KR100869625B1

KR100869625B1 - Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 ｌ-쓰레오닌의생산 방법

Info

Publication number: KR100869625B1
Application number: KR1020070035699A
Authority: KR
Inventors: 정유미; 양영렬
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2007-04-11
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2008-11-21
Also published as: KR20080092171A

Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌(L-threonine)을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 대사조절분석(metabolic control analysis) 기법을 이용하여 확인된, L-쓰레오닌 중앙대사 경로상의 속도제한단계(rate-limiting step)에 관여하는 효소의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌(L-threonine), 대장균, 중앙대사경로, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 속도제한단계(rate-limiting step)

Description

Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌의 생산 방법 {L-threonine producing microorganism and a process for producinig L-threonine using the same}

도 1은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-gapA의 제작과정을 도시한 것이다.

도 2는 대장균의 중앙대사 경로를 도시한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 또는 식품 첨가제로서 널리 사용되며, 의약용으로서는 수액제 또는 의약품의 합성 원료로 사용되고 있다. L-쓰레오닌은 미생물 발효법으로 제조되며, 이 방법에는 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움(Corynebacterium), 세라티아(Serratia) 속 또는 프로비덴시아(Providencia) 속 미생물의 야생주로부터 유도된 인공변이주 등이 사용되고 있다. 일본 공개특허 평제2-219582호에는 프로비덴시아(Providencia) 속에 속하며 α-아미노-β-히드록시 발레르산, L-에티오닌, 티아이소루이신(thiaisoleucine), 옥시티아민(oxythiamine) 및 설파구아니딘(sulfaguanidine) 내성을 가지며, L-루이신 요구성, L-이소루이신 리키(leaky)형 요구성인 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있으며, 한국 등록특허 제58286호에는 L-메티오닌 유사체에 대해 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티르산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균(Escherichia coli)에 속하는 미생물에 대하여 기술되어 있다. 그러나, 상기 기술들은 인공돌연변이 방법을 통해 무작위로 변형이 일어난 미생물들 중에서 유효한 변이를 갖는 미생물을 선별하므로 변형된 미생물의 특성을 정확히 파악할 수 없을 뿐만 아니라, 미생물의 성장을 저해하는 변이들을 가질 수도 있기 때문에 성장 속도의 저해로 인해 생산성이 감소하는 문제가 있다. 따라서 대사회로 내에서 변형이 필요한 부위를 정확하게 확인할 수 있는 기법의 개발이 필요하게 되었다.

이에 따라, 최근에는 L-쓰레오닌을 생합성하는 대사경로에 관여하는 주요 효소의 반응성을 증가시키는 대사공학적 방법을 통해 재조합 균주를 제조하고, 이로부터 L-쓰레오닌을 대량으로 생산하는 방법이 개발되고 있다. 즉, 유전자 재조합 기술을 이용하여 L-쓰레오닌의 대사경로에 관여하는 효소들의 유전자를 분리하고 이들 유전자를 적당한 벡터에 클로닝한 후, 이 재조합 벡터로 미생물을 형질전환시켜 L-쓰레오닌 생산성을 향상시키는 방법이 개발되고 있다.

한편, 대사공학(metabolic engineering)이란 생물 전반에 대한 학문적 기초를 바탕으로 유전자 재조합 기술과 화학공학의 기술을 접목한 학문으로서, 세포 내(in vitro) 대사시스템의 분석과 새로운 대사회로의 도입, 조절, 제거 등을 통하여 원하는 방향으로 세포 시스템을 유도하는 기술이다. 대사공학적 방법의 일종인 대사회로분석 기법은 미생물 내에서의 효소 반응을 수학적으로 모델링하여 효소의 활성이나 변형에 따른 대사 흐름 또는 대사체의 농도의 영향을 예측하는 방법이다. 최근 대장균의 주요 대사회로에 관한 동역학적 모델들이 발표되었으나(Dynamic modeling of the central carbon metabolism of Escherichia coli, Christophe Chassagnole, Naruemol Noisommit-Rizzi, Joachim W. Schmid, Klaus Mauch, Matthias Reuss, Biotechnology and Bioengineering, Volume 79, Issue 1: 53-73), 이러한 대사회로분석 기법을 이용하여 L-쓰레오닌 생산성이 증가된 미생물의 개발은 아직 이루어지지 않았다.

이에 본 발명자는 L-쓰레오닌 생산성을 증가시키기 위한 연구를 수행한 결과, 대사회로분석 기법을 이용하여 대장균의 중앙대사 경로에서의 반응 속도 제한 단계를 확인할 수 있었고, 확인된 반응 단계에 관여하는 효소의 발현을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산성을 증가시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 L-쓰레오닌의 생합성 경로상의 속도제한 단계에 관여하는 효소의 발현을 증가시킨 L-쓰레오닌 생성 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 L-쓰레오닌 생산 미생물을 배양하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 L-쓰레오닌의 중앙대사 경로상의 속도제한 단계에 관여하는 효소의 발현을 증가시킨 L-쓰레오닌 생성 미생물에 관한 것이다.

본 발명에서는 L-쓰레오닌의 생산 수율이 높은 미생물을 제조하기 위하여 대사조절분석 기법을 이용하여 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 미생물의 중앙대사경로에서 L-쓰레오닌 생산의 속도제한단계를 결정하고, 상기 단계에 관여하는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드로 미생물을 형질전환시켰다.

본 발명에서 활용된 “대사조절분석”기법이란 대사 흐름이 특정 효소의 활성과 대사체 농도에 따라 어떻게 변화하는지를 이해하기 위한 수학적인 모델링 기법을 말한다. 대사조절분석은 대사 시스템의 조절을 모델링하기 위한 방법을 수학적 형태로 제공하며 독립적인 변수(Parameters)가 대사흐름 또는 대사체의 농도(Variables)에 영향을 주는 상대적인 값을 묘사한다. 따라서 수학적 해법에 의하여 대사 흐름에 상대적으로 많은 영향을 주는 인자를 발견하고, 그 인자를 조절함으로써 원하는 생산물로의 대사 흐름을 증가시킬 수 있다. 본 발명에서는, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 미생물의 생합성 효율을 증진시키기 위해 대장균의 중앙대사 경로를 파악하고 각 단계에 관여하는 효소 및 기질의 농도를 조절하면서, 최종 생성물인 L-쓰레오닌의 양에 가장 큰 영향을 미치는 인자를 찾아 이를 조절하여 생산성을 높였다. 즉, L-쓰레오닌 생산에서 중앙대사 경로의 전체 반응 속도를 결정하는 속도제한단계(rate limiting step)를 담당하는 효소를 찾아 그 발현의 증가를 통해 활성을 강화하여 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 미생물을 제조하였다.

본 발명에서 “중앙대사 경로”란 L-쓰레오닌의 생합성 과정 중 특히 글루코 즈가 2분자의 피루베이트로 분해되는 과정인 해당과정(glycolysis)을 주로 의미하며, 본 발명에서 실시한 대장균의 중앙대사 경로를 [도 2]에 나타내었다. 본 발명에서 “속도 제한 단계”란 대사경로의 여러 단계 중에서 전체반응속도를 제한하는, 반응속도가 가장 낮은 단계를 의미한다.

본 발명에서 L-쓰레오닌의 생합성 속도를 제한하는 반응에 관여하는 효소는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), PEP 카르복실라제(PEP carboxylase), 피루베이트 디하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase), 리불로오스 포스페이트 에피머라제 (Ribulose phosphate epimerase), 에놀라제(enolase), 포스포글루코아이소머라제 (phosphoglucoisomerase), 포스포프락토키나제(phosphofructokinase), 트랜스케토라제(transketolase), 포스포글리세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase) 등일 수 있으며, 바람직하게는, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제이다. 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제는 해당과정(glycolysis)에 관여하는 필수 효소로서 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 1,3-비스포스포글리세레이트(1,3-bisphosphoglycerate)로 전환시키며, 생체 내에서 항상 발현된 상태로 있다.

본 발명의 구체적인 양태에서는 상기 효소의 활성을 증가시키기 위하여 상기 효소를 코딩하는 뉴클레오티드를 다복제수의 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제작하였다. 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 벡터는 유전자 재조합시 통상 사용되는 벡터로서 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박 테리오파지를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 에세리키아 (Escherichia) 속의 박테리아에서 자율적으로 증식할 수 있는, 카피 수가 적은 pCL1920 플라미스미드 벡터(Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631)를 사용할 수 있다. 본 발명의 상기 재조합 벡터는 공지된 통상의 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 발현을 위한 프로모터와 터미네이터가 있는 적절한 벡터에 제한효소를 사용하여 상기 대사조절분석에서 확인된 효소의 유전자를 라이게이션시킴으로써 제조할 수 있다. 발현을 위한 프로모터로는 trc, tac, lac 등 이나 대장균 aroF 유전자의 프로모터 등을 사용할 수 있으며, 또한 효과적인 발현을 위하여 터미네이터를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 pCL1920 플라스미드 벡터에 대장균 aroF 유전자의 프로모터 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자 gapA를 삽입한 재조합 벡터 pCL-P_aroF-gapA를 제조하였다(도 1).

본 발명에서는 상기의 재조합 벡터로 L-쓰레오닌 생성용 미생물을 형질전환시켜 본 발명의 미생물을 제조하였다. 본 발명에서 사용할 수 있는 L-쓰레오닌 생성용 미생물은 대장균, 코리네형 세균, 세라티아 속 세균, 프로덴시아 세균 등과 같이 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 어떤 미생물도 가능하며, 바람직하게는 그람음성 박테리아에 속하는 미생물이고, 가장 바람직하게는 에세리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물로서 대장균 TF5015(메치오닌 요구성, 아이소루이신 리키(leaky), α-아미노-β-히드록시 바레릭산 내성, 2-아미노에틸-l-시스테인 내성, l-아제티딘-2-카르복시산 내성)을 사용할 수 있다.

본 발명의 형질전환 미생물은 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오티드로 형질전환된 미생물이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기한 재조합 벡터(pCL-P_aroF-gapA)로 대장균(Escherichia coli) TF5015(Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2003, p. 5442-5451)을 형질전환시켜 대장균 CO01-0021을 제조하였으며, 이를 2007년 4월 2일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism, 이하 “KCCM”으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM 10851P로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 형질전환 미생물을 배양하고, 그 배양물로부터 L-쓰레오닌을 분리하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에서, 상기 미생물의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" by James M.Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물의 배지는 예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology,Washington D.C.,미국, 1981에 개시되어 있다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예로는 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예로는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가된 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억 제할 수 있다.

배양물로부터의 L-쓰레오닌의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 대장균의 중앙대사회로의 대사조절분석 기법을 이용한 L- 쓰레오닌 생합성 경로의 속도제한단계 결정

대장균에서의 중앙대사에 대한 효소 반응의 수학적 모델은 Christophe Chassagnole 등에 의하여 이전에 발표되었다 (Dynamic modeling of the central carbon metabolism of Escherichia coli, Christophe Chassagnole, Naruemol Noisommit-Rizzi, Joachim W. Schmid, Klaus Mauch, Matthias Reuss, Biotechnology and Bioengineering, Volume 79, Issue 1: 53-73). 사용된 모델식은 다음과 같다.

이러한 대장균의 중앙대사경로 모델을 가지고 L-쓰레오닌 생산을 증가시키기 위하여 효소 활성의 증가에 대한 L-쓰레오닌 대사 흐름의 증가량을 계산하였다. 계산 결과, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 증가시킬 경우 L-쓰레오닌 생산을 위한 대사흐름이 가장 크게 증가한다는 결과를 얻었다. 대장균 중앙 대사의 주요 효소의 증폭에 따른 L-쓰레오닌 대사 흐름의 증가량을 상대적으로 비교한 결과는 표1과 같다.

[표 1] 효소 증폭에 따른 대사흐름 증가의 상대량

효소 이름	L-쓰레오닌 대사 흐름 증가량
Glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase	1.23
PEP carboxylase	0.67
Pyruvate dehydeogenase	0.0001
Ribulose phosphate epimerase	0.014
Enolase	0.001
Phosphoglucoisomerase	0.0001
Phosphofructokinase	0.07
Transketolase b	0.0066
Phosphoglycerate kinase	0.001

이에 의해, 대장균의 중앙대사 경로에서 L-쓰레오닌의 생합성 속도를 제한하는 단계는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제에 의한 단계임을 알 수 있었다.

실시예 2 : 글리세르알데하이드 -3- 포스페이트 디하이드로게나제 발현용 재조합 벡터의 제조

대사조절분석 기법을 이용하여 대장균의 L-쓰레오닌 생합성에서의 속도제한단계로 확인된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제의 활성을 증가시키기 위하여, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오티드를 대장균에서 다복제수를 갖는 플라즈미드를 이용하여 과다 발현시키는 방법을 사용하였다.

먼저 발현에 필요한 프로모터를 벡터인 플라즈미드 pCL1920(Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631)에 삽입하였다. 대장균의 염색체에 존재하는 aroF 유전자의 프로모터를 사용하기 위하여 각각 서열번호 1 및 2를 갖는 아래 표 2의 프라이머 1과 2를 제작하였다. 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=95℃, 30초/Annealing=53℃, 30초/Polymerization=72℃, 1분, 30 회)에 의해 약 294 쌍의 aroF 유전자의 프로모터 부분을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 KpnI 과 EcoRV의 제한 효소로 절단하고 같은 제한 효소로 절단된 pCL-플라즈미드를 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 pCL-P_aroF를 제작하였다.

[표 2] 프라이머 1 및 2의 염기서열

프라이머 1	5'-cgg ggt acc tgc tgg tca agg ttg gcg cgt-3'(서열번호 1)
프라이머 2	5'-ccg gat atc gat cct gtt tat gct cgt ttg-3'(서열번호 2)

또한, 대장균 W3110으로부터 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자(gapA)를 클로닝하기 위하여 각각 서열번호 3 및 4를 갖는 표 3과 같은 프라이머를 제작하였다. 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자 gapA(NCBI GI: 16129733)의 염기 서열은 이미 문헌에 보고되어 있다. 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA (Blattner, F. R., Plunkett, G 3^rd, Bloch, C. A., Perna, N. T., Burland, V., Riley. M., Collado-Vides, J., Glasner, J. D., Rode, C. K., Mayhew, G. F., Gregor, J., Davis, N. W., Kirkpatrick, H. A., Goeden, M. A., Rose, D. J., Mau, B., Shao, Y. (1997), The complete genome sequence of Escherichia coli K-12, Science, 277(5331), 1453-74)를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=95℃, 30초/Annealing=53℃, 30초/Polymerization=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 996 염기쌍의 gapA 유전자를 증폭하였다(서열번호 5). 얻어진 DNA 단편을 EcoRV 과 HindIII의 제한 효소로 절단하고, 같은 제한 효소로 절단된 pCL-P_aroF 플라즈미드를 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 도 1과 같은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-gapA를 제조하였다.

[표 3] 프라이머 3 및 4의 염기서열

프라이머 3	5'- GGGGATATCA TGACTATCAA AGTAGGTAT -3' (서열번호 3)
프라이머 4	5'- GGGAAGCTTT TATTTGGAGA TGTGAGCGA -3' (서열번호 4)

실시예 3 : 글리세르알데하이드 -3- 포스페이트 디하이드로게나제가 과발현된 재조합 미생물의 쓰레오닌 생산 농도 비교

본 실시예에서는 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터(pCL-P_aroF-gapA)로 L-쓰레오닌 생성용 대장균 (Escherichia coli) TF5015를 형질전환시켰다. 먼저, TF5015를 LB 배지에서 초기 대수 증식기까지 배양한 후, di-H₂O와 10% 글리세롤로 세척하고 최소 부피의 10% 글리세롤에 현탁하여 형질전환용 세포(electro-competent cell)를 제작하였다. 제작된 상기 형질전환용 세포를 Gene pulser를 이용하여 실시예 2에서 수득한 벡터 pCL-P_aroF-gapA로 형질전환시켰다.

얻어진 형질전환 미생물을 표 4에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지를 이용하여 배양하고, 그로부터 얻어진 쓰레오닌 농도와 모균주인 대장균 TF5015에서 얻어진 쓰레오닌 농도를 비교하였다. 얻어진 L-쓰레오닌 농도는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

[표 4] 플라스크 역가 배지

조성	농도(g/L)
글루코스	70
효모 추출물	2
암모늄 설페이트	28
마그네슘 설페이트	0.5
페러스 설페이트	0.005
망간 설페이트	0.005
L-메티오닌	0.15
칼슘 카르보네이트	30
포타슘 디히드로겐포스페이트	1

표 5에 나타난 바와 같이, 본 실시예에 따라 형질전환된의 L-쓰레오닌 농도가 모균주인 대장균 TF5015에서보다 16% 증가한 것이 확인되었으며, 따라서 형질전환된 미생물을 대장균 CO01-0021균주로 명명하고, 이를 2007년 4월 2일자로 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM 10851P로 기탁하였다.

[표 5] L- 쓰레오닌 농도 비교

균주	L-쓰레오닌(g/L)
TF5015	6.92
CO01-0021	8.00

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 대사조절분석 기법을 이용하여 대장균의 중앙대사 경로에서 L-쓰레오닌 생산 속도를 제한하는 것으로 확인된 반응 단계에 관여하는 효소의 활성을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 미생물을 제조할 수 있으며, 이러한 미생물을 이용함으로써 의약품, 식품 또는 사료의 첨가제로 널리 사용되는 L-쓰레오닌을 보다 효율적으로 얻을 수 있게 되었다.

<110> CJ corporation <120> L-threonine producing microorganism and a process for producing L-threonine using the same <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 cggggtacct gctggtcaag gttggcgcgt 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 ccggatatcg atcctgttta tgctcgtttg 30 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 for gapA <400> 3 ggggatatca tgactatcaa agtaggtat 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer4 for gapA <400> 4 gggaagcttt tatttggaga tgtgagcga 29 <210> 5 <211> 996 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapA <400> 5 atgactatca aagtaggtat caacggtttt ggccgtatcg gtcgcattgt tttccgtgct 60 gctcagaaac gttctgacat cgagatcgtt gcaatcaacg acctgttaga cgctgattac 120 atggcataca tgctgaaata tgactccact cacggccgtt tcgacggtac cgttgaagtg 180 aaagacggtc atctgatcgt taacggtaaa aaaatccgtg ttaccgctga acgtgatccg 240 gctaacctga aatgggacga agttggtgtt gacgttgtcg ctgaagcaac tggtctgttc 300 ctgactgacg aaactgctcg taaacacatc accgctggtg cgaagaaagt ggttatgact 360 ggtccgtcta aagacaacac tccgatgttc gttaaaggcg ctaacttcga caaatatgct 420 ggccaggaca tcgtttccaa cgcttcctgc accaccaact gcctggctcc gctggctaaa 480 gttatcaacg ataacttcgg catcatcgaa ggtctgatga ccaccgttca cgctactacc 540 gctactcaga aaaccgttga tggcccgtct cacaaagact ggcgcggcgg ccgcggcgct 600 tcccagaaca tcatcccgtc ctctaccggt gctgctaaag ctgtaggtaa agtactgcca 660 gaactgaatg gcaaactgac tggtatggcg ttccgcgttc cgaccccgaa cgtatctgta 720 gttgacctga ccgttcgtct ggaaaaagct gcaacttacg agcagatcaa agctgccgtt 780 aaagctgctg ctgaaggcga aatgaaaggc gttctgggct acaccgaaga tgacgtagta 840 tctaccgatt tcaacggcga agtttgcact tccgtgttcg atgctaaagc tggtatcgct 900 ctgaacgaca acttcgtgaa actggtatcc tggtacgaca acgaaaccgg ttactccaac 960 aaagttctgg acctgatcgc tcacatctcc aaataa 996

Claims

글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (gapA)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환되어 L-쓰레오닌이 생산능이 향상됨을 특징으로 하는 대장균 C001-0021 균주 (수탁번호 KCCM 10851P).
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제1항의 대장균을 배양하고 그 배양물로부터 L-쓰레오닌을 분리하는 것을 특징으로 하는, L-쓰레오닌을 생산하는 방법.