KR20050079344A

KR20050079344A - ｇａｌＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 미생물,그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한Ｌ-쓰레오닌의 제조방법

Info

Publication number: KR20050079344A
Application number: KR1020040007529A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 이병춘; 조광명; 김대철; 신용욱; 이진호
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2004-02-05
Filing date: 2004-02-05
Publication date: 2005-08-10
Also published as: PL1561811T3; CN1654634A; BRPI0507347B8; KR100576342B1; BRPI0507347B1; CN100379851C; ES2382473T3; ATE553210T1; BRPI0507347A; US7229794B2; WO2005075625A1; US20050176114A1; EP1561811A1; EP1561811B1

Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌을 생산할 수 있고, galR 유전자가 불활성화된 미생물, 그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 미생물은 L-쓰레오닌을 높은 수율로 생산하는 방법에 사용될 수 있다.

Description

ｇａｌＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 미생물, 그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법{A microorganism producing L-threonine having an inactivated galR gene, method for producing the same and method for producing L-threonine using the microorganism}

본 발명은 galR 유전자가 불활성화된 미생물, 그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. L-쓰레오닌은 발효법으로 제조하는데 보통 대장균, 코리네형 세균, 세라티아 속 세균 및 프로비덴시아 속 균주의 야생주로부터 유도된 인공변이주를 사용하고 있다. 예를 들면, 일본국 공고특허출원 제10037/81호에는 에스케리키아 (Escherichia) 속에 속하며 디아미노피메릭산 및 메티오닌을 요구하며, 그의 생합성계가 쓰레오닌의 피이드백 억제작용(feedback inhibition)을 저지하는 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있다. 일본국 공개특허출원 제224684/83호에는 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 속하며 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 및α-아미노-β-히드록시 발레릭산에 대한 내성을 지니며 L-이소루이신 및 L-라이신 영양요구성 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있다. 한국 공개특허출원 제8022/87호에는 에스케리키아 속에 속하며 디아미노피메릭산, 메티오닌요구성, α-아미노-β-히드록시발레릭산 내성을 지니며 리팜피신, 라이신, 메티오닌, 아스파르트산 및 호모세린 중 최소한 1가지 물질에 대한 내성을 갖거나 또는 저하된 L-쓰레오닌 분해능을 갖는 미생물을 이용한 방법이 기술되어 있다. 일본국 공개특허출원 제219582/90호에는 프로비덴시아 (Providencia) 속에 속하며 α-아미노-β-히드록시 발레릭산, L-에티오닌, 티아이소루이신 (thiaisoleucine), 옥시티아민 (oxythiamine) 및 설파구아니딘 (sulfaguanidine) 내성을 지니며, L-루이신 요구성, L-이소루이신 리키(leaky)형 요구성 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있다.

그러나, 상술한 공지의 방법들은 L-쓰레오닌 생산성이 높지 못하거나 또는 디아미노피메릭산 요구성 또는 이소루이신 요구성과 같은 값비싼 물질들을 첨가해야 하는 단점들이 있다. 즉, 디아미노피메릭산 요구성 균주를 사용할 경우, 디아미노피메릭산을 부발효해야 하므로 원가 부담 요인이 크며, 이소루이신 요구성 균주를 사용할 경우에도 이소루이신을 발효배지에 첨가하여 주어야 하는데, 이 경우 이소루이신의 가격이 고가이므로 원가 상승 요인이 된다.

이러한 문제점을 극복하기 위하여 본 발명자들은 이소루이신 리키(leaky)형 요구성 균주를 사용하여 발효배지 내에 이소루이신을 첨가할 필요가 없으며, 라이신 합성의 중간 매체인 디아미노피메릭산 요구성 균주를 사용하지 않으면서도 종래의 균주들보다 발효법에 의해 고농도의 L-쓰레오닌을 생성할 수 있는 균주로서 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티릭산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 에스케리키아 콜리(대장균)에 속하는 미생물을 개발하고 이러한 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 제조방법을 특허받은 바 있다 (한국 특허공고 제92-8365호).

GalP 단백질은 갈락토즈 및 포도당을 포함한 여러 종의 당을 세포 내부로 수송하는 퍼미아제(permease)인 것으로 알려져 있다(V. Hernandez-Montalvo F. Valle F. Bolivar G. Gosset, Appl Microbiol Biotechnol (2001) 57:186-191). 이러한 galP 유전자는 GalR 단백질에 의해 세포 내에서의 유전자 발현이 억제된다(MARK GEANACOPOULOS AND SANKAR ADHYA, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Jan. 1997, p. 228-234, Vol. 179, No. 1).

본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술에 근거하여, L-쓰레오닌의 생산능이 향상된 균주를 선별하고자 집중적으로 연구를 수행하던 중, 염색체 중의 상기 galR 유전자를 불활성화시킴으로써, L-쓰레오닌의 생합성이 촉진될 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 L-쓰레오닌의 생산능이 향상된 미생물 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 미생물 균주를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 높은 수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 L-쓰레오닌을 생산할 수 있고, galR 유전자가 불활성화된 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 L-쓰레오닌을 생산할 수 있고, galR 유전자 불활성화된 미생물이면 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae) 과에 속하는 미생물이며, 더욱 바람직하게는 에스케리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물이다. 가장 바람직하게는, 대장균 (Escherichia coli) FTR2541 (KCCM-10539), 대장균 (Escherichia coli) FTR2537 (KCCM-10540) 및 대장균 (Escherichia coli) FTR2533 (KCCM-10541)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물이다.

또한, 상기 미생물에는 천연 미생물 뿐만 아니라, L-쓰레오닌 생산용 변이 미생물도 포함할 수 있다. 이러한 변이 미생물의 예에는, L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노부티릭산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균에 속하는 미생물; 내재적 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자와 쓰레오닌 오페론에 함유된 유전자 외에 추가로 1 카피 이상의 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자와 쓰레오닌 오페론에 함유된 유전자 thrA, thrB 및 thrC 가 염색체 DNA 중에 삽입된 변이 미생물; L-쓰레오닌 생합성 중간체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate, OAA)를 포스포에놀 파이루베이트(PEP)로 전환하는데 관여하는 pckA 유전자가 불활성화된 미생물; 상기 pckA 유전자 및 또 다른 L-쓰레오닌 생합성 중간체인 아스파테이트(aspartate, Asp)를 푸마레이트(fumarate)로 전환시키는 aspA 유전자가 불활성화된 변이 미생물; 및 L-쓰레오닌의 생합성에 관여하는 tyrB 유전자의 발현을 억제하는 tyrR 유전자가 불활성화된 미생물을 포함된다. 상기 L-메티오닌 유사체는 예를 들면, D,L-에티오닌, 노르루이신, α-메틸메티오닌 및 L-메티오닌-D,L-설폭시민으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있다. 또한, 상기 L-쓰레오닌 유사체는 예를 들면, α-아미노-β-히드록시 발레릭산 및 D,L-쓰레오닌 히드록사메이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나이상의 화합물일 수 있다. 또한, L-라이신 유사체는 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 및 δ-메틸-L-라이신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나이상의 화합물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 galR 유전자 산물은 갈라토즈를 세포 내부로 전달하는 갈락토즈 퍼미아제(galactose permease)를 코딩하는 galP 유전자의 발현을 억제한다. 대장균 (Escherichia coli)에 있어서, 상기 galR 유전자는 공지되어 있으며, Blattner 등 (Science 277 : 1453-1462 (1997))에 의하여 공개된 대장균의 게놈 서열로부터도 얻을 수 있다 (Accession no. AAC75876). 상기 유전자 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터도 얻을 수 있다. 또한, 상기 galR 유전자에는 유전코드의 축퇴 또는 기능적으로 중성인 돌연변이로 인하여 발생하는 대립유전자(allele)도 포함한다. 본 발명에 있어서, "불활성화"란 활성이 있는 galR 산물이 발현되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, galR 유전자가 불활성화되면 galP 의 발현은 증가하게 된다.

본 발명의 미생물은 L-쓰레오닌 생산할 수 있는 미생물의 염색체에 존재하는 galR 유전자를 불활성화시킴으로써, 제조될 수 있다. 이러한 불활성화 방법에는, 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 galR 유전자가 불활성화된 균주를 선별할 수 있다. 또한, 상기 불활성화 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함된다. 상기 DNA 재조합 기술에는 예를 들면, 상기 galR 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터에는 우성 선별 마커를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 불활성화된 galR 유전자 또는 그의 DNA 단편을 제조하고 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 미생물에 도입시켜 상기 미생물의 염색체 상에 존재하는 galR 유전자와 재조합시키고, galR 유전자가 불활성화된 미생물을 선별하는 것을 특징으로 하는, L-쓰레오닌의 생산용 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 불활성화된 galR 유전자 또는 그의 DNA 단편이란, 숙주 내의 galR 유전자와 서열상동성을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하나, 결실, 치환, 및 역위와 같은 돌연변이가 도입되어 활성이 있는 galR 산물을 발현할 수 없는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 불활성화된 galR 유전자 또는 그의 단편을 숙주세포 내로 도입하는 과정은 예를 들면, 형질전환(transformation), 접합(conjugation), 형질도입(transduction) 또는 전기천공(electroporation)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 불활성화된 galR 유전자 또는 그의 DNA 단편이 형질전환에 의하여 숙주세포내로 도입되는 경우, 불활성화 절차는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 균주의 배양물과 혼합하여 수행할 수 있다. 이 경우, 균주는 천연적으로 DNA 유입에 대해 컴피턴트하여 형질전환할 수 있으나, 사전에 균주를 적절한 방법에 의해 DNA 유입을 위해 컴피턴트하도록 만드는 것이 바람직하다 (LeBlanc 등, Plasmid 28, 130-145, 1992; Pozzi 등, J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996 참조). 상기 불활성화된 galR 유전자 또는 그의 DNA 단편은 게놈 DNA의 절편내에 외래 DNA 조각을 도입하고, 이 서열의 야생형 염색체 카피를 불활성화 상태로 치환시킨다. 한 구체예에서, 상기 불활성화 폴리뉴클레티드 서열은 표적 부위 DNA의 일부분을 포함하는 "테일(tail)"을 5' 및 3' 말단에 포함하는 것이다. 테일은 적어도 50개의 염기쌍 이상이어야 하고, 바람직하게는 효율적인 재조합 및/또는 유전자 전환을 위해 200 내지 500개 염기쌍이어야 한다. 상기 불활성화 폴리뉴클레오티드 서열에는 편의상 선별 마커 예를 들면, 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 표적 DNA가 항생제 내성 유전자에 의해 불활성화되는 경우, 형질전환체의 선별은 적절한 항생물질이 함유된 한천 평판상에서 실시한다. 형질전환에 의하여 숙주세포에 도입된 상기 불활성화 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA 중의 테일 서열과의 상동 재조합에 의하여 야생형 게놈 서열을 불활성화시킬 수 있다. 불활성화 재조합이 이루어졌는지의 여부는 예를 들면 써던 블로팅에 의해 쉽게 확인할 수 있으며, 더욱 편리하게는 PCR에 의해 검증할 수 있다.

본 발명의 방법의 일 구체예에서, 본 발명의 L-쓰레오닌의 생산용 미생물을 제조하는 방법은 다음의 과정을 포함한다.

먼저, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 하여 통상적인 기술을 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 galR 유전자를 증폭한다.

다음으로, 얻어진 galR 유전자를 적합한 플라스미드 또는 벡터내로 클로닝하고, 형성된 재조합 벡터를 형질전환에 의해 대장균과 같은 숙주 세포내로 도입한다. 형질전환체를 배양하고 세포를 분리한 다음, 이들로부터 galR 유전자를 갖는 재조합 벡터를 분리한다. 분리된 재조합 벡터내의 galR 유전자에 항생제 내성 유전자 절편을 삽입하여, galR 유전자가 불활성화된 재조합 벡터를 제작한다. 상기와 같이 제작된 재조합 벡터를 다시 형질전환에 의해 숙주 세포내로 도입하고 배양한다. 얻은 형질전환체로부터 증식된 재조합 벡터를 분리하고 적절한 제한효소의 처리에 의해 galR 유전자가 불활성화된 폴리뉴클레오티드 서열을 얻는다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 균주에 전기천공법과 같은 통상의 기술에 의해 유입시킨 다음, 항생제 내성을 갖는 균주를 선별함으로써 galR 유전자가 불활성화된 균주를 분리한다.

당업자라면, 본 발명의 불활성화 폴리뉴클레오티드 서열을 일반적인 클로닝 방법에 의해 제조할 수 있음을 용이하게 알 수 있다. 상기 제조법에는 예를 들면, galR 유전자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR 증폭 방법이 포함된다. PCR 증폭 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다 (PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis 등, Academic Press (1990) 참조). PCR은 게놈 DNA, 적합한 효소, 프라이머 및 완충액을 포함하고 편리하게는 DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn. USA)에서 실시한다. 양성 PCR 결과는 예를 들면 적절한 크기의 DNA 절편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 검출함으로써 결정한다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명자들은 재조합 플라스미드 pT7blue/galR 및 pT7bluegalR::loxpKAN을 제작하고, 이로부터 불활성화 폴리뉴클레오티드 서열 ΔgalR::loxpKAN을 수득하고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티릭산에 대한 내성을 갖는 대장균 KCCM 10236; pckA 유전자가 불활성화된 대장균 FTR2717; 및 pckA 및 aspA 유전자가 불활성화된 대장균 FTR8625 (KCCM-10544); 및 L-쓰레오닌의 생합성에 관여하는 tyrB 유전자의 발현을 억제하는 tyrR 유전자가 불활성화된 대장균 FTR7624 (KCCM-10538)에 각각 전기천공법으로 유입시켰다. 그 결과, 야생 galR 유전자가 불활성화되어 각 모균주에 비해 고농도의 L-쓰레오닌을 생성하는 신균주 3종을 개발하였다. 이 신균주는 각각 대장균 (Escherichia coli) FTR2541, 대장균 (Escherichia coli) FTR2537 및 대장균 (Escherichia coli) FTR2533으로 명명하였고 부다페스트협약 하의 국제기관인 한국미생물보존센터에 2003년 12월 4일에 기탁하였다(수탁번호 각각, KCCM-10539; KCCM-10540; KCCM-10541).

본 발명의 신균주 대장균 (Escherichia coli) FTR2541은 모균주인 대장균 (Escherichia coli) KCCM 10236으로부터 유도된 것으로, 균주 KCCM 10236은 대장균 TF4076으로부터 유도된 것이다. L-쓰레오닌 생산균주인 TF4076(KFCC10718, 한국 특허공고 제92-8365)는 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체 (예, α-아미노-β-히드록시 발레릭산, AHV)에 대한 내성, 라이신 유사체 (예, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인, AEC)에 대한 내성, 이소루이신 유사체 (예, α-아미노부티릭산) 대한 내성, 메티오닌의 유사체 (예, 에티오닌)에 대한 내성 등의 특성을 가지고 있다. 상기 한국특허의 전체 내용은 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. L-쓰레오닌을 생산하는데 있어 포스포에놀 피루베이트(phosphoenol pyruvate, PEP)는 쓰레오닌의 대사 경로의 중간체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)의 전구체이다. KCCM 10236 균주는 L-쓰레오닌의 생산 균주인 상기 대장균 TF4076의 염색체로부터 중합효소 연쇄반응을 통해 얻은 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈 유전자(phosphoenol pyruvate carboxylase gene, ppc 유전자)와 쓰레오닌 오페론(thr operon)을 다시 모균주인 TF4076의 염색체에 삽입시킴으로써 TF4076의 염색체 DNA 중에 ppc 유전자와 쓰레오닌 오페론의 수를 2개로 증가시켰다. 따라서, KCCM 10236 균주는 PEP로부터 쓰레오닌 생합성의 중간체인 옥살로아세테이트로 전환해 주는 효소인 ppc 유전자의 발현량과 아스파테이트(aspartate)로부터 쓰레오닌을 합성하는 경로 관련 유전자들(thrA : aspartokinase I-homoserine dehydrogenase, thrB : homoserine kinase, thrC : threonine synthase)의 발현량을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산량을 향상시키는 것을 특징으로 한다. 다른 신균주인 대장균 (Escherichia coli) FTR2537은 모균주인 대장균 (Escherichia coli) FTR8625 (KCCM-10544)로부터 유도된 것으로, FTR8625는 KCCM 10236으로부터 유도되었다. KCCM 10236의 염색체 내부에 존재하는 pckA 및 aspA 유전자를 불활성화시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산량을 향상시키는 것을 특징으로 한다. 또 다른 신균주인 대장균 (Escherichia coli) FTR2533은 모균주인 대장균 (Escherichia coli) FTR7624로부터 유도된 것으로, FTR7624는 KCCM 10236으로부터 유도되었다. KCCM 10236의 염색체 내부에 존재하는 tyrR 유전자를 불활성화시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산량을 향상시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 L-쓰레오닌을 생산할 수 있고, galR 유전자가 불활성화된 미생물을 배양하고, 그 배양물로부터 L-쓰레오닌을 분리하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에서, 상기 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다. 다양한 미생물의 배지는 예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981에 개시되어 있다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 배양 기간은 원하는 L-쓰레오닌의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

배양물로부터의 L-쓰레오닌의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 재조합 플라스미드 제작과 이를 이용한 galR 유전자의 불활성화(knock-out)

본 실시예에서는 대장균 (Escherichia coli) 염색체 내의 galR 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성시켰다. 이를 위하여, 상기 galR 유전자의 일부분을 포함하는 벡터를 제조하고, 이를 대장균 숙주 세포에 형질전환한 다음, galR 유전자가 불활성화된 균주를 선별하였다.

먼저, 게노믹-팁 시스템 (Genomic-tip system)(QIAGEN 사)을 이용하여 쓰레오닌 생산 대장균 (Escherichia coli) KCCM 10236 균주로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 이 게놈 DNA를 주형(template)으로 한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 galR 유전자의 ORF(Open Reading Frame)를 포함하는 DNA 절편, 약 850 bp를 얻었다. 사용된 프라이머로서 서열번호 1과 서열번호2의 올리고뉴클레오티드를 사용하였고, 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 60℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.

그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 856 bp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 pT7blue 클로닝 벡터 (Novagen Co. 사)의 EcoR V 부위에 16℃에서 밤새 연결시켰다(도 1). 그 결과 얻어진 재조합 플라스미드 pT7bluegalR을 대장균 NM522에 형질전환시키고, 카베니실린(50 mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 백금이에 묻혀 카베니실린이 든 액체 LB 배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit) (QIAGEN 사)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소 Mlu I로 처리한 후, galR 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다. 확인된 플라스미드 pT7Blue/galR을 제한 효소 Hinc II로 처리한 후, 0.8% 아가로즈 겔에서 약 3.8kb 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하고, 이를 클레노우(Klenow) 효소를 처리하에 평활말단(blunt end)으로 만들었다. 상기 DNA와 플라스미드 pUG6 (U. Guldenre 등, Nucleic Acid Research 24 (13),1996, pp2519-2524)를 제한효소 Hinc II 와 EcoRV 로 처리하여 얻은 loxp 부분을 포함하는 가나마이신 내성 유전자 절편 (약 1.5 kb)을 평활말단 연결시켜 재조합 플라스미드 pT7ΔgalR::loxpKAN (약 5.3kb)을 얻었다(도 2).

이 재조합 플라스미드 pT7ΔgalR::loxpKAN을 대장균 (Escherichia coli) NM522에 형질전환시키고, 카베니실린과 가나마이신(각각 50 mg/L과 50 mg/L)이 포함된 고체 LB 배지에 도말하여 32℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니를 백금이에 묻혀 카베니실린과 가나마이신이 든 액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 미니 프렙 키트(QIAGEN mini prep kit)(QIAGEN 사)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 이 플라스미드 DNA를 주형(template)으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 galR 유전자의 ORF(Open Reading Frame)와 loxpKAN 부위를 포함하는 DNA 절편, 약 2.3kb를 증폭하였다. 사용된 프라이머는 서열번호 1과 서열번호 2의 올리뉴클레오티드이고, 변성 (denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링 (annealing) 단계는 60℃에서 30초, 연장 (extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하였고, 30 회를 수행하였다.

이 DNA 절편 ΔgalR::loxpKAN을 쓰레오닌 생산 균주 (KCCM10236, FTR8625, FTR7624)에 전기천공법 (electroporation)으로 도입하여 가나마이신이 포함된 고체 LB 배지에 도말하여, galR 유전자가 불활성화된 콜로니를 선발하고, 이를 다시 플라스크 배양을 통하여 역가를 확인하였다.

실시예 2 : 선별 균주에 대한 삼각 플라스크에서 쓰레오닌 생산 역가 비교 실험

실시예 1에서 나타낸 바와 같이, 항생제 가나마이신이 함유된 고체배지에 도말하여 선별한 각 균주에 대한 콜로니 30주씩을 선발하여 표 1에 나타낸 쓰레오닌 역가배지를 사용하여 삼각 플라스크에서 쓰레오닌 생산성을 비교하였다.

표 1. 쓰레오닌 역가 배지

조성물	농도(리터당)
포도당	70 g
황산암모늄	28 g
KH₂PO₄	1.0 g
MgSO₄ㆍ7H₂O	0.5 g
FeSO₄ㆍ7H₂O	5 mg
MnSO₄ㆍ8H₂O	5 mg
탄산칼슘	30 g
L-메티오닌	0.15 g
효모엑기스	2 g
pH (7.0)

32℃의 배양기에서 LB 고체배지 중에 밤새 배양한 단일 콜로니를 25 ml의 역가 배지에 1 백금이씩 접종하여 32℃에서 250 rpm으로 42-48시간 동안 배양하였다.

배양물로부터 L-쓰레오닌을 HPLC에 의하여 분석하였다. 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 모 균주인 대장균 KCCM10236 균주는 48 시간 발효시간에 23g/L인 반면, galR 유전자가 불활성화된 재조합 균주 FTR2541 균주는 44 시간의 발효시간에 25g/L의 쓰레오닌을 생산하였다. 또다른, 모균주인 대장균 FTR8625 및 FTR7624는 48 시간 발효시간에 26 g/L의 L-쓰레오닌을 생산한 반면, galR 유전자가 불활성화된 재조합 대장균 균주 FTR2537 및 FTR2533은 각각 44 시간 및 42시간의 발효시간에 28g/L의 수득율을 보였다. 이 결과를 바탕으로 발효시간 및 농도가 모균주 대비 각각 7-9% 정도 향상되었고, 시간당 쓰레오닌 생산량은 18-25% 가량 증가 되었음을 확인 하였다. 이렇게 선발된 재조합 대장균 (Escherichia coli) FTR2541, FTR2537 및 FTR2533 균주를 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2003년 12월 4일에 기탁하였다(수탁번호 각각 KCCM-10539, KCCM-10540, KCCM-10541). 또한, 모균주인 대장균 (Escherichia coli) FTR8625 및 FTR7624 균주를 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2003년 12월 4일에 기탁하였다 (수탁번호 각각 KCCM-10544 및 KCCM-10538).

표 2. 재조합 균주들의 플라스크 역가 시험 결과

균주	KCCM10236	FTR7624(KCCM-10539)	FTR8625 (KCCM-10544)	FTR2537(KCCM-10540)	FTR7624(KCCM-10538)	FTR2533(KCCM-10541)
L-쓰레오닌(g/L)	23	25	26	28	26	28
발효시간(hr)	48	44	48	44	48	42
시간당 생산량(g/L/hr)	0.48	0.57	0.54	0.64	0.54	0.67

본 실시예에 나타낸 바와 같이, galR 유전자의 불활성화에 의하여 미생물의 L-쓰레오닌의 생합성능은 향상된다. 이는 galR 유전자의 불활성화에 의하여 galP 발현의 억제가 해제되어 galB 유전자의 발현이 증가되고, 상기 증가된 GalP 에 의하여 당의 균주 내부로의 전달속도가 증가되어 L-쓰레오닌 생산 균주의 비성장 속도가 증가하기 때문인 것으로 여겨진다. 그러나, 상기 미생물의 생산능 향상에 대한 설명이 이러한 기작에 한정되는 것은 아니다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 galR 유전자가 불활성화된 미생물은 L-쓰레오닌을 미생물 발효에 의하여 생산하는 방법에 이용되어 L-쓰레오닌을 높은 수율로 생산할 수 있다.

본 발명의 상기 미생물을 제조하는 방법에 의하면, L-쓰레오닌을 높은 수율로 생산할 수 있는 미생물을 제조할 수 있다.

본 발명의 L-쓰레오닌 생산방법에 의하면 L-쓰레오닌을 높은 수율로 생산할 수 있다.

도 1은 galR 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pTblue/galR의 작제도이다.

도 2는 재조합 플라스미드 pT7bluegalR::loxpKAN로부터 DNA 절편 ΔgalR::loxpKAN을 얻는 작제도이다.

<110> CJ Corporation <120> A microorganism producing L-threonine having an inactivated galR gene, method for producing the same and method for producing L-threonine using the microorganism <130> PN052460 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctcccgacac gctcaaccca gatt 24 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgcccgccag aaaaagtcag c 21

Claims

L-쓰레오닌을 생산할 수 있고, galR 유전자가 불활성화된 미생물.
제1항에 있어서, 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae) 과에 속하는 미생물.
제2항에 있어서, 대장균인 미생물.
제3항에 있어서, 상기 대장균이 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노부티릭산 내성을 가짐을 특징으로 하는 미생물.
제4항에 있어서, L-메티오닌 유사체가 D,L-에티오닌, 노르루이신, α-메틸메티오닌 또는 L-메티오닌-D,L-설폭시민임을 특징으로 하는 미생물.
제4항에 있어서, L-쓰레오닌 유사체가 α-아미노-β-히드록시 발레릭산 또는

D,L-쓰레오닌 히드록사메이트임을 특징으로 하는 미생물.
제4항에 있어서, L-라이신 유사체가 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 또는

δ-메틸-L-라이신임을 특징으로 하는 미생물.
제1항에 있어서, 염색체 상의 pckA 유전자가 불활성화된 미생물.
제1항에 있어서, 염색체 상의 pckA 및 aspA 유전자가 불활성화된 미생물.
제1항에 있어서, 내재적 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자와 thrA, thrB 및 thrC 유전자 외에 추가로 1 카피 이상의 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자와 thrA, thrB 및 thrC 유전자가 염색체 DNA 중에 삽입된 것을 특징으로 하는 미생물.
제1항에 있어서, 대장균 (Escherichia coli) FTR2541 (KCCM-10539), 대장균 (Escherichia coli) FTR2537 (KCCM-10540) 및 대장균 (Escherichia coli) FTR2533 (KCCM-10541)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물.
불활성화된 galR 유전자 또는 그의 DNA 단편을 제조하고 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 미생물에 도입시켜 상기 미생물의 염색체 상에 존재하는 galR 유전자와 재조합시키고, galR 유전자가 불활성화된 미생물을 선별하는 것을 특징으로 하는, L-쓰레오닌의 생산용 미생물을 제조하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 불활성화된 galR 유전자 또는 그의 DNA 절편이 항생제 마커 (loxpKAN)를 포함한 카세트를 galR 유전자 내부에 삽입하여 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제11항에 따른 미생물을 배양하고, 그 배양물로부터 L-쓰레오닌을 분리하는 것을 특징으로 하는, L-쓰레오닌을 생산하는 방법.