CN101096668B - 一种乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种乳链菌肽基因工程菌的构建方法，以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)il1403总DNA为模板，扩增得到编码谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因gadCB。将gadCB基因克隆到表达载体pMG36e中，构建得到重组表达质粒pMG36egad，然后再用重组表达质粒pMG36egad电转化乳链菌肽产生菌Lactococcus lactisATCC 11454，获得本发明的乳链菌肽基因工程菌，将该基因工程菌命名为MELgad。应用SDS-PAGE分析和酶活测定，显示本发明克隆的gadCB基因在基因工程菌中得到组成型和活性表达。测定结果表明本发明克隆的基因工程菌的生物量和乳链菌肽产量比宿主菌分别提高了39％和24％。本发明为乳链菌肽高产基因工程菌的构建开辟了一条新的途径。

Description

一种乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建方法

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种乳链菌肽基因工程菌的构建方法。

背景技术

乳链菌肽(Nisin)亦称为乳酸链球菌素，是由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产生的一种含34个氨基酸的小肽抗菌物质，对许多革兰氏阳性菌，包括引起食品腐败和对人体健康有害的葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)和利斯特氏菌(Listeria)等有强烈抑制作用。1962年日本的Hara证实了乳链菌肽对鼠的半致死量LD50约为7000mg/kg(体重)，与普通食盐的LD50相近，1969年FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会确认Nisin是一种安全、高效的天然食品防腐剂，到目前为止，已被世界50多个国家和地区(包括我国大陆、台湾和香港)广泛应用于肉类、鱼类、牛奶、干酪、蛋类、水果、蔬菜、果汁饮料、啤酒酿造、豆制品等食品的防腐处理，并且随着应用研究的深入，Nisin应用范围目前已扩展到造纸、农业饲料、医学移植、生殖避孕等(张国只，陈林海，王雁萍等.乳链菌肽应用新进展[J]，食品科学，2006，22(5)：102)。Nisin的研究已经经历了半个多世纪，但是在菌种改造方面仍然以传统诱变育种为主，而传统诱变育种需要消耗大量的人力和物力，存在盲目性，工作量大，而且效率低等缺点。在基因工程菌方面报道很少，只有韩国的Cheigh等通过在乳链菌肽产生菌Lactococcus lactis subsp lactisA164中增加nisRK，nisFEG等基因的拷贝数来提高nisin产量。但是现在Nisin的生产水平仍然很低，成本高，远不能满足市场的需求。一个很重要的原因是乳酸乳球菌的能量的低产生和高消耗，导致低生物量和Nisin低产量。乳酸乳球菌不具备完整的三羧酸循环，其能量的产生主要来源于糖酵解途径，即1摩尔葡萄糖净生成2摩尔ATP，并产生大量乳酸，而通过质子泵(H+_ATPase)向胞外运输H+来维持胞内的中性环境需要消耗大量ATP，能量的低产生和高消耗，使得乳酸乳球菌的生物量很低(O’SullivanE，Condon S.Relationship between acid tolerance，cytoplasmic pH，and ATP and H+_ATPase levels inchemostatcultures of Lactococcus lactis[J].Appl Environ Microbiol，1999，65(6)：2287)。而谷氨酸脱羧酶系统是微生物的一种耐酸机制，即谷氨酸通过转运体进入胞内后，在谷氨酸脱羧酶的作用下脱掉一个羧基，生成一个比谷氨酸更偏碱性的Y-氨基丁酸，并消耗一个H⁺，Y-氨基丁酸再通过转运体送出胞外，这导致了胞内胞外pH值，同时上升(Small，P.L.，and S.R.Waterman.Acid stress，anaerobiosis and gadCB：lessons from Lactococcus lactis and Escherichia coli.[J]Trends Microbiol.1998，6：214)。Higuchi et al研究认为谷氨酸脱羧酶连续三个脱羧反应还可以形成产生一个ATP分子所需要的质子势动力，即可以产一个ATP分子(Higuchi T，H Hayashi，and K.Abe.Exchange ofglutamate and gamma-aminobutyrate in a Lactobacillus strain[J].J.Bacteriol.1997，179：3362)。乳酸乳球菌的乳酸亚种虽然有谷氨酸脱羧酶系统，但是这个酶系需要在较酸性环境下才能诱导表达，而起不到节约能量的作用(DE BIASE D，TRAMONTI A，BOSSA F，et al.The response tostationary-phase stress conditions in Escherichia coli：role and regulation of the glutamic aciddecarboxylase system[J].Mol Microbiol，1999，32：1198)

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳链菌肽基因工程菌的构建方法。

本发明所述的乳链菌肽基因工程菌的构建方法，其特征在于以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)il1403总DNA为模板，扩增得到编码谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因gadCB。将gadCB基因克隆到表达载体pMG36e中，然后再用重组表达质粒pMG36egad电转化nisin产生菌Lactococcus lactis ATCC11454，获得本发明的乳链菌肽基因工程菌，将该基因工程菌命名为MELgad。

利用本发明方法所构建的的基因工程菌MELgad做初步发酵性能测试，本发明的基因工程菌MELgad的生物量和乳链菌肽产量比原始菌(宿主菌)分别提高了39％和24％。这为乳链菌肽高产工程菌的构建开辟了一条新的途径。

本发明是这样实现的：

一种乳链菌肽工程菌MELgad的构建方法，按照以下步骤：

(1)、PCR引物设计和扩增根据GeneBank公布的Lactococcus lactis il1403基因组序列，利用Primer premier5.0软件设计如下一对引物：

5′端引物：5′CGCGAGCTCTGATGAATCAAAAAAAAATATCATT 3′，3′端引物：5′ATGCTGCAGTGAATATCGGTTTTTTTAGTGAGTA 3′，在所述引物5′端的下划线部分分别引入Sac I和Pst I酶切位点；

(2)、谷氨酸脱羧酶基因(gadCB)的克隆：通过PCR技术，以Lactococcus lactis il1403总DNA为模板，以步骤(1)所示的引物和LA TaqDNA聚合酶(购自Takara公司)扩增得到编码谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因gadCB。该谷氨酸脱羧酶基因(gadCB)的核苷酸序列具有如序列表SEQ ID NO：1所示的序列。与报道的谷氨酸脱羧酶基因序列是一致的。

(3)、重组表达质粒pMG36egad的构建：

1)在克隆的gadCB基因的两端分别引入引入Sac I和Pst I酶切位点，经纯化后用限制性内切酶Sac

I和Pst I酶切；

2)将从大肠杆菌TG1抽取的表达载体pMG36e用用限制性内切酶Sac I和Pst I酶切；

3)将步骤1)和2)的酶切产物用T₄DNA连接酶连接；

4)用步骤3)的限制性内切酶酶连产物转化大肠杆菌TG1；

5)少量快速提取筛选阳性重组子；

6)对阳性重组子进行验证，

(4)、用重组表达质粒pMG36egad电转化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ATCC 11454)，得到基因工程菌株MELgad候选菌株，和

(5)、对步骤(4)的候选基因工程菌做发酵性能测定，筛选得到基因工程菌MELgad。

上述步骤(2)所述的PCR条件是：在25μL反应体系中，引物浓度为1pmol/μL；dNTP各25pmol/μL，Mg²⁺25pmol/μL，PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃20s，55℃45s，72℃3min，进行25个循环；72℃7min。

上述步骤(3)所述的PCR产物酶切反应体系为：

PCR产物       20ul

H₂O           29ul

Sac I         2.5ul

Pst I         2.5ul

M Buffer      6ul

37℃反应4小时；反应结束后于65℃保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活。

上述步骤(3)所述的表达载体pMG36e的酶切反应体系(60ul)为：

pMG36e       20ul

H₂O          29ul

Sac I        2.5ul

Pst I        2.5ul

M Buffer     6ul

37℃反应4小时；将酶切后的DNA溶液于65℃保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活。

所述的表达载体pMG36e和PCR产物的酶连反应体系为：

PCR产物       5ul

pMG36e        1ul

Buffer        1ul

T₄Ligase      0.5ul

H₂O           2.5ul

4℃过夜反应；反应结束后65℃保温10分钟，以灭活T4DNA连接酶。

酶连产物转化大肠杆菌TG1的方法是：

(1)制备大肠杆菌TG1的感受态细胞：用牙签接一大肠杆菌TG1(张岚岚等，大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素，细胞生物学杂志，2004，26(4)：429-432)单菌落于5ml LB中过夜振荡培养；然后按体积比为1％大肠杆菌菌液转接于5ml LB中，培养至OD600为0.5～0.8左右停止培养；吸取该菌液1.5ml 于Eppendorf管中，将菌液冰浴5min，4℃4000r/min离心4min，倾去上清，用手指轻弹管底使菌体分散在残余的液体中；加入500ul冰冷的0.1M CaCl2，用移液枪轻轻打散菌体，继续冰浴30min，3000r/min离心4min，倾去上清；加入100ul冰冷的0.1M CaCl2，得到用于转化的悬浮菌体，或将该悬浮菌体于-70℃保存备用；

(2)酶连产物转化：每管加入5-10ul酶连产物和大肠杆菌感受态细胞冰浴30min，42℃热激90sec，冰镇1分钟，再加入600ulLB置于37℃振荡培养45min是使其转化，然后涂含有1mg/L红霉素的选择平板。

少量快速提取筛选阳性重组子的方法是：从平板上挑取大量转化子，并将转化子划线扩大培养12h，用接种环挑取一环菌体悬浮于添加葡萄糖50mmol/L，Tris·HCl 25mmol/L和EDTA 10mmol/L 50μl的快检液中，加入25μl 0.3M NaOH 2％碱性十二烷基磺酸钠溶液，立即振荡混合完全，然后打开管盖，在70℃放置15min后，于水浴中冷却至室温，加入10μl体积比为25∶24∶1的酸性苯酚/氯仿/异戊醇.溶液，然后将液体彻底混合均匀，混匀后在12000r/min离心5min，上清液直接进行琼脂糖凝胶电泳检测(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002年版)。结果显示，阳性重组子约占70％。

阳性重组子的验证的方法是：抽取阳性重组子质粒，再用限制性内切酶Sac I和Pst I进行酶切，酶切反应体系为(60ul)：

重组质粒       20ul

H₂O            29ul

Sac I          2.5ul

Pst I          2.5ul

M Buffer       6ul

37℃反应4小时；酶切结束后琼脂糖电泳检测。并将重组质粒送北京奥科生物技术有限公司进行序列测定。

重组表达质粒pMG36egad电转化Lactococcus lactis ATCC 11454的方法是：

(1)Lactococcus lactis ATCC 11454电转化感受态制备：将Lactococcus lactis ATCC 11454单菌落接种于5mL M 17(培养基组成按g/L计：胰蛋白胨50.0，大豆胨50.0，牛肉膏50.0，酵母膏25.0，抗坏血酸5.0，MgSO₄.7H₂O 2.5，磷酸甘油二钠190.0，琼脂15.0％，调pH至6.9)培养基中，30℃静置培养过夜；按培养基体积1％接种量转接过夜培养物到含1％甘氨酸的GSM 17(培养基组成：M 17培养基+1％甘氨酸+17.1％蔗糖)培养基中，30℃静置培养至OD₆₀₀＝0.2-0.5(约需6-8小时)；然后在4℃，5,000rpm离心10min，收集菌体；用等体积冰冷的菌体电转缓冲溶液(蔗糖0.5mol/L，甘油10％(V/V))重悬、洗涤细胞。4℃，5,000rpm离心15min，弃上清。重复上述操作一次；弃上清，吸干液体，菌体悬浮于1/100体积的冰冷菌体电转缓冲溶液(蔗糖0.5mol/L，甘油10％(V/V))，置于冰浴备用。

(2)电击转化：在45uL Lactococcus lactis ATCC 11454电转化感受态细胞中加1-2uL重组表达质粒pMG36egad溶液，混匀后加入预冷的2mm电击杯中；冰浴10min后电击，条件为25u F，10KV/cm；电击后立即加1mL冰冷的GSM17培养基至30℃培养4小时；取电击过的菌液0.1mL涂于加含1ug/ml红霉素选择平板上，30℃培养48小时。

更详细的技术方案如下所述：

乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建：

1.目的基因PCR

以Lactococcus lactis il1403(由法国国家农学研究院的Bolotin教授惠赠)总DNA为模板，用LA Taq DNA聚合酶扩增gadCB基因，5′端引物：5′CGCGAGCTCTGATGAATCAAAAAAAAATATCATT 3′，3′端引物：5′ATGCTGCAGTGAATATCGGTTTTTTTAGTGAGTA 3′，在上述两条引物的两端(即引物的下划线部分)分别引入Sac I和Pst I酶切位点。上述引物由北京奥科生物技术有限公司合成，在25μL反应体系中，上述两条引物的浓度均为1pmol/μL；dNTP各25pmol/μL。PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃20s，55℃45s，72℃3min，进行25个循环；72℃7min。

2.重组质粒和菌株的构建

PCR产物采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，产品编号为AP-GX-50)回收纯化后，用限制酶Sac I和Pst I酶切，克隆入载体pMG36e(荷兰Groningen大学J.Kok博士惠赠)多克隆位点处的限制酶位点Sac I和Pst I，转化大肠杆菌TG1(张岚岚等，大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素，细胞生物学杂志，2004，26(4)：429-432)，然后挑取大肠杆菌TG1转化子，抽取质粒得到gadCB组成型表达质粒pMG36egad，再在表达质粒pMG36egad限制位点Sac I和Pst I处用Sac I及Pst I酶切验证和测序验证。重组质粒pMG36egad电转化Lactococcus lactis ATCC 11454(购自美国菌种保藏中心，保藏编号为ATCC11454)，得到本发明的乳链菌肽基因工程菌，将该菌命名为MELgad。

附图说明

图1：是本发明的乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建过程示意图。

图2：是本发明重组质粒pMG36egad的构建示意图

图3：是本发明克隆的基因工程菌MELgad与原始菌(宿主菌)Lactococcus lactis ATCC 11454发酵液的抑菌圈大小对比图。发酵液都稀释100倍测定。图中代号如下：CK：原始菌(宿主菌)Lactococcuslactis ATCC 11454；1、2、3：本发明的基因工程菌候选菌株；4：本发明的基因工程菌MELgad

图4：是本发明克隆的基因gadCB PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

以Lactococcus lactis il1403总DNA为模板，扩增得到编码谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因gadCB。将gadCB基因克隆到表达载体pMG36e中，然后再用重组表达质粒pMG36egad电转化nisin产生菌Lactococcus lactis ATCC 11454，获得乳链菌肽基因工程菌MELgad。

乳链菌肽基因工程菌MELgad具体构建步骤为：

1、PCR引物设计和扩增根据GeneBank公布的gadCB基因序列(登录号：AE005176)利用Primerpremier5.0软件设计了一对引物：

5′端引物：5′CGCGAGCTCTGATGAATCAAAAAAAAATATCATT 3′，3′端引物：5′ATGCTGCAG TGAATATCGGTTTTTTTAGTGAGTA 3′，在该5′端引物和3′端引物的两端(见引物的下划线部分)分别引入Sac I和Pst I酶切位点。

在25μL反应体系中，上述两条引物浓度均为1pmol/μL；dNTP各25pmol/μL，Mg²⁺25pmol/μL，PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃20s，55℃45s，72℃3min，进行25个循环；72℃7min。

将PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002年版)，结果显示得到一条约3kb的特异片段，与预期扩增的目的片段大小吻合。

2.PCR产物的回收与酶切

PCR产物的回收采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，产品编号为AP-GX-50)。根据扩增gadCB基因所用引物两端的酶切位点Sac I和Pst I，PCR产物用限制酶Sac I和Pst I进行酶切，产生带有单链突出端的DNA片段，为下一步的互补粘性末端连接做准备，具体操作步骤：

(1)酶切反应体系(60ul)，

PCR产物        20ul

H₂O            29ul

Sac I          2.5ul

Pst I          2.5ul

M Buffer       6ul

条件37℃反应4小时；

(2)酶切后的DNA溶液于65℃保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活。

3、表达载体pMG36e的抽提与酶切

表达载体pMG36e用碱裂解法(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002)提取，根据表达载体pMG36e的多克隆位点处及gadCB基因两端所含有的Sac I和Pst I酶切位点，确定酶切反应体系(60ul)为：

pMG36e      20ul

H₂O         29ul

Sac I       2.5ul

Pst I       2.5ul

M Buffer    6ul

条件37℃反应4小时；酶切后的DNA溶液于65℃保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活。

4、PCR产物和表达载体pMG36e的连接

经过相同双酶切并且纯化了PCR产物和表达载体pMG36e的酶连反应体系为：

PCR产物     5ul

pMG36e       1ul

Buffer       1ul

T₄Ligase     0.5ul

H₂O          2.5ul

4℃过夜反应；反应结束后65℃保温10分钟，以灭活T4DNA连接酶。

5、酶连产物转化大肠杆菌TG1

大肠杆菌TG1的感受态制备方法：用牙签接一大肠杆菌TG1(张岚岚等，大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素，细胞生物学杂志，2004，26(4)：429-432)单菌落于5ml LB中过夜振荡培养；然后按1％培养基体积转接于5ml LB中，培养至OD600为0.5～0.8左右停止培养；吸取1.5ml于Eppendorf管中，将菌液冰浴5min，4℃4000r/min离心4min，倾去上清，用手指轻弹管底使菌体分散在残余的液体中；加入500ul冰冷的0.1M CaCl2，用移液枪轻轻打散菌体，继续冰浴30min，3000r/min离心4min，倾去上清；加入100ul冰冷的0.1M CaCl2，悬浮菌体，即可用于转化，或-70℃保存备用。酶连产物转化：转化时每管加入5-10ul酶连产物和大肠杆菌感受态细胞冰30min。42℃热激90sec，冰镇1分钟，再加入600ul LB置于37℃振荡培养45min。涂含有1mg/L红霉素的选择平板。

6、大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取筛选阳性重组子

从平板上挑取大量转化子，并将转化子划线扩大培养12h，用接种环挑取一环菌体悬浮于50μl快检液(葡萄糖50mmol/L，Tris·HCl 25mmol/L，EDTA 10mmol/L)中，加入25μl碱性十二烷基磺酸钠(SDS)溶液(0.3MNaOH 2％SDS)，立即振荡混合完全，然后打开管盖，在70℃放置15min后，于水浴中冷却至室温，加入10μl酸性苯酚/氯仿/异戊醇.(体积比为25∶24∶1).溶液，然后将液体彻底混合均匀，混匀后在12000r/min离心5min，上清液直接进行琼脂糖凝胶电泳检测(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002)。结果显示，阳性重组子约占70％。

7、阳性重组子的双酶切和测序验证

抽取阳性重组子质粒，再用限制酶Sac I和Pst I进行酶切，酶切反应体系为(60ul)：

重组质粒      20ul

H₂O           29ul

Sac I         2.5ul

Pst I         2.5ul

M Buffer      6ul

条件37℃反应4小时；酶切结束后琼脂糖电泳检测。结果显示重组质粒完全正确。然后将重组质粒送北京奥科生物技术有限公司进行序列测定，结果与文献报道序列完全相符。将获得的重组质粒命名为pMG36egad。

8、重组表达质粒pMG36egad电转化Lactococcus lactis ATCC 11454

Lactococcus lactis ATCC 11454电转化感受态制备：接一Lactococcus lactis ATCC 11454单菌落于5mL M 17(g/L：胰蛋白胨50.0，大豆胨50.0，牛肉膏50.0，酵母膏25.0，抗坏血酸5.0，MgSO₄.7H₂O 2.5，磷酸甘油二钠190.0，琼脂15.0，pH 6.9)培养基中，30℃静置培养过夜；按培养基体积1％接种量转接过夜培养物到含1％甘氨酸的GSM 17(M 17+1％甘氨酸+17.1％蔗糖)培养基中，30℃静置培养至OD₆₀₀＝0.2-0.5，约需6-8小时；然后在4℃，5,000rpm离心10min，收集菌体；用等体积冰冷的菌体电转缓冲溶液(蔗糖0.5mol/L，甘油10％(V/V))重悬、洗涤细胞。4℃，5,000rpm离心15min，弃上清。重复上述操作一次；弃上清，吸干液体，菌体悬浮于1/100体积的冰冷菌体电转缓冲溶液(蔗糖0.5mol/L，甘油10％(V/V))，置于冰浴备用。电击转化：在45uL Lactococcuslactis ATCC 11454电转化感受态细胞中加1-2uL重组表达质粒pMG36egad溶液，混匀后加入预冷的2mm电击杯中；冰浴10min后电击，条件为25u F，10KV/cm；电击后立即加1mL冰冷的GSM17培养基至30℃培养4小时；取电击过的菌液0.1mL涂于加含1ug/ml红霉素选择平板上，30℃培养48小时。

9、阳性克隆的筛选与PCR验证

将挑取的Lactococcus lactis ATCC 11454转化子抽取质粒，用限制酶Sac I和Pst I进行酶切验证，再以经过酶切验证后的质粒为模板，以扩增gadCB基因的引物为引物进行PCR验证，PCR反应条件为：在25μL反应体系中，引物浓度皆1pmol/μL；dNTP各25pmol/μL，Mg²⁺25pmol/μL，PCR扩增条件：95℃预变性1min；95℃20s，55℃45s，72℃3min，进行25个循环；72℃7min。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳，结果显示得到一条约3kb的特异片段，与预期扩增的目的片段大小吻合，说明已经成功获得含有重组表达质粒pMG36egad的工程菌，并将该工程菌命名为MELgad。

工程菌MELgad中谷氨酸脱羧酶系的表达分析。

1、SDS-PAGE分析

将活化好的工程菌MELgad和原始菌ATCC11454按培养基体积1％的接种量接种，在5-7小时左右，达到对数期，各取样1.5mL，离心，TE溶液(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM)洗涤两次，再加入100μLTE溶液和20μL10mg/ml的溶菌酶(购自华美生物工程公司)处理1个小时，煮沸3min，离心，取上清即可使用。SDS-PAGE凝胶制备好后点样，每个点5-15μL，然后电泳、染色及脱色(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002)。SDS-PAGE结果表明：谷氨酸脱羧酶系在工程菌MELgad中获得了组成型表达，而Lactococcus lactis ATCC 11454则没有。

2、谷氨酸脱羧酶酶活测定

参照许建军等报道的方法进行谷氨酸脱羧酶活测定(许建军等，比色法快速测定乳酸菌谷氨酸脱羧酶活力及其应用[J]，2004)，从本发明克隆的基因工程菌MEL4gad中提取谷氨酸脱羧酶为实验材料，测定重复三次。结果显示，本发明克隆的基因工程菌的酶活为6.9U/mg，而对照菌(ATCC11454)几乎检测不到酶活，说明本发明克隆的gadCB基因在乳酸乳球菌中得到了活性表达。

本发明的基因工程菌MELgad和原始菌ATCC11454的发酵性能试验

将活化好的本发明的基因工程菌MELgad和原始菌ATCC11454以体积比1％的接种量接入发酵培养基(培养基配方，按g/L：大豆蛋白胨20.0，蔗糖20.0，酵母提取物5.0，谷氨酸钠5.0，Na₂HPO₄·12H₂O 10.0，MgSO₄.7H₂O 0.12，pH 7.0)中，在2L的NBS发酵罐(购自美国NBS公司)中30℃发酵16小时，按照常规方法收集菌体并测定菌体的干重。Nisin效价的测定采用报道的琼脂平板扩散法(参见张国只，琼脂平板扩散法测定乳链菌肽效价的优化，食品科学，2007(3)175-177)进行。结果显示本发明的基因工程菌MELgad和原始菌ATCC11454的菌体干重分别为1.35g/L，0.97g/L；发酵液nisin效价分别为1104U/ml，890IU/ml(见说明书附图3)。基因工程菌MELgad的生物量提高了39％，nisin效价提高了24％，发酵终点pH值MEL4gad为4.7，原始菌ATCC11454为4.2，说明谷氨酸脱羧酶在本发明的基因工程菌中的组成型表达减小了乳酸累积给细胞带来的压力，同时节约了能量，改善了发酵性能，有利于菌体的生长。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种乳链菌肽基因工程菌MELgad的构建方法

<130>

<141>2007-06-06

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2932

<212>DNA

<213>乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1512)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1532)..(2932)

<223>

<400>1

atg aat caa aaa aaa ata tca tta ttc ggt ttt ttt gca tta acc gct    48

Met Asn Gln Lys Lys Ile Ser Leu Phe Gly Phe Phe Ala Leu Thr Ala

1                5                    10                    15

tca atg gtt ttg act gtc tat gag tat cca act ttt gcc acg tca aaa    96

Ser Met Val Leu Thr Val Tyr Glu Tyr Pro Thr Phe Ala Thr Ser Lys

             20                   25                   30

tta cat ttg gtg ttc ttt tta ctt ctc gga gga cta ctc tgg ttt ttg    144

Leu His Leu Val Phe Phe Leu Leu Leu Gly Gly Leu Leu Trp Phe Leu

        35                    40              45

ccc gta gcg ctc tgt gca gca gaa atg gcg acg gtt gaa ggt tgg aaa    192

Pro Val Ala Leu Cys Ala Ala Glu Met Ala Thr Val Glu Gly Trp Lys

    50                   55                   60

aat ggt gga att ttt agt tgg gtg agc caa act tta ggg gag cgc ttt    240

Asn Gly Gly Ile Phe Ser Trp Val Ser Gln Thr Leu Gly Glu Arg Phe

65                   70                   75                    80

ggt ttt gca gcc ata ttt ttt cag tgg ttt caa att aca gtt ggc ttt    288

Gly Phe Ala Ala Ile Phe Phe Gln Trp Phe Gln Ile Thr Val Gly Phe

                 85                   90                   95

gtc act atg atc tat ttc att tta ggg gcc ctc tct tat gtg tta aat       336

Val Thr Met Ile Tyr Phe Ile Leu Gly Ala Leu Ser Tyr Val Leu Asn

             100                  105                  110

ttt cag gca ctt aat aca gat cca ttg att aaa ttt att ggt tta cta       384

Phe Gln Ala Leu Asn Thr Asp Pro Leu Ile Lys Phe Ile Gly Leu Leu

        115                  120                  125

atc att ttt tgg gga ttg aca ttt tct cag tta ggt ggg aca caa aga       432

Ile Ile Phe Trp Gly Leu Thr Phe Ser Gln Leu Gly Gly Thr Gln Arg

    130                  135                  140

act gct aaa ttg gta aaa gct ggt ttt gta gtt ggg ata gtg att cca       480

Thr Ala Lys Leu Val Lys Ala Gly Phe Val Val Gly Ile Val Ile Pro

145                 150                   155                  160

tcg att atc ttg ttt gga tta gct gcg gca tat ttt atc gga ggt aat       528

Ser Ile Ile Leu Phe Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Phe Ile Gly Gly Asn

                 165                  170                 175

cct ata gag ata cca att aat aag cat gct ttt gta cca gat ttt tca       576

Pro Ile Glu Ile Pro Ile Asn Lys His Ala Phe Val Pro Asp Phe Ser

             180                 185                  190

caa gta tca act tta gta gtt ttt gtt tct ttt att ctt gct tat atg       624

Gln Val Ser Thr Leu Val Val Phe Val Ser Phe Ile Leu Ala Tyr Met

         195                  200                 205

ggg gta gaa gct tca gct tcg cac att aat gaa ctt gaa aat cca aag       672

Gly Val Glu Ala Ser Ala Ser His Ile Asn Glu Leu Glu Asn Pro Lys

    210                  215                  220

aga aat tat ccc tta gca atg att tta tta gta ata tta gct att tct       720

Arg Asn Tyr Pro Leu Ala Met Ile Leu Leu Val Ile Leu Ala Ile Ser

225                  230                  235                  240

tta gat gcc ata ggt gga ttt tct gta gca gcg gtt att cct caa aaa       768

Leu Asp Ala Ile Gly Gly Phe Ser Val Ala Ala Val Ile Pro Gln Lys

                 245                  250                  255

gac tta tca tta agt gca ggg gta att caa act ttt caa acg tta atc       816

Asp Leu Ser Leu Ser Ala Gly Val Ile Gln Thr Phe Gln Thr Leu Ile

             260                 265                   270

tta cat ttt aat cat cat ttg gga tgg tta gtt aaa gta att gca cta       864

Leu His Phe Asn His His Leu Gly Trp Leu Val Lys Val Ile Ala Leu

         275                  280                 285

atg att gcc ttt ggg gtt atg gga gaa gtg agt tca tgg gtt gtt ggt       912

Met Ile Ala Phe Gly Val Met Gly Glu Val Ser Ser Trp Val Val Gly

    290                  295                  300

cct tct aga ggg atg ttt gca gca gca caa aga ggc tta tta cca aaa       960

Pro Ser Arg Gly Met Phe Ala Ala Ala Gln Arg Gly Leu Leu Pro Lys

305                 310                   315                   320

ttt tta cgt aaa aca aat acg cat gaa gtc cct gtt cct tta gtt atg      1008

Phe Leu Arg Lys Thr Asn Thr His Glu Val Pro Val Pro Leu Val Met

                  325                 330                 335

att caa gga atc att gtt aca ctt tgg ggc gct gta tta act ttt gga      1056

Ile Gln Gly Ile Ile Val Thr Leu Trp Gly Ala Val Leu Thr Phe Gly

             340                  345                  350

gga gga gga aat aat tta tct ttc tta gtt gcc att tca ctg aca gta      1104

Gly Gly Gly Asn Asn Leu Ser Phe Leu Val Ala Ile Ser Leu Thr Val

        355                   360                 365

gtg att tat ttg gta ggt tat ctc tta ttc ttt att ggt tac ttt gtt      1152

Val Ile Tyr Leu Val Gly Tyr Leu Leu Phe Phe Ile Gly Tyr Phe Val

    370                  375                  380

tta atc tat aaa aaa caa aat tta aag cgc act tat aat gtt cca ggt      1200

Leu Ile Tyr Lys Lys Gln Asn Leu Lys Arg Thr Tyr Asn Val Pro Gly

385                  390                  395                   400

aaa aga gtt gga aaa aca atc att gcg gga att gga ttt tta tta tca      1248

Lys Arg Val Gly Lys Thr Ile Ile Ala Gly Ile Gly Phe Leu Leu Ser

                 405                  410                  415

att ttt gct cta ttt att tcc ttt gtt cct cca gca tca att gcg aaa      1296

Ile Phe Ala Leu Phe Ile Ser Phe Val Pro Pro Ala Ser Ile Ala Lys

             420                  425                 430

aat gag act cat act tac caa atg ata ctt ctt ata agt ttt gtt gtg      1344

Asn Glu Thr His Thr Tyr Gln Met Ile Leu Leu Ile Ser Phe Val Val

        435                   440                 445

act gct atc ttg cca ttt att gtt tat gaa ttg cat gat aaa agg gga      1392

Thr Ala Ile Leu Pro Phe Ile Val Tyr Glu Leu His Asp Lys Arg Gly

    450                  455                  460

cat gat act att gaa gaa cca agg cac ttt aaa gca aga gat gtg aac      1440

His Asp Thr Ile Glu Glu Pro Arg His Phe Lys Ala Arg Asp Val Asn

465                  470          475                           480

ccc gcg att tat cca gca gct cgt ggt gag cat cat att att aaa aaa      1488

Pro Ala Ile Tyr Pro Ala Ala Arg Gly Glu His His Ile Ile Lys Lys

                 485                  490                  495

gaa gaa cat atc tta aaa cat taa aaaattggag gatgtacct atg tta tac     1540

Glu Glu His Ile Leu Lys His                                Met Leu Tyr

             500                                                505

gga aaa gaa aat cgc gat gaa gca gag ttc ttg gaa cca att ttt ggt      1588

Gly Lys Glu Asn Arg Asp Glu Ala Glu Phe Leu Glu Pro Ile Phe Gly

             510                  515                 520

tca gaa agt gaa caa gtg gat ttg cct aaa tat aaa tta gct caa caa      1636

Ser Glu Ser Glu Gln Val Asp Leu Pro Lys Tyr Lys Leu Ala Gln Gln

         525                 530                  535

tca att gaa cct cga gtg gcc tat cag tta gtt caa gat gaa atg tta      1684

Ser Ile Glu Pro Arg Val Ala Tyr Gln Leu Val Gln Asp Glu Met Leu

    540                  545                  550

gat gaa ggg aac gct cgt tta aat tta gcc aca ttc tgt caa act tat      1732

Asp Glu Gly Asn Ala Arg Leu Asn Leu Ala Thr Phe Cys Gln Thr Tyr

555                  560                  565                   570

atg gaa cct gaa gca gtc aaa cta atg agt caa acc ttg gaa aaa aat      1780

Met Glu Pro Glu Ala Val Lys Leu Met Ser Gln Thr Leu Glu Lys Asn

                 575                  580                 585

gca att gat aaa tcg gaa tat cca aga aca act gaa att gag aac cgt      1828

Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Arg Thr Thr Glu Ile Glu Asn Arg

             590                  595                  600

tgc gtc aac atg atc gct gac ctt tgg aat gcg agt gaa aaa gaa aaa      1876

Cys Val Asn Met Ile Ala Asp Leu Trp Asn Ala Ser Glu Lys Glu Lys

        605                  610                  615

ttt atg ggg act tca acg att ggt tct tca gaa gct tgt atg ctt ggt      1924

Phe Met Gly Thr Ser Thr Ile Gly Ser Ser Glu Ala Cys Met Leu Gly

    620                  625                  630

gga atg gcc atg aag ttt tct tgg cgc aag cga gca gaa aaa ttg gga      1972

Gly Met Ala Met Lys Phe Ser Trp Arg Lys Arg Ala Glu Lys Leu Gly

635                  640                  645                  650

tta gat att aat gcg aaa aag cca aac tta gtt att tca tct ggt tat      2020

Leu Asp Ile Asn Ala Lys Lys Pro Asn Leu Val Ile Ser Ser Gly Tyr

                 655                  660                  665

caa gtt tgc tgg gaa aaa ttc tgt att tat tgg gat att gaa atg cga      2068

Gln Val Cys Trp Glu Lys Phe Cys Ile Tyr Trp Asp Ile Glu Met Arg

            670                   675                 680

gaa gtg cca atg gat aaa gaa cat atg tca atc aat ttg gac aag gtg      2116

Glu Val Pro Met Asp Lys Glu His Met Ser Ile Asn Leu Asp Lys Val

        685                  690                  695

atg gat tat gtt gat gag tac acg att ggt gta gtt ggt att atg ggg      2164

Met Asp Tyr Val Asp Glu Tyr Thr Ile Gly Val Val Gly Ile Met Gly

    700                  705                  710

att act tat act ggt cgt tat gat gat atc aaa gct ttg gat aat tta      2212

Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Tyr Asp Asp Ile Lys Ala Leu Asp Asn Leu

715                  720                  725                  730

att gaa gaa tat aat aaa cag aca gac tat aaa gtt tat att cac gta      2260

Ile Glu Glu Tyr Asn Lys Gln Thr Asp Tyr Lys Val Tyr Ile His Val

                 735                  740                  745

gat gct gct tca gga gga ctt tat gct ccc ttt gtt gag cca gaa ctt      2308

Asp Ala Ala Ser Gly Gly Leu Tyr Ala Pro Phe Val Glu Pro Glu Leu

             750                  755                 760

gag tgg gat ttc cgt ttg aaa aat gtc att tca atc aat acc tca ggc      2356

Glu Trp Asp Phe Arg Leu Lys Asn Val Ile Ser Ile Asn Thr Ser Gly

        765                   770                 775

cat aaa tat ggt tta gtt tat cct ggt gta ggt tgg gtt ttg tgg cgt      2404

His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Val Gly Trp Val Leu Trp Arg

    780                 785                   790

gac aaa aaa tat tta cca gaa gaa tta att ttt aaa gta agt tat ctt      2452

Asp Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Glu Leu Ile Phe Lys Val Ser Tyr Leu

795                  800                  805                  810

gga gga gaa cta cca acg atg gcc att aat ttt tct cat agt gcc tct      2500

Gly Gly Glu Leu Pro Thr Met Ala Ile Asn Phe Ser His Ser Ala Ser

                 815                  820                 825

caa tta att ggt caa tat tat aat ttt gta cgt tat gga ttt gat gga      2548

Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Tyr Asn Phe ValArg Tyr Gly Phe Asp Gly

             830                  835                840

tat aaa gct att cat gag aga aca cat aaa gta gcc atg ttt tta gca      2596

Tyr Lys Ala Ile His Glu Arg Thr His Lys Val Ala Met Phe Leu Ala

         845                  850                 855

aaa gaa att gaa aaa act gga atg ttt gaa att atg aac gat ggg tca      2644

Lys Glu Ile Glu Lys Thr Gly Met Phe Glu Ile Met Asn Asp Gly Ser

    860                  865                  870

caa ttg cca att gtc tgc tat aaa tta aaa gaa gat tca aat cga ggt      2692

Gln Leu Pro Ile ValCys Tyr Lys Leu Lys Glu Asp Ser Asn Arg Gly

875                     880              885                   890

tgg aat ctt tat gat ttg gcg gac cgt tta tta atg aag gga tgg caa      2740

Trp Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Met Lys Gly Trp Gln

                 895                  900                  905

gtg cct gct tat cca ctt ccc aaa aat ttg gaa aat gaa atc att caa      2788

Val Pro Ala Tyr Pro Leu Pro Lys Asn Leu Glu Asn Glu Ile Ile Gln

             910                  915                 920

cgt tta gtg att cga gca gat ttt ggg atg aat atg gca ttt aac tat    2836

Arg Leu Val Ile Arg Ala Asp Phe Gly Met Asn Met Ala Phe Asn Tyr

        925                  930                  935

gtt caa gat atg caa gaa gca att gag gct tta aat aag gct cat att    2884

Val Gln Asp Met Gln Glu Ala Ile Glu Ala Leu Asn Lys Ala His Ile

    940                  945                  950

cta tat cat gaa gag cct gaa aat aaa aca tat gga ttt act cac taa    2932

Leu Tyr His Glu Glu Pro Glu Asn Lys Thr Tyr Gly Phe Thr His

955                  960                  965

<210>2

<211>503

<212>PRT

<213>乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)

<400>2

Met Asn Gln Lys Lys Ile Ser Leu Phe Gly Phe Phe Ala Leu Thr Ala

1                5                    10                   15

Ser Met Val Leu Thr Val Tyr Glu Tyr Pro Thr Phe Ala Thr Ser Lys

             20                   25                  30

Leu His Leu Val Phe Phe Leu Leu Leu Gly Gly Leu Leu Trp Phe Leu

        35                   40                   45

Pro Val Ala Leu Cys Ala Ala Glu Met Ala Thr Val Glu Gly Trp Lys

    50                   55                   60

Asn Gly Gly Ile Phe Ser Trp Val Ser Gln Thr Leu Gly Glu Arg Phe

65                   70                   75                    80

Gly Phe Ala Ala Ile Phe Phe Gln Trp Phe Gln Ile Thr Val Gly Phe

                 85                   90                   95

Val Thr Met Ile Tyr Phe Ile Leu Gly Ala Leu Ser Tyr Val Leu Asn

            100                   105                  110

Phe Gln Ala Leu Asn Thr Asp Pro Leu Ile Lys Phe Ile Gly Leu Leu

         115                 120                  125

Ile Ile Phe Trp Gly Leu Thr Phe Ser Gln Leu Gly Gly Thr Gln Arg

    130                  135                  140

Thr Ala Lys Leu Val Lys Ala Gly Phe Val Val Gly Ile Val Ile Pro

145                  150                  155                   160

Ser Ile Ile Leu Phe Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Phe Ile Gly Gly Asn

                 165                  170                 175

Pro Ile Glu Ile Pro Ile Asn Lys His Ala Phe Val Pro Asp Phe Ser

             180                  185                 190

Gln Val Ser Thr Leu Val Val Phe Val Ser PheIle Leu Ala Tyr Met

        195                   200                  205

Gly Val Glu Ala Ser Ala Ser His Ile Asn Glu Leu Glu Asn Pro Lys

    210                  215                  220

Arg Asn Tyr Pro Leu Ala Met Ile Leu Leu Val Ile Leu Ala Ile Ser

225                  230                  235                  240

Leu Asp Ala Ile Gly Gly Phe Ser Val Ala Ala Val Ile Pro Gln Lys

                 245                  250                  255

Asp Leu Ser Leu Ser Ala Gly Val Ile Gln Thr Phe Gln Thr Leu Ile

             260                  265                  270

Leu His Phe Asn His His Leu Gly Trp Leu Val Lys Val Ile Ala Leu

        275                  280                   285

Met Ile Ala Phe Gly Val Met Gly Glu Val Ser Ser Trp Val Val Gly

    290                  295              300

Pro Ser Arg Gly Met Phe Ala Ala Ala Gln Arg Gly Leu Leu Pro Lys

305                  310                  315                  320

Phe Leu Arg Lys Thr Asn Thr His Glu Val Pro Val Pro Leu Val Met

                 325                  330                  335

Ile Gln Gly Ile Ile ValThr Leu Trp Gly Ala Val Leu Thr Phe Gly

             340                 345                  350

Gly Gly Gly Asn Asn Leu Ser Phe Leu Val Ala Ile Ser Leu Thr Val

        355                  360                   365

Val Ile Tyr Leu Val Gly Tyr Leu Leu Phe Phe Ile Gly Tyr Phe Val

    370                  375                  380

Leu Ile Tyr Lys Lys Gln Asn Leu Lys Arg Thr Tyr Asn Val Pro Gly

385                  390                  395                  400

Lys Arg ValGly Lys Thr Ile Ile Ala Gly Ile Gly Phe Leu Leu Ser

                405                  410                  415

Ile Phe Ala Leu Phe Ile Ser Phe Val Pro Pro Ala Ser Ile Ala Lys

            420                   425                  430

Asn Glu Thr His Thr Tyr Gln Met Ile Leu Leu Ile Ser Phe Val Val

        435                  440                  445

Thr Ala Ile Leu Pro Phe Ile Val Tyr Glu Leu His Asp Lys Arg Gly

    450                  455                  460

His Asp Thr Ile Glu Glu Pro Arg His Phe Lys Ala Arg Asp Val Asn

465                  470                  475                  480

Pro Ala Ile Tyr Pro Ala Ala Arg Gly Glu His His Ile Ile Lys Lys

                 485                  490                  495

Glu Glu His Ile Leu Lys His

             500

<210>3

<211>466

<212>PRT

<213>乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)

<400>3

Met Leu Tyr Gly Lys Glu Asn Arg Asp Glu Ala Glu Phe Leu Glu Pro

1                5                    10                   15

Ile Phe Gly Ser Glu Ser Glu Gln Val Asp Leu Pro Lys Tyr Lys Leu

             20                   25                   30

Ala Gln Gln Ser Ile Glu Pro Arg Val Ala Tyr Gln Leu Val Gln Asp

        35                   40                    45

Glu Met Leu Asp Glu Gly Asn Ala Arg Leu Asn Leu Ala Thr Phe Cys

    50                   55                   60

Gln Thr Tyr Met Glu Pro Glu Ala Val Lys Leu Met Ser Gln Thr Leu

65                   70                   75                    80

Glu Lys Asn Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Arg Thr Thr Glu Ile

                 85                   90                   95

Glu Asn Arg Cys Val Asn Met Ile Ala Asp Leu Trp Asn Ala Ser Glu

             100                  105                  110

Lys Glu Lys Phe Met Gly Thr Ser Thr Ile Gly Ser Ser Glu Ala Cys

        115                  120                  125

Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Phe Ser Trp Arg Lys Arg Ala Glu

    130                  135                  140

Lys Leu Gly Leu Asp Ile Asn Ala Lys Lys Pro Asn Leu Val Ile Ser

145                  150                  155                  160

Ser Gly Tyr Gln Val Cys Trp Glu Lys Phe Cys Ile Tyr Trp Asp Ile

                 165                  170                  175

Glu Met Arg Glu Val Pro Met Asp Lys Glu His Met Ser Ile Asn Leu

             180                  185                  190

Asp Lys Val Met Asp Tyr Val Asp Glu Tyr Thr Ile Gly Val Val Gly

         195                  200                 205

Ile Met Gly Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Tyr Asp Asp Ile Lys Ala Leu

    210                  215                  220

Asp Asn Leu Ile Glu Glu Tyr Asn Lys Gln Thr Asp Tyr Lys Val Tyr

225                  230                  235                  240

Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Leu Tyr Ala Pro Phe Val Glu

                 245                  250                  255

Pro Glu Leu Glu Trp Asp Phe Arg Leu Lys Asn Val Ile Ser Ile Asn

             260                  265                  270

Thr Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Val Gly Trp Val

        275                  280                   285

Leu Trp Arg Asp Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Glu Leu Ile Phe Lys Val

    290              295                      300

Ser Tyr Leu Gly Gly Glu Leu Pro Thr Met Ala Ile Asn Phe Ser His

305                  310                  315                  320

Ser Ala Ser Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Tyr Asn Phe Val Arg Tyr Gly

                 325                  330                  335

Phe Asp Gly Tyr Lys Ala Ile His Glu Arg Thr His Lys Val Ala Met

             340                  345                  350

Phe Leu Ala Lys Glu Ile Glu Lys Thr Gly Met Phe Glu Ile Met Asn

        355                   360                 365

Asp Gly Ser Gln Leu Pro Ile Val Cys Tyr Lys Leu Lys Glu Asp Ser

    370                  375                  380

Asn Arg Gly Trp Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Met Lys

385                  390                  395                  400

Gly Trp Gln Val Pro Ala Tyr Pro Leu Pro Lys Asn Leu Glu Asn Glu

                 405                  410                  415

Ile Ile Gln Arg Leu Val Ile Arg Ala Asp Phe Gly Met Asn Met Ala

             420                  425                  430

Phe Asn Tyr Val Gln Asp Met Gln Glu Ala Ile Glu Ala Leu Asn Lys

        435                  440                   445

Ala His Ile Leu Tyr His Glu Glu Pro Glu Asn Lys Thr Tyr Gly Phe

    450                  455                  460

Thr His

465

Claims (8)

1.一种乳链菌肽基因工程菌的构建方法，其特征是按以下步骤：

(1)PCR引物设计和扩增：根据GeneBank公布的Lactococcus lactis il1403基因组序列，利用Primer premier5.0软件设计如下一对引物：

5’端引物：5’CGCGAGCTCTGATGAATCAAAAAAAAATATCATT 3’，3’端引物：5’ATGCTGCAGTGAATATCGGTTTTTTTAGTGAGTA 3’，在所述引物5’端的下划线部分分别引入Sac I和Pst I酶切位点；

(2)谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因gadCB的克隆：通过PCR方法，以Lactococcuslactis il1403总DNA为模板，以步骤(1)所示的引物和LA TaqDNA聚合酶扩增得到谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因gadCB；

(3)重组表达质粒pMG36egad的构建：

1)在克隆的gadCB基因的两端分别引入Sac I和Pst I酶切位点，经纯化后用限制性内切酶Sac I和Pst I酶切；

2)将从大肠杆菌TG1抽取的表达载体pMG36e用限制性内切酶Sac I和Pst I酶切，所述表达载体pMG36e的60uL酶切反应体系为：

pMG36e   20uL

H₂O      29uL

Sac I    2.5uL

Pst I    2.5uL

M缓冲液  6uL

37℃反应4小时；将酶切后的DNA溶液于65℃保温20分钟，使内切酶Sac I和Pst I失活；

3)将步骤1)和2)的酶切产物用T4DNA连接酶连接；

4)用步骤3)的T4DNA连接酶酶连产物转化大肠杆菌TG1；

5)少量快速提取筛选阳性重组子；

6)对阳性重组子进行验证；

(4)用重组表达质粒pMG36egad电转化Lactococcus lactis ATCC 11454，得到基因工程菌MELgad候选菌株；

(5)对步骤(4)的候选菌株做发酵性能测定，筛选得到基因工程菌MELgad。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的谷氨酸脱羧酶和谷氨酸转运体蛋白的基因gadCB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR条件是：在25uL反应体系中，引物浓度为1pmol/uL，dNTP各25pmol/uL，Mg²⁺25pmol/uL，PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃20S，55℃45S，72℃3min，进行25个循环；72℃7min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的表达载体pMG36e和PCR产物的酶连反应体系为：

PCR产物      5uL

pMG36e       1uL

缓冲液       1uL

T₄连接酶     0.5uL

H₂O          2.5uL

4℃反应过夜；反应结束后于65℃保温10分钟，以灭活T₄DNA连接酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的酶连产物转化大肠杆菌TG1的方法是：

(1)制备大肠杆菌TG1的感受态细胞：用牙签接一大肠杆菌TG1单菌落于5mL LB中过夜振荡培养；然后按体积比为1％大肠杆菌菌液转接于5mL LB中，培养至OD600为0.5～0.8停止培养；吸取该菌液1.5ml于Eppendorf管中，将菌液冰浴5min，4℃4000rpm离心4min，倾去上清，用手指轻弹管底使菌体分散在残余的液体中；加入500uL冰冷的0.1M CaCl₂，用移液枪轻轻打散菌体，继续冰浴30min，3000rpm离心4min，倾去上清；加入100ul冰冷的0.1M CaCl₂，得到用于转化的悬浮菌体，或将该悬浮菌体于-70℃保存备用；

(2)酶连产物转化：每管加入5～10uL酶连产物和大肠杆菌感受态细胞冰浴30min，42℃热激90sec，冰镇1min，再加入600uL LB置于37℃振荡培养45min使其转化，然后涂含有1mg/L红霉素的选择平板。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)所述的少量快速提取筛选阳性重组子的方法是：从平板上挑取大量转化子，将转化子划线扩大培养12h，用接种环挑取一环菌体悬浮于添加葡萄糖50mmol/L，Tris·HCl25mmol/L和EDTA 10mmol/L50uL的快检液中，加入25uL 0.3M NaOH 2％碱性十二烷基磺酸钠溶液，立即振荡混合完全，然后打开管盖，在70℃放置15min后，于水浴中冷却至室温，加入10uL体积比为25∶24∶1的酸性苯酚/氯仿/异戊醇溶液，然后将溶液彻底混匀，混匀后在12000rpm离心5min，取上清液直接进行琼脂糖凝胶电泳检测。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的阳性重组子的验证的方法是：抽取阳性重组子质粒，再用限制性内切酶Sac I和Pst I进行酶切，60uL的酶切反应体系为：

重组质粒   20uL

H₂O        29uL

Sac I      2.5uL

Pst I      2.5uL

M缓冲液    6uL

37℃反应4h；酶切结束后用琼脂糖电泳检测，并将重组质粒测序。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的重组表达质粒pMG36egad电转化Lactococcus lactis ATCC 11454的方法是：

(1)Lactococcus lactis ATCC 11454电转化感受态制备：将Lactococcus lactis ATCC 11454单菌落接种于添加有5mL M 17培养基中，30℃静置培养过夜；按培养基体积1％接种量转接过夜培养物到含1％甘氨酸的GSM 17培养基中，30℃静置培养至OD600为0.2～0.5，然后在4℃，5000rpm离心10min，收集菌体，用等体积冰冷的菌体电转缓冲溶液重悬、洗涤细胞，4℃，5000rpm离心15min，弃上清，重复上述操作一次；弃上清，吸干液体，将菌体按V/V悬浮于1/100体积的冰冷菌体电转缓冲溶液，置于冰浴备用；

(2)电击转化：在45uL Lactococcus lactis ATCC 11454电转化感受态细胞中加1～2uL重组表达质粒pMG36egad溶液，混匀后加入预冷的2mm电击杯中；冰浴10min后用25uF，10KV/cm电击，电击后立即加入1mL冰冷的GSM 17培养基至30℃培养4h，取电击过的菌液0.1mL涂于含1ug/mL红霉素选择平板上，30℃培养48h；

其中所述的培养基按照下列步骤配制：

M 17培养基：按g/L计，胰蛋白胨50.0g/L，大豆胨50.0g/L，牛肉膏50.0g/L，酵母膏25.0g/L，抗坏血酸5.0g/L，MgSO₄·7H₂O 2.5g/L，磷酸甘油二钠190.0g/L，琼脂15.0％，调pH至6.9；

GSM 17培养基：M 17培养基+1％甘氨酸+17.1％蔗糖；

缓冲溶液配制：按V/V计，蔗糖0.5mol/L+甘油10％。

Images