SK15112000A3 - Baktéria patriaca do rodu escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje l-amonokyselinu, a spôsob výroby l-aminokyseliny fermentáciou - Google Patents
Baktéria patriaca do rodu escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje l-amonokyselinu, a spôsob výroby l-aminokyseliny fermentáciou Download PDFInfo
- Publication number
- SK15112000A3 SK15112000A3 SK1511-2000A SK15112000A SK15112000A3 SK 15112000 A3 SK15112000 A3 SK 15112000A3 SK 15112000 A SK15112000 A SK 15112000A SK 15112000 A3 SK15112000 A3 SK 15112000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- glu
- gly
- ala
- lys
- leu
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka spôsobu výroby L-aminokyseliny, konkrétne sa týka spôsobu výroby L-treonínu, kyseliny L-glutámovej, L-homoserínu, L-metionínu, L-arginínu, L-prolínu alebo L-izoleucínu použitím baktérie patriacej do rodu Escherichia.
Doterajší stav techniky
L-aminokyseliny ako napríklad L-treonín a kyselina L-glutámová sa bežne vyrábajú fermentačnými spôsobmi principiálne využívajúcimi koryneformné baktérie, ktoré patria do rodu Brevibacterium, Corynebacterium a Microbacterium, alebo sa využívajú ich mutanty (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, str. 195-215, 1986).
Na druhej strane boli opísané techniky využívajúce techniky genetickej rekombinácie na šľachtenie bakteriálnych kmeňov produkujúcich L-aminokyseliny, ktoré patria do rodu Escherichia.
Bol napríklad opísaný spôsob výroby L-lyzínu použitím Escherichia coli, v ktorej boli gény kódujúce dihydrodipikolinát syntetázu a aspartokinázu znecitlivené voči spätnej inhibicii L-lyzínom a L-treonínom, a gény kódujúce diaminopimelát dehydrogenázu (alebo tetrahydrodipikolinát sukcinylázu a sukcinyldiaminopimelát deacylázu) boli zosilnené (WO 95/16042).
Hoci sa produktivita L-aminokyselín značne zlepšila šľachtením týchto vyššie uvedených mikroorganizmov alebo boli zlepšené produkčné spôsoby, je stále želateľné vyvinúť účinnejšie spôsoby výroby L-aminokyselín, aby sa splnil očakávaný značne zvýšený budúci dopyt po aminokyselinách.
-2Pyruvát karboxyláza (pyruvátoxid uhličitý ligáza (vytvárajúca ADP), EC 6.4.1.1) je enzým obsahujúci biotín. Katalyzuje karboxyláciu pyruvátu, čím sa vytvára oxaloacetát. Pyruvát karboxyláza nie je známa v Escherichia coli, ale Bacillus subtilis (Diesterhaft, M.D. a Freese, E., J. Biol. Chem., 248, č. 17, 60626070 (1973) a Corynebacterium glutamicum (Peters-Wfendisch, P.G. a ďalší, Microbiology, 144, 915-927 (1998) majú pyruvát karboxylázu a boli publikované nukleotidové sekvencie génov kódujúcich enzýmy.
Ďalej sú známe Corynebacterium glutamicum, v ktorom je zosilnená aktivita pyruvát karboxylázy, alebo Corynebacterium glutamicum, ktorého gén pyruvát karboxylázy je inaktivovaný (Peters-Wendisch, P.G. a ďalší, Microbiology, 144, 915927 (1998)). Avšak tieto mikroorganizmy boli vytvorené ako experimentálne materiály na štúdium enzýmov nevyhnutných na rast glukózy. Vzťah medzi aktivitou pyruvát karboxylázy a produktivitou L-aminokyselín nebol známy. Nebol známy ani pokus zaviesť gén pre pyruvát karboxylázu do baktérie patriacej do rodu Escherichia.
Cieľom vynálezu je poskytnúť spôsob výroby L-aminokyseliny, konkrétne Ltreonínu, L-lyzínu, kyseliny L-glutámovej, L-homoserínu, L-metionínu, L-arginínu, Lprolínu alebo L-izoleucínu s vysokou účinnosťou.
Výsledkom usilovného výskumu za účelom dosiahnutia vyššie opísaného cieľa bolo zistenie, že zavedenie génu, ktorý kóduje pyruvát karboxylázu (tu označovaný ako pyc gén), do baktérie patriacej do rodu Escherichia môže zlepšiť produktivitu L-aminokyseliny touto baktériou. Tak sa skompletoval predložený vynález.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je baktéria patriaca do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje L-aminokyselinu.
Predložený vynález poskytuje aj vyššie opísanú baktériu, v ktorej je gén kódujúci pyruvát karboxylázu odvodený od baktérie patriacej do rodu Bacillus.
-3Predložený vynález ďalej poskytuje vyššie opísanú baktériu, do ktorej je gén kódujúci pyruvát karboxylázu zavedený v malom počte kópií.
Ďalej predložený vynález poskytuje vyššie opísanú baktériu, pričom Laminokyselina je vybraná zo skupiny zahŕňajúcej L-treonín, L-lyzín, kyselinu Lglutámovú, L-homoserín, L-metionín, L-arginín, L-prolín alebo L-izoleucín.
Predložený vynález poskytuje aj spôsob výroby L-aminokyseliny, ktorý zahŕňa kultiváciu vyššie uvedenej baktérie v médiu, produkciu a akumulovanie Laminokyseliny v médiu a izoláciu L-aminokyseliny z média.
Predložený vynález ďalej poskytuje vyššie opísaný spôsob, pričom Laminokyselina je vybraná zo skupiny zahŕňajúcej L-treonín, L-lyzín, kyselinu Lglutámovú, L-homoserín, L-metionín, L-arginín, L-prolín alebo L-izoleucín.
Výraz produktivita L-aminokyseliny znamená, že baktéria produkuje a akumuluje L-aminokyselinu v médiu vo vyššom množstve ako jej zodpovedajúci kmeň divého typu.
V súlade s predloženým vynálezom je možné zlepšiť produktivitu Laminokyseliny, ako L-treonínu, L-lyzínu, kyseliny L-glutámovej, L-homoserínu, Lmetionínu, L-arginínu, L-prolínu alebo L-izoleucínu, v baktérii patriacej do rodu Escherichia. Ďalej môže byť predložený vynález využitý na šľachtenie producentov L-aminokyselín patriacich do rodu Escherichia.
Predložený vynález bude podrobne vysvetlený nižšie.
<1> Baktéria patriaca do rodu Escherichia transformovaná pyc génom
Baktéria patriaca do rodu Escherichia podľa predloženého vynálezu je baktéria transformovaná pyc génom. Príkladom baktérie patriacej do rodu Escherichia je Escherichia coli. Keďže pyc gén použitý podľa predloženého vynálezu nie je nejako konkrétne obmedzený pokiaľ kóduje protein majúci pyruvát karboxylázovú aktivitu, príklady pyc génu zahŕňajú pyc gén odvodený od baktérie patriacej do rodu Bacillus alebo pyc gén odvodený z koryneformných baktérií. Nukleotidová sekvencie pyc génu odvodeného od Bacillus subtilis (Genbank/EMBL/DDBJ č. Z97025, NID g2224758) a od Corynebacterium giutamicum (Peters-Wendisch, P.G. a ďalší, Microbiology, 144, 915-927 (1998)) boli
-4publikované. Preto je možné získať pyc gén PCR (polymerázovou reťazovou reakciou: White, T.J. a ďalší, Trends Genet., 5, 185 (1989)) použitím primérov syntetizovaných podľa nukleotidových sekvencií z chromozomálnej DNA baktérií patriacej do rodu Bacillus, ako napríklad Bacillus subtilis, alebo koryneformných baktérií, ako Corynebacterium glutamicum, ako templátu.
Transformanty Escherichia coli 44/pMW119-pycA, ktoré nesú pMW119-pycA obsahujúci pyc gén z Bacillus subtilis boli uložené v ruskej národnej zbierke priemyselných mikroorganizmov (VKPM), depozit GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskva, Rusko, 30 augusta, 1999, pod registračným číslom VKPM B-7822, a preniesli sa z pôvodného depozitu do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody 1. septembra 2000.
Transformanty Escherichia coli MG442/pMW119-pycA, ktoré nesú pMW119pycA obsahujúci pyc gén z Bacillus subtilis boli uložené v ruskej národnej zbierke priemyselných mikroorganizmov (VKPM), depozit GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskva, Rusko, 30 augusta, 1999, pod registračným číslom VKPM B-7821, a preniesli sa z pôvodného depozitu do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody 1. septembra 2000.
Mimochodom, gén kódujúci pyruvát karboxylázu Bacillus subtilis (pycA gén) sa klonoval ako je opísané nižšie, spôsobom podľa predloženého vynálezu.
Najprv sa skonštruoval pycA gén-deficientný kmeň Bacillus subtilis. Potom sa použitím tohto kmeňa ako recipienta, pycA gén klonoval izoláciou DNA fragmentu, ktorý komplementuje citrátovú alebo aspartátovú auxotrofiu kmeňa, z genómovej DNA knižnice divého typu kmeňa Bacillus subtilis. Keďže Bacillus subtilis vytvára oxaloacetát prostredníctvom pyruvát karboxylázy, Bacillus subtilis nemôže rásť na minimálnom médiu, ak mu chýba tento enzým. Avšak rast je možné opraviť pridaním L-aspartátu, L-glutamátu, citrátu alebo sukcinátu. Nukleotidová sekvencia pycA génu je znázornená ako sekv. č. 3 a aminokyselinová sekvencia, ktorá je kódovaná týmto génom, je znázornená ako sekv. č. 4.
PycA gén-deficientný kmeň je možné získať napríklad nižšie opísaným spôsobom. Čiastočný DNA fragment ylaP génu umiestneného na chromozóme hneď za pycA génom sa získa prostredníctvom PCR. Príkladmi primérov pre PCR
-5sú oligonikleotidy so sekv. č. 1 a 2. Potom sa divý typ kmeňa Bacillus subtilis transformuje s plazmidovou DNA obsahujúcou získaný DNA fragment a markerový gén a nasleduje integrácia plazmidovej DNA do ylaP génu na chromozomálnej DNA prostredníctvom homologickej rekombinácie. Ďalej sa skonštruuje chromozomálna DNA knižnica získaného kmeňa použitím reštrikčného enzýmu, ktorý rozoznáva reštrikčné miesto vo vnútri pycA génu, napríklad Pstl. Rekombinantný plazmid obsahujúci markerový gén a čiastočný pycA génový fragment sa môže získať transfomáciou divého typu kmeňa Bacillus subtilis s knižnicou a selekciou klonov exprimujúcich markerový gén. Potom sa divý typ kmeňa Bacillus subtilis transformuje linearizovaným rekombinantným plazmidom a vyberú sa klony exprimujúce markerový gén, aby sa získal pycA gén-deficientný kmeň, v ktorom je plazmidová DNA integrovaná do pycA génu na chromozomálnej DNA kmeňa.
Transformácia baktérie patriacej do rodu Escherichia s pyc génom sa môže uskutočniť zavedením pyc génu do príslušného vektora, ktorý funguje v baktérii patriacej do rodu Escherichia, aby sa skonštruoval rekombinantný vektor, a zavedením tohto rekombinantného vektora do baktérie patriacej do rodu Escherichia.
Príkladom vektora je plazmid, ako pBR322, pMW118, pUC18, pUC19 alebo podobne, fágový vektor, ako λ1059, XBF101, M13mp9 alebo podobne, a transpozón, ako Mu, Tn10 alebo podobne. Avšak podľa predloženého vynálezu je výhodný plazmid s malým množstvom kópií, ako pMW118 a pMW119, pretože transformant nesúci vektor môže byť nestabilný, ak je na zavedenie pycA génu použitý ako vektor plazmid s veľkým počtom kópií.
Zavedenie DNA do baktérie patriacej do rodu Escherichia sa môže uskutočniť napríklad spôsobom podľa D.A. Morrisona (Methods in Enzymology 68, 326 (19979) alebo spôsobom, v ktorom sa recipientné bakteriálne bunky ošetria chloridom vápenatým, aby sa zvýšila permeabilita pre DNA (Mandel, M. a Higa, A.,
J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) a podobne.
Príprava genomickej DNA, konštrukcia genomickej DNA knižnice, hybridizácia, PCR, príprava plazmidovej DNA, štiepenie a ligácia DNA, transformácia a podobne sa uskutočňujú v súlade so spôsobmi, ktoré sú
-6priemernému odborníkovi v oblasti známe. Takéto spôsoby boli opísané v Sambrook, J., Fritsche, E.F., Maniatis, T. v Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989).
Produktivita L-aminokyseliny baktériou patriacou do rodu Escheríchia sa môže zlepšiť poskytnutím alebo zosilnením pyruvát karboxylázovej aktivity baktérie prostredníctvom transformácie baktérie s pyc génom. Je to pravdepodobne preto, že kyselina oxalooctová sa vytvára nie len z kyseliny fosfoenolpyruvátovej, ale aj z kyseliny pyruvátovej. Takže transport glukózovej (alebo sacharózovej) molekuly do bakteriálnej bunky, ktorý je sprostredkovaný systémom kyseliny fosfoenolpyruvátovej, prebieha prostredníctvom spotreby jedenej molekuly kyseliny fosfoenolpyruvátovej, ktorá je sprevádzaná vytvorením jednej molekuly kyseliny pyruvátovej. Hoci vytváranie kyseliny pyruvátovej sa priamo nevyužíva na syntézu L-aminokyseliny v bakteriálnej bunke, je možné zvýšiť produktivitu L-aminokyseliny vytvorením kyseliny oxalooctovej z kyseliny pyruvátovej.
Ako baktéria patriaca do rodu Escheríchia, do ktorej sa má zaviesť pyc gén, sa použije kmeň majúci schopnosť produkovať danú L-aminokyselinu. Alternatívne sa produktivita L-aminokyseliny môže poskytnúť baktérii patriacej do rodu Escheríchia, ktorá je transformovaná pyc génom. Mimochodom, pyc gén Escheríchia coli ešte nie je známy, ak sa však neskôr v E. coli objaví, môže byť použitý.
Nižšie sú opísané príklady baktérií produkujúcich L-aminokyselinu, ktoré patria do rodu Escheríchia.
(1) Baktérie produkujúce L-treonín
Príkladom baktérie produkujúcej L-treonín, ktorá patrí do rodu Escheríchia môže byť kmeň MG442 (uložený v ruskej národnej zbierke priemyselných mikroorganizmov (VKPM) depozit, GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskva, Rusko, pod registračným číslom VKPM B-1628) (USP 4278765; Guayatiner M.M. a ďalší, Genetika (v ruštine), 14, 947-956 (1978)). Kmeň MG442 sa získal ako mutant rezistentný voči L-treonínovému analógu, kyseline 2-amino-3-7hydroxyvalérovej, a je aj izoleucín auxotrofný priepustného typu. Produkuje Ltreonín a L-glutamát ako vedľajší produkt.
Alternatívne môže byť ako L-treonín produkujúci kmeň výhodne použitý transformant MG442, ktorý je transformovaný s pVIC40 (USP 5175107).
(2) Baktérie produkujúce L-lyzín
Príkladom baktérií produkujúcich L-lyzín, ktoré patria do rodu Escherichia, môžu byť rôzne baktérie opísané vo WO95/16042. Konkrétnym príkladom baktérií produkujúcich L-lyzín sú baktérie, v ktorej je zvýšená aspartokinázová aktivita a dihydrodipikolinát reduktázová aktivita, ako napríklad W3110(tyrA)RSFD80+pdapB.
(3) Baktérie produkujúce L-homoserín
Príkladom baktérií produkujúcich L-homoserín, ktoré patria do rodu Escherichia, môže byť kmeň 44 (thrB). Tento kmeň bol odvodený od známeho kmeňa C600 (thrB, leuB) (Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452 (1954)) ako Leu+ revertant. Výhodne je možné použiť transformantový kmeň 44, ktorý je transformovaný plazmidom obsahujúcim thrA gén kódujúci aspartokinázahomoserín dehydrogenázu I.
Kmeň Escherichia coli 44 je uložený v ruskej medzinárodnej zbierke priemyselných mikroorganizmov (VKPM), depozit GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskva, Rusko, od 23. septembra 1980, pod registračným číslom VKPM B-2175, a preniesol sa z pôvodného depozitu do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody 1. septembra 2000.
(4) Baktérie produkujúce kyselinu L-glutámovú
Príkladom baktérií produkujúcich kyselinu L-glutámovú, ktoré patria do rodu Escherichia, môže byť kmeň, ktorý je rezistentný voči L-valínu, napríklad Escherichia coli kmene B11, K-12 (ATCC10798), B (ATCC11303) a W (ATCC9637).
-8(5) Baktérie produkujúce L-izoleucín
Príkladom baktérií produkujúcich L-izoleucín, ktoré patria do rodu Escherichia, môže byť kmeň TDH6/pVIC40, pMWD5 (Hashiguchi, K. a ďalší, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(4), 672-679 (1999)) alebo AJ12919, ktorý je opísaný v EPO 685 555 A1.
<2> Spôsob produkcie L-aminokyseliny
L-aminokyselinu je možné účinne vyrábať kultiváciou baktérie patriacej do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná pycA génom, ako bolo opísané vyššie, a produkuje L-aminokyselinu v príslušnom médiu, prostredníctvom produkcie a akumulovania L-aminokyseliny v médiu a izolácie L-aminokyseliny z média.
Príkladom L-aminokyseliny je výhodne L-treonín, L-lyzín, kyselina Lglutámová, L-homoserín, L-metionín, L-arginín, L-prolín alebo L-izoleucín. Laminokyselinu je možné vyrábať spôsobom podľa predloženého vynálezu buď samostatne, alebo ako zmes viac ako dvoch druhov L-aminokyselín.
V spôsobe podľa predloženého vynálezu sa kultivácia baktérie patriacej do rodu Eschericia, izolácia a purifikácia aminokyseliny z kvapalného média môžu uskutočňovať spôsobom podobným so spôsobmi bežnej metódy na produkciu aminokyseliny fermentáciou použitím baktérie. Médiom použitým na kultiváciu môže byť buď syntetické médium, alebo prirodzené médium, pokiaľ médium obsahuje vhodné množstvá zdroja uhlíka a dusíka a minerálov, a ak je to potrebné aj živín, ktoré použitá baktéria vyžaduje na rast. Zdroj uhlíka môže zahŕňať rôzne uhľovodíky, ako glukózu a sacharózu, a rôzne organické kyseliny. V závislosti na asimilačnej schopnosti použitej baktérie môže byť použitý alkohol zahŕňajúc etanol a glycerol. Ako zdroj dusíka sa používa amoniak, rôzne amónne soli, ako síran amónny, iné dusíkaté zlúčeniny, ako amíny, prirodzený zdroj dusíka, ako peptón, sójový hydrolyzát a poštiepené fermentatívne mikróby. Ako minerály sa používajú fosforečnan draselný, síran horečnatý, chlorid sodný, síran železitý, síran manganatý, uhličitan vápenatý.
Kultivácia sa výhodne uskutočňuje v aeróbnych podmienkach, ako pretrepávaná kultúra, a za prevzdušňovania a miešania kultúry. Teplota kultúry je
-9zvyčajne 20 až 40 °C, výhodne 30 až 38 °C. pH kultúry je zvyčajne medzi 5 a 9, výhodne medzi 6,5 a 7,2. pH kultúry sa môže nastaviť amoniakom, uhličitanom vápenatým, rôznymi kyselinami, rôznymi zásadami a tlmivými roztokmi. Zvyčajne 1 až 3 dni kultivácie vedú k akumulovaniu cieľovej L-aminokyseliny v médiu.
Izolácia a purifikácia L-aminokyseliny sa môže uskutočňovať odstránením pevných častí, ako napríklad buniek, z média po kultivácii centrifigáciou alebo membránovou filtráciou, následne metódami iónovej výmeny, zakoncentrovávania a kryštalizačnou frakčnou metódou a podobne.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje schému konštrukcie Bacillus subtilis pycA::KmR recipientného kmeňa na klonovanie pycA génu.
Obrázok 2 znázorňuje schému klonovania pycA génu z Bacillus subtilis 168.
Obrázok 3 znázorňuje schému konštrukcie plazmidu obsahujúceho pycA gén.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Predložený vynález bude konkrétnejšie vysvetlený nižšie s odvolaním sa na príklady.
Príklad 1
Klonovanie pycA génu z Bacillu subtilis 168 kmeňa <1> Konštrukcia B. subtilis pycA::KmR recipientného kmeňa na klonovanie
Recipientný kmeň B. subtilis sa skonštruoval inzerčnou mutagenézou pycA génu. Fragment pycA génu sa klonoval v dvoch krokoch (pozri obrázky 1 a 2).
V databáze B. subtilis genómového sekvenčného projektu je jeden čítací rámec (ylaP) označený ako pycA gén, ktorý kóduje pyruvát karboxylázu. Oblasť
-10umiestnená hneď za pycA génovým terminátorom sa klonovala PCR amplifikáciou použitím nasledujúceho páru oligonukleotidov:
5’-GATATAAGGGGACTTCAGAG, a 5’-GGCGCTTTATGCGTTTCAATC.
DNA fragmentu s dĺžkou 269 bp sa Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I zatupili konce a klonoval sa do Seal miesta pBR322 plazmidu v E. coli kmeni. Výsledný plazmid pBRPYCAH sa poštiepil s Clal a ligoval sa s 1628bp DNA fragmentom nesúcim cat gén, ktorý sa získal poštiepením pC194 s Clal. Potom sa použitím získaného plazmidu pBRPYCA11CmR3 transformoval kmeň Bacillus subtilis 168 trpC2 a selektovali sa CmR-klony. Plazmid pBRPYCA11CmR3 sa nemôže autonómne replikovať v baktérii patriacej do rodu Bacillus, ale môže sa integrovať do chromozómu neďaleko pycA génu prostredníctvom homológie s 269bp DNA fragmentom. Kmeň sa označil ako B. subtilis trpC2 xyz::pBRPYCACmR3. Začlenený fragment niesol pBR322 replikón, ŕeŕgén kódujúci rezistenciu voči tetracyklínu odvodený od pBR322 a CmR marker.
Izolovala sa chromozomálna DNA z B. subtilis trpC2 xyz::pBRPYCACmR3 a použila sa na klonovanie distálnej časti pycA génu. Chromozomálna DNA, ktorá sa poštiepila s Pstl sa ligovala sama so sebou a transformovala sa do kmeňa E. coli TG1. Selektovali sa rekombinanty rezistentné voči tetracyklínu a chloramfenikolu. Z jedného rekombinanta sa izoloval plazmid a označil sa ako pPYC1. Plazmid pPYC1 obsahoval jedno Bglll reštrikčné miesto, ktoré sa nachádzalo v pycA génovom fragmente. Toto miesto bolo použité na inzerciu 1818bp DNA fragmentu obsahujúceho marker kanamycínovej rezistenciu pre B. subtilis. Plazmid pPYC1 sa poštiepil s Bglll a ligoval sa s pUCľKmR, ktorý bol poštiepený s BamHI, čím vznikol plazmid pPYC1::KmR.
Inaktivácia pycA génu v divom type B. subtilis 168 trpC2 sa dosiahla transformáciou tohto kmeňa linearizovaným plazmidom pPYC1::KmR jednokrokovým postupom, následnou seleciou na Luria médiu obsahujúcom kanamycín. KmR marker sa zaviedol do pycA génu na chromozomálnej DNA homologickou rekombináciou prostredníctvom dvojitého crossoveru.
-11 Skonštruovaný kmeň B. subtilis pycA::KmR trpC2 nerástol na Spizizenovom minimálnom médiu (Anagnostopoulos, C a Spizizen, J., J. Bacteriol., 81, 741-746 (1961) s tryptofánom, pokiaľ sa do tohto média nepridal citrát alebo aspartát.
Zloženie Spizizenovho minimálneho média
K2HPO4.3H2O 18,3 g/l
KH2PO4 6,0 g/l (NH4)2SO4 2,0 g/l citran sodný.5H2O 1,2 g/l
MgSO4.7H2O 0,2 g/l glukóza 10,0 g/l pH 7,0
Kmeň B. subtilis trpC2 pycA::KmR recE::TcR sa skonštruoval transdukciou inaktivovanej alely recE génu z kmeňa B. subtilis recE::TcR fágom E40 (obrázok 2). Na klonovanie pycA génu do B. subtilis bolo nevyhnutné inaktivovať rekombináciu v recipientnom kmeni. Skonštruovaný kmeň B. subtilis trpC2 pycA::KmR recE::TcR bol použitý ako recipient na klonovanie pycA génu.
<2> Klonovanie B. subtilis prirodzeného pycA génu komplementáciou
PycA gén sa klonoval z kmeňa B. subtilis 168 trpC2. Chromozomálna DNA pripravená z kmeňa 168 trpC2 sa čiastočne poštiepila s EcoRI a ligovala sa s pCB20 (EmR) (darovaný Dr. Yu Jomantas, pozri Genetic transformation and expression L.O. Butler a ďalší, vyd. Intercept Ltd., PO Box 402, Wimborne, Dorset BH229T2, UK, 1989, str. 269-281), ktorý bol poštiepený s EcoRI. Potom sa trpC2 pycA::KmR recE::TcR recipientný kmeň transformoval s ligačnou zmesou (obr. 2). Asp+, EmR, KmR klony sa selektovali na Spizizenovom minimálnom médiu bez citrátu alebo aspartátu, ale s tryptofánom, erytromycínom a kanamycínom. Plazmid pPYCR3 nachádzajúci sa v jednom zo selektovaných klonov komplementoval pycA mutáciu, mal predpokladanú štruktúru a vykazoval rovnaký Asp+, EmR fenotyp po druhej transformácii.
-12<3> Klonovanie DNA fragmentu nesúceho pycA gén z kmeňa B. subtilis 168 trpC2 do plazmidov pUC18 a pUC19 s vysokým počtom kópií
Plazmid pPYCR3 sa poštiepil s Hindll a Seal a Hindll-Scal fragment (4414 bp) nesúci pycA gén s 5' predchádzajúcou sekvenciou (zahŕňajúcou promótor a ribozóm viažuce miesto) sa klonoval do pUC18, ktorý bol poštiepený so Smal. Tak sa získal plazmid pUC18-pycA (horná časť obrázka 3). Ligačná reakcia sa uskutočňovala nasledovne. Deväťdesiat ng Sma/-poštiepeného pUC18 a 300 ng Hindll-Scal fragmentu (4414 bp), ktorý nesie pycA gén, a ktorý sa purifikoval agarózovou gélovou elektoroforézou, sa ligovalo s 2 jednotkami T4 DNA ligázy (Pharmacia, Švédsko) v 45 μΙ reakčnej zmesi s obsahom 1x One-Phor-AII tlmivého roztoku (Pharmacia, Švédsko) a 1 mM ATP.
E. coli TG1 sa transformoval s pUC18-pycA. Získané transformanty sa analyzovali použitím Kpnl, Xbal, BamHI, Hindlll a EcoRI endonukleáz. Všetky klony niesli pycA gén v opačnej orientácii voči lac promótoru pUC18 plazmidu. Avšak pycA gény klonované v pUC18 plazmide môžu byť exprimované pod kontrolou ich vlastného génového promótora.
Aby sa dostal pycA gén pod kontrolu lac promótora, klonoval sa potom KpnlXbal fragment pUC18-pycA do pUC19, ktorý bol poštiepený s Kpnl-Xbal. Avšak získané klony boli nestabilné a rekombinantný plazmid sa eliminoval počas krátkej doby (6 až 8 hodín) kultivácie.
<4> Klonovanie DNA fragmentu nesúceho pycA gén do nízkokópiového plazmidu pMW119
Kpnl-Xbal fragment pUC18-pycA sa ligoval do nízkokópiového plazmidu pMW119, ktorý bol poštiepený s Kpnl a Xbal (spodná čásť obrázka 3). Ligačná reakcia sa uskutočňovala v 50 μΙ reakčnej zmesi obsahujúcej 60 ng pMW119 poštiepeného s Kpnl-Xbal, 120 ng Kpnl-Xbal fragmentu pUC18-pycA, ktorý bol purifikovaný agarózovou gélovou elektroforézou, 1x One-Phor-AII tlmivého roztoku (Pharmacia, Švédsko), 1mM ATP a 1 jednotky T4 DNA ligázy (Pharmacia, Švédsko).
-13Použitím ligačnej zmesi sa transformoval E. coli TG1. Výsledné transformanty sa analyzovali použitím Sad, Kpnl, Xbal, BamHI, HindlII a EcoRI.
Všetky klony niesli pycA gén pod kontrolou lac promótora plazmidu pMW119 a pod kontrolou ich vlastného promótora. Takto získaný kloň, z ktorého sa získal plazmid pMW119-pycA, sa označil TG1 (pMW119-pycA).
Príklad 2
Produkcia L-treonínu a kyseliny L-glutámovej
E. coli kmeň MG442 sa transformoval s plazmidom pMW119-pycA a selektovalo sa desať Ampr kolónií. Produktivity L-treonínu a kyseliny L-glutámovej kolóniami sa skúmali použitím nasledujúceho fermentačného média.
Zloženie fermentačného média | |
glukóza (sterilizuje sa oddelene) | 60 g/l |
(NH4)SO4 | 15,0 g/l |
kh2po4 | 1,5 g/l |
MgSO4.7H2O | 1,0 g/l |
L-izoleucín | 100 mg/l |
tiamín | 0,1 mg/l |
CaCO3 (sterilizuje sa oddelene) | 20 g/l |
Fermentácia sa uskutočňovala v testovacích skúmavkách (20 x 300 mm) pri 32 °C 72 hodín použitím rotačnej miešačky. Jedno očko každého z 10 klonov sa inokulovalo do testovacej skúmavky obsahujúcej 2,0 ml fermentačného média. Ako kontrola sa použilo 10 jednotlivých kolónií kmeňa MG442 bez plazmidu. Po fermentácii sa merali koncentrácie L-treonínu a kyseliny L-glutámovej naakumulovaných v médiu prostredníctvom chromatografie na tenkej vrstve. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1.
- 14Tabuľka 1
Kloň č. | MG442 (kontrola) | MG442 (pMW119-pycA) | ||
L-thr (g/l) | L-glu (g/l) | L-thr (g/l) | L-glu (g/l) | |
1 | 5,5 | 9,5 | 7,8 | 12,3 |
2 | 3,2 | 7,1 | 9,8 | 12,3 |
3 | 3,6 | 7,1 | 9,4 | 13,3 |
4 | 3,4 | 8,9 | 9,8 | 11,8 |
5 | 3,3 | 8,9 | 9,8 | 11,8 |
6 | 4,8 | 7,3 | 9,9 | 11,8 |
7 | 3,3 | 7,0 | 10,0 | 10,7 |
8 | 4,7 | 8,3 | 10,0 | 10,4 |
9 | 3,2 | 7,3 | 9,7 | 11,2 |
10 | 2,6 | 4,1 | 10,0 | 10,7 |
priemer | 3,8 | 7,4 | 9,6 | 11,6 |
Príklad 3
Produkcia L-homoserínu
E. coli kmeň 44 produkujúci L-homoserín sa transformoval plazmidom pMW442-pycA a selektovalo sa päť ampicilín rezistentných klonov. Produkcia Lhomoserínu sa skúmala tak ako bolo uvedené v príklade 1, ale fermentačné médium bolo doplnené s 0,5 g/l L-treonínu. Ako kontrola sa použilo päť kolónií kmeňa 44 bez plazmidu. Po fermentácii boli priemerné koncentrácie L-homoserínu
4,5 g/l (kmeň 44) a 5,7 g/l (kmeň 44 s plazmidom pMW442-pycA).
Opodstatnene sa očakáva aj účinok pycA génu na produktivitu L-lyzínu, pretože sa potvrdilo, že pycA gén má pozitívny účinok na produktivitu L-treonínu a L-homoserínu, ktoré čiastočne zdieľajú rovnakú biosyntetickú dráhu ako L-lyzín.
-15Zoznam sekvencií <110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> Spôsob výroby L-aminokyseliny fermentáciou <130> OP877 <141> 2000-10-14 <150> RU 99121636 <151> 2000-10-14 <160>2 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211 >20 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: primer <400> 1 gatataaggg gacttcagag <210>2 <211 >20 <212> DNA <213> umelá sekvencia
-16<220>
<223> Opis umelej sekvencie: primér <400> 2 ggcgctttat gcgtttcaatc 20 <210>3 <211 >3462 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>
<221>CDS <222> (16)..(3459) <400> 3 aagggggaga aaagt ttg tct cag caa tcg ata caa aaa gta tta gta gca 51 Leu Ser Gin Gin Ser íle Gin Lys Val Leu Val Ala
5 10
aac | agg | gga | gaa | att | gca | atc | ega | ata | ttc | cgg | gcg | tgt | acc | gag | ttg | 99 |
Asn | Arg | Gly | Glu | íle | Ala | íle | Arg | íle | Phe | Arg | Ala | Cys | Thr | Glu | Leu | |
15 | 20 | 25 | ||||||||||||||
aat | att | cgt | aca | gtt | gcg | gtc | tat | tca | aaa | gaa | gat | tcc | ggt | tcc | tac | 147 |
Asn | íle | Arg | Thr | Val | Ala | Val | Tyr | Ser | Lys | Glu | Asp | Ser | Gly | Ser | Tyr | |
30 | 35 | 40 | ||||||||||||||
cat | cgg | tac | aaa | gcg | gat | gaa | gca | tac | ttg | gtc | ggt | gaa | ggg | aaa | aaa | 195 |
His | Arg | Tyr | Lys | Ala | Asp | Glu | Ala | Tyr | Leu | Val | Gly | Glu | Gly | Lys | Lys | |
45 | 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
ccg | att | gat | get | tac | ctg | gat | att | gaa | ggt | atc | att | gat | att | gcg | aaa | 243 |
Pro | íle | Asp | Ala | Tyr | Leu | Asp | íle | Glu | Gly | íle | íle | Asp | íle | Ala | Lys | |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
aga | aac | aaa | gtc | gat | gca | att | cat | ccg | gga | tac | ggt | ttc | tta | tct | gaa | 291 |
Arg | Asn | Lys | Val | Asp | Ala | íle | His | Pro | Gly | Tyr | Gly | Phe | Leu | Ser | Glu | |
80 | 85 | 90 |
aat | att | cat ttt gcg aga ega tgt | gaa gaa gaa ggc | atc gta | ttc | ata | 339 | |||
Asn | íle | His Phe Ala Arg Arg Cys | Glu Glu Glu Gly | íle Val | Phe | lle | ||||
95 | 100 | 105 | ||||||||
ggg | cca | aaa tcc gag cat ctc gat | atg ttt ggt gac | aag gta | aaa | gcg | 387 | |||
Gly | Pro | Lys Ser Glu His Leu Asp | Met | Phe Gly Asp Lys Val | Lys | Ala | ||||
110 | 115 | 120 | ||||||||
Cgt | gag | cag gca gaa | aaa gcg gga | atc | ccc gtg att | ccg gga | age | gac | 435 | |
Arg | Glu Gin Ala Glu | Lys Ala Gly | íle | Pro Val | íle | Pro Gly | Ser | Asp | ||
125 | 130 | 135 | 140 | |||||||
ggt | cct | gcc gaa acg | ctt gaa gcc | gtc gaa caa ttt | gga caa | get | aac | 483 | ||
Gly | Pro | Ala Glu Thr | Leu Glu Ala Val | Glu Gin Phe Gly Gin Ala Asn | ||||||
145 | 150 | 155 | ||||||||
ggt | tat | ccg atc atc | att aaa gcc | tcg | ctt ggc | ggc | ggc ggc ege ggt | 531 | ||
Gly Tyr | Pro íle íle | íle Lys Ala | Ser | Leu Gly | Gly | Gly Gly Arg Gly | ||||
160 | 165 | 170 | ||||||||
atg | cgg | att gtc aga | tet gaa agt | gaa | gtt aaa | gaa | gca tat | gag | cgt | 579 |
Met | Arg | íle Val Arg | Ser Glu Ser | Glu | Val Lys | Glu | Ala Tyr | Glu | Arg | |
175 | 180 | 185 | ||||||||
get | aaa | tca gag gcg | aaa gca gcc | ttt | ggc aat | gat | gaa gtt | tat | gta | 627 |
Ala | Lys | Ser Glu Ala | Lys Ala Ala Phe | Gly Asn Asp Glu Val | Tyr | Val | ||||
190 | 195 | 200 | ||||||||
gaa | aaa | tta att gag | aat ccg aaa | cat | att gag | gtt | cag gtc | att | gga | 675 |
Glu | Lys | Leu íle Glu Asn Pro Lys | His | íle Glu | Val | Gin Val | íle | Gly | ||
205 | 210 | 215 | 220 | |||||||
gac | aag | cag ggc aat gtc gtc cat | ctt | ttt gag | agg | gat tgc | tcc | gtt | 723 | |
Asp Lys Gin Gly Asn Val Val His | Leu Phe Glu | Arg | Asp Cys | Ser | Val | |||||
225 | 230 | 235 | ||||||||
caa | aga ege cat caa | aaa gtc att | gaa | gtg gcg | ccg | agt gtc tcg ctg | 771 | |||
Gin | Arg Arg His Gin | Lys Val íle | Glu | Val Ala | Pro | Ser Val | Ser Leu | |||
240 | 245 | 250 | ||||||||
tca | cct | gaa tta agg | gac caa att | tgt gag get | gca | gtt gcg ctt gcc | 819 | |||
Ser | Pro | Glu Leu Arg Asp Gin íle | Cys Glu Ala Ala | Val Ala Leu Ala | ||||||
255 | 260 | 265 | ||||||||
aaa | aat | gta aac tat ata aat gcg | ggg acg gtc gaa | ttc ctt gtt gca | 867 | |||||
Lys | Asn | Val Asn Tyr íle Asn Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val Ala |
-18270 275 280
aac | aac | gag | ttc | tac | ttt | att | gaa | gta | aat | cct | ege | gta | caa | gtt | gaa | 915 |
Asn | Asn | Glu | Phe | Tyr | Phe | íle | Glu | Val | Asn | Pro | Arg | Val | Gin | Val | Glu | |
285 | 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
cac | acg | ata | aca | gaa | atg | att | act | ggt | gtc | gat | att | gtt | caa | act | cag | 963 |
His | Thr | íle | Thr | Glu | Met | íle | Thr | Gly | Val | Asp | íle | Val | Gin | Thr | Gin | |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
atc | ctt | gtt | gcc | caa | ggg | cac | age | ctt | cac | age | aaa | aaa | gta | aat | att | 1011 |
íle | Leu | Val | Ala | Gin | Gly | His | Ser | Leu | His | Ser | Lys | Lys | Val | Asn | íle | |
320 | 325 | 330 | ||||||||||||||
cct | gag | caa | aag | gac | att | ttt | aca | atc | ggc | tat | gcc | att | cag | tca | cgg | 1059 |
Pro | Glu | Gin | Lys | Asp | íle | Phe | Thr | íle | Gly | Tyr | Ala | íle | Gin | Ser | Arg | |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||||
gtt | acg | act | gag | gat | ccg | caa | aat | gat | ttc | atg | cct | gat | aca | gga | aaa | 1107 |
Val | Thr | Thr | Glu | Asp | Pro | Gin | Asn | Asp | Phe | Met | Pro | Asp | Thr | Gly | Lys | |
350 | 355 | 360 | ||||||||||||||
atc | atg | get | tac | ege | tca | ggc | ggc | ggt | ttt | ggt | gtc | cgt | ctt | gat | acc | 1155 |
íle | Met | Ala | Tyr | Arg | Ser | Gly | Gly | Gly | Phe | Gly | Val | Arg | Leu | Asp | Thr | |
365 | 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
gga | aac | age | ttc | cag | ggc | gcc | gtg | atc | aca | cca | tac | tat | gat | tca | ctt | 1203 |
Gly | Asn | Ser | Phe | Gin | Gly | Ala | Val | íle | Thr | Pro | Tyr | Tyr | Asp | Ser | Leu | |
385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
ctc | gtt | aag | ctt | tca | act | tgg | get | tta | acg | ttt | gaa | cag | gca | get | gcc | 1251 |
Leu | Val | Lys | Leu | Ser | Thr | Trp | Ala | Leu | Thr | Phe | Glu | Gin | Ala | Ala | Ala | |
400 | 405 | 410 | ||||||||||||||
aaa | atg | gtg | ega | aac | ctt | cag | gag | ttt | aga | atc | aga | ggc | ata | aaa | acg | 1299 |
Lys | Met | Val | Arg | Asn | Leu | Gin | Glu | Phe | Arg | íle | Arg | Gly | íle | Lys | Thr | |
415 | 420 | 425 | ||||||||||||||
aac | att | ccg | ttc | ctt | gag | aac | gtt | gca | aag | cat | gag | aag | ttc | ctg | aca | 1347 |
Asn | íle | Pro | Phe | Leu | Glu | Asn | Val | Ala | Lys | His | Glu | Lys | Phe | Leu | Thr | |
430 | 435 | 440 | ||||||||||||||
ggg | caa | tat | gat | aca | tet | ttc | att | gat | aca | acg | cct | gaa | tta | ttt | aat | 1395 |
Gly | Gin | Tyr | Asp | Thr | Ser | Phe | íle | Asp | Thr | Thr | Pro | Glu | Leu | Phe | Asn | |
445 | 450 | 455 | 460 |
ttc | cct | aaa | caa | aaa | gac | ege | gga | acg | aaa | atg | ctc | act | tac | atc | ggc | 1443 |
Phe | Pro | Lys | Gin | Lys | Asp | Arg | Gly | Thr | Lys | Met | Leu | Thr | Tyr | íle | Gly | |
465 | 470 | 475 | ||||||||||||||
aat | gtg | aca | gtg | aac | ggc | ttc | cct | gga | atc | ggg | aaa | aaa | gaa | aaa | ccg | 1491 |
Asn | Val | Thr | Val | Asn | Gly | Phe | Pro | Gly | íle | Gly | Lys | Lys | Glu | Lys | Pro | |
480 | 485 | 490 | ||||||||||||||
gcg | ttt | gac | aaa | ccg | tta | ggc | gta | aag | gta | gac | gtt | gat | cag | cag | cct | 1539 |
Ala | Phe | Asp | Lys | Pro | Leu | Gly | Val | Lys | Val | Asp | Val | Asp | Gin | Gin | Pro | |
495 | 500 | 505 | ||||||||||||||
gcc | aga | gga | aca | aag | caa | att | ctc | gat | gaa | aaa | ggt | gca | gaa | ggg | ctt | 1587 |
Ala | Arg | Gly | Thr | Lys | Gin | íle | Leu | Asp | Glu | Lys | Gly | Ala | Glu | Gly | Leu | |
510 | 515 | 520 | ||||||||||||||
gca | aat | tgg | gtt | aag | gag | cag | aaa | tet | gtc | ctt | tta | act | gat | acg | aca | 1635 |
Ala | Asn | Trp | Val | Lys | Glu | Gin | Lys | Ser | Val | Leu | Leu | Thr | Asp | Thr | Thr | |
525 | 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
ttc | agg | gat | gcc | cac | caa | tcg | tta | ttg | gca | act | aga | atc | aga | tcg | cat | 1683 |
Phe | Arg | Asp | Ala | His | Gin | Ser | Leu | Leu | Ala | Thr | Arg | íle | Arg | Ser | His | |
545 | 550 | 555 | ||||||||||||||
gat | ttg | aaa | aaa | atc | gca | aat | ccg | acg | get | gcg | tta | tgg | cct | gaa | cta | 1731 |
Asp | Leu | Lys | Lys | íle | Ala | Asn | Pro | Thr | Ala | Ala | Leu | Trp | Pro | Glu | Leu | |
560 | 565 | 570 | ||||||||||||||
ttc | agt | atg | gaa | atg | tgg | gga | ggc | gcg | acc | ttc | gat | gta | gcc | tac | ega | 1779 |
Phe | Ser | Met | Glu | Met | Trp | Gly | Gly | Ala | Thr | Phe | Asp | Val | Ala | Tyr | Arg | |
575 | 580 | 585 | ||||||||||||||
ttc | ctg | aaa | gaa | gat | ccg | tgg | aaa | cgt | ttg | gaa | gat | ctt | ege | aaa | gaa | 1827 |
Phe | Leu | Lys | Glu | Asp | Pro | Trp | Lys | Arg | Leu | Glu | Asp | Leu | Arg | Lys | Glu | |
590 | 595 | 600 | ||||||||||||||
gtg | ccg | aat | acc | tta | ttc | cag | atg | ttg | ctt | ege | tca | tca | aat | gcg | gtc | 1875 |
Val | Pro | Asn | Thr | Leu | Phe | Gin | Met | Leu | Leu | Arg | Ser | Ser | Asn | Ala | Val | |
605 | 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
ggc | tat | acg | aat | tat | ccg | gac | aat | gtg | att | aaa | gaa | ttt | gtg | aag | caa | 1923 |
Gly | Tyr | Thr | Asn | Tyr | Pro | Asp | Asn | Val | íle | Lys | Glu | Phe | Val | Lys | Gin | |
625 | 630 | 635 | ||||||||||||||
tca | get | caa | tcc | ggt | att | gat | gtg | ttt | cgt | att | ttc | gac | age | tta | aac | 1971 |
Ser | Ala | Gin | Ser | Gly | íle | Asp | Val | Phe | Arg | íle | Phe | Asp | Ser | Leu | Asn | |
640 | 645 | 650 | ||||||||||||||
tgg | gta | aaa | ggg | atg | acg | tta | gcc | att | gat | get | gtt | agg | gat | acc | ggc | 2019 |
Trp | Val | Lys | Gly | Met | Thr | Leu | Ala | íle | Asp | Ala | Val | Arg | Asp | Thr | Gly | |
655 | 660 | 665 | ||||||||||||||
aaa | gtg | gca | gaa | get | gcg | att | tgt | tat | acg | gga | gat | atc | ctt | gac | aag | 2067 |
Lys | Val | Ala | Glu | Ala | Ala | íle | Cys | Tyr | Thr | Gly | Asp | íle | Leu | Asp | Lys | |
670 | 675 | 680 | ||||||||||||||
aac | cgg | acg | aag | tac | gac | ctt | gca | tat | tat | aca | tcg | atg | gcg | aag | gag | 2115 |
Asn | Arg | Thr | Lys | Tyr | Asp | Leu | Ala | Tyr | Tyr | Thr | Ser | Met | Ala | Lys | Glu | |
685 | 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
ctt | gag | gcg | gcc | gga | gcc | cat | att | ctc | ggg | att | aaa | gat | atg | gca | ggg | 2163 |
Leu | Glu | Ala | Ala | Gly | Ala | His | íle | Leu | Gly | íle | Lys | Asp | Met | Ala | Gly | |
705 | 710 | 715 | ||||||||||||||
ctg | tta | aaa | ccg | cag | get | gca | tat | gag | ctc | gtt | tet | gcg | ttg | aaa | gaa | 2211 |
Leu | Leu | Lys | Pro | Gin | Ala | Ala | Tyr | Glu | Leu | Val | Ser | Ala | Leu | Lys | Glu | |
720 | 725 | 730 | ||||||||||||||
acg | atc | gac | att | ccg | gtt | cac | ctt | cat | acg | cat | gat | acg | agc | gga | aac | 2259 |
Thr | íle | Asp | íle | Pro | Val | His | Leu | His | Thr | His | Asp | Thr | Ser | Gly | Asn | |
735 | 740 | 745 | ||||||||||||||
ggt | att | tat | atg | tat | gcg | aaa | get | gtt | gaa | gcc | ggc | gtt | gat | atc | ata | 2307 |
Gly | íle | Tyr | Met | Tyr | Ala | Lys | Ala | Val | Glu | Ala | Gly | Val | Asp | íle | íle | |
750 | 755 | 760 | ||||||||||||||
gac | gtg | gcg | gtc | agc | tca | atg | gcg | gga | tta | acg | tca | cag | cct | agc | gcg | 2355 |
Asp | Val | Ala | Val | Ser | Ser | Met | Ala | Gly | Leu | Thr | Ser | Gin | Pro | Ser | Ala | |
765 | 770 | 775 | 780 | |||||||||||||
agc | gga | ttt | tat | cat | gcg | atg | gaa | ggc | aac | gac | ege | cgt | ccg | gaa | atg | 2403 |
Ser | Gly | Phe | Tyr | His | Ala | Met | Glu | Gly | Asn | Asp | Arg | Arg | Pro | Glu | Met | |
785 | 790 | 795 | ||||||||||||||
aat | gtc | caa | ggc | gtt | gaa | ttg | ctg | tcc | caa | tat | tgg | gag | tcg | gtg | cgt | 2451 |
Asn | Val | Gin | Gly | Val | Glu | Leu | Leu | Ser | Gin | Tyr | Trp | Glu | Ser | Val | Arg | |
800 | 805 | 810 | ||||||||||||||
aaa | tat | tat | agt | gaa | ttt | gaa | agc | gga | atg | aag | tet | ccg | cat | act | gaa | 2499 |
Lys | Tyr | Tyr | Ser | Glu | Phe | Glu | Ser | Gly | Met | Lys | Ser | Pro | His | Thr | Glu |
-21 815 820 825
att | tat | gaa | cac | gaa | atg | cca | ggg | ggc | caa | tac | age | aac | ctg | cag | cag | 2547 |
íle | Tyr | Glu | His | Glu | Met | Pro | Gly | Gly | Gin | Tyr | Ser | Asn | Leu | Gin | Gin | |
830 | 835 | 840 | ||||||||||||||
caa | gcc | aag | gga | gta | ggc | ctt | ggc | gac | ege | tgg | aac | gaa | gtc | aag | gaa | 2595 |
Gin | Ala | Lys | Gly | Val | Gly | Leu | Gly | Asp | Arg | Trp | Asn | Glu | Val | Lys | Glu | |
845 | 850 | 855 | 860 | |||||||||||||
atg | tac | aga | ege | gtg | aac | gat | atg | ttc | ggt | gac | atc | gtc | aag | gta | acg | 2643 |
Met | Tyr | Arg | Arg | Val | Asn | Asp | Met | Phe | Gly | Asp | íle | Val | Lys | Val | Thr | |
865 | 870 | 875 | ||||||||||||||
cct | tcc | tca | aaa | gta | gtc | gga | gat | atg | gca | ctc | tac | atg | gtg | caa | aac | 2691 |
Pro | Ser | Ser | Lys | Val | Val | Gly | Asp | Met | Ala | Leu | Tyr | Met | Val | Gin | Asn | |
880 | 885 | 890 | ||||||||||||||
aat | ctg | act | gaa | aaa | gac | gtt | tac | gaa | aaa | ggt | gaa | tet | tta | gat | ttc | 2739 |
Asn | Leu | Thr | Glu | Lys | Asp | Val | Tyr | Glu | Lys | Gly | Glu | Ser | Leu | Asp | Phe | |
895 | 900 | 905 | ||||||||||||||
cct | gat | tet | gtc | gtg | gag | ctt | ttt | aaa | gga | aat | atc | ggc | cag | cct | cat | 2787 |
Pro | Asp | Ser | Val | Val | Glu | Leu | Phe | Lys | Gly | Asn | íle | Gly | Gin | Pro | His | |
910 | 915 | 920 | ||||||||||||||
ggc | gga | ttc | cca | gaa | aaa | ctg | caa | aag | ctg | atc | tta | aaa | ggg | cag | gag | 2835 |
Gly | Gly | Phe | Pro | Glu | Lys | Leu | Gin | Lys | Leu | íle | Leu | Lys | Gly | Gin | Glu | |
925 | 930 | 935 | 940 | |||||||||||||
ccg | att | aca | gtc | aga | ccg | ggc | gaa | ctg | ctt | gag | ccg | gtg | tca | ttt | gaa | 2883 |
Pro | íle | Thr | Val | Arg | Pro | Gly | Glu | Leu | Leu | Glu | Pro | Val | Ser | Phe | Glu | |
945 | 950 | 955 | ||||||||||||||
gcg | atc | aaa | cag | gaa | ttt | aaa | gag | cag | cat | aac | ttg | gaa | att | tca | gat | 2931 |
Ala | íle | Lys | Gin | Glu | Phe | Lys | Glu | Gin | His | Asn | Leu | Glu | íle | Ser | Asp | |
960 | 965 | 970 | ||||||||||||||
cag | gat | get | gtg | gca | tat | gcc | ctt | tat | cct | aaa | gtc | ttc | act | gat | tat | 2979 |
Gin | Asp | Ala | Val | Ala | Tyr | Ala | Leu | Tyr | Pro | Lys | Val | Phe | Thr | Asp | Tyr | |
975 | 980 | 985 | ||||||||||||||
gtg | aaa | acg | aca | gaa | age | tat | gga | gac | atc | tcg | gta | tta | gat | aca | ccg | 3027 |
Val | Lys | Thr | Thr | Glu | Ser | Tyr | Gly | Asp | íle | Ser | Val | Leu | Asp | Thr | Pro |
990 995
1000
-22aca ttc ttc tac ggt atg aca tta ggt gaa gag ata gaa gtt gaa att 3075
Thr Phe Phe Tyr Gly Met Thr Leu Gly Glu Glu íle Glu Val Glu íle 1005 1010 1015 1020 gag cgc ggc aaa acg ctg atc gtt aag ctg att tca atc ggt gag cct 3123
Glu Arg Gly Lys Thr Leu Ue Val Lys Leu íle Ser íle Gly Glu Pro
1025 1030 1035 cag cct gat gcc acc cgc gtc gtt tat ttc gaa ctc aac ggg cag ccg 3171
Gin Pro Asp Ala Thr Arg Val Val Tyr Phe Glu Leu Asn Gly Gin Pro
1040 1045 1050 cgt gaa gta gtc att aaa gat gaa age att aag tet tcc gtt cag gaa 3219
Arg Glu Val Val íle Lys Asp Glu Ser íle Lys Ser Ser Val Gin Glu
1055 1060 1065 agg ctg aaa gca gac cgg aca aat cca age cac atc gca get tcc atg 3267
Arg Leu Lys Ala Asp Arg Thr Asn Pro Ser His íle Ala Ala Ser Met
1070 1075 1080 cct gga aca gtt att aag gta ttg get gaa gca ggc aca aaa gtc aat 3315
Pro Gly Thr Val íle Lys Val Leu Ala Glu Ala Gly Thr Lys Val Asn
1085 1090 1095 1100
aaa | ggt | gat | cat | ttg | atg | att | aat | gaa | gcg | atg | aaa | atg | gaa | aca | acg | 3363 |
Lys | Gly | Asp | His | Leu | Met | íle | Asn | Glu | Ala | Met | Lys | Met | Glu | Thr | Thr | |
1105 | 1110 | 1115 | ||||||||||||||
gtt | cag | gcg | cct | ttc | tca | gga | aca | atc | aag | cag | gtt | cat | gtg | aaa | aat | 3411 |
Val | Gin | Ala | Pro | Phe | Ser | Gly | Thr | íle | Lys | Gin | Val | His | Val | Lys | Asn | |
1120 | 1125 | 1130 | ||||||||||||||
ggt | gag | ccg | atc | caa | acg | gga | gat | ctg | ctc | ctt | gaa | att | gaa | aaa | gca | 3459 |
Gly | Glu | Pro | íle | Gin | Thr | Gly | Asp | Leu | Leu | Leu | Glu | íle | Glu | Lys | Ala |
1135 1140 1145 taa
3462 <210>4 <211> 1148 <212> PRT <213> Bacillus subtilis
-23<400> 1
Leu | Ser | Gin | Gin | Ser | íle | Gin | Lys | Val | Leu | Val | Ala | Asn | Arg | Gly | Glu |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
íle | Ala | íle | Arg | íle | Phe | Arg | Ala | Cys | Thr | Glu | Leu | Asn | íle | Arg | Thr |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Val | Ala | Val | Tyr | Ser | Lys | Glu | Asp | Ser | Gly | Ser | Tyr | His | Arg | Tyr | Lys |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Ala | Asp | Glu | Ala | Tyr | Leu | Val | Gly | Glu | Gly | Lys | Lys | Pro | íle | Asp | Ala |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Tyr | Leu | Asp | íle | Glu | Gly | íle | íle | Asp | íle | Ala | Lys | Arg | Asn | Lys | Val |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Asp | Ala | íle | His | Pro | Gly | Tyr | Gly | Phe | Leu | Ser | Glu | Asn | íle | His | Phe |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ala | Arg | Arg | Cys | Glu | Glu | Glu | Gly | íle | Val | Phe | íle | Gly | Pro | Lys | Ser |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Glu | His | Leu | Asp | Met | Phe | Gly | Asp | Lys | Val | Lys | Ala | Arg | Glu | Gin | Ala |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Glu | Lys | Ala | Gly | íle | Pro | Val | íle | Pro | Gly | Ser | Asp | Gly | Pro | Ala | Glu |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Thr | Leu | Glu | Ala | Val | Glu | Gin | Phe | Gly | Gin | Ala | Asn | Gly | Tyr | Pro | íle |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
íle | íle | Lys | Ala | Ser | Leu | Gly | Gly | Gly | Gly | Arg | Gly | Met | Arg | íle | Val |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Arg | Ser | Glu | Ser | Glu | Val | Lys | Glu | Ala | Tyr | Glu | Arg | Ala | Lys | Ser | Glu |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ala | Lys | Ala | Ala | Phe | Gly | Asn | Asp | Glu | Val | Tyr | Val | Glu | Lys | Leu | íle |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Glu | Asn | Pro | Lys | His | íle | Glu | Val | Gin | Val | íle | Gly | Asp | Lys | Gin | Gly |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Asn | Val | Val | His | Leu | Phe | Glu | Arg | Asp | Cys | Ser | Val | Gin | Arg | Arg | His |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gin | Lys | Val | íle | Glu | Val | Ala | Pro | Ser | Val | Ser | Leu | Ser | Pro | Glu | Leu |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Arg | Asp | Gin | íle | Cys | Glu | Ala | Ala | Val | Ala | Leu | Ala | Lys | Asn | Val | Asn |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Tyr | íle | Asn | Ala | Gly | Thr | Val | Glu | Phe | Leu | Val | Ala | Asn | Asn | Glu | Phe |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Tyr | Phe | íle | Glu | Val | Asn | Pro | Arg | Val | Gin | Val | Glu | His | Thr | íle | Thr |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Glu | Met | íle | Thr | Gly | Val | Asp | íle | Val | Gin | Thr | Gin | íle | Leu | Val | Ala |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Gin | Gly | His | Ser | Leu | His | Ser | Lys | Lys | Val | Asn | íle | Pro | Glu | Gin | Lys |
325 330 335
Asp | íle | Phe | Thr | íle | Gly | Tyr | Ala | íle | Gin | Ser | Arg | Val | Thr | Thr | Glu |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Asp | Pro | Gin | Asn | Asp | Phe | Met | Pro | Asp | Thr | Gly | Lys | íle | Met | Ala | Tyr |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Arg | Ser | Gly | Gly | Gly | Phe | Gly | Val | Arg | Leu | Asp | Thr | Gly | Asn | Ser | Phe |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Gin | Gly | Ala | Val | íle | Thr | Pro | Tyr | Tyr | Asp | Ser | Leu | Leu | Val | Lys | Leu |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ser | Thr | Trp | Ala | Leu | Thr | Phe | Glu | Gin | Ala | Ala | Ala | Lys | Met | Val | Arg |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Asn | Leu | Gin | Glu | Phe | Arg | íle | Arg | Gly | íle | Lys | Thr | Asn | íle | Pro | Phe |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Leu | Glu | Asn | Val | Ala | Lys | His | Glu | Lys | Phe | Leu | Thr | Gly | Gin | Tyr | Asp |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Thr | Ser | Phe | íle | Asp | Thr | Thr | Pro | Glu | Leu | Phe | Asn | Phe | Pro | Lys | Gin |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Lys | Asp | Arg | Gly | Thr | Lys | Met | Leu | Thr | Tyr | íle | Gly | Asn | Val | Thr | Val |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Asn | Gly | Phe | Pro | Gly | íle | Gly | Lys | Lys | Glu | Lys | Pro | Ala | Phe | Asp | Lys |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Pro | Leu | Gly | Val | Lys | Val | Asp | Val | Asp | Gin | Gin | Pro | Ala | Arg | Gly | Thr |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Lys | Gin | íle | Leu | Asp | Glu | Lys | Gly | Ala | Glu | Gly | Leu | Ala | Asn | Trp | Val |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Lys | Glu | Gin | Lys | Ser | Val | Leu | Leu | Thr | Asp | Thr | Thr | Phe | Arg | Asp | Ala |
-25530 535 540
His Gin Ser Leu Leu Ala Thr Arg íle Arg Ser His Asp Leu Lys Lys
545 550 555 560 íle Ala Asn Pro Thr Ala Ala Leu Trp Pro Glu Leu Phe Ser Met Glu
565 570 575
Met | Trp | Gly | Gly | Ala | Thr | Phe | Asp | Val | Ala | Tyr | Arg | Phe | Leu | Lys | Glu |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Asp | Pro | Trp | Lys | Arg | Leu | Glu | Asp | Leu | Arg | Lys | Glu | Val | Pro | Asn | Thr |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Leu | Phe | Gin | Met | Leu | Leu | Arg | Ser | Ser | Asn | Ala | Val | Gly | Tyr | Thr | Asn |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Tyr | Pro | Asp | Asn | Val | íle | Lys | Glu | Phe | Val | Lys | Gin | Ser | Ala | Gin | Ser |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Gly | íle | Asp | Val | Phe | Arg | íle | Phe | Asp | Ser | Leu | Asn | Trp | Val | Lys | Gly |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Met | Thr | Leu | Ala | íle | Asp | Ala | Val | Arg | Asp | Thr | Gly | Lys | Val | Ala | Glu |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Ala | Ala | íle | Cys | Tyr | Thr | Gly | Asp | íle | Leu | Asp | Lys | Asn | Arg | Thr | Lys |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Tyr | Asp | Leu | Ala | Tyr | Tyr | Thr | Ser | Met | Ala | Lys | Glu | Leu | Glu | Ala | Ala |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Gly | Ala | His | íle | Leu | Gly | íle | Lys | Asp | Met | Ala | Gly | Leu | Leu | Lys | Pro |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Gin | Ala | Ala | Tyr | Glu | Leu | Val | Ser | Ala | Leu | Lys | Glu | Thr | íle | Asp | íle |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Pro | Val | His | Leu | His | Thr | His | Asp | Thr | Ser | Gly | Asn | Gly | íle | Tyr | Met |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Tyr | Ala | Lys | Ala | Val | Glu | Ala | Gly | Val | Asp | íle | íle | Asp | Val | Ala | Val |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Ser | Ser | Met | Ala | Gly | Leu | Thr | Ser | Gin | Pro | Ser | Ala | Ser | Gly | Phe | Tyr |
770 775 780
His Ala Met Glu Gly Asn Asp Arg Arg Pro Glu Met Asn Val Gin Gly 785 790 795 800 Val Glu Leu Leu Ser Gin Tyr Trp Glu Ser Val Arg Lys Tyr Tyr Ser
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Glu | Phe | Glu | Ser | Gly | Met | Lys | Ser | Pro | His | Thr | Glu | íle | Tyr | Glu | His |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Glu | Met | Pro | Gly | Gly | Gin | Tyr | Ser | Asn | Leu | Gin | Gin | Gin | Ala | Lys | Gly |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Val | Gly | Leu | Gly | Asp | Arg | Trp | Asn | Glu | Val | Lys | Glu | Met | Tyr | Arg | Arg |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Val | Asn | Asp | Met | Phe | Gly | Asp | íle | Val | Lys | Val | Thr | Pro | Ser | Ser | Lys |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Val | Val | Gly | Asp | Met | Ala | Leu | Tyr | Met | Val | Gin | Asn | Asn | Leu | Thr | Glu |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Lys | Asp | Val | Tyr | Glu | Lys | Gly | Glu | Ser | Leu | Asp | Phe | Pro | Asp | Ser | Val |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Val | Glu | Leu | Phe | Lys | Gly | Asn | íle | Gly | Gin | Pro | His | Gly | Gly | Phe | Pro |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Glu | Lys | Leu | Gin | Lys | Leu | íle | Leu | Lys | Gly | Gin | Glu | Pro | íle | Thr | Val |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Arg | Pro | Gly | Glu | Leu | Leu | Glu | Pro | Val | Ser | Phe | Glu | Ala | íle | Lys | Gin |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
Glu | Phe | Lys | Glu | Gin | His | Asn | Leu | Glu | íle | Ser | Asp | Gin | Asp | Ala | Val |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Ala | Tyr | Ala | Leu | Tyr | Pro | Lys | Val | Phe | Thr | Asp | Tyr | Val | Lys | Thr | Thr |
980 985 990
Glu Ser Tyr Gly Asp íle Ser Val Leu Asp Thr Pro Thr Phe Phe Tyr 995 1000 1005
Gly Met Thr Leu Gly Glu Glu íle Glu Val Glu íle Glu Arg Gly Lys 1010 1015 1020
Thr Leu íle Val Lys Leu íle Ser íle Gly Glu Pro Gin Pro Asp Ala 025 1030 1035 1040
Thr Arg Val Val Tyr Phe Glu Leu Asn Gly Gin Pro Arg Glu Val Val
1045 1050 1055 íle Lys Asp Glu Ser íle Lys Ser Ser Val Gin Glu Arg Leu Lys Ala
1060 1065 1070
Asp Arg Thr Asn Pro Ser His íle Ala Ala Ser Met Pro Gly Thr Val
-271075 1080 1085 íle Lys Val Leu Ala Glu Ala Gly Thr Lys Val Asn Lys Gly Asp His
1090 1095 1100
Leu Met íle Asn Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Thr Val Gin Ala Pro 105 1110 1115 1120
Phe Ser Gly Thr íle Lys Gin Val His Val Lys Asn Gly Glu Pro íle
1125 1130 1135
Gin Thr Gly Asp Leu Leu Leu Glu íle Glu Lys Ala
1140 1145
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Baktéria patriaca do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje L-aminokyselinu.
- 2. Baktéria podľa nároku 1, pričom gén kódujúci pyruvát karboxylázu je odvodený z baktérie patriacej do rodu Bacillus.
- 3. Baktéria podľa nároku 1, pričom gén kódujúci pyruvát karboxylázu je zavedený do baktérie v malom počte kópií.
- 4. Baktéria podľa nároku 1, pričom L-aminokyselina je vybraná zo skupiny, ktorá zahŕňa L-treonín, L-lyzín, kyselinu L-glutámovú, L-homoserín, L-metionín, Larginín, L-prolín alebo L-izoleucín.
- 5. Spôsob výroby L-aminokyseliny, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu baktérie podľa nároku 1 v médiu, produkciu a akumuláciu L-aminokyseliny v médiu a izoláciu L-aminokyseliny z média.
- 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že L-aminokyselina je vybraná zo skupiny, ktorá zahŕňa L-treonín, L-lyzín, kyselinu Lglutámovú, L-homoserín, L-metionín, L-arginín, L-prolín alebo L-izoleucín.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99121636/13A RU2207376C2 (ru) | 1999-10-14 | 1999-10-14 | Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK15112000A3 true SK15112000A3 (sk) | 2001-06-11 |
SK285997B6 SK285997B6 (sk) | 2008-01-07 |
Family
ID=20225848
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK1511-2000A SK285997B6 (sk) | 1999-10-14 | 2000-10-11 | Baktéria patriaca do rodu Escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje L-aminokyselinu, a spôsob výroby L-aminokyseliny fermentáciou |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1092776B1 (sk) |
JP (1) | JP2001136991A (sk) |
CN (1) | CN1247783C (sk) |
BR (1) | BR0004832A (sk) |
DE (1) | DE60011974T2 (sk) |
RU (1) | RU2207376C2 (sk) |
SK (1) | SK285997B6 (sk) |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2175351C2 (ru) * | 1998-12-30 | 2001-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот |
RU2207371C2 (ru) | 2000-09-26 | 2003-06-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислот семейства l-глутаминовой кислоты, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
JP2006230202A (ja) * | 2003-06-23 | 2006-09-07 | Ajinomoto Co Inc | L−グルタミン酸の製造法 |
EP1907559A1 (en) * | 2005-07-18 | 2008-04-09 | Basf Se | Methionine producing recombinant microorganisms |
CN101374953B (zh) * | 2006-01-27 | 2011-09-28 | 味之素株式会社 | 用于产生l-氨基酸的方法 |
EP1979486B1 (en) | 2006-01-30 | 2013-04-17 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid |
JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
CN1986777B (zh) * | 2006-07-11 | 2010-09-08 | 湖北大学 | 活体催化工程菌及利用α-酮酸生产L型非天然疏水性氨基酸的方法 |
JP2010017082A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2010088301A (ja) | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸または核酸の製造方法 |
RU2395579C2 (ru) | 2007-12-21 | 2010-07-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia |
WO2009031565A1 (ja) * | 2007-09-04 | 2009-03-12 | Ajinomoto Co., Inc. | アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
JP2010263790A (ja) | 2007-09-04 | 2010-11-25 | Ajinomoto Co Inc | アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
BRPI0906795A2 (pt) | 2008-01-23 | 2015-08-18 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido |
BRPI0918299B1 (pt) | 2008-09-08 | 2018-08-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Método para produzir um l-aminoácido |
JP2012029565A (ja) | 2008-11-27 | 2012-02-16 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JPWO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2013-01-10 | 味の素株式会社 | L−アミノ酸の製造法 |
JP2012223091A (ja) | 2009-08-25 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2012223092A (ja) | 2009-08-28 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2013013329A (ja) | 2009-11-06 | 2013-01-24 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
MY185322A (en) | 2013-05-13 | 2021-05-04 | Ajinomoto Kk | Method for producing l-amino acid |
JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
JP2016192903A (ja) | 2013-09-17 | 2016-11-17 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのl−アミノ酸の製造方法 |
PL3053999T3 (pl) | 2013-10-02 | 2020-03-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Przyrząd do regulowania poziomu amoniaku i sposób regulowania poziomu amoniaku |
WO2015060314A1 (ja) | 2013-10-21 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | L-アミノ酸の製造法 |
WO2015060391A1 (ja) | 2013-10-23 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
JP2015156844A (ja) * | 2014-02-25 | 2015-09-03 | 花王株式会社 | 枯草菌変異株及びそれを用いたジピコリン酸の製造方法 |
CN105505969A (zh) * | 2014-09-26 | 2016-04-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用 |
JP6623690B2 (ja) | 2015-10-30 | 2019-12-25 | 味の素株式会社 | グルタミン酸系l−アミノ酸の製造法 |
CN106148261B (zh) * | 2016-07-01 | 2019-09-03 | 江南大学 | 一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 |
JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | L-アミノ酸の製造法 |
KR101947959B1 (ko) * | 2018-05-28 | 2019-02-13 | 씨제이제일제당 (주) | 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법 |
EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
RU2714763C1 (ru) * | 2018-11-08 | 2020-02-19 | Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд | Генотерапевтический ДНК-вектор для таргетной генной терапии, способ его получения (варианты), штамм для его производства, способ его получения |
JPWO2022092018A1 (sk) | 2020-10-28 | 2022-05-05 | ||
US20240117393A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU875663A1 (ru) * | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
BR9610016A (pt) * | 1995-08-23 | 1999-07-06 | Ajinomoto Kk | Microorganismo e processo para a produção do ácido l-glutâmico por fermentação |
SK284235B6 (en) * | 1997-10-04 | 2004-11-03 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method |
JP2002511250A (ja) * | 1998-04-13 | 2002-04-16 | ザ ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチファウンデーション,インコーポレイティド | 微生物におけるオキサロ酢酸由来生化学物質の生産増強のためのピルビン酸カルボキシラーゼの過剰発現 |
-
1999
- 1999-10-14 RU RU99121636/13A patent/RU2207376C2/ru active
-
2000
- 2000-10-02 JP JP2000302598A patent/JP2001136991A/ja active Pending
- 2000-10-05 DE DE60011974T patent/DE60011974T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-05 EP EP00121763A patent/EP1092776B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-11 SK SK1511-2000A patent/SK285997B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-10-13 BR BR0004832-1A patent/BR0004832A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-10-14 CN CNB001348914A patent/CN1247783C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2001136991A (ja) | 2001-05-22 |
CN1305002A (zh) | 2001-07-25 |
BR0004832A (pt) | 2001-05-22 |
EP1092776B1 (en) | 2004-07-07 |
DE60011974D1 (de) | 2004-08-12 |
RU2207376C2 (ru) | 2003-06-27 |
SK285997B6 (sk) | 2008-01-07 |
CN1247783C (zh) | 2006-03-29 |
DE60011974T2 (de) | 2005-03-10 |
EP1092776A1 (en) | 2001-04-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SK15112000A3 (sk) | Baktéria patriaca do rodu escherichia, ktorá je transformovaná génom kódujúcim pyruvát karboxylázu a produkuje l-amonokyselinu, a spôsob výroby l-aminokyseliny fermentáciou | |
US6319696B1 (en) | Process for producing L-amino acids | |
KR100924065B1 (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 l-라이신 생산 방법 | |
US7179623B2 (en) | Method of producing amino acids using E. coli transformed with sucrose PTS genes | |
US7618803B2 (en) | Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia | |
KR100823044B1 (ko) | 트레오닌 및 이소류신의 제조방법 | |
US7186531B2 (en) | L-threonine producing bacterium belonging to the genus Escherichia and method for producing L-threonine | |
KR100976072B1 (ko) | 에스세리키아속 세균을 사용하는 l-트레오닌의 제조방법 | |
US7229794B2 (en) | Microorganism producing L-threonine having inactivated galR gene, method of producing the same and method of producing L-threonine using the microorganism | |
US20090093030A1 (en) | fadR KNOCK-OUT MICROORGANISM AND METHODS FOR PRODUCING L-THREONINE | |
CN100516230C (zh) | L-氨基酸的生产方法 | |
KR101117513B1 (ko) | 에스케리치아 속에 속하는 l-트레오닌 생산 세균 및l-트레오닌의 생산 방법 | |
US7256018B2 (en) | Microorganism producing L-threonine having inactivated tyrR gene, method of producing the same and method of producing L-threonine using the microorganism | |
US7074602B2 (en) | Method for producing L-threonine | |
EP1611232B1 (en) | tdcBC/pckA GENE-INACTIVATED MICROORGANISM AND METHOD OF PRODUCING L-THREONINE USING THE SAME |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20101011 |