DE69433873T2

DE69433873T2 - Synthese von Catechol durch eine aus Biomasse stammende Kohlenstoffquelle

Info

Publication number: DE69433873T2
Application number: DE69433873T
Authority: DE
Inventors: John W. Frost; Karen M. Draths
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1993-09-16
Filing date: 1994-09-14
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2014-09-15
Also published as: EP0722488A1; EP0722488A4; CA2171331C; WO1995007979A1; FI115841B; EP0722488B1; DE69433873D1; CA2171331A1; FI961233A0; US5629181A; ES2220916T3; FI961233A; JPH09506242A

Description

Technischer Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Catechol und seiner Vorstufen durch Umwandlung von Kohlenstoffquellen, die aus Biomasse abgeleitet sind. Insbesondere richtet sich die Erfindung auf die biokatalytische Umwandlung von Glucose und anderen für die Verwendung bei der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren geeigneten Zuckern in Catechol über 3-Dehydroshikimat und Protocatechuat.
Catechol ist ein außerordentlich wichtiges Molekül und wird als Ausgangsmaterial bei der Synthese von Arzneimitteln, Pestiziden, Aromen, Duftstoffen, Sonnenschutzmitteln und Polymerisationsinhibitoren verwendet. Die Weltjahresproduktion übersteigt 20000 t.
Derzeit beruht die gewerbliche Herstellung von Catechol überwiegend auf der Reaktion von Phenol mit Persäuren oder der metallkatalysierten (Fe²⁺, Co²⁺) Reaktion von Phenol mit Wasserstoffperoxid. Catechol wird auch bei der Destillation von Kohlenteer erzeugt. Weil diese Verfahren nicht erneuerbare Ausgangsmaterialien auf Basis fossiler Brennstoffe verwenden und komplexe Gemische von Catechol mit aromatischen Nebenprodukten wie Hydrochinon ergeben, sind sie nicht ganz erwünscht. Außerdem erfordern diese Reaktionen hohe Temperaturen und umfassen die Verwendung ökologisch bedenklicher Stoffe. Weitere Wege zu Catechol umfassen die alkalische Hydrolyse von o-Chlorphenol und die Fries-Peroxid-Umlagerung von Salicylaldehyd. Diese sind jedoch nicht mehr im gewerb lichen Gebrauch.
Auch die mikrobiologische Synthese wurde zur Herstellung von Catechol angewendet, jedoch nicht gewerblich. Für die mikrobiologische Synthese müssen Mikroben identifiziert werden, welche die Ausgangsmaterialien in Catechol umwandeln können. Einige solcher Mikroben wurden gefunden, jedoch sind die Substrate für ihre biologische Aktivität Benzol oder Phenol. Benzol, ein bekanntes Carcinogen, bringt beträchtliche ökologische Gefahren mit sich. Außerdem werden Benzol und seine Derivate (wie Phenol) aus fossilen Brennstoffen, einer nicht erneuerbaren Quelle, erzeugt. Daher hat bisher die mikrobiologische Synthese des Catechols hinsichtlich Umweltsicherheit und Ressourcenverbrauchs keine Vorteile gegenüber den herkömmlichen chemischen Synthesen erkennen lassen.
In der Literatur gibt es auch Berichte über die beiläufige Bildung von Catechol zusammen mit anderen Produkten, wenn gewisse Mikrobenstämme und Mutanten in einem Medium mit D-Glucose als Kohlenstoffquelle kultiviert werden. Die beschriebenen Stämme ergeben jedoch eine ungewisse und komplexe Mischung, die auf einem unbestimmten biokatalytischen Pfad erzeugt wird.
Es wäre erwünscht, einen Syntheseweg für Catechol bereitzustellen, der nicht nur die Abhängigkeit von ökologisch bedenklichen Ausgangsmaterialien vermeidet, sondern auch effizienten Gebrauch von erneuerbaren Ressourcen macht. Weiter wäre es erwünscht, einen Syntheseweg für Catechol als ausschließliches Produkt und nicht als Teil eines komplexen Gemischs bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die mikrobiologische Synthese von Catechol aus leicht zugänglichen Kohlenstoffquellen bereit, die in Mikroorganismen, die einen gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren haben, biokatalytisch in D-Erythrose-4-phosphat (E4P) und Phosphoenolpyruvat (PEP) umgewandelt werden können. Eine bevorzugte Kohlenstoffquelle ist D-Glucose. D-Glucose und die verschiedenen anderen erfindungsgemäß verwendbaren Kohlenstoffquellen sind vorteilhafterweise nicht toxisch. Sie sind auch nachwachsende Ressourcen, die sich in Stärke, Cellulose und Zuckers, die in Mais, Zuckerrohr, Zuckerrüben, Holzschliff und anderen Biomassequellen finden.
Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Biosynthesen geeignete Wirtsmikroorganismen gehören zu Gattungen, die einen gemeinsamen endogenen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren besitzen. Bevorzugte Wirtsorganismen sind mutante Linien von Escherichia coli, die gentechnisch verändert wurden, um ausgewählte endogene Gene von Klebsiella pneumoniae zu exprimieren. Eine zur Verwendung bei dieser Erfindung bevorzugte Mutante von E. coli ist E. coli AB2834, eine Defektmutante, welche die Umwandlung von 3-Dehydroshikimat (DHS), einem Zwischenprodukt des gemeinsamen Pfads, in Shikimisäure wegen einer Mutation am aroE-Ort, welcher die Shikimat-Dehydrogenase codiert, nicht katalysieren kann.
Der gemeinsame Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren erzeugt die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan in Bakterien und Pflanzen. Der gemeinsame Pfad endet im Verzweigungspunktmolekül Chorismat, das danach auf drei getrennten Endpfaden in Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan umgewandelt wird.
Lösungswege zur Steigerung der Produktionseffizienz des gemeinsamen Pfads wurden im US-Patent Nr. 5,168,056 (ausgegeben 1.12.1992) und in der US-Patentanmeldung Serial No. 07/994,194, eingereicht 21.12.1992, beschrieben.
Bei der Verwendung der gentechnisch veränderten mutanten Wirtsorganismen zur erfindungsgemäßen Herstellung von Cate chol verläuft der Fluss des Kohlenstoffs in Richtung auf die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren längs des gemeinsamen Pfads und ergibt ein erhöhtes intrazelluläres Niveau des DHS-Zwischenprodukts, das sich wegen der Mutation, welche die Umwandlung des DHS in Chorismat längs des gemeinsamen Pfads verhindert, ansammelt. In einem vom gemeinsamen Pfad abzweigenden Pfad dient DHS als Substrat für das Enzym 3-Dehydroshikimatdehydratase und erzeugt Protocatechuat, das danach mit Protocatechuatdecarboxylase in Catechol umgewandelt wird. Bevorzugt werden diese Enzyme in der Wirtszelle konstitutiv exprimiert infolge der Transformation der Wirtszelle mit rekombinanter DNA, welche diese Enzyme codierende Gene umfasst. Dadurch wird der Kohlenstofffluss von gemeinsamen Pfad in den abzweigenden, Catechol erzeugenden Pfad getrieben.
Im Wirtsstamm E. coli AB2834 steigt beispielsweise die intrazelluläre Konzentration des DHS wegen einer Mutation in einem Gen (aroE), das Shikimat-Dehydrogenase codiert, an. DHS wird längs eines abzweigenden Pfads in Catechol umgewandelt, der durch Transformation der Wirtszelle mit exprimierbaren Genfragmenten, welche DHS-Dehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codieren, und mit Genen, die Enzyme codieren, die eine erhöhte Menge Kohlenstoff in den gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren liefern, eröffnet wird. Es ergibt sich ein abzweigender Pfad, in dem der ursprünglich auf den gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren gerichtete Kohlenstofffluss auf Protocatechuat aus DHS und danach auf die Erzeugung von Catechol aus Protocatechuat gerichtet wird. Die Analyse des Überstands der Kulturen der erfindungsgemäßen rekombinanten Mutanten mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) zeigt, dass sich Catechol extrazellulär als ausschließliches Produkt ansammelt.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden den Fachleuten bei Betrachtung der folgenden eingehenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen offenbar, welche die beste Art der Ausführung der Erfindung erläutert, wie sie derzeit erkannt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht des gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren und den abzweigenden Pfad, der die Synthese von Catechol aus 3-Dehydroshikimat ermöglicht und
2 stellt eine Plasmidkarte von p2-47 dar und veranschaulicht, wie das Plasmid pKD8.243A aus den Plasmiden p2-47, pSU1-31 und pSUaroZY 157-27 erzeugt wurde.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Catechol aus einer von Biomasse stammenden Kohlenstoffquelle, die von einer Wirtszelle verwendet werden kann, die einen gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren aufweist, bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die biokatalytische Umwandlung der Kohlenstoffquelle in ein Zwischenprodukt längs des gemeinsamen Pfads und danach die biokatalytische Umwandlung des Zwischenprodukts in Catechol durch Erzwingung des Kohlenstoffflusses vom gemeinsamen Pfad hinweg auf einen abzweigenden Pfad. Im abzweigenden Pfad wird das Zwischenprodukt 3-Dehydroshikimat (DHS) biokatalytisch in Protocatechuat umgewandelt und das Protocatechuat danach unter Bildung von Catechol decarboxyliert.
Erfindungsgemäß verwendbare, von Biomasse abgeleitete Kohlenstoffquellen umfassen alle Kohlenstoffquellen, die biokatalytisch in D-Erythrose-4-phosphat (E4P) und Phosphoenolpyruvat (PEP), zwei Vorstufen des gemeinsamen Pfads der Biosynthese aromatischer Aminosäuren, umgewandelt werden können (siehe 1). Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Stärken, Cellulose und Zuckerarten wie Glucose, Pentosen und Fructose. In bevorzugten Ausführungsformen ist erfindungsgemäß D-Glucose die Kohlenstoffquelle für die Verwendung durch Wirtszellen.
Geeignete Wirtszellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Mitglieder jener Gattungen, die zur industriellen biosynthetischen Produktion der gewünschten aromatischen Verbindungen genutzt werden können. Insbesondere haben die geeigneten Wirtszellen einen gemeinsamen endogenen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren. Gemeinsame aromatische Pfade sind in einer großen Vielfalt von Mikroorganismen endogen und werden zur Herstellung verschiedener aromatischer Verbindungen genutzt. Wie in 1 gezeigt, führt der gemeinsame aromatische Pfad von E4P und PEP mit vielen Zwischenprodukten im Pfad zu Chorisminsäure (wobei die Verfügbarkeit des E4P durch das Enzym Transketolase des Pentosephosphatpfads, das vom tkt-Gen codiert wird, gesteigert wird). Die Zwischenprodukte im Pfad umfassen 3-Desoxy-D-arabino-heptusolonsäure-7-phosphat (DAHP), 3-Dehydrochinat (DHQ), 3-Dehydroshikimat (DHS), Shikimisäure, Shikimat-3-phosphat (S3P) und 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphat (EPSP). Die Enzyme im gemeinsamen Pfad und die ihnen entsprechenden Gene umfassen DAHP-Sythase (aroF), DHQ-Synthase (aroB), DHQ-Dehydratase (aroD), Shikimatdehydrogenase (aroE), Shikimatkinase (aroL, aroK), EPSP-Synthase (aroA) und Chorismatsynthase (aroC).
Zu den Wirtszellen, die gemeinsame Pfade dieses Typs umfassen, gehören zu den Gattungen Escherichia, Klebsiella, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus oder Serratia. Auch eukaryotische Wirtszellen können verwendet werden, wobei Hefen der Gattungen Saccharomyces oder Schizosaccharomyces bevorzugt sind.
Insbesondere werden prokaryotische Wirtszellen von Spezies abgeleitet, die Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lichenformis, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus pumilis, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas angulata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas tabaci, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces kasugensis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces lipmanii, Streptomyces lividans, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus saprophyticus oder Serratia marcescens umfassen. Zu den bevorzugten eukaryotischen Wirtszellen gehören Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces carlsbergensis.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfassen die Wirtszellen defektmutante Zelllinien mit einer Mutation im gemeinsamen Pfad der Aminosäure-Biosynthese, welche die Umwandlung des DHS in das Molekül des Verzweigungspunkts, Chorismat, blockiert. Solche Mutanten können die Umwandlung des 3-Dehydroshikimats (DHS) in Chorismat wegen einer Mutation in einem oder mehreren Genen, die Shikimatdehydrogenase, Shikimatkinase, EPSP-Synthase oder Chorismatsynthase codieren, nicht katalysieren und sammeln daher erhöhte intrazelluläre Konzentrationen von DHS an. Bevorzugte mutante Zelllinien umfassen die Escherichia coli-Stämme AB2834, AB2829 und AB2849.
E. coli AB2834 kann die Umwandlung von 3-Dehydroshikimat (DHS) in Shikimisäure wegen einer Mutation in der aroE-Stelle, welche die Shikimatdehydrogenase codiert, nicht katalysieren. Die Verwendung von E. coli AB2834 stellt si cher, dass der Kohlenstofffluss in Richtung auf die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren über DHS hinaus nicht weitergeht. Ebenso führen E. coli AB2829 (das die Umwandlung von Shikimat-3-phosphat (S3P) in 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat (EPSP) wegen einer Mutation in der die EPSP-Synthase codierenden aroA-Stelle nicht katalysieren kann) und E. coli AB2849 (das die Umwandlung von EPSP in Chorisminsäure wegen einer Mutation in der die Chorismatsynthase codierenden aroC-Stelle nicht katalysieren kann) zu erhöhten intrazellulären Gehalten von DHS. Die in bevorzugten Ausführungsformen verwendete Wirtszelllinie ist E. coli AB2834.
Zur erfindungsgemäßen Verwendung werden die Wirtszellen des hier beschriebenen Typs transformiert, so dass das intrazelluläre DHS als Substrat für die biokatalytische Umwandlung zu Catechol verwendet werden kann. Bevorzugt werden die Wirtszellen mit rekombinanter DNA transformiert, um den Kohlenstofffluss von den normalerweise beim gemeinsamen Pfad aus DHS synthetisierten Zwischenprodukten hinweg und in einen abzweigenden Pfad zur Erzeugung von Catechol zu treiben.
Der abzweigende Pfad ist in 1 veranschaulicht. Wie gezeigt ist das Zwischenprodukt im abzweigenden Pfad Protocatechuat. Für die Umwandlung des DHS in Protocatechuat ist das Enzym 3-Dehydroshikimatdehydratase, in 1 mit "h" bezeichnet, zuständig, und sein Gen ist aroZ. Für die Decarboxylierung des Protocatechuats zur Bildung von Catechol ist das Enzym Protocatechuatdecarboxylase, in 1 mit "i" bezeichnet, zuständig, und sein Gen ist aroY. Daher umfasst die rekombinante DNA für die Transformation der Wirtszellen für die erfindungsgemäße Verwendung konstitutiv exprimierte Gene, die 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codieren.
Die Enzyme 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase wurden aus den Pfaden der Ortho-Spaltung gewonnen, welche Mikroben wie Neurospora, Aspergillus, Acinetobacter, Klebsiella und Pseudomonas befähigen, Aromaten (Benzoat und p-Hydroxybenzoat) wie auch Hydroaromaten (Shikimat und Chinat) als alleinige Kohlenstoffquelle für das Wachstum zu nutzen. Die DHS-Dehydratase spielt eine entscheidende Rolle beim mikrobiellen Katabolismus der China- und Shikimisäure. Protocatechuatdecarboxylase wurde von Patel als Katalysator für die Umwandlung von Protocatechuat in Catechol beim Katabolismus von p-Hydroxybenzoat durch Klebsiella aerogenes erkannt. Die neuerliche Untersuchung von Patel's Stamm (jetzt als Enterobacter aerogenes bezeichnet) [(a) Grant, D. J. W.; Patel, J. C. Antonie van Leewenhoek 1969, 35, 325. (b) Grant, D. J. W. Antonie van Leewenhoek 1970, 36, 161] führte kürzlich Ornston zu dem Schluss, dass Protocatechuatdecarboxylase beim Katabolismus von p-Hydroxybenzoat nicht wesentlich für den Metabolismus ist [Doten, R. C.; Ornston, N. J. Bacteriol. 1987, 169, 5827]. Die wahre Rolle der Protocatechuatdecarboxylase bei der Ortho-Spaltung ist daher etwas rätselhaft.
Der Mechanismus der Transformation der Wirtszelle für die Umleitung des Kohlenstoffflusses in den abzweigenden Pfad umfasst bevorzugt das Einsetzen genetischer Elemente, darunter exprimierbare Sequenzen, die für 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codieren. Ohne Rücksicht auf den genauen angewendeten Mechanismus wird erwogen, dass die Expression dieser enzymatischen Aktivitäten durch die Überführung der rekombinanten genetischen Elemente in die Wirtszelle bewirkt oder vermittelt wird. Zu den genetischen Elementen wie hier definiert gehören Nukleinsäuren (im allgemeinen DNA oder RNA), die exprimierbare, für Produkte wie Proteine, Apoproteine oder Antisense-RNA codierende Sequenzen aufweisen, welche enzyma tische Funktionen des Pfads ausführen oder steuern können. Die exprimierten Proteine können als Enzyme wirken, die Enzymaktivität unterdrücken oder die Unterdrückung aufheben oder die Expression von Enzymen steuern. Die diese exprimierbaren Sequenzen codierenden Nukleinsäuren können chromosomal (z. B. durch homologe Rekombination in ein Chromosom der Wirtszelle integriert) oder extrachromosomal (z. B. von Plasmiden, Cosmiden usw. getragen) sein.
Die erfindungsgemäßen genetischen Elemente können von Plasmiden, Cosmiden, Phagen, künstlichen Hefechromosomen oder anderen Vektoren, welche die Überführung der genetischen Elemente in eine Wirtszelle vermitteln, in eine Wirtszelle eingeführt werden. Diese Vektoren können einen Replikationsursprung zusammen mit cis-wirkenden Steuerelementen umfassen, welche die Replikation des Vektors und der von ihm getragenen genetischen Elemente steuern. Auf dem Vektor können auswählbare Marker zugegen sein, um die Identifizierung derjenigen Wirtszellen, in die genetische Elemente eingeführt wurden, zu unterstützen. Auswählbare Marker können beispielsweise Gene sein, die Beständigkeit gegen bestimmte Antibiotika, wie Tetracyclin, Ampicillin, Chloramphenicol, Kanamycin oder Neomycin verleihen.
Ein bevorzugtes Mittel zur Einführung von genetischen Elementen in eine Wirtszelle wendet einen extrachromosomalen Multicopy-Plasmidvektor an, in den erfindungsgemäße genetische Elemente eingefügt sind. Die von Plasmiden getragene Einführung des genetischen Elements in Wirtszellen umfasst zunächst eine Spaltung des Plasmids mit einem Restriktionsenzym, gefolgt von der Verknüpfung des Plasmids und der erfindungsgemäßen genetischen Elemente. Nach Rezirkularisierung des verknüpften rekombinanten Plasmids wird eine Transduktion oder ein anderer Mechanismus für die Einschleusung von Plasmiden (z. B. Elektroporation, Mikroinjektion usw.) angewendet, um das Plasmid in die Wirtszelle einzuführen. Geeignete Plasmide für die Einführung genetischer Elemente in die Wirtszelle umfassen ohne Beschränkung pBR322 und seine Derivate wie pAT153, pXf3, pBR325, pBR327, pUC-Vektoren, pACYC und seine Derivate, pSC101 und seine Derivate und ColE1. Außerdem sind Cosmidvektoren wie pLAFR3 ebenfalls für die Einführung genetischer Elemente in Wirtszellen geeignet. Bevorzugte Plasmidkonstrukte umfassen ohne Beschränkung p2-47, pKD8.243A, pKD8.243B und pSUaroZY157-27, welche die aus Klebsiella pneumoniae isolierten aroZ- und aroY-Stellen tragen, welche 3-Dehydroshikimatdehydratase bzw. Protocatechuatdecarboxylase codieren.
Typischerweise umfasst der Mechanismus für die Transformation der erfindungsgemäßen Wirtszellen auch die Einführung von Genen, die Enzyme codieren, welche die Einspeisung von Kohlenstoff in den gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren steigern. Die Expression eines Gens wird in erster Linie durch seinen eigenen Promotor gesteuert, jedoch können andere genetische Elemente, darunter optionale Steuerelemente der Expression wie Repressoren und Verstärker eingeschlossen werden, um die Expression oder die Aufhebung der Repression von Sequenzen, die Proteine, Apoproteine oder Antisense-RNA kodieren, zu steuern. Außerdem können rekombinante DNA-Konstrukte erzeugt werden, wobei der natürliche Promotor des Gens durch einen alternativen Promotor ersetzt wird, um die Expression des Genprodukts zu steigern. Promotoren können entweder konstitutiv oder induzierbar sein. Ein konstitutiver Promotor steuert die Transkription eines Gens mit konstanter Geschwindigkeit über das Leben der Zelle, während die Aktivität eines induzierbaren Promotors je nach Anwesenheit (oder Abwesenheit) eines spezifischen Induktors schwankt. Beispielsweise können Steuersequenzen in Wildtyp-Wirtszellen eingeführt werden, um die Überexpression ausgewählter, bereits im Genom der Wirtszelle codierter Enzyme zu för dern, oder sie können alternativ auch verwendet werden, um die Synthese extrachromosomal codierter Enzyme zu steuern.
In der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt Steuersequenzen für die Promotion der Überproduktion von DHS verwendet. Wie zuvor bemerkt, wird DHS im gemeinsamen Pfad durch die aufeinanderfolgende katalytische Aktivität des tyrosinsensitiven Isozyms Synthase des 3-Desoxy-D-arabinoheptulosonsäure-7-phosphats (DAHP) (codiert durch aroF) und Synthase des 3-Dehydrochinats (DHQ) (codiert durch aroB) zusammen mit dem Enzym Transketolase des Pentosephosphatpfads (codiert durch tkt) synthetisiert. Die Expression dieser biosynthetischen Enzyme kann zur Steigerung der Umwandlung von D-Glucose in DHS verstärkt werden. Steigerung der katalytischen in vivo-Aktivität der DAHP-Synthase, des ersten Enzyms des gemeinsamen Pfads, erhöht den in die aromatische Biosynthese gerichteten Fluss von D-Glucose-Äquivalenten. Es werden jedoch Niveaus der katalytischen Aktivität der DAHP-Synthetase erreicht, jenseits derer keine weitere Verbesserung des Prozentsatzes der in die aromatische Biosynthese eingespeisten D-Glucose erzielt wird. Bei diesem Grenzniveau der Biosynthese aromatischer Aminosäuren erzielt die Verstärkung der katalytischen Niveaus des Enzyms Transketolase des Pentosephosphatpfads eine beträchtliche Erhöhung des Prozentanteils der in den Pfad eingeführten D-Glucose.
Zur Erhöhung der Konzentration an D-Erythrose-4-phosphat wurde eine verstärkte Transketolaseaktivität vorgeschlagen. Beschränkte Verfügbarkeit des D-Erythrose-4-phosphats als eines der beiden Substrate der DAHP-Synthase beschränkt wahrscheinlich die katalytische Aktivität der DAHP-Synthase. Ein bevorzugtes Mittel zur Verstärkung der katalytischen Aktivität der DAHP-Synthase, der DHQ-Synthase und der DHQ-Dehydratase ist es, durch Transformation der Wirtszelle mit einer rekombinanten, diese Enzyme codierenden DNA-Sequenz diese Enzymspezies überzuexprimieren.
Die verstärkte Expression der aroF-codierten DAHP-Synthase und der tkt-codierten Transketolase erzeugt eine in den gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren gerichtete Woge des Kohlenstoffflusses, die den normalen Kohlenstofffluss in diesen Pfad übersteigt. Wenn die einzelnen Geschwindigkeiten der von den einzelnen Enzymen des gemeinsamen Pfads katalysierten Umwandlung von Substrat in Produkt nicht vergleichbar mit der Geschwindigkeit der DAHP-Synthese sind, sammeln sich die Substrate dieser geschwindigkeitsbestimmenden Enzyme in der Zelle an.
Mikroorganismen wie E. coli bewältigen angesammelte Substrate häufig durch Export dieser Substrate in den Überstand des Wachstumsmediums. Dies führt zu einer Abnahme des Kohlenstoffflusses im gemeinsamen Pfad, da das exportierte Substrat typischerweise für den Stoffwechsel der Mikrobe verloren ist. Ein Beispiel eines geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms des gemeinsamen Pfads ist DHQ-Synthase. Eine verstärkte Expression von DHQ-Synthase beseitigt den geschwindigkeitsbestimmenden Charakter dieses Enzyms und verhindert die Ansammlung von DAHP und seines nicht-phosphorylierten Analogons DAH. DHQ-Dehydratase ist nicht geschwindigkeitsbestimmend. Daher steigert eine verstärkte Expression der aroF-codierten DAHP-Synthase, der tkt-codierten Transketolase und der aroB-DHQ-Synthase die Produktion von DHS, welches in Gegenwart von DHS-Dehydratase und Protocatechuatdecarboxylase in Catechol umgewandelt wird. Das synthetisierte Catechol sammelt sich dann als Endprodukt an und wird danach in das Wachstumsmedium exportiert.
Ein besonders bevorzugtes Plasmid für die Steigerung der Effizienz des Kohlenstoffflusses längs des gemeinsamen Pfads zwischen der Kohlenstoffquelle und DHS ist das Plasmid pKD136, welches die aroF-, tkt- und aroB-Gene codiert (siehe US 5,272,073 ). Durch die verstärkte Expression der DAHP-Synthase (codiert durch aroF) und Transketolase (codiert durch tkt) leitet das Plasmid pKD136 die Woge des Kohlenstoffflusses in die aromatische Biosynthese. Diese Woge des Kohlenstoffflusses wird dann durch pKD136 wegen der verstärkten Expression der DHQ-Synthase (codiert durch aroB) vollständig in die DHS-Synthese weitergeleitet.
Daher wurde nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ein heterologer Stamm von Escherichia coli, der DHS-Dehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codierende Gene exprimiert, konstruiert und so die biokatalytische Produktion von Catechol aus D-Glucose ermöglicht. Bei Transformation der Wirtszellen mit pKD136 wurde eine effiziente Umwandlung von D-Glucose in Catechol erzielt. Der Stamm E. coli AB2834/pKD136 wurde dann mit dem Plasmid p2-47 transformiert. Das Endergebnis war E. coli AB2834/pKD136/p2-47, eine heterologe Mikrobe, welche die Umwandlung von D-Glucose in Catechol katalysiert.
Demnach bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Catechol in einer Wirtszelle, die einen gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren aufweist. Das Verfahren umfasst die Schritte:

– Transformation der Wirtszelle mit rekombinanter DNA zur Erzeugung einer heterologen Wirtszelle. Die rekombinante DNA umfasst konstitutiv exprimierende Gene, die 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codieren, und:
– Züchtung der transformierten Wirtszelle in einem Medium, das eine Kohlenstoffquelle enthält. In einer Ausgestaltung der Erfindung ist die Wirtszelle außerdem mit rekombinanter DNA transformiert, die Sequenzen umfasst, welche die Enzymspezies Transketolase, DAHP-Synthase und DHQ-Synthase codieren. In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung ist die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt, die aus Mutationen besteht, welche die Synthese von Zwischenprodukten im Pfad stromabwärts von DHS blockieren. Eine solche Wirtszelle ist der E. coli-Stamm aroE.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung rekombinant transformierte E. coli-Stämme, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus E. coli AB2834/pKD136/p2-47, E. coli AB2834/pKD136/pKD8.243A und E. coli AB2834/pKD136/pKD8.243B besteht. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung rekombinante Plasmidkonstrukte, ausgewählt aus der Gruppe, die aus p2-47, pKD8.243A und pKD8.243B besteht.
Beispiel 1
Isolierung des aroZ-Gens aus Klebsiella pneumoniae
Die Isolierung des Gens, welches DHS-Dehydratase codiert (in der vorliegenden Beschreibung mit aroZ bezeichnet) begann mit der Reinigung von Genom-DNA des Klebsiella pneumoniae-Stamms A170-40. Zur Erzeugung von Fragmenten im Bereich von 15 bis 30 kb wurde die partielle Digestion der Genom-DNA mit BamHI angewendet. Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit pLAFR3 verknüpft, das vorher mit BamHI digeriert und danach mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm behandelt worden war. pLARF3 ist ein tetracyclinresistentes Cosmid, welches das RK2-Replikon besitzt. Zum Verpacken der verknüpften DNA wurde das Packagene-Packaging-System (Promega) benutzt. Die resultierenden Phagenteilchen wurden zum Infizieren von E. coli DH5α/pKD136 verwendet. Das Plasmid pKD136 ist ein Vektor auf Basis pBR325 (Replikationsursprung pMB1), der Gene enthält, die sowohl Transketolase (tkt), DHAP-Synthase (aroF) und DHQ-Synthase (aroB) als auch ein Gen für Ampicillinresistenz codieren. Kolonien, die sowohl gegen Tetracyc lin als auch Ampicillin resistent waren, wurden danach auf Platten mit chromogenem Minimummedium ("chromogenic minimum medium")(M9) aufgetragen, die D-Glucose (4 g/l), Shikimisäure (0,04 g/l), Eisen(III)-citrat (0,07 g/l), p-Toluidin (1,9 g/l), Ampicillin (0,05 g/l) und Tetracyclin (0,013 g/l) enthielten. Nach 48 h Inkubation bei 37°C erschien die Farbe des Wachstumsmediums um die Kolonie 5-87 leicht braun. Fortgesetzte Inkubation bei Raumtemperatur führte zu weiterer Dunkelfärbung der die Kolonie 5-87 umgebenden Agarose. Die aus einer Kultur der Kolonie 5-87 gereinigte DNA bestand aus pKD136 und einem mit p5-87 bezeichneten tetracyclinresistenten Plasmid.
Digerieren des Plasmids p5-87 mit BamHI und nachfolgende Elektrophorese auf Agarosegel ergab fünf DNA-Fragmente, die durch Ethidiumfärbung nachweisbar waren. Die 22 kb-Bande stellte den pLAFR3-Wirtsvektor dar, während die 5,7, 4,3, 3,5 und 0,5 kb-Fragmente den aroZ codierenden Insert von Klebsiella pulmoniae darstellten. Die erhaltenen BamHI-Fragmente wurden in pLAFR3 ligiert, das zuvor mit BamHI digeriert und mit Phosphatase behandelt worden war. Nach Transformation der Ligationsprodukte in DH5α/pKD136 wurden die resultierenden ampicillin- und tetracyclinresistenten Kolonien wie oben beschrieben auf die Fähigkeit geprüft, Minimalmedium-Agaroseplatten mit p Toluidin und Eisen(III)-citrat braun zu färben. Unter Anwendung dieser Technik wurde das Plasmid p4-20, welches das 3,5 kb-BamHI-Fragment enthielt, isoliert.
In einem Versuch, die Größe des aroZ codierenden Inserts zu minimieren, wurde das Plasmid p5-87 mit BamHI digeriert und die resultierenden Fragmente mit dem Vektor pSU19 verknüpft, der zuvor mit BamHI digeriert und mit Phosphatase behandelt worden war. Das Plasmid pSU19 enthält das Replikon p15A und das Gen, das Resistenz gegen Chloramphenicol verleiht. Nach Transformation der Ligationsprodukte in DH5α/pKD136 wurden die resultierenden ampicillin- und chloraphenicolresistenten Kolonien wie in Beispiel 1 beschrieben auf die Fähigkeit geprüft, Minimalmedium-Agaroseplatten mit p-Toluidin und Eisen(III)-citrat braun zu färben. Unter Anwendung dieser Technik wurde das Plasmid pSU1-31, welches aus einem in pSU19 enthaltenen 3,5 kb-BamHI-Insert enthielt, isoliert.
Beispiel 2
Bestätigung der Klonierung von aroZ
Die Bestätigung, dass beide Plasmide p5-87 und pSU1-31 das aroZ-Gen enthielten, beruhte auf der Tatsache, dass Transformation eines E. coli-Stamms, der typischerweise D-Glucose in DHS umwandelt, darüber hinaus DHS in Protocatechusäure umwandeln konnte. E. coli AB2834 sammelt wegen einer Mutation im aroE-Gen, das Shimatdehydrogenase codiert, DHS im Überstand der Zellkultur an. Die Umwandlung der D-Glucose in DHS wird maximiert, wenn AB2834 mit pKD136 transformiert ist. AB2834 wurde mit pKD136 und p5-87 kotransformiert und ergab Kolonien, die sowohl gegen Ampicillin als auch gegen Tetracyclin resistent waren. Ein Liter LB-Medium (4 l-Erlenmeyerkolben) wurde mit einer Übernacht-Kultur (5 ml) von AB2834/pKD136/p5-87 geimpft. Die Kultur wurde unter Rühren (250 min^–1) 8 h bei 37°C gezüchtet. Dann wurden die Zellen geerntet und in einem Liter (4 l-Erlenmeyerkolben) Minimalmedium M9, enthaltend Glucose (10 g/l), Shikimisäure (0,04 g/l), Ampicillin (0,05 g/l) und Tetracyclin (0,013 g/l) wieder suspendiert. Die Kultur wurde wiederum bei 37°C inkubiert. Nach 24 und 64 h wurden der Kultur Aliquote entnommen und zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Von jeder Probe wurden fünf ml des abgetrennten Überstands entnommen und das Wasser im Vakuum entfernt. Die Proben wurden in D₂O wieder gelöst und im Vakuum eingedampft. Durch Wiederholung dieser Prozedur wurde das Restwasser gegen D₂O ausgetauscht und man erhielt für die ¹H-NMR-Analyse geeignete Proben. Mit dem Natriumsalz der 3-(Trimethylsilyl)-2,2,3,3-d₄- propionsäure als internem Standard wurde festgestellt, dass sich im Überstand der Kultur etwa 9 mmol/l Protocatechusäure angesammelt hatten. Protocatechusäure wurde mittels der spezifischen Resonanzbanden bei δ 6,94 (d, 7 Hz, 1H) und δ 7,48 (d, 7 Hz, 2H) nachgewiesen. DHS wurde im Überstand der Kultur nicht nachgewiesen. Aus diesem Versuch wurde geschlossen, dass das DHS-Dehydratase codierende Gen auf dem Plasmid p5-87 lokalisiert war.
Wenn AB2834/pKD136/pSU1-31 im 1 l-Maßstab unter den unmittelbar vorstehend beschriebenen ähnlichen Bedingungen gezüchtet wurde, zeigte die ¹H-NMR-Analyse, dass sich extrazellulär 11 mmol/l Protocatechusäure angesammelt hatten. Aus diesem Versuch wurde geschlossen, dass das aroZ-Gen erfolgreich subkloniert worden und auf dem Plasmid pSU1-31 lokalisiert war.
Beispiel 3
Isolierung des aroY-Gens aus Klebsiella pulmoniae
Zu dieser Zeit war das aroZ-Gen auf einem 3,5 kb-Fragment mit BamHI sowohl im p4-20 (pLAFR3-Vektor) als auch im pSU1-31 (pSU19-Vektor) lokalisiert worden. Es wurde gezeigt, dass Kolonien von DH5α/pKD136/p4-20 beim Züchten auf Platten mit Minimalmedium-Agarose sowie Eisen(III)-citrat und p-Toluidin örtlich eine Braunfärbung hervorrufen. Die Auswahl eines Plasmids mit dem Gen, welches Protocatechuatdecarboxylase codiert (für die vorliegende Beschreibung als aroY bezeichnet), beruhte auf der Tatsache, dass von der Expression der Protocatechuatdecarboxylase in DH5α/pKD136/p4-20 die Mengenproduktion von Catechol und nicht von Protocatechusäure erwartet wurde. Da Catechol mit p-Toluidin zu einer stärker braunen Farbe reagiert als Protocatechuat, erwartete man, dass eine Catechol produzierende Kolonie aus dem Untergrund der Protocatechuat produzierenden Kolonien bei der Beurtei lung auf chromogenen Minimalmediumplatten (M9) ausgewählt werden konnte.
Die Isolierung eines das aroY-Gen enthaltenden Plasmids begann mit partieller Digestion der Genom-DNA von K. pneumoniae mit EcoRI unter Bildung von Fragmenten im Größenbereich von 15 bis 30 kb. Die entstandenen Fragmente wurden in das Cosmid p4-20 ligiert, das zuvor mit EcoRI digeriert und mit Phosphatase behandelt worden war. Die ligierte DNA wurde in Lamba-Phagenköpfe verpackt, die dann zur Infektion von DH5α/pKD136 verwendet wurden. Die entstandenen Kolonien waren sowohl gegen Ampicillin als auch gegen Tetracyclin resistent und wurden auf Minimalmedium-Agaroseplatten, die p-Toluidin und Eisen(III)-citrat enthielten, geprüft. Nach etwa 24 h Inkubation bei 37°C erzeugte die Kolonie 2-47 einen örtlichen braunen Bereich, der bei allen anderen Kolonien fehlte.
Die Isolierung von DNA aus der Kolonie 2-47 ergab die Plasmide pKD136 und p2-47, die danach in geeignete Zellen kotransformiert wurden, wobei man E. coli AB2834/pKD136/p2-47 erhielt.
Ähnlich zur ursprünglichen Strategie für die Isolierung der Protocatechuatdecarboxylase codierenden DNA beruhte die Subklonierung des aroY-EcoRI-Fragments zu seiner minimalen Größe auf der Synthese von Catechol durch einen aroE-Wirtsstamm in Gegenwart von DHS-Dehydratase. Vollständiges Digerieren von p2-47 mit EcoRI zeigte an, dass das aroY-Insert aus zwei EcoRI-Fragmenten von etwa 8 und 11,9 kb bestand. Lokalisierung des 11,9 kb-EcoRI-Fragments in pSU1-31 ergab das Plasmid pSUaroZY157-27.
Die Kartierung des 11,9 kb-EcoRI-Fragments in Verbindung mit weiterer Subklonierung zeigte, dass das aroY-Gen wahrscheinlich nahe der Mitte des 11,9 kb-Fragments lokalisiert ist. Digerieren von pSUaroZY157-27 mit HindIII erzeugte ein 2,3 kb-HindIII-Fragment, das in pSU1-31 eingesetzt wurde und das Plasmid pKD8.243A ergab (2). Auch das Plasmid pKD8.243B wurde isoliert, bei dem das 2,3 kb-HindIII-Fragment relativ zum Vektor die entgegengesetzte Ausrichtung hat.
Beispiel 4
Biokatalytische Umwandlung von DHS in Protocatechuat durch das Plasmid p5-87
Die Kotransformation von pKD136 und p5-87 in E. coli AB2834 ergab das gegen Ampicillin und Tetracyclin resistente AB2834/pKD136/p5-87. Eine Mutation im aroE-Gen von E. coli macht die Shikimatdehydrogenase inaktiv. Ein Liter LB-Medium mit Ampicillin und Tetracyclin (4 l-Erlenmeyerkolben) wurde mit einer Übernacht-Kultur (5 ml) von AB2834/pKD136/p5-87 geimpft. Die Kultur wurde 8 h unter Rühren (250 min^–1) bei 37°C gezüchtet. Dann wurden die Zellen geerntet und in einem Liter (4 l-Erlenmeyerkolben) Minimalmedium M9, enthaltend Glucose (10 g/l), Shikimisäure (0,04 g/l), Ampicillin (0,05 g/l) und Tetracyclin (0,013 g/l) wieder suspendiert. Die Kultur wurde weiter bei 37°C inkubiert. Nach 24 und 64 h wurden der Kultur Aliquote entnommen und zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Von jeder Probe wurden fünf ml des abgetrennten Überstands entnommen und das Wasser im Vakuum entfernt. Die Proben wurden in D₂O wieder gelöst und im Vakuum eingedampft. Durch Wiederholung dieser Prozedur wurde das Restwasser gegen D₂O ausgetauscht und man erhielt für die ¹H-NMR-Analyse geeignete Proben. Mit dem Natriumsalz der 3-(Trimethylsilyl)-2,2,3,3-dy-propionsäure als internem Standard wurde festgestellt, dass sich im Überstand der Kultur etwa 9 mmol/l Protocatechusäure angesammelt hatten. Protocatechusäure wurde mittels der spezifischen Resonanzbanden bei δ 6,94 (d, 7 Hz, 1H) und δ 7,48 (d, 7 Hz, 2H) nachgewiesen. Weitere Resonanzen entsprechen unverstoffwechselter D-Glucose und Essigsäure. DHS wurde im Überstand der Kultur nicht nachgewiesen. Aus diesem Versuch wurde geschlossen, dass das DHS-Dehydratase codierende Gen auf dem Plasmid p5-87 lokalisiert war.
Beispiel 5
Biokatalytische Umwandlung von DHS in Protocatechuat durch das Plasmid p4-20
Ein Überstand einer Kultur von AB2834/pKD136/p4-20 wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt und analysiert. ¹H-NMR-Analyse zeigte, dass 11 mmol/l Protocatechusäure extrazellulär angesammelt worden waren. Außer Acetat (δ 1,9, s, 3H) wurden keine anderen Produkte im Überstand der Kultur gefunden.
Beispiel 6
Enzymatische Aktivität des subklonierten aroZ-Genkonstrukts
Das aroZ codierende 3,5 kb-BamHI-Fragment wurde auch in die BamHI-Stelle des Plasmids pSU19 geklont, um die Plasmide pSU1-31 und pSU1-28 herzustellen. Das Plasmid pSU19 enthält das Replikon p15A und das Gen, welches Resistenz gegen Chloramphenicol verleiht. Ein lac-Promotor ist in pSU19 stromauf von der multiplen Klonierungsstelle positioniert. Die einzige Differenz zwischen den Plasmiden pSU1-31 und pSU1-28 ist die Ausrichtung des BamHI-Inserts relativ zum lac-Promotor.
Zur weiteren Bestätigung, dass das 3,5 kb-BamHI-Fragment das aroZ-Gen codiert, wurde die Aktivität der DHS-Dehydratase in Zellextrakten bestimmt. In 2 l-Erlenmeyerkolben wurden je 500 ml LB, das Chloramphenicol (0,02 g/l) enthielt, mit 5 ml von Kulturen von DH5α/pSU1-31 oder DH5α/pSU1-28 geimpft. Die Zellen wurden 12 h bei 37°C unter Rühren (250 min^–1) gezüchtet. Von jedem Stamm wurde eine Kultur in Gegenwart von 0,2 mmol/l Isopropyl- -D- thiogalactosid (IPTG), eine zweite ohne IPTG gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und in 250 ml Puffer A (100 mmol/l Tris HCl, 2,5 mmol/l MgCl₂, pH 7,5) wieder suspendiert. Die Zellen wurden erneut geerntet und dann in 2 ml Puffer A je g Nassgewicht der Zellen wieder suspendiert. Nach Zellaufschluss mit der French Press wurde das Lysat zentrifugiert (35000 g, 30 min, 4°C), um teilchenförmige Bruchstücke zu entfernen. Die Proteinkonzentrationen wurden mit der Farbstoffbindungsmethode von Bradford mittels einer von Bio-Rad gekauften Messlösung bestimmt.
Die DHS-Dehydratase wurde wie von Strøman beschrieben mit folgenden Änderungen bestimmt. Die Messlösung (1 ml) enthielt Tris HCl (100 mmol/l), MgCl₂ (25 mmol/l) und ein Aliquot des Zelllysats. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur inkubiert und die Extinktion bei 290 nm wurde bis zum Erreichen einer stabilen Grundlinie verfolgt. DHS (Endkonzentration 1 mmol/l) wurde zugesetzt und die Reaktion etwa 20 min bei 290 nm verfolgt. Eine Einheit der DHS-Dehydratase-Aktivität wurde definiert als Bildung von 1 μmol Protocatechuat (ε = 3890 l/mol*cm) pro Minute. Die wahrscheinliche Ausrichtung des aroZ-Gens auf dem BamHI-Fragment wurde aufgrund der DHS-Dehydratase-Aktivität (Tabelle 1) bestimmt, die für DH5α/pSU1-31 und DH5α/pSU1-28 in Gegenwart und in Abwesenheit von IPTG erhalten wurden. Die Tatsache, dass DH5α/pSU1-28 zu höherer DHS-Dehydratase-Aktivität führt, zeigt wahrscheinlich, dass das aroZ-Gen in diesem Plasmidkonstrukt sowohl vom vektorcodierten lac-Promotor als auch von seinem nativen K. pneumoniae-Promotor transkribiert wird. Zusatz von IPTG zum Wachstumsmedium ergibt keine erhöhte DHS-Dehydratase-Aktivität; vielleicht, weil der lac-Promotor in DH5α/pSU1-28 nicht in wesentlichem Ausmaß unterdrückt wird.
Tabelle 1: DHS-Dehydratase-Aktivität von aroZ-Subklonen
Beispiel 7
Biokatalytische Umwandlung von D-Glucose in Catechol mittels des Plasmids pSUaroZY157-27
Überstand einer Kultur von AB2834/pKD136/pSUaroZY157-27 wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt und analysiert. Die ¹H-NMR-Analyse des Kulturüberstands von E. coli AB2834/pKD136/pSUaroZY157-27 sammelte nach Versorgung mit 56 mmol/l D-Glucose 16 mmol/l Catechol im Kulturüberstand an.
Beispiel 8
Biokatalytische Umwandlung von D-Glucose in Catechol mittels des Plasmids p2-47
Überstand einer Kultur von AB2834/pKD136/p2-47 wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt und analysiert. Die ¹H-NMR-Analyse des Kulturüberstands von AB2834/pKD136/p2-47 zeigte, dass nach 48 h in Minimalmedium die der Zelle ursprünglich zugeführten 56 mmol/l D-Glucose durch 20 mmol/l Catechol ersetzt worden waren.
Beispiel 9
Biokatalytische Umwandlung von D-Glucose in Catechol mittels der Plasmide pKD8.243A und pKD8.243B
Jedes der Plasmide pKD8.243A und pKD8.243B wurde in AB2834 mit dem Plasmid pKD136 kotransformiert. Bei Züchtung im 1 l-Maßstab unter den in Beispiel 4 beschriebenen ähnlichen Bedingungen synthetisierte AB2834/pKD136/pKD8.243A in 48 h 16 mmol/l Catechol aus 56 mmol/l D-Glucose, während AB2834/pKD136/pKD8.243B 10 mmol/l Catechol synthetisierte. In einigen der Kulturüberstände wurde auch Protocatechusäure (< 4 mmol/l) nachgewiesen, jedoch nicht auf einer zuverlässigen Grundlage und nicht immer am Ende der mikrobiologischen Synthese.

Claims

Verfahren zur Synthese von Catechol aus einer aus Biomasse stammenden Kohlenstoffquelle, die von einer Wirtszelle genutzt werden kann, die einen gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren aufweist, umfassend die Schritte: – Transformation der Wirtszelle mit rekombinanter DNA, welche die Enzyme 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codiert, um die biokatalytische Umwandlung von 3-Dehydroshikimat zu Protocatechuat und Catechol in der Wirtszelle zu verstärken, und – Züchtung der transformierten Wirtszelle in einem Medium, das die von Biomasse stammende Kohlenstoffquelle enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle mit DNA-Sequenzen transformiert ist, welche 3-Dehydrochinatsynthase codieren, um die Expression von 3-Dehydrochinatsynthase in der Wirtszelle zu steigern.
Verfahren zur Herstellung von Catechol, umfassend den Schritt der Züchtung einer Wirtszelle, welche eine Kohlenstoffquelle durch Enzyme im der Wirtszelle endogenen gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren in 3-Dehydroshikimat umwandelt, weiter gekennzeichnet durch die Expression heterologer Gene, welche 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codieren, in einem diese Kohlenstoff quelle enthaltenden Medium.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wirtszelle weiter mit rekombinanter DNA transformiert ist, die Sequenzen umfasst, welche die Enzymspezies Transketolase, 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphatsynthase und 3-Dehydrochinatsynthase codieren.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe mutanter Zelllinien ausgewählt ist, die aus Mutationen besteht, welche die Umwandlung von 3-Dehydroshikimat in Chorismat längs des gemeinsamen Pfads verhindern.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Wirtszelle der E. coli-Stamm AB2834 ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Wirtszelle mit dem Plasmid pKD136 transformiert ist.
Heterologer Transformant von E. coli, gekennzeichnet durch Expression zusätzlicher Strukturgene, welche die Enzymspezies Transketolase, 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphatsynthase und 3-Dehydrochinatsynthase codieren und weiter gekennzeichnet durch die konstitutive Expression von 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codierenden Strukturgenen.
Transformant nach Anspruch 8, wobei die 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codierenden Strukturgene endogen in Klebsiella pneumoniae sind.
Transformant nach Anspruch 8, wobei der E. coli-Stamm aus der Gruppe mutanter Zelllinien ausgewählt ist, die aus Mutationen im gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren besteht, welche die Umwandlung von 3-Dehydroshikimat in Chorismat blockieren.
Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von Catechol, umfassend den Schritt der Züchtung eines heterologen Transformanten von E. coli, der gekennzeichnet ist durch die konstitutive Expression exogener Strukturgene, welche die Enzymspezien Transketolase, 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphatsynthase, 3-Dehydrochinatsynthase, 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codieren, in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Kohlenstoffquelle D-Glucose ist.
Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von Catechol, umfassend den Schritt der Züchtung eines heterologen Transformanten von E. coli, der gekennzeichnet ist durch die konstitutive Expression exogener Strukturgene, welche die Enzymspezies Transketolase, 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphatsynthase (DAHP-Synthase), 3-Dehydrochinatsynthase (DHQ-Synthase) und die in Klebsiella pneumoniae endogenen 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codieren, in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle.
Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von Catechol, umfassend den Schritt der Züchtung einer prokaryotischen, mit Strukturgenen von Klebsiella pneumoniae, welche die Enzymspezies 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase exprimieren, transformierten Zelle, in einem Medium mit einer Kohlenstoffquelle unter Bedingungen, bei denen die Kohlenstoffquelle mit einer Geschwindigkeit von mehr als 0,21 mmol/l*h in Catechol umgewandelt wird.
Heterologer mutanter E. coli-Stamm mit einem endogenen gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren und ausgewählt aus der Gruppe, die aus Stämmen mit Mutationen im gemeinsamen Pfad besteht, welche die Umwandlung von 3-Dehydroshikimat zu Chorismat verhindern, und weiter gekennzeichnet durch die konstitutive Expression von 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codierenden Strukturgenen.
Mutante Zelllinie nach Anspruch 15, wobei die Mutation aroE ist.
Rekombinantes DNA-Konstrukt mit Strukturgenen für 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase.
Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Catechol in einer Wirtszelle, die einen endogenen gemeinsamen Pfad der Biosynthese aromatischer Aminosäuren und eine Mutation in einem der ein Enzym dieses Pfads codierenden Gene aufweist, wobei diese Mutation die Umwandlung von 3-Dehydroshikimat zu Chorismat verhindert und die Wirtszelle weiter gekennzeichnet ist durch die Expression von Strukturgenen, die 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphatsynthase, 3-Dehydrochinatsynthase und Transketolase codieren, gekennzeichnet durch Transformieren der Wirtszelle mit rekombinanter DNA, die konstitutiv exprimierte Gene umfasst, die 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codieren und Züchten der transformierten Wirtszelle in einem Medium, das eine von Biomasse abgeleitete Kohlenstoffquelle enthält.
Heterologer Transformant eines Prokaryoten mit rekombinanten DNA-Sequenzen, die 3-Dehydroshikimatdehydratase und Protocatechuatdecarboxylase codierende Gene exprimieren.