

E. coli kmeň 44 produkujúci L-homoserín sa transformoval plazmidom pMW442-pycA a selektovalo sa päť ampicilín rezistentných klonov. Produkcia L-homoserínu sa skúmala tak ako bolo uvedené v príklade 1, ale fermentačné médium bolo doplnené s 0,5 g/1 L-treonínu. Ako kontrola sa použilo päť kolónií kmeňa 44 bez plazmidu. Po fermentácii boli priemerné koncentrácie L-homoserínu 4,5 g/1 (kmeň 44) a 5,7 g/1 (kmeň 44 s plazmidom pMW442-pycA).

Opodstatnene sa očakáva aj účinok pycA génu na produktivitu L-lyzínu, pretože sa potvrdilo, že pycA gén má pozitívny účinok na produktivitu L-treonínu a L-homoserínu, ktoré čiastočne zdieľajú rovnakú biosyntetickú dráhu ako L-lyzín.

Zoznam sekvencii <110> Ajinomoto Co., Inc.

< 120> Spôsob výroby L-aminokyseliny fermentáciou <130> OP877 <141> 2000-10-14 <150>RU 99121636 <151> 2000-10-14 <160> 2 < 170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212>DNA <213> umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primer <400> 1 gatataaggg gacttcagag 20 <210> 2 <211> 20 <212>DNA <213> umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primer <400> 2 ggcgctttat gcgtttcaatc 20 <210> 3 <211>3462 <212>DNA <213> Bacillus subtilis <220>

<221>CDS <222> (16)..(3459) <400> 3 aagggggaga aaagt ttg tet cag caa tcg ata caa aaa gta tta gta gca 51

			Leu Ser Gli	n Gin	Ser íle Gin Lys Val Leu Val Ala
			1		5 10
aac agg	gga	gaa	att gca atc	ega a	ta ttc cgg gcg tgt acc gag ttg 99
Asn Arg	Gly	Glu	íle Ala íle	Arg I	le Phe Arg Ala Cys Thr Glu Leu
	15			20	25

aat

att

cgt

aca gtt

gcg

gtc

tat

tca

aaa

gaa

gat

tcc

ggt

tcc

tac

147

Asn

íle .

Arg '

Thr Val

Ala

Val

Tyr

Ser

Lys

Glu

Asp

Ser

Gly

Ser

Tyr

30

35

40

cat

cgg

tac

aaa gcg

gat

gaa

gca

tac

ttg

gtc

ggt

gaa

ggg

aaa

195

His

Arg '

Tyr '

Lys Ala

Asp ¹

Glu

Ala '

Tyr

Leu

Val

Gly

Glu

Gly

Lys

45

50

55

60

ccg

att j

gat j

get tac

ctg ;

gat

att ;

gaa

ggt

atc

att

gat

att

gcg

aaa

243

Pro

íle i

Asp .

Ala Tyr

Leu .

Asp

íle i

Glu

Gly

íle

Asp

íle

Al a

Lys

65

70

75

aga

aac <

laa gtc gat <

gca i

att

cat <

ccg

gga

tac

ggt

ttc

tta

tet

gaa

291

Arg .

Asn 1

Lys ¹

/al Asp ,

41a

íle i

His 1

Pro

Gly

Tyr

Gly

Phe

Leu

Ser

Glu

qn J v

85

90

aat

att

cat

ttt gcg

aga

ega

tgt

gaa

ggc

atc

gta

ttc

ata

339

Asn

íle

His

Phe Ala

Arg

Cys

Glu

Gly

íle

Val

Phe

íle

95

100

105

ggg

cca

aaa

tcc gag

cat

ctc

gat

atg

ttt

ggt

gac

aag

gta

aaa

gcg

387

Gly

Pro

Lys

Ser Glu

His

Leu

Asd

Met

Phe

Gly

Asp

Lys

Val

Lys

Ala

110

115

120

cgt

gag

cag

gca gaa

aaa

gcg

gga

atc

ccc

gtg

att

ccg

gga

age

gac

435

Arg

Glu

Gin

Ala Glu

Lys

Ala

Gly

Íle

Pro

Val

íle

Pro

Gly

Ser

Asp

125

130

135

140

ggt

cct

gcc

gaa acg

ctt

gaa

gcc

gtc

gaa

caa

ttt

gga

caa

get

aac

483

Gly

Pro

Ala

Glu Thr

Leu

Glu

Ala

Val

Glu

Gin

Phe

Gly

Gin

Ala

Asn

145

150

155

ggt

tat

ccg

atc atc

att

aaa

gcc

tcg

ctt

ggc

ege

ggt

531

Gly

Tyr

Pro

íle íle

íle

Lys

Ala

Ser

Leu

Gly

Arg

Gly

160

165

170

atg

cgg

att

gtc aga

tet

gaa

agt

gaa

gtt

aaa

gaa

gca

tat

gag

Cgt

579

Met

Arg

íle

Val Arg

Ser

Glu

Ser

Glu

Val

Lys

Glu

Ala

Tyr

Glu

Arg

175

180

185

get

aaa

tca

gag gcg

aaa

gca

gcc

ttt

ggc

aat

gat

gaa

gtt

tat

gta

627

Ala

Lys

Ser

Glu Ala

Lys

Ala

Phe

Gly

Asn

Asp

Glu

Val

Tyr

Val

190

195

200

gaa

aaa

t ta

att gag

aat

ccg

aaa

cat

att

gag

gtt

cag

gtc

att

gga

675

Glu

Lys

Leu

íle Glu

Asn

Pro

Lys

His

íle

Glu

Val

Gin

Val

íle

Gly

205

210

215

220

723

gac

aag

cag

ggc

aat

gtc

cat

ctt

ttt

gag

agg

gat

tgc

tcc

gtt

Asp

Lys

Gin

Gly

Asn

Val

His

Leu

Phe

Glu

Arg

Asp

Cys

Ser

Val

225

230

235

caa

aga

cgc

cat

caa

aaa

gtc

att

gaa

gtg

gcg

ccg

agt

gtc

tcg

ctg

Gin

Arg

His

Gin

Lys

Val

íle

Glu

Val

Ala

Pro

Ser

Val

Ser

Leu

240

245

250

tca

cct

gaa

t ta

agg

gac

caa

att

tgt

gag

get

gca

gtt

gcg

ctt

gcc

Ser

Pro

Glu

Leu

Arg

Asp

Gin

íle

Cys

Glu

Ala

Val

Ala

Leu

Ala

255

260

265

aaa

aat

g ta

aac

tat

ata

aat

gcg

ggg

acg

gtc

gaa

ttc

ctt

gtt

gca

Lys

Asn

Val

Asn

Tyr

íle

Asn

Ala

Gly

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Val

Ala

771

819

867

270

275

280

aac

gag

ttc

tac

ttt

att

gaa

gta

aat

cct

cgc

gta

caa

gtt

gaa

915

Asn

Glu

Phe

Tyr

Phe

íle

Glu

Val

Asn

Pro

Arg

Val

Gin

Val

Glu

285

290

295

300

cac

acg

ata

aca

gaa

atg

att

act

ggt

gtc

gat

att

gtt

caa

act

cag

963

His

Thr

íle

Thr

Glu

Met

íle

Thr

Gly

Val

Asp

íle

Val

Gin

Thr

Gin

305

310

315

atc

ctt

gtt

gcc

caa

ggg

cac

age

ctt

cac

age

aaa

gta

aat

att

1011

íle

Leu

Val

Ala

Gin

Gly

His

Ser

Leu

His

Ser

Lys

Val

Asn

Íle

320

325

330

cct

gag

caa

aag

gac

att

ttt

aca

atc

ggc

tat

gcc

att

cag

tca

cgg

1059

Pro

Glu

Gin

Lys

Asp

íle

Phe

Thr

íle

Gly

Tyr

Ala

Ue

Gin

Ser

Arg

335

340

345

gtt

acg

act

gag

gat

ccg

caa

aat

gat

ttc

atg

cct

gat

aca

gga

aaa

1107

Val

Thr

Glu

Asp

Pro

Gin

Asn

Asp

Phe

Met

Pro

Asp

Thr

Gly

Lys

350

355

360

atc

atg

get

tac

cgc

tca

ggc

ggt

ttt

ggt

gtc

cgt

ctt

gat

acc

1155

I le

Met

Ala

Tyr

Arg

Ser

Gly

Phe

Gly

Val

Arg

Leu

Asp

Thr

365

370

375

380

gga

aac

age

ttc

cag

ggc

gcc

gtg

atc

aca

cca

tac

tat

gat

tca

ctt

1203

Gly

Asn

Ser

Phe

Gin

Gly

Ala

Val

íle

Thr

Pro

Tyr

Asp

Ser

Leu

385

390

395

ctc

gtt

aag

ctt

tca

act

tgg

get

tta

acg

ttt

gaa

cag

gca

get

gcc

1251

Leu

Val

Lys

Leu

Ser

Thr

Trp

Ala

Leu

Thr

Phe

Glu

Gin

Ala

400

405

410

ίο

aaa

atg

gtg

ega

aac

ctt

cag

gag

ttt

aga

atc

aga

ggc

ata

aaa

acg

1299

Lys

Met

Val

Arg

Asn

Leu

Gin

Glu

Phe

Arg

Ile

Arg

Gly

Ile

Lys

Thr

415

420

425

aac

att

ccg

ttc

ctt

gag

aac

gtt

gca

aag

cat

gag

aag

ttc

ctg

aca

1347

Asn

Ile

Pro

Phe

Leu

Glu

Asn

Val

Ala

Lys

His

Glu

Lys

Phe

Leu

Thr

430

435

440

ggg

caa

tat

gat

aca

tet

ttc

att

gat

aca

acg

cct

gaa

tta

ttt

aat

1395

Gly

Gin

Tyr

Asp

Thr

Ser

Phe

Ile

Asp

Thr

Pro

Glu

Leu

Phe

Asn

445

450

455

460

ttc

cct

aaa

caa

aaa

gac

ege

gga

acg

aaa

atg

ctc

act

tac

atc

ggc

1443

Phe

Pro

Lys

Gin

Lys

Asp

Arg

Gly

Thr

Lys

Met

Leu

Thr

Tyr

íle

Gly

465

470

475

aat

gtg

aca

gtg

aac

ggc

ttc

cct

gga

atc

ggg

aaa

gaa

aaa

ccg

1491

Asn

Val

Thr

Val

Asn

Gly

Phe

Pro

Gly

Ile

Gly

Lys

Glu

Lys

Pro

480

485

490

gcg

ttt

gac

aaa

ccg

tta

ggc

gta

aag

gta

gac

gtt

gat

cag

cct

1539

Ala

Phe

Asp

Lys

Pro

Leu

Gly

Val

Lys

Val

Asp

Val

Asp

Gin

Pro

495

500

505

gcc

aga

gga

aca

aag

caa

att

ctc

gat

gaa

aaa

ggt

gca

gaa

ggg

ctt

1587

Ala

Arg

Gly

Thr

Lys

Gin

Ile

Leu

Asp

Glu

Lys

Gly

Ala

Glu

Gly

Leu

510

515

520

gca

aat

tgg

gtt

aag

gag

cag

aaa

tet

gtc

ctt

tta

act

gat

acg

aca

1635

Ala

Asn

Trp

Val

Lys

Glu

Gin

Lys

Ser

Val

Leu

Thr

Asp

Thr

525

530

535

540

ttc

agg

gat

gcc

cac

caa

tcg

tta

ttg

gca

act

aga

atc

aga

tcg

cat

1683

Phe

Arg

Asp

Ala

His

Gin

Ser

Leu

Ala

Thr

Arg

Ile

Arg

Ser

His

545

550

555

gat

ttg

aaa

atc

gca

aat

ccg

acg

get

gcg

tta

tgg

cct

gaa

cta

1731

Asp

Leu

Lys

Ile

Ala

Asn

Pro

Thr

Ala

Leu

Trp

Pro

Glu

Leu

560

565

570

ttc

agt

atg

gaa

atg

tgg

gga

ggc

gcg

acc

ttc

gat

gta

gcc

tac

ega

1779

Phe

Ser

Met

Glu

Met

Trp

Gly

Ala

Thr

Phe

Asp

Val

Ala

Tyr

Arg

575

580

585

ttc

ctg

aaa

gaa

gat

ccg

tgg

aaa

cgt

ttg

gaa

gat

ctt

ege

aaa

gaa

1827

Phe

Leu

Lys

Glu

Asp

Pro

Trp

Lys

Arg

Leu

Glu

Asp

Leu

Arg

Lys

Glu

590

595

600

gtg

; ccg

aat

acc

t ta

ttc

cag

atg

ttg

ctt

: ege

: tca tca aat

gcg

gtc

1875

Val

Pro

Asn

Thr

Leu

Phe

Gin

Met

Leu

. Let

i Arg

; Ser

' Ser Asn

i Ala

Val

605

610

615

620

ggc

tat

acg

aat

tat

ccg

gac

aat

gtg

att

. aaa

. gaa

. ttt

: gtg

aag

caa

1923

Gly

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Pro

Asp

Asn

Val

íle

Lys

Glu

i Phe

t Val

Lys

Gin

625

630

635

tca

get

caa

tcc

ggt

att

gat

gtg

ttt

cgt

att

ttc

gac

: agc

tta

aac

1971

Ser

Ala

Gin

Ser

Gly

íle

Asp

Val

Phe

Arg

íle

Phe

Asp

Ser

Leu

Asn

640

645

650

tgg

gta

aaa

ggg

atg

acg

tta

gcc

att

gat

get

gtt

agg

gat

acc

ggc

2019

Trp

Val

Lys

Gly

Met

Thr

Leu

Ala

íle

Asp

Ala

Val

Arg

Asp

Thr

Gly

655

660

665

aaa

gtg

gca

gaa

get

gcg

att

tgt

tat

acg

gga

gat

atc

ctt

gac

aag

2067

Lys

Val

Ala

Glu

Ala

íle

Cys

Tyr

Thr

Gly

Asp

íle

Leu

Asp

Lys

670

675

680

aac

cgg

acg

aag

tac

gac

ctt

gca

tat

aca

tcg

atg

gcg

aag

gag

2115

Asn

Arg

Thr

Lys

Tyr

Asp

Leu

Ala

Tyr

Thr

Ser

Met

Ala

Lys

Glu

685

690

695

700

ctt

gag

gcg

gcc

gga.

gcc

cat

att

ctc

ggg

att

aaa

gat

atg

gca

ggg

2163

Leu

Glu

Ala

Gly

Ala

His

íle

Leu

Gly

íle

Lys

Asp

Met

Ala

Gly

705

710

715

ctg

t ta

aaa

ccg

cag

get

gca

tat

gag

ctc

gtt

tet

gcg

ttg

aaa

gaa

2211

Leu

Lys

Pro

Gin

Ala

Tyr

Glu

Leu

Val

Ser

Ala

Leu

Lys

Glu

720

725

730

acg

atc

gac

att

ccg

gtt

cac

ctt

cat

acg

cat

gat

acg

agc

gga

aac

2259

Thr

I le

Asp

íle

Pro

Val

His

Leu

His

Thr

His

Asp

Thr

Ser

Gly

Asn

735

740

745

ggt

att

tat

atg

tat

gcg

aaa

get

gtt

gaa

gcc

ggc

gtt

gat

atc

ata

2307

Gly

I le

Tyr

Met

Tyr

Ala

Lys

Ala

Val

Glu

Ala

Gly

Val

Asp

íle

I le

750

755

760

gac

gtg

gcg

gtc

agc

tca

atg

gcg

gga

tta

acg

tca

cag

cct

agc

gcg

2355

Asp

Val

Ala

Val

Ser

Met

Ala

Gly

Leu

Thr

Ser

Gin

Pro

Ser

Ala

765

770

775

780

agc

gga

ttt

tat

cat

gcg

atg

gaa

ggc

aac

gac

ege

cgt

ccg

gaa

atg

2403

Ser

Gly

Phe

Tyr

His

Ala

Met

Glu

Gly

Asn

Asp

Arg

Pro

Glu

Met

785

790

795

aat

gtc

caa

ggc

gtt

gaa

ttg

ctg

tcc

caa

tat

tgg

gag

tcg

gtg

cgt

2451

Asn

Val

Gin

Gly

Val

Glu

Leu

Ser

Gin

Tyr

Trp

Glu

Ser

Val

Arg

800

805

810

aaa

tat

agt

gaa

ttt

gaa

agc

gga

atg

aag

tct

ccg

cat

act

gaa

2499

Lys

Tyr

Ser

Glu

Phe

Glu

Ser

Gly

Met

Lys

Ser

Pro

His

Thr

Glu

815 820 825

att

tat

gaa

cac

gaa

atg

cca

ggg

ggc

caa

tac

agc

aac

ctg

cag

2547

Íle

Tyr

Glu

His

Glu

Met

Pro

Gly

Gin

Tyr

Ser

Asn

Leu

Gin

830

835

840

caa

gcc

aag

gga

gta

ggc

ctt

ggc

gac

cgc

tgg

aac

gaa

gtc

aag

gaa

2595

Gin

Ala

Lys

Gly

Val

Gly

Leu

Gly

Asp

Arg

Trp

Asn

Glu

Val

Lys

Glu

845

850

855

860

atg

tac

aga

cgc

gtg

aac

gat

atg

ttc

ggt

gac

atc

gtc

aag

gta

acg

2643

Met

Tyr

Arg

Val

Asn

Asp

Met

Phe

Gly

Asp

íle

Val

Lys

Val

Thr

865

870

875

cct

tcc

tca

aaa

gta

gtc

gga

gat

atg

gca

ctc

tac

atg

gtg

caa

aac

2691

Pro

Ser

Lys

Val

Gly

Asp

Met

Ala

Leu

Tyr

Met

Val

Gin

Asn

880 885 890

aat

ctg

act

gaa

aaa

gac

gtt

tac

gaa

aaa

ggt

gaa

tct

tta

gat

ttc

2739

Asn

Leu

Thr

Glu

Lys

Asp

Val

Tyr

Glu

Lys

Gly

Glu

Ser

Leu

Asp

Phe

895

900

905

cct

gat

tct

gtc

gtg

gag

ctt

ttt

aaa

gga

aat

atc

ggc

cag

cct

cat

2787

Pro

Asp

Ser

Val

Glu

Leu

Phe

Lys

Gly

Asn

íle

Gly

Gin

Pro

His

910

915

920

ggc

gga

ttc

cca

gaa

aaa

ctg

caa

aag

ctg

atc

tta

aaa

ggg

cag

gag

2835

Gly

Phe

Pro

Glu

Lys

Leu

Gin

Lys

Leu

íle

Leu

Lys

Gly

Gin

Glu

925

930

935

940

ccg

att

aca

gtc

aga

ccg

ggc

gaa

ctg

ctt

gag

ccg

gtg

tca

ttt

gaa

2883

Pro

íle

Thr

Val

Arg

Pro

Gly

Glu

Leu

Glu

Pro

Val

Ser

Phe

Glu

945

950

955

gcg

atc

aaa

cag

gaa

ttt

aaa

gag

cag

cat

aac

ttg

gaa

att

tca

gat

2931

Ala

íle

Lys

Gin

Glu

Phe

Lys

Glu

Gin

His

Asn

Leu

Glu

íle

Ser

Asp

960

965

970

cag

gat

get

gtg

gca

tat

gcc

ctt

tat

cct

aaa

gtc

ttc

act

gat

tat

2979

Gin

Asp

Ala

Val

Ala

Tyr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Lys

Val

Phe

Thr

Asp

Tyr

975 980 985

gtg

aaa

acg aca

gaa

agc

tat gga

gac

atc

tcg

gta

tta

gat

aca

ccg

3027

Val

Lys

Thr Thr

Glu

Ser

Tyr Gly

Asp

íle

Ser

Val

Leu

Asp

Thr

Pro

990

995

1000

aca

ttc

ttc tac

ggt

atg

aca tta

ggt

gaa

gag

ata

gaa

gtt

gaa

att

3075

Thr

Phe

Phe Tyr

Gly

Met

Thr Leu

Gly

Glu

Íle

Glu

Val

Glu

íle

LOO;

5

1010

1015

1020

gag

cgc

ggc aaa

acg

ctg

atc gtt

aag

ctg

att

tca

atc

ggt

gag

cct

3123

Glu

Arg

Gly Lys

Thr

Leu

íle Val

Lys

Leu

íle

Ser

íle

Gly

Glu

Pro

1025

1030

1035

cag

cct

gat gcc

acc

cgc

gtc gtt

tat

ttc

gaa

ctc

aac

ggg

cag

ccg

3171

Gin

Pro

Asp Ala

Thr

Arg

Val Val

Tyr

Phe

Glu

Leu

Asn

Gly

Gin

Pro

1040

1045

1050

cgt

gaa

gta gtc

att

aaa

gat gaa

agc

att

aag

tet

tcc

gtt

cag

gaa

3219

Arg

Glu

Val Val

íle

Lys

Asp Glu

Ser

íle

Lys

Ser

Val

Gin

Glu

1055

1060

1065

agg

ctg

aaa gca

gac

cgg

aca aat

cca

agc

cac

atc

gca

get

tcc

atg

3267

Arg

Leu

Lys Ala

Asp

Arg

Thr Asn

Pro

Ser

His

íle

Ala

Ser

Met

1

.070

1075

1080

cct

gga

aca gtt

att

aag

gta ttg

get

gaa

gca

ggc

aca

aaa

gtc

aat

3315

Pro

Gly

Thr Val

íle

Lys

Val Leu

Ala

Glu

Ala

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

1085

J

.090

1

1095

1

j 100

aaa

ggt

gat cat

ttg

atg

att aat

gaa

gcg

atg

aaa

atg

gaa

aca

acg

3363

Lys

Gly

Asp His

Leu

Met

íle Asn

Glu

Ala

Met

Lys

Met

Glu

Thr

1

.105

1

.110

1

115

gtt

cag

gcg cct

ttc

tca

gga aca

atc

aag

cag

gtt

cat

gtg

aaa

aat

3411

Val

Gin

Ala Pro

Phe

Ser

Gly Thr

íle

Lys

Gin

Val

His

Val

Lys

Asn

1120

1

.125

1

130

ggt

gag

ccg atc

caa

acg

gga gat

ctg

ctc

ctt

gaa

att

gaa

ä£.ä

gca

3459

Gly

Glu

Pro íle

Gin

Thr

Gly Asp

Leu

Glu

íle

Glu

Lys

Ala

1

135

1140

1

145

taa 3462 <210>4 <211>1148 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 1

Leu

Ser

Gin

Ser

íle

Gin

Lys

Val

Leu

Val

Ala

Asn

Arg

Gly

C-lu

1

5

10

15

íle

Ala

íle

Arg

íle

Phe

Arg

Ala

Cys

Thr

Glu

Leu

Asn

íle

Arg

Thr

20

25

30

Val

Ala

Val

Tyr

Ser

Lys

Glu

Asp

Ser

Gly

Ser

Tyr

His

Arg

Tyr

Lys

35

40

45

Ala

Asp

Glu

Ala

Tyr

Leu

Val

Gly

Glu

Gly

Lys

Pro

íle

Asp

Ala

50

55

60

Tyr

Leu

Asp

íle

Glu

Gly

íle

Asp

íle

Ala

Lys

Arg

Asn

Lys

Val

65

70

75

80

Asp

Ala

íle

His

Pro

Gly

Tyr

Gly

Phe

Leu

Ser

Glu

Asn

íle

His

Phe

85

90

95

Ala

Arg

Cys

Glu

Gly

íle

Val

Phe

íle

Gly

Pro

Lys

Ser

100

105

110

Glu

His

Leu

Asp

Met

Phe

Gly

Asp

Lys

Val

Lys

Ala

Arg

Glu

Gin

Ala

115

120

125

Glu

Lys

Ala

Gly

íle

Pro

Val

íle

Pro

Gly

Ser

Asp

Gly

Pro

Ala

Glu

130

135

140

Thr

Leu

Glu

Ala

Val

Glu

Gin

Phe

Gly

Gin

Ala

Asn

Gly

Tyr

Pro

íle

145

150

155

160

íle

Lys

Ala

Ser

Leu

Gly

Arg

Gly

Met

Arg

íle

Val

165

170

175

Arg

Ser

Glu

Ser

Glu

Val

Lys

Glu

Ala

Tyr

Glu

Arg

Ala

Lys

Ser

Glu

180

185

190

Ala

Lys

Ala

Phe

Gly

Asn

Asp

Glu

Val

Tyr

Val

Glu

Lys

Leu

íle

195

200

205

Glu

Asn

Pro

Lys

His

íle

Glu

Val

Gin

Val

I le

Gly

Asp

Lys

Gin

Gly

210

215

220

Asn

Val

His

Leu

Phe

Glu

Arg

Asp

Cys

Ser

Val

Gin

Arg

His

225

230

235

240

Gin

Lys

Val

íle

Glu

Val

Ala

Pro

Ser

Val

Ser

Leu

Ser

Pro

Glu

Leu

245

250

255

Arg

Asp

Gin

íle

Cys

Glu

Ala

Val

Ala

Leu

Ala

Lys

Asn

Val

Asn

260

265

270

Tyr

íle

Asn

Ala

Gly

Thr

Val

Glu

Phe

Leu

Val

Ala

Asn

Glu

Phe

275

280

285

Tyr

Phe

Ile

Glu

Val

Asn

Pro

Arg

Val

Gin

Val

Glu

His

Thr

Ile

Thr

290

295

300

Glu

Met

íle

Thr

Gly

Val

Asp

íle

Val

Gin

Thr

Gin

Ile

Leu

Val

Ala

305

310

315

320

Gin

Gly

His

Ser

Leu

His

Ser

Lys

Val

Asn

Ile

Pro

Glu

Gin

Lys

325

330

335

Asp

Ile

Phe

Thr

Ile

Gly

Tyr

Ala

íle

Gin

Ser

Arg

Val

Thr

Glu

340

345

350

Asp

Pro

Gin

Asn

Asp

Phe

Met

Pro

Asp

Thr

Gly

Lys

Ile

Met

Ala

Tyr

355

360

365

Arg

Ser

Gly

Phe

Gly

Val

Arg

Leu

Asp

Thr

Gly

Asn

Ser

Phe

370

375

380

Gin

Gly

Ala

Val

Ile

Thr

Pro

Tyr

Asp

Ser

Leu

Val

Lys

Leu

385

390

395

400

Ser

Thr

Trp

Ala

Leu

Thr

Phe

Glu

Gin

Ala

Lys

Met

Val

Arg

405

410

415

Asn

Leu

Gin

Glu

Phe

Arg

Ile

Arg

Gly

Ile

Lys

Thr

Asn

íle

Pro

Phe

420

425

430

Leu

Glu

Asn

Val

Ala

Lys

His

Glu

Lys

Phe

Leu

Thr

Gly

Gin

Tyr

Asp

435

440

445

Thr

Ser

Phe

I le

Asp

Thr

Pro

Glu

Leu

Phe

Asn

Phe

Pro

Lys

Gin

450

455

460

Lys

Asp

Arg

Gly

Thr

Lys

Met

Leu

Thr

Tyr

Ile

Gly

Asn

Val

Thr

Val

465

470

475

480

Asn

Gly

Phe

Pro

Gly

Ile

Gly

Lys

Glu

Lys Pro

Ala

Phe Asp

Lys

485

490

495

Pro

Leu

Gly

Val

Lys

Val

Asp

Val

Asp

Gin

Gin Pro

Ala

Arg Gly

Thr

500

505

5L0

Lys

Gin

íle

Leu

Asp

Glu

Lys

Gly

Ala

Glu

Gly Leu

Ala

Asn Trp

Val

515

520

525

Lys

Glu

Gin

Lys

Ser

Val

Leu

Thr

Asp

Thr Thr

Phe

Arg Asp

Ala

530

535

540

His

Gin

Ser

Leu

Ala

Thr

Arg íle

Arg

Ser

His

Asp

Leu

Lys

545

550

555

560

íle

Ala

Asn

Pro

Thr

Ala

Leu Trp

Pro

Glu

Leu

Phe

Ser

Met

Glu

565

570

575

Met

Trp

Gly

Ala

Thr

Phe

Asp Val

Ala

Tyr

Arg

Phe

Leu

Lys

Glu

580

585

590

Asp

Pro

Trp

Lys

Arg

Leu

Glu

Asp Leu

Arg

Lys

Glu

Val

Pro

Asn

Thr

595

600

605

Leu

Phe

Gin

Met

Leu

Arg

Ser Ser

Asn

Ala

Val

Gly

Tyr

Thr

Asn

610

615

620

Tyr

Pro

Asp

Asn

Val

íle

Lys

Glu Phe

Val

Lys

Gin

Ser

Ala

Gin

Ser

625

630

635

640

Gly

íle

Asp

Val

Phe

Arg

íle

Phe Asp

Ser

Leu

Asn

Trp

Val

Lys

Gly

645

650

655

Met

Thr

Leu

Ala

íle

Asp

Ala

Val Arg

Asp

Thr

Gly

Lys

Val

Ala

Glu

660

665

670

Ala

íle

Cys

Tyr

Thr

Gly

Asp íle

Leu

Asp

Lys

Asn

Arg

Thr

Lys

675

680

685

Tyr

Asp

Leu

Ala

Tyr

Thr

Ser Met

Ala

Lys

Glu

Leu

Glu

Ala

690

695

700

Gly

Ala

His

íle

Leu

Gly

íle

Lys Asp

Met

Ala

Gly

Leu

Lys

Pro

705

710

715

720

Gin

Ala

Tyr

Glu

Leu

Val

Ser Ala

Leu

Lys

Glu

Thr

íle

Asp

íle

725

730

735

Pro

Val

His

Leu

His

Thr

His

Asp Thr

Ser

Gly

Asn

Gly

íle

Tyr

Ne t

740

745

750

Tyr

Ala

Lys

Ala

Val

Glu

Ala

Gly Val

Asp

íle

Asp

Val

Ala

Val

755

760

765

Ser

Met

Ala

Gly

Leu

Thr

Ser Gin

Pro

Ser

Ala

Ser

Gly

Phe

Tyr

770

775

780

His

Ala

Met

Glu

Gly

Asn

Asp

Arg Arg

Pro

Glu

Met

Asn

Val

Gin

Gly

785

790

795

800

Val

Glu

Leu

Ser

Gin

Tyr

Trp Glu

Ser

Val

Arg

Lys

Tyr

Ser

805

810

815

Glu

Phe

Glu Ser

Gly

Met

Lys

Ser

Pro

His Thr

Glu

íle

Tyr

Glu

His

820

825

830

Glu

Met

Pro Gly

Gly

Gin

Tyr

Ser

Asn

Leu Gin

Gin

Ala

Lys

Gly

835

840

845

Val

Gly

Leu Gly

Asp

Arg

Trp

Asn

Glu

Val Lys

Glu

Met

Tyr

Arg

850

855

860

Val

Asn

Asp Met

Phe

Gly

Asp

íle

Val

Lys Val

Thr

Pro

Ser

Lys

865

870

875

880

Val

Gly Asp

Met

Ala

Leu

Tyr

Met

Val Gin

Asn

Leu

Thr

Glu

885

890

895

Lys

Asp

Val Tyr

Glu

Lys

Gly

Glu

Ser

Leu Asp

Phe

Pro

Asp

Ser

Val

900

905

910

Val

Glu

Leu Phe

Lys

Gly

Asn

íle

Gly

Gin Pro

His

Gly

Phe

Pro

915

920

925

Glu

Lys

Leu Gin

Lys

Leu

íle

Leu

Lys

Gly Gin

Glu

Pro

íle

Thr

Val

930

935

940

Arg

Pro

Gly Glu

Leu

Glu

Pro

Val

Ser Phe

Glu

Ala

íle

Lys

Gin

945

950

955

960

Glu

Phe

Lys Glu

Gin

His

Asn

Leu

Glu

íle Ser

Asp

Gin

Asp

Ala

Val

965

970

975

Ala

Tyr

Ala Leu

Tyr

Pro

Lys

Val

Phe

Thr Asp

Tyr

Val

Lys

Thr

980

985

990

Glu

Ser

Tyr Gly

Asp

íle

Ser

Val

Leu

Asp Thr

Pro

Thr

Phe

Tyr

995

1

000

1005

Gly

Met

Thr Leu

Gly

Glu

íle

Glu

Val Glu

íle

Glu

Arg

Gly

Lys

]

.010

1015

1

020

Thr

Leu

íle Val

Lys

Leu

íle

Ser

íle

Gly Glu

Pro

Gin

Pro

Asp

Ala

025

1

030

1035

1

.040

Thr

Arg

Val Val

Tyr

Phe

Glu

Leu

Asn

Gly Gin

Pro

Arg

Glu

Val

1

045

1

050

1

055

íle

Lys

Asp Glu

Ser

íle

Lys

Ser

Val Gin

Glu

Arg

Leu

Lys

Ala

1060

1

065

1

070

Asp

Arg

Thr Asn

Pro

Ser

His

íle

Ala

Ala Ser

Met

Pro

Gly

Thr

Val

1075 1080 1085

íle

Lys

Val

Leu

Ala

Glu

Ala

Gly

Thr

Lys

Val Asn

Lys

Gly

Asp His

1090

1095

1100

Leu

Met

íle

Asn

Glu

Ala

Met

Lys

Met

Glu

Thr Thr

Val

Gin

Ala Pro

105

1110

1115

1120

Phe

Ser

Gly

Thr

íle

Lys

Gin

Val

His

Val

Lys Asn

Gly

Glu

Pro íle

1125

1130

1135

Gin

Thr

Gly

Asp

Leu

Glu

íle

Glu

Lys Ala

1140 1145

Claims

1. Baktéria patriaca do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje L-aminokyselinu, pričom pyruvát karboxyláza pozostáva z aminokyselinovej sekvencie SEQ ID č:4.

2. Baktéria patriaca do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje L-aminokyselinu, pričom gén pozostáva z nukleotidovej sekvencie SEQ ID č:3, alebo gén je získateľný z chromozómovej DNA baktérie patriacej do rodu Bacillus pomocou PCR (polymerázovou reťazovou reakciou) s oligonukleotidovými primermi založenými na nukleotidovej sekvencií SEQ ID č:3.

3. Baktéria podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že gén kódujúci pyruvát karboxylázu je zavedený do baktérie v malom počte kópií.

4. Baktéria podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že produkuje vyššie množstvo L-aminokyseliny ako baktéria neobsahujúca uvedený gén.

5. Baktéria podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že produkuje L-treonín v koncentrácii, ktorá je aspoň o 100 % vyššia ako koncentrácia L-treonínu produkovaného baktériou neobsahujúcou uvedený gén.

6. Baktéria podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že produkuje kyselinu L-glutámovú v koncentrácii, ktorá je aspoň o 50 % vyššia ako koncentrácia kyseliny L-glutámovej produkovanej baktériou neobsahujúcou uvedený gén.

7. Baktéria podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že produkuje L-homoserín v koncentrácii, ktorá je aspoň o 25 % vyššia ako koncentrácia L-homoserínu produkovaného baktériou neobsahujúcou uvedený gén.

8. Baktéria, ktorá má prístupové číslo VKPM B-7821.

9. Baktéria, ktorá má prístupové číslo VKPM B-7822.

10. Spôsob výroby L-aminokyseliny, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu baktérie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9 v médiu, produkciu a akumuláciu L-aminokyseliny v médiu a izoláciu L-aminokyseliny z média.