CN1807645A

CN1807645A - 乳链菌肽和蜜蜂肽的融合基因及其构建方法和用途

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Publication number: CN1807645A
Application number: CN 200510062379
Authority: CN
Inventors: 李卫芬; 周绪霞; 马国霞; 王彦波; 陆平; 姚江涛; 胡春霞; 韩森
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2005-12-30
Publication date: 2006-07-26

Abstract

本发明公开了一种乳链菌肽和蜜蜂肽的融合基因，其核苷酸序列是SEQID NO：3；该融合基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：6。本发明还公开了该融合基因的构建方法，以及用此融合基因所制得的融合蛋白，该融合蛋白同时具有G－菌和G⁺菌的抑菌活性，能用于食品防腐。本发明还公开了该融合蛋白的制备方法。

Description

乳链菌肽和蜜蜂肽的融合基因及其构建方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域及蛋白质表达领域，尤其涉及Nisin-Ap融合基因cDNA序列及其构建方法和用途。

背景技术

食品安全一直是食品工业、食品科学家和消费者共同关注的一个话题，并逐渐成为关系我国国计民生的重大问题。据卫生部提供的统计数字，我国最近几年的食品安全问题呈现出上升趋势，食物中毒报告例数、中毒人数和死亡人数都有较大程度的提高，平均每年食物中毒例数至少在20-40万人，而其中一个不可忽视的原因就是食品中病原微生物的污染。

食品在生产、包装、储存、运输和销售等各个环节，都不可避免地会受到环境中微生物的污染。食品源病原微生物感染不仅危及着消费者的健康，而且造成了食品的腐败变质；据估计，全世界每年平均约10％-20％的食品由于腐败而废弃，造成巨大的经济损失。虽然食品在投放市场之前都进行了严格的加工，并确保其卫生指标达到标准；但是在不适当的运输、货架存放等过程中食品都有可能受到致病性微生物的污染。这些致病性微生物在食品中的繁殖，正是导致食品变质和引起消费者感染病原菌而致病的主要原因；这严重制约了中国食品的对外出口贸易。

人们不断尝试用各种方法防止微生物对食品的感染，传统的物理方法是通过如低温冷藏(t)、高温处理(H)、降低水分活度(aw)、酸化(pH)、氧化还原电势(Eh)、腌渍、烟薰、辐照等方法来杀菌或抑菌。但低温、真空的方法对运输、包装的要求比较高，而加热等处理对食品的质地、风味及营养成分都造成了严重破坏。最有效地防腐办法是使用化学的方法，即在食品加工过程中添加防腐剂。

我国目前常用的防腐剂是有机酸及其盐类等化学防腐剂，如：丙酸及其盐类、山梨酸及其盐类、苯甲酸类、对羟基苯甲酸酯类、乳酸和乳酸钠、双乙酸钠、单辛酸甘油酯、脱氢醋酸钠、焦亚硫酸钾等，但它们均有一定的毒性。消费者在食用食品的同时也食用了一定量的防腐剂，会造成危害身体健康甚至引发中毒事件；因此化学防腐剂使用的安全性越来越受到挑战，这就促使人们在研究如何减少防腐剂添加量的同时，将目光更多的投向研制新的生物源食品添加剂。

生物防腐剂，是指从生物体通过生物培养、提取和分离技术获得的具有抑制和杀灭微生物的生物活性物质。其中，微生物型防腐剂是近年来开发的一个热点。目前研究开发的微生物型防腐剂包括由乳酸乳球菌产生的乳链菌肽(Nisin)、由链霉菌产生的纳他霉素(Natamycin，商品名称为霉克)、纳豆菌(Bacillus natto)产生的纳豆以及由微生物发酵而合成的ε-聚赖氨酸(ε-Poly-L-Lysine)，其中研究较多并开发成商品的主要是乳链菌肽。

乳链菌肽(Nisin)，又称乳酸链球菌素、尼生素等，是目前国际上最为看好和应用效果最好的微生物型天然食品防腐剂，它是由乳酸乳球菌某些菌株生长过程中产生的次级代谢产物，对食品传播的病原菌和腐败微生物有强的抑制作用。

早在1928年，Rogers和Whittier就发现乳酸链球菌的代谢产物能够抑制部分革兰氏阳性菌的生长。1944年Mattick和Hirsch发现血清学N群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质，命名为N-inhibitory Substance即N群抑菌物质，简称为Nisin，乳链菌肽。1951年，Hirsch等人应用Nisin到食品保藏中，成功的抑制了由产气梭状芽孢杆菌引起的奶酪腐败，极大改善了奶酪的品质。1953年由英国的阿普林和巴雷特公司首次以商品的形式出售了这种新的防腐剂—乳酸链球菌素。1969年，FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会批准Nisin作为一种推荐使用的高效安全生物型防腐剂应用于食品工业。1988美国食品和药物管理局(FDA)也正式批准将Nisin应用于食品中。我国在GB2760-86中批准Nisin可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品、肉制品中。1994年中科院微生物所和浙江银象制药合作，自行研究和开发了突变菌株并投入生产。迄今为止，Nisin已在全世界约60多个国家和地区被用作食品防腐剂。

Nisin应用前景广阔，但也存在局限性，突出的表现在不能够抑制G-、酵母菌以及霉菌，而且由于Nisin复杂的翻译后加工及其独特的分子结构，单纯对其基因进行改造以扩大其抗菌谱及提高其活性难度较大。

基因融合及其表达技术的发展为扩大Nisin的抗菌谱提供了技术支持，其关键技术为基因重叠延伸技术(splicing by overlap extension，SOE)。SOE可以使多个DNA片段通过具有互补末端的引物延伸融合成单一产物，连接效率高，且不会打乱阅读框，是一项十分有效的基因连接技术。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种含有不同抗菌谱的抗菌肽基因的融合基因，以及用该种融合基因所制备的同时具有G^-菌和G⁺菌抗性的融合蛋白。

本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种乳链菌肽(Nisin)和蜜蜂肽(Apidaecin)的融合基因(即Nisin-Ap融合基因)，其核苷酸序列是SEQ ID NO：3。

本发明还同时提供了上述融合基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：6。

本发明还同时提供了上述融合基因的构建方法，包括以下步骤：

1)、设计扩增乳链菌肽和蜜蜂肽基因片段的PCR引物，

2)、在乳链菌肽下游引物和蜜蜂肽上游引物中分别加上一段柔性的连接肽序列，然后分别通过PCR反应扩增乳链菌肽和蜜蜂肽基因；

3)根据基因重叠延伸技术，以上述两个PCR产物的混合物为模版，以乳链菌肽的上游引物和蜜蜂肽的下游引物为引物进行第二轮PCR，获得融合基因。

然后依次进行了目的片段割胶回收，并插入克隆载体或表达载体、质粒提取等步骤。

本发明还同时提供了依靠上述融合基因所制得的融合蛋白，该融合蛋白同时具有G^-菌和G⁺菌的抑菌活性，能用于食品防腐。

本发明还同时提供了上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)、将SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列插入表达载体，形成融合基因重组表达载体；

2)、将上述融合基因重组表达载体转入表达宿主细胞，形成含融合基因表达载体的阳性细胞；

3)、在适合Nisin-Ap融合蛋白表达的条件下，培养上述步骤中的阳性细胞；

4)、分离出其中Nisin前体序列经正确加工的Nisin-Ap融合蛋白。

本发明的Nisin-Ap融合基因的cDNA序列，同时具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的特征，基因的5’端为SEQ ID NO：1序列，来自于Nisin基因，全长为171bp，其中1-171位是基因开放阅读框，1-3位是起始密码子ATG，无终止密码子。3’端为SEQ ID NO：2序列，来自Apidaecin基因序列，全长为54bp，其中1-54位是基因开放阅读框，52-54位为终止密码子。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为长度和序列不同的连接子序列。

本发明的Nisin-Ap融合基因序列编码的多肽同时具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中的氨基酸序列，同时具有Nisin的G⁺菌抑菌活性和Apidaecin的G^-菌抑菌活性，将在安全、高效、广谱的食品防腐剂的开发中具有重大作用。

本发明的Nisin-Ap融合基因所用的重组克隆载体，含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述的DNA；克隆宿主细胞为上述重组克隆载体转化的原核细胞。

本发明的设计原理如下：由于Nisin存在着不能抑制G^-的缺陷，因此选择对G^-菌具有较强抑制活性的Apidaecin为材料，构建同时具有G^-菌和G⁺菌抑菌活性的融合蛋白，并将其在乳酸乳球菌等表达系统中进行表达，以期获得广谱高效的重组蛋白生产菌株。在完成Nisin和Apidaecin基因克隆和测序基础上，把Nisin和Apidaecin cDNA通过SOE技术进一步连接成融合基因，并在相互间融合具有不同结构的连接子序列，构建成国内外首例融合含有不同抗菌谱的抗菌肽基因的融合基因，该融合基因成功的在乳酸乳球菌等宿主菌中获得表达，融合表达产物为同时具有G^-菌和G⁺菌抗性的融合蛋白。

对本发明的序列表作如下说明：

一、SEQ ID NO：1代表Nisin基因序列：

序列特征如下：长度：171碱基；类型：核酸；链性：双链；拓扑：线性。

分子型：cDNA。

二、SEQ ID NO：2代表Apidaecin基因序列：

序列特征如下：长度：57碱基；类型：核酸；链性：双链；拓扑：线性。

分子型：cDNA。

三、SEQ ID NO：3代表Nisin-AP融合基因序列：

序列特征如下：长度：273碱基；类型：核酸；链性：双链；拓扑：线性。

分子型：cDNA。

四、SEQ ID NO：4代表Nisin编码的氨基酸序列：

序列特征如下：长度：34个氨基酸；类型：氨基酸；拓扑结构：线性，分子内由二硫键形成5个环状结构。

分子型：多肽。

五、SEQ ID NO：5代表Apidaecin编码的氨基酸序列：

序列特征如下：长度：18个氨基酸；类型：氨基酸；拓扑结构；线性。

分子型：多肽。

六、SEQ ID NO：6代表Nisin-AP融合基因编码的氨基酸序列：

序列特征如下：长度：61个氨基酸；类型：氨基酸；拓扑结构：线性。

分子型：多肽。

具体实施方式

1.PCR引物设计

在保留Nisin和Apidaecin基因的功能区域基础上，设计PCR引物，并在两个基因的连接区引入不同的连接肽序列(Linker)。如在本例中，linker连接肽序列中引入肠激酶酶解位点的基因序列，该基因序列为GGAGGTGGATCAGATGACGATGACAAA，其对应的氨基酸序列为GGGSDDDDK。

1.1Nisin引物：

以筛选到的Nisin产生菌为模版，参照Genbank上所登录的Nisin基因，进行同源性分析，根据保守序列设计上下游引物，5Pnis和3Pnis，用于扩增Nisin前体结构基因。在下游引物中引入Xba I酶切位点序列。

上游引物序列如下，引物名称为5Pnis：

5′-CCTATGAGTACAAAAGATTTTAACTTGGA-3′

5′-CGG

GCAGTACAAAAGATTTTAA-3′

Nco I

下游引物序列如下，引物名称为3Pnis：

5′-CCG

FTATTTGCTTACGTGAATACTACAAT-3′

Xba I

1.2Apidaecin引物：

参照活性Apidaecin的基因序列，分别设计两个上下游引物(5AP和3AP)，其中5AP的3′-端与3AP的5′-端有26个碱基重叠(划线部分)，根据双引物重叠延伸法扩增得到Apidaecin基因序列。

上游引物序列如下，名称为5AP：

5′-GATCCTCTAGACGGTAACAACCGCCCGGTT TACATCCCGCAACCG CGCCCGCCGCC-3′

下游引物序列如下：名称为3AP：

5′-CTGCAGGTCGACTTACAGGCGCGG GTGCGGCGGGCGCGGTTGCG GGATGTA-3′

1.3融合基因构建引物：

参照Nisin和Apidaecin序列，在序列中间加入连接子GGGSDDDDKG，设计其基因序列为：

5′-GGAGGTGGATCAGATGACGATGACAAAGGAGGTT CA-3′。

按照连接情况分别设两对引物，第一对引物(5LNIS和3LNIS)，用于克隆Nisin序列和部分连接子序列，第二对引物(5LAP和3LAP)，用于克隆Apidaecin序列和部分连接子序列，其中第一对引物的下游引物(3LNIS)和第二对引物的上游引物(5LAP)部分碱基序列互补，可以用SOE方法连接两个基因，融合基因构建后将在5′和3′分别引入Nco I和Xba I酶切位点序列。

引物及其序列分别如下：

第一对引物：

上游引物序列如下，名称为5LNIS：

5′-CGG

GCAGTACAAAAGATTTTAA-3′

Nco I

下游引物序列如下：名称为3LNIS：

5′-TGAACCTCCTTTGTCATCGTCATCTGATCCACCTCCTTATTTGCTTACGTGAATACTA-3′

第二对引物：

上游引物序列如下，名称为5LAP：

5′-CGATGACAAAGGAGGTTCAGGTAACAACCGCCCGGTTTACATCCC-3′

下游引物序列如下，名称为3LAP：

5′-ATAT

TTACAGGCGCGGGTGC-3′

Xba I

2.PCR扩增

2.1扩增Nisin基因片段：

PCR反应体系：Nisin产生菌基因组DNA 0.5-1.0μl，10×Taq butter 5μl，dNTP(2.5mM)2-4μl，上游引物(5Pnis，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(3Pnis，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)0.2-0.5μl，加ddH₂O至总体积50μl。扩增条件为94℃变性1-2min，55℃复性1-1.5min，72℃延伸1.5-2.0min，30-35个循环后在72℃延伸7-10min。

2.2扩增Apidaecin基因片段：

PCR反应体系：10×Taq butter 5μl，dNTP(2.5Mm)2-4μl，上游引物(5AP，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(3AP，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)0.2-0.5μl，加ddH₂O至总体积50μl。扩增条件为94℃变性1-2min，65℃复性1-1.5min，72℃延伸1.5-2.0min，30-35个循环后在72℃延伸7-10min。

2.3Nisin和Apidaecin的PCR扩增结果

Nisin和Apidaecin的PCR产物长约171和54bp，和目的基因的大小一致。

3.Nisin-Ap融合基因的构建(SOE方法)

先以含Nisin基因的重组质粒为模板，以5LNIS和3LNIS为引物扩增融合基因的5’端，得到Nisin全序列及部分linker序列，PCR产物标记为PCR/5LAN，低熔点凝胶回收PCR/5LAN；PCR扩增条件体系同上，退火温度52℃，35个循环结束后直接结束反应，不进行72℃10分钟加A(腺嘌呤核苷酸)。

以含Apidaecin基因的重组质粒为模板，以5LAP和3LAP为引物扩增融合基因的3’端，得到Apidaecin全序列及部分linker序列，PCR产物标记为PCR/3LAN，低熔点凝胶回收PCR/3LAN；PCR扩增条件同上，退火温度57℃，35个循环结束后直接结束反应，不进行72℃10分钟加A(腺嘌呤核苷酸)。

以PCR/5LAN和PCR/3LAN割胶回收产物为模板，分别以5LNIS和3LAP为引物PCR扩增，反应体系如下(50μl)：PCR反应体系：10×Taq butter 5μl，dNTP(2.5Mm)2-4μl，上游引物(5LNIS 13pmol/μl)1-2μl，下游引物(3LAP13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)0.2-0.5μl，加ddH₂O至总体积50μl。扩增条件为94℃变性1-2min，65℃复性1-1.5min，72℃延伸1.5-2.0min，30-35个循环后在72℃延伸7-10min。

4.融合基因克隆

Nisin-Ap融合基因1μl，pUCm-T Vector 1.0μl，10×连接酶缓冲液1μl，T₄DNA连接酶(1U/μl)1μl，ddH₂O 4μl，总体积10μl。16℃连接过夜，将基因定向插入到质粒pUCm-T中。

5.连接产物转化

连接产物转化、感受态的制备、阳性克隆筛选、质粒DNA的提取均按文献所记载的现有技术进行。融合基因片段与质粒pUCm-T连接并导入宿主菌DH5α后，经氨苄青霉素抗性及α-互补筛选后，筛选阳性重组质粒，pUCm-T/Nisin-Ap。

6.DNA序列分析

用碱法提取质粒，用BigDye terminator v2.0测序试剂盒(EpicentreTeclnologies)对抽提的质粒在全自动测序仪(ABI Prim 377-18，PE公司)进行测序，获得cDNA序列，全长共273bp，详细序列见SEQ ID No：3，其中开放读框位于6-263位核苷酸。在融合基因中，6-179bp来自Nisin基因，序列长为174bp；180-209bp为连接肽的DNA序列，共30bp；210-263来自Apidaecin基因，序列长为54bp。

根据得到的全长cDNA序列推导出融合基因Nisin-Ap的氨基酸序列(开放读框位于6-263bp)，具有起始、终止密码子及正确阅读框架，共编码85个氨基酸残基。考虑Nisin前体序列的翻译后加工后，推导出融合基因共编码61个氨基酸残基，其中，Nisin段的编码序列是第78-179bp，编码34个氨基酸残基；连接肽位置在第180-209bp，编码10个氨基酸残基；Apidaecin段的编码序列是第210-263bp，编码18个氨基酸残基。融合基因对应的氨基酸序列详见SEQ ID No：6。

7.融合基因在乳酸乳球菌中的表达

重组质粒pUCm-T/Nisin-Ap酶切，酶切体系如下：10×M Buffer 2.0μl，10×BSA 2.0μl，Nco I限制性内切酶(10U/μl)1.0μl，Xba I限制性内切酶(10U/μl)1.0μl，pUCm-T/Nisin-Ap重组克隆载体14.0μl，反应液混匀，37℃酶切过夜。之后电泳，割胶回收目的基因。同时表达载体用相同的内切酶酶切，酶切反应体系同上，割胶回收目的片段。

目的基因和表达载体酶切的割胶回收产物连接，连接反应体系如下：载体DNA 4.0μl，目的基因4.0μl，T4DNA连接酶1.0μl，10×T4 DNA连接酶反应缓冲液1.0μl，于12℃连接过夜。连接产物电击转化乳酸乳球菌感受态细胞，筛选重组表达子。

8.融合表达产物纯化及活性检测

将筛选到的乳酸乳球菌重组表达子接种于GM17液体培养基中，30℃静置培养过夜，以3.0％接种量转接于100ml GM17液体培养基中，30℃静置培养过夜，用浓HCl将发酵液pH调至2.0，然后加热煮沸，自来水冷却。6,000rpm，4℃离心20min，收集上清液，平板扩散法分别检测其对一系列G^-菌和G⁺菌的抑菌活性。发酵上清对G⁺指示菌M.leteus和G-指示菌E.coli K88等进行的琼脂扩散抑菌试验，结果都形成了明显的抑菌圈，表明发酵液上清对G⁺菌和G^-菌均有明显的抑菌活性。

将重组表达子的发酵液通过菌体吸附法及凝胶层析进行纯化，纯化产物进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳电泳检测，并用以上相同的方法检测其抑菌活性。结果表明，纯化后的蛋白电泳得到单一的，大小与理论分子量一致的目的条带。活性检测表明，该融合蛋白同时具有对G⁺菌和G^-菌的抑菌活性，说明融合蛋白中的Nisin和Apidaecin部分均具有活性。

9.融合表达产物用作食品防腐剂应用效果研究实例

研究了融合蛋白Nis-AP对苹果汁中主要的G⁺菌、酸土芽孢杆菌和主要的外源G^-菌、大肠杆菌的抑菌活性。

将纯化的Nis-AP蛋白，按照0.01mg/ml的剂量(溶于0.02M的HCl溶液)添加到苹果汁中，作为实验组。在另一份相同的苹果汁中加入相同体积的0.02M的HCl溶液，作为对照组。上述两份苹果汁均于25℃下保存。定期取样，涂布平板，并将平板于37℃保温培养48h，计算菌落数。

结果发现，0.01mg/ml的融合蛋白能够明显抑制酸土芽孢杆菌孢子的生长和大肠杆菌的污染。5天后，实验组的苹果汁中的酸土芽孢杆菌数从起始的5.0×10²个/ml下降到3.0×10¹个/ml以下，而对照组中则达到了3.0×10³个/ml。实验组的苹果汁中检测不到污染的大肠杆菌，而对照组中却明显有污染的大肠杆菌(平均为5.0个/ml)。该实验结果说明：Nis-AP融合蛋白能够成功的抑制苹果汁中的G⁺菌和G^-菌。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

1 ATGAGTACAA AAGATTTTAA CTTGGATTTG GTATCTGTTT CGAAGAAAGA

51 TTCAGGTGCA TCACCACGCA TTACAAGTAT TTCGCTATGT ACACCCGGTT

101 GTAAAACAGG AGCTCTGATG GGTTGTAACA TGAAAACAGC AACTTGTCAT

151 TGTAGTATTC ACGTAAGCAA A

SEQ ID NO：2

1 GGTAACAACC GCCCGGTTTA CATCCCGCAA CCGCGCCCGC CGCACCCGCG

51 CCTGTAA

SEQ ID NO：3

1 CGGCCATGGG CAGTACAAAA GATTTTAACT TGGATTTGGT ATCTGTTTCG

51 AAGAAAGATT CAGGTGCATC ACCACGCATT ACAAGTATTT CGCTATGTAC

101 ACCCGGTTGT AAAACAGGAG CTCTGATGGG TTGTAACATG AAAACAGCAA

151 CTTGTCATTG TAGTATTCAC GTAAGCAAAG GAGGTGGATC AGATGACGAT

201 GACAAAGGTA ACAACCGCCC GGTTTACATC CCGCAACCGC GCCCGCCGCA

251 CCCGCGCCTG TAATCTAGAA TAT

SEQ ID NO：4

1 ITSISLCTPG CKTGALMGCN MKTATCHCSI HVSK

SEQ ID NO：5

1 GNNRPVYIPQ PRPPHPRL

SEQ ID NO：6

1 ITSISLCTPG CKTGALMGCN MKTATCHCSI HVSKGGGSDD DDKGNNRPVY

51 IPQPRPPHPR L

Claims

1、一种乳链菌肽和蜜蜂肽的融合基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：3。

2、如权利要求1所述的融合基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：6。

3、如权利要求1所述的融合基因的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、设计扩增乳链菌肽和蜜蜂肽基因片段的PCR引物；

4、如权利要求1所述的融合基因所制得的融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白同时具有G^-菌和G⁺菌的抑菌活性，能用于食品防腐。

5、如权利要求4所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、将如权利要求1所述的核苷酸序列插入表达载体，形成融合基因重组表达载体；

3)、在适合该融合蛋白表达的条件下，培养上述步骤中的阳性细胞；

4)、分离出其中乳链菌肽前体序列经正确加工的融合蛋白。