KR101489723B1 - 전기천공법을 이용한 프로피오니박테리움 아크네스의형질전환 조건의 최적화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전기천공법(electroporation)을 이용한 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P. acnes)의 형질전환 조건의 최적화에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 전기천공법의 조건인 플라스미드(plasmid) DNA의 숙주 균주의 종류, 반응능세포(competent cell)의 배양 온도, 전기충격 완충용액(electroporation buffer, EPB)의 조성, 전기장의 세기 및 충격 시간을 설정하여 프로피오니박테리움 아크네스를 대상으로 형질전환시 고효율로 형질전환을 수행할 수 있는 방법에 관한 것이다. 프로피오니박테리움 아크네스의 고효율 형질전환 방법은 특정 유전자의 녹-아웃(knock-out)을 비롯한 유전자 조작에 유용하게 이용될 수 있다.
프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P. acnes), 전기천공법(electroporation), 형질전환
Description
본 발명은 전기천공법(electroporation)을 이용한 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P. acnes)의 형질전환 조건의 최적화에 관한 것으로, 보다 상세하게는 프로피오니박테리움 아크네스를 대상으로 형질전환시 최적의 전기천공법의 조건을 설정하여 고효율로 형질전환을 수행할 수 있는 방법에 관한 것이다.
프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)는 일반적인 그람 양성 세균이며 포자를 형성하지 않는 막대 모양의 미호기성 세균이다. 보통 프로피오니박테리움 아크네스는 전형적인 프로피오니박테리아(propionibacteria) 그룹과 피부질환을 일으키는 그룹으로 분류된다. 전형적인 프로피오니박테리아는 유제품 제조와 비타민 B12, 테트라 피롤(tetra pyrolle) 화합물 및 프로피온산 생산에 사용된다(Kiatpapan, P., Murooka, Y., J. Biosci . Bioeng . 93, 1-8, 2002). 피부질환과 관련된 그룹에는 프로피오니박테리움 아크네스, 프로피오니박테리움 그래눌로즘(Propionibacterium granulosum) 및 프로피오니박테리움 프로피오니쿰(Propionibacterium propionicum)이 포함된다. 이 중에서, 프로피오니박테리움 아크네스는 여드름과 만성 안내염 및 포도막염과 같은 질병을 유발한다(Csukas, Z., et al., Microbial . Pathog . 36, 171-174, 2004). 그 중 여드름은 가장 일반적인 피부질환이다.
전형적인 프로피오니박테리아의 경우, 형질전환, 셔틀벡터 시스템(shuttle vector system) 및 고유 플라스미드(plasmid)의 서열 분석과 같은 유전적 도구를 통해 이미 많은 연구가 이루어졌다(Kiatpapan, P., Murooka, Y., J. Biosci . Bioeng . 93, 1-8, 2002; Jore et al., . App . Environ . Microbiol . 67, 499-503, 2001). 반면 피부질환 그룹 중에서 하나인 프로피오니박테리움 아크네스의 경우에는 최근에 와서 열충격 단백질(heat shock protein)인 GroE1 및 DnaK가 클로닝 되었다(Farrar et al., . FEMS Microbiol . Lett. 191, 183-186, 2000). 최근에는 프로피오니박테리움 아크네스의 완벽한 유전체 서열이 발표되었다(Brulggemann et al., Science 305, 671-673, 2004). 프로피오니박테리움 아크네스와 피부질환 사이의 명확한 연관성은 아직 증명되지 않았지만, 몇 가지 가설이 제안되어 오고 있다(Brulggemann H., Semin . Cutan . Med . Surg. 24, 67-72, 2005).
형질전환은 미생물의 돌연변이 생성을 비롯한 유전공학의 기본적인 기술이다. 형질전환 기술은 동식물의 개량, 생산성 향상 및 산업 의학적으로 유용한 산물을 얻기 위하여 외래 유전자를 인위적인 방법으로 생물의 염색체상에 전이시켜 발현시키는 기술과 내인성 유전자의 과발현을 유도, 조작하는 기술 및 염색체상의 특정 유전자의 기능을 삭제함으로써 그 유전자의 발현에 따른 표현형의 변화와 유전자의 기능을 규명하는 등의 일련의 기술을 총칭한다. 생물체에 외래유전자를 전이하는 기술은 형질전환 동물의 경우, 수정란에 미세주입기를 통한 미세주입방법, 여러 가지 형태의 바이러스를 이용하는 방법, 전자기장을 이용하는 방법, 지질 등의 화합물을 이용하는 방법 등 추구하는 목적에 따라 이용방법이 다양하다. 외래유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 따라 특정 조직, 즉 유선, 간, 혈액 등에 국한되게 발현시키거나 생물체의 발달 단계에 따라 외래유전자의 발현 유도가 가능하다.
형질전환 방법은 직접적인 형질전환 방법과 간접적인 형질전환 방법으로 크게 분류할 수 있다. 직접적인 형질전환 방법의 예로서는 전기천공법(Electroporation)(Shimamoto K. et al., Nature , 338: 274-276, 1989; Rhodes C.A. et al., Science , 240: 204-207, 1989), 파티클건법(particle gun)(Christou P. et al., Bio / Technology , 9:957-962, 1991) 및 폴리에틸렌글리콜법(PEG)(Datta, S. K. et al., Bio / Technology, 8 :736-740, 1990)이 있고, 간접적인 형질전환방법으로서는 아그로박테리움 매개성 형질전환 방법이 있다. 이들 중 전기천공법은 미 생물의 유전적 연구를 위해 형질전환시키는 유용한 기술로 많이 이용되어 왔다(Trevors and Starodub, Enzyme Microb . Technol . 12, 653-655, 1990). 그러나 지금까지 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환에 대한 보고는 전혀 없다.
이에, 본 발명자들은 프로피오니박테리움 아크네스의 유전자 조작을 위한 기본적 도구로서 전기천공법을 이용한 형질전환 방법 개발을 위해 다양한 조건을 변화시키며 형질전환의 효율을 비교하였다. 그 결과 충격 시간, 플라스미드(plasmid) DNA의 숙주 균주의 종류, 반응능세포(competent cell)의 배양 온도, 전기충격 완충용액(electroporation buffer, EPB)의 조성, 전기장의 세기 및 충격 시간이 결정적인 요소임을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes , P. acnes)의 형질전환 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 숙주 균주로부터 플라스미드(plasmid)를 분리하는 단계;
2) 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)를 반응능세포(competant cell)로 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 플라스미드를 단계 2)의 반응능세포에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 도입하는 단계를 포함하는 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환된 프로피오니박테리움 아크네스를 제공한다.
본 발명의 전기천공법(electroporation)을 이용한 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, P. acnes)의 형질전환방법은 플라스미드(plasmid) DNA의 숙주 균주의 종류, 반응능세포(competent cell)의 배양 온도, 전기충격 완충용액(electroporation buffer, EPB)의 조성, 전기장의 세기 및 충격 시간의 조건을 최적화하여 높은 효율의 형질전환을 할 수 있으므로 특정 유전자의 녹-아웃(knock-out)을 비롯한 유전자 조작에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 숙주 균주로부터 플라스미드(plasmid)를 분리하는 단계;
2) 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)를 반응능세포(competant cell)로 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 플라스미드를 단계 2)의 반응능 세포에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 도입하는 단계를 포함하는 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 숙주 균주는 dam - 유전형을 갖는 균주인 것이 바람직하고 dam - 대장균(E. coli ) 인 것이 더욱 바람직하며 ET12567 균주인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 플라스미드는 프로피오니박테리움으로부터 유도되는 복제원점을 가지고 외래 유전자 및 선별을 위한 내성 유전자를 포함하는 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 내성 유전자는 앰피실린(ampicillin) 및 에리스로마이신(erythromycin)에 내성을 지닌 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 도 1의 개열지도로 표시되는 프로피오니박테리움으로부터 유도되는 복제원점을 가지고 숙주 균주-프로피오니박테리움 셔틀벡터인 pBRESP36A을 이용하였으며(도 1 참조), 이는 대장균과 프로피오니박테리움에서 대해 각각 앰피실린 및 에리스로마이신에 내성을 지닌 유전자를 포함하고 있다(Jore, J.P.M., et al., App . Environ. Microbiol . 67, 499-503, 2001).
본 발명자들은 플라스미드 DNA를 증폭시켜 얻기 위해 숙주로 사용하는 대장균 균주의 종류가 전기천공법을 이용한 형질전환의 효율에 미치는 영향을 알아보기 위해 4가지의 대장균 균주인 JM109, DH5α, HB101 및 ET12567로부터 분리된 각각의 플라스미드를 이용하여 형질전환한 후 효율을 비교하였다. 그 결과, ET12567 균주로부터 분리한 플라스미드 DNA를 이용하였을 때에만 형질전환에 성공하였다.
ET12567 균주가 dam - 의 유전형을 가지고 있으므로 상기 플라스미드 DNA가 프로피오니박테리움 아크네스에 존재할 수 있는 메틸-의존 제한(methyl-dependent restriction) 시스템을 우회하여 삽입될 것이라는 것을 알 수 있다. 따라서 숙주로 사용하는 대장균 균주의 선택이 형질전환 효율에 중요한 요소임을 알 수 있다(표 1 참조). 이와 관련하여, 스트렙토마이세스 아버미틸리 스(Streptomyces avermitilis)의 형질전환 실험에서 dam + 균주로부터 분리한 플라스미드를 이용하였을 때 메틸-의존 제한 시스템에 의해 형질전환의 효율이 감소한다는 보고가 있다(MacNeil, J. Bacteriol . 170, 5607-5612, 1988; MacNeil et al., J. Bacteriol . 175, 2552-2563, 1993). 이는 세균이 가지는 제한-변형(restriction-modification) 시스템이 외부 DNA의 삽입을 저해하는 가장 결정적인 요소임을 말해 준다(Jore et al, App . Environ . Microbiol. 67, 499-503, 2001).
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 프로피오니박테리움 아크네스는 20 ~ 30℃에서 배양하는 것이 바람직하고 22 ~ 26℃에서 배양하는 것이 더욱 바람직하며, 24℃에서 배양하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
형질전환시 세포를 낮은 온도에서 배양하면 외부 DNA를 분해하는 엔도뉴클레아제(endonuclease)의 활성이 저하되고 형질전환의 효율이 높아진다는 보고가 있다(van der Rest et al., App . Microbiol . Biotechnol . 52, 541-545, 1999; Sch er et al., App . Environ . Microbiol . 60, 756-759, 1994). 이에, 본 발명자들은 반응능세포의 배양 온도가 형질전환 효율에 미치는 영향을 알아보기 위해 프로피오니박테리움 아크네스의 BL 배양액을 다양한 온도에서 배양한 반응능세포들을 이용하여 전기천공법을 통한 형질전환을 수행한 후 효율을 비교하였다. 그 결과, 반응능세포는 20 ~ 30℃에서만 생장을 보였고, 특히 24℃에서 자란 세포를 사용하는 경우 15 kV/cm의 전기장에서 1.5 × 104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA의 최대 형질전환 효율을 얻었다. 이보다 낮은 온도에서는 세포의 생장이 거의 이루어 지지 않아 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환을 관찰할 수 없었다. 따라서 반응능세포의 배양온도가 형질전환 효율에 중요한 요소로 작용하는 것을 알 수 있다(도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 반응능세포를 준비하기 위해 세포벽 약화제를 첨가하였을 때 형질전환 효율이 증가하였다는 보고(Wei et al., 1995)를 근거로 세포벽 약화제가 형질전환 효율에 미치는 영향을 알아보기 위해, 프로피오니박테리움 아크네스의 BL 배양액에 DL-트레오닌(DL-threonine), 글라이신(glycine) 및 페니실린(penicillin)을 각각 첨가하여 배양한 반응능세포들을 이용하여 전기천공법을 통한 형질전환을 수행한 후 효율을 비교하였다. 그 결과, 세포벽 약화제를 첨가한 경우 첨가하지 않은 경우에 비해 형질전환 효율이 감소하였다. 이는 세포벽 약화제가 생장에 영향을 준다는 기존 연구 결과를 통해 설명될 수 있다(Turgeon et al., J. Microbiol . Methods 67, 543-548, 2006).
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 프로피오니박테리움 아크네스는 전기천공 완충용액(Electroporation buffer, EPB)에 현탁하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 전기천공 완충용액은 글리세롤(glycerol) 10%, 0.5 M 솔비톨(sorbitol), 0.5 M ~ 0.2 M 슈크로즈(sucrose), 7mM 인산나트륨(sodium phosphate) 및 1mM 염화마그네슘(magnesium chloride)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 272 mM 슈크로즈(sucrose), 7mM 인산나트륨(sodium phosphate) 및 1mM 염화마그네슘(magnesium chloride)을 포함하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 전기천공 완충용액의 조성이 형질전환 효율에 미치는 영향을 알아보기 위해, 표 2에서 보는 바와 같이 다양한 EPB 조성을 이용하여 전기천공법을 통한 형질전환을 수행한 후 그 효율을 비교하였다. 그 결과, 글리세롤 10%, 0.5 M 슈크로즈 및 10 mM 염화마그네슘, 또는 글리세롤 10%, 0.5 M 슈크로즈 및 10 mM 인산칼륨(potassium phosphate)을 포함한 완충용액을 이용하였을 때 형질전환 효율이 매우 낮은 반면에, 272 mM 슈크로즈, 7 mM 인산나트륨 및 1 mM 염화마그네슘을 포함한 완충용액을 이용하였을 때에는 가장 높은 형질전환 효율을 얻을 수 있었다. 따라서 전기천공 완충용액의 조성이 형질전환 효율에 중요한 요소로 작용하는 것을 알 수 있다(표 2 및 도 2 참조).
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 전기천공법은 충격 시간이 2.0 ~ 5.0 ms에서 수행하는 것이 바람직하고 3.0 ~ 4.0 ms에서 수행하는 것이 더욱 바람직하며, 3.2 ms에서 수행하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
전기장과 관련된 조건들은 전기천공법에 의한 형질전환 효율에 영향을 미칠 수 있다고 보고되었다(Trevors et al., Chang , D.C., Chassy , B.M., Saunders , J.A., Sowers , A.E.( Eds .), Guide to Electroporation and Electrofusion . Academic Press Inc., San Diego, CA, pp. 265-290, 1992). 이에, 본 발명자들은 충격 시간이 형질전환 효율에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기 전기천공 완충용액의 조성에 따른 시간상수 값들을 측정하여 형질전환 효율을 비교하였다. 그 결과, 충격 시간이 3.0 ~ 3.6 ms로 나타났을 때 가장 높은 형질전환 효율을 얻을 수 있었다. 따라서 충격 시간이 형질전환 효율에 중요한 요소로 작용하는 것임을 알 수 있다(표 2 및 도 2 참조).
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 전기천공법은 전기장의 세기가 6.0 kV/cm ~ 9.5 kV/cm 또는 13.0 kV/cm ~ 20.0 kV/cm에서 수행하는 것이 바람직하고 8.0 ~ 9.5 kV/cm 또는 14.0 ~ 16.0 kV/cm에서 수행하는 것이 더욱 바람직하며, 15.0 kV/cm에서 수행하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 전기장의 세기가 형질전환 효율에 미치는 영향을 알아보기 위해, 다양한 크기의 전기장을 적용시켜 전기천공법을 통한 형질전환을 수행한 후 그 효율을 비교하였다. 비교적 높은 전압(10 kV/cm)에서는 0.1 cm 큐벳(cuvette)이, 낮은 전압(< 10 kV/cm)에서는 0.2 cm 큐벳(cuvette)이 각각 사용되었다. 그 결과, 37℃에서 배양된 반응능세포(competent cell)를 사용하였을 때 9.0 kV/cm의 전기장에서 6.2 × 103 CFU/μg 플라스미드 DNA의 최대 효율을 얻었고, 배양 온도를 변화시켜 24℃에서 자란 반응능세포를 사용하였을 때 15.0 kV/cm의 전기장에서 1.5 × 104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA의 최대 효율을 얻었다. 따라서 전기장의 세기가 형질전환 효율에 중요한 요소로 작용하는 것을 알 수 있다(도 3 참조).
상기 형질전환을 확인하기 위해 PCR을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 pBRESP36A에 있는 pBR322의 ori 유전자를 증폭시키기 위해 포워드(forward) 프라이머: 5'-CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA TAG-3'(서열번호 1) 및 리버스(reverse) 프라이머: 5'-TTC TGC GCG TAA TCT GCT GCT TGC-3'(서열번호 2)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 형질전환체의 산물이 로딩(loading)된 레인에서 pBESP36A의 ori 유전자에 해당하는 밴드가 관찰되었다. 따라서 성공적인 형질전환이 이루어졌음을 알 수 있다(도 4 참조).
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환된 프로피오니박테리움 아크네스를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 균주의 배양
본 발명자들은 사람 피부에서 몇 종류의 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 균주를 분리한 후, 분리된 균주 중 하나를 16S rDNA 서열결정(sequencing)에 의해 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes , P. acnes)로 판명하고 DC-1으로 명명하였다(GenBank Accession No. EF592610). 상기 프로피오니박테리움 아크네스 DC-1은 2008년 3월 6일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC11301 BP).
상기 프로피오니박테리움 아크네스 DC-1은 BL 배지(Difco, USA)에서 37℃, 혐기 조건에서 배양되었다. 표 1에 나열된 바와 같이 플라스미드(Plasmid)를 증폭하고 유지하는데 사용된 4종류의 대장균(Escherichia coli) 균주를 각각 배양하였다(표 1). 상기 대장균 균주는 진탕(shaking)하면서 37℃에서 LB 배양액(medium)[박토 트립톤(Bacto tryptone) 10 g/ℓ, 박토 효모 추출물(Bacto Yeast extract) 5 g/ℓ, 염화나트륨(Sodium chloride) 10 g/ℓ] 또는 LB 아가 플레이트(agar plate)[LB 배양액(LB medium) + 1.5% 박토 아가(Bacto agar)]에서 배양하였다. 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환체 선별을 위한 에리스로마이신(erythromycin)과 E. coli 선별을 위한 앰피실린(ampicillin)은 각각 최종농도가 10 ㎍/㎖과 50 ㎍/㎖가 되도록 배지에 첨가하였다.
| 종 | 유전자형 | 참고문헌 |
| JM109 | F['traD36 proAB+ lacIq △(lacZ)M15] recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 thi △(lac-proAB) |
Sambrook, J., Russell, D.W., Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, New York, pp. A3.6-A3.10, 2001 |
| DH5α | supE44 △lacU169(∮80lacZ△M15) hsdR17 recA56 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 | |
| HB101 | supE44 supF58 hsdS3(rB -mB -) recA56 galK2 galT22 metB1 supE44 hsdS20(rB -mB -) recA13 ara-14 proA2 lacY1 gaIlK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 |
|
| ET12567 | F- dam-13::Tn9 dcm-6 hsdM hsdR zjj-202::Tn10 recF143 galK2 galT22 ara-14 lacY1 xyl-5 leuB6 thi-1 tonA31 rpsL136 hisG4 tsx-78 mtl-1 glnV44 |
Choi, S.-U., et al., Arch. Microbiol . 181, 294-298, 2004 |
<
실시예
2> 플라스미드(
plasmid
)의 준비
프로피오니박테리움 아크네스 DC-1의 형질전환 실험에 사용된 플라스미드는 도 1의 개열지도로 표시되는 pBRESP36A이며, 이는 Jore, J.P.M로부터 제공받았다(Mailing address: TNO Nutrition and Food Research, P.O. Box 360, 3700 AJ Zeist, The Netherlands. Phone: 31 30 69 444 68. Fax: 31 30 69 444 66. E-mail: jore@voeding.tno.nl.)(도 1). 상기 플라스미드는 8.2 kb의 크기로써 프로피오니박테리움 프레우덴레이치(Propionibacterium freudenreichii)의 p545로부터 유도되는 복제원점을 가지는 E. coli - 프로피오니박테리움 셔틀벡터이고, E. coli와 프로피오니박테리움에서 대해 각각 앰피실린(ampicillin) 및 에리스로마이신(erythromycin)에 내성을 지닌 유전자를 포함하고 있다(Jore, J.P.M., et al., App . Environ . Microbiol . 67, 499-503, 2001).
<
실시예
3>
반응능세포(Competent cell)의
제조
반응능세포(Competent cell)를 준비하기 위해, 정체기의 프로피오니박테리움 아크네스 배양액을 5 ㎖의 새로운 BL 액체 배지에 2%(v/v)씩 접종하였다. 이를 네 가지 다른 온도(4℃, 18℃, 24℃, 37℃)로 나누어 배양하였다. 5시간(1.5 ~ 2.07 cell/㎖) 배양 후 5000×g에서 원심분리하여 세포를 수확하였다. 상기 세포를 상온으로 맞춰진 표 2에 나열된 6종류 조성의 전기천공 완충용액(electroporation buffer, EPB) 1 ㎖를 각각 이용하여 두 번 세척한 후, 최종적으로 200 ㎕의 EPB로 세포를 현탁하였다(표 2). 이때 반응능세포의 최종 농도는 4.0 ~ 5.08 cell/㎖이었다.
| 완충용액 | 조성 | 시간상수(ms) |
| 1 | 글리세롤(Glycerol) 10% | 4.2 ~ 4.6 |
| 2 |
글리세롤(Glycerol) 10% + 0.5 M 솔비톨(sorbitol) | 4.2 ~ 4.6 |
| 3 |
글리세롤(Glycerol) 10% + 0.5 M 슈크로즈(sucrose) | 4.2 ~ 4.6 |
| 4 |
글리세롤(Glycerol) 10% + 0.5 M 슈크로즈(sucrose) + 10mM 염화마그네슘(magnesium chloride) | 2.0 ~ 2.5 |
| 5 |
글리세롤(Glycerol) 10% + 0.5 M 슈크로즈(sucrose) + 10mM 인산칼륨(potassium phosphate) | 2.0 ~ 2.5 |
| 6 |
272 mM 슈크로즈(sucrose) + 7 mM 인산나트륨(sodium phosphate) + 1 mM 염화마그네슘(magnesium chloride) | 3.0 ~ 3.6 |
<
실시예
4> 전기천공법을 이용한 형질전환
<4-1> 플라스미드
DNA
의 숙주 균주가 미치는 영향
상기 표 1에 나열된 대장균(Escherichia coli) 균주인 JM109(KCTC 2871), DH5α(KCTC 2895), HB101(KCTC 2134) 및 ET12567(Jore, J.P.M) 균주로부터 분리된 각각의 플라스미드(Plasmid)들을 이용하여 전기천공법을 통한 형질전환을 수행한 후 형질전환 효율을 비교하였다. 전기천공법(Electroporation)을 위해 세포 현탁액을 100 ㎕씩 둘로 나누어 각각 0.7 ng의 플라스미드 DNA와 혼합하였다. 상기 전기천공법은 실내온도에서 Gene Pulser와 Pulse Controller apparatus(Bio-Rad laboratories, USA)를 이용하여 진행되었다.
그 결과, ET12567 균주로부터 분리한 플라스미드 DNA를 이용하여 전기천공법을 수행하였을 때에만 형질전환에 성공하였다. ET12567 균주는 상기 4종류 중 유일하게 dam - 의 유전형을 가지고 있으므로 플라스미드 DNA가 프로피오니박테리움 아크네스에 존재할 수 있는 메틸-의존 제한(methyl-dependent restriction) 시스템을 우회하여 삽입될 것이라는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 다양한 전기천공법 변수들 중 플라스미드 DNA를 증폭시켜 얻기 위해 숙주로 사용하는 대장균 균주의 선택이 형질전환 효율에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있었다.
<4-2> 충격 시간과 전기천공 완충용액(
electroporation
buffer
,
EPB
)이 미치는 영향
상기 표 2에 나열된 6종류의 EPB 조성을 각각 적용시켜 전기천공법을 통한 형질전환을 수행한 후 형질전환 효율을 비교하였다. 충격 시간이 EPB의 도전율과 관련 있기 때문에, 상기 조성에 따른 시간상수 값들을 얻었다.
그 결과, 4번 및 5번 완충용액을 이용하였을 때 충격 시간이 2.0 ~ 2.5 ms로 나타났고 형질전환 효율이 매우 낮았다. 그러나 6번 완충용액을 이용하였을 때에는 충격 시간이 3.0 ~ 3.6 ms로 나타났으며 가장 높은 형질전환 효율을 얻을 수 있었다(표 2 및 도 2). 따라서 충격 시간 및 EPB의 조성 역시 형질전환 효율에 중요한 요소로 작용하는 것을 알 수 있었다. 이어지는 실험에서는 6번 완충용액을 계속 사용하였다.
<4-3> 전기장 세기가 미치는 영향
다양한 크기의 전기장을 각각 적용시켜 전기천공법을 통한 형질전환을 수행한 후 형질전환 효율을 비교하였다. 미리 냉각된 0.1 cm 및 0.2 cm 간극의 큐벳(cuvette)을 이용하여 다양한 크기의 전기장을 적용시켰다. 비교적 높은 전압(10 kV/cm)에서는 0.1 cm 큐벳(cuvette)이, 낮은 전압(< 10 kV/cm)에서는 0.2 cm 큐벳(cuvette)이 각각 사용되었다. 모든 전기천공법은 적어도 두 번 이상 반복하였다.
그 결과, 아무런 처리를 하지 않은 37℃에서 배양된 반응능세포(competent cell)를 사용하였을 때 9 kV/cm의 전기장에서 6.2 × 103 CFU/μg 플라스미드 DNA의 최대 효율을 얻었고, 배양 온도를 변화시켜 24℃에서 배양된 반응능세포를 사용하였을 때 15 kV/cm의 전기장에서 1.5 × 104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA의 최대 형질전환 효율을 얻었다. 따라서 전기장의 세기가 형질전환 효율에 중요한 요소로 작용하는 것을 알 수 있었다(도 3).
<4-4> 배양 온도가 미치는 영향
프로피오니박테리움 아크네스의 BL 배양액(broth)을 네 가지 다른 온도(4℃, 18℃, 24℃, 37℃)로 나누어 배양한 반응능세포(Competent cell)들을 이용하여 전기천공법을 통한 형질전환을 수행한 후 형질전환 효율을 비교하였다.
그 결과, 반응능세포는 24℃에서만 생장을 보였고 24℃에서 자란 세포를 사용하여 15 kV/cm의 전기장에서 1.5 × 104 CFU/㎍ 플라스미드 DNA의 최대 형질전환 효율을 얻었다.
<4-5> 세포벽
약화제가
미치는 영향
반응능세포를 만들기 위해 세포벽 약화제를 첨가하였을 때 형질전환 효율이 증가하였다는 보고(Wei et al., J. Microbio . Methods 21, 97-109, 1995)를 근거로 세포벽 약화제의 영향을 조사하였다. 세포벽 약화제인 DL-트레오닌(DL-threonine)(0.12 mM 및 0.24 mM), 글라이신(glycine)(5 및 10%) 및 페니실린(penicillin)(2 ㎍/㎖)를 고농도 저장(stock)의 형태로 준비하여 냉장 및 냉동 보관하였다. BL 배지에 상기 세포벽 약화제를 첨가한 후 프로피오니박테리움 아크네스 균주를 접종하여 2 ~ 3시간 배양한 후에 페니실린을 최종농도 2 ug/ml이 되도록 처리를 하고 프로피오니박테리움 아크네스 세포 농도가 약 1.5E7 cells/ml이 될 때까지 추가로 배양하였다. 이후 전기천공법을 실시하기 위한 실험은 동일하게 진행하였다.
그 결과, 세포벽 약화제를 처리한 후의 형질전환 효율은 9 ~ 10.5 kV/cm 전기장에서 최고 약 200 ~ 300 CFU/ug plasmid DNA 정도로 매우 감소하였다. 이는 세포벽 약화제가 생장에 영향을 준다는 기존 연구 결과를 통해 설명될 수 있다(Turgeon et al., J. Microbiol . Methods 67, 543-548, 2006).
<
실시예
5>
PCR
을 통한 형질전환의 확인
형질전환을 확인하기 위해 PCR(GoTaq DNA Polymerase, Promega)을 이용하여 pBRESP36A에 있는 pBR322의 ori 유전자를 증폭시켰다. 사용된 프라이머 세트(primer set)는 Bioneer에 의뢰하여 제작된 것으로 하기와 같다: 포워드(forward) 프라이머: 5'-CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA TAG-3'(서열번호 1), 리버스(reverse) 프라이머: 5'-TTC TGC GCG TAA TCT GCT GCT TGC-3'(서열번호 2). 상기 PCR은 10 CR 완충용액, 10 mM의 dNTPs(Promega, UK), 및 10 pmol의 프라이머를 포함한 최종 부피 50 ㎕의 반응혼합물로 수행하였다. 콜로니(Colony)로부터 얻어진 세포를 주형 DNA 재료로 사용하였다. 증폭 과정은 PCR 기기(Techne, USA)를 이용하여 하기와 같은 단계로 수행하였다: (1) 10분 동안 94℃로 가열하여 세포벽을 파괴; (2) 5분 동안 94℃에서 계속 가열; (3) 94℃에서 1분, 65℃에서 1분, 및 72℃에서 20초를 한 주기로 30번 반복하여 DNA 증폭; 및 (4) 72℃에서 10분간 유지.
그 결과, 형질전환체의 PCR 산물이 로딩(loading)된 4번 레인에서 pBESP36A의 ori 유전자에 해당하는 밴드가 관찰되었다. 이는 성공적인 형질전환이 이루어졌음을 말해주었다(도 4).
도 1은 pBRESP36A 플라스미드의 개열지도를 나타내는 그림이다.
도 2는 전기충격 완충용액(electroporation buffer, EPB)의 조성에 따른 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환 효율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 3은 반응능세포(competent cell)의 배양 온도가 24℃일 때, 전기장의 세기에 따른 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환 효율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4는 pBRESP36A에 있는 pBR322의 ori 유전자에 대한 primer 쌍을 이용한 프로피오니박테리움 아크네스 형질전환체의 PCR 확인한 결과를 나타내는 그림이다:
1: 100bp DNA ladder;
2: pBRESP36A에서 얻은 PCR 산물(대조군);
3: 야생형의 P. acnes(대조군); 및
4: 형질전환체(실험군).
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> Marker genes and screening method of Amiodarone having pulmonary
toxicity using thereof
<130> 7p-07-13
<160> 24
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Polo-like kinase 1(Drosophila) sense primer
<400> 1
ctcaacacgc ctcatcctc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Polo-like kinase 1(Drosophila) antisense primer
<400> 2
gtgctcgctc atgtaattgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Cyclin B1 sense primer
<400> 3
tctggataat ggtgaatgga ca 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Cyclin B1 antisense primer
<400> 4
cgatgtggca tacttgttct tg 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Growth factor independent 1B sense primer
<400> 5
ttcctggtga agagcaagaa ggct 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Growth factor independent 1B antisense primer
<400> 6
tccaggcact ggtttgggaa taga 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Fatty acid desaturase 2 sense primer
<400> 7
tggatggaac agctaaggcc aaga 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Fatty acid desaturase 2 antisense primer
<400> 8
ctgtggtttg cagccagatg gttt 24
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Peroxisome proliferative activated receptor, gamma sense primer
<400> 9
cacaagaaca gatccagtgg ttgcag 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Peroxisome proliferative activated receptor, gamma antisense primer
<400> 10
aataataagg tggagatgca ggctcc 26
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase) sense primer
<400> 11
aacttgatac gtccgtgtgt ccca 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Stearoyl-CoA desaturase(delta-9-desaturase) antisense primer
<400> 12
ctgtatgttt ccgtggcaat gcgt 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> sh2 domain containg 5 sense primer
<400> 13
agacctggtc attggtccag actt 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> sh2 domain containg 5 antisense primer
<400> 14
aacatggccc tgatagcttc tcca 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Ankyrin repeat domain 1(cardiac muscle) sense primer
<400> 15
aagcgagaaa caacgagagg caga 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Ankyrin repeat domain 1(cardiac muscle) antisense primer
<400> 16
agaaacgtag gcacatccac aggt 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Lymphocyte antigen 96 sense primer
<400> 17
agctctgaag ggagagactg tgaa 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Lymphocyte antigen 96 antisense primer
<400> 18
ggtgtaggat gacaaactcc aagc 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Growth differentiation factor 15 sense primer
<400> 19
aagaactcag gacggtgaat ggct 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Growth differentiation factor 15 antisense primer
<400> 20
tttccgcaac tctcggaatc tgga 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14 sense primer
<400> 21
aggaatgtca gcaccagacc aagt 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14 antisense primer
<400> 22
ggccaactgt ggagcaaaca atga 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> DEP domain containing 1 sense primer
<400> 23
gccaccaagc tgtggaatga agtt 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> DEP domain containing 1 antisense primer
<400> 24
atccactgct tctcctgctg tgaa 24
Claims (7)
1) dam - 유전자형을 포함하는 대장균 균주로부터 프로피오니박테리움으로부터 유도되는 복제원점을 가지고, 외래 유전자 및 선별을 위한 내성 유전자를 포함하는 플라스미드(plasmid)를 분리하는 단계;
2) 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)를 20 ~ 30℃의 배양 온도에서 배양하여 반응능세포(competant cell)로 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 플라스미드를 단계 2)의 반응능 세포에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 도입하되,
여기서, 상기 전기천공법은 전기천공 완충용액이 슈크로즈(sucrose), 인산나트륨(sodium phosphate) 및 염화마그네슘(magnesium chloride)으로 구성되고, 충격 시간이 3.0 내지 3.6 ms이며, 전기장의 세기가 6.0 kV/cm 내지 9.5 kV/cm 또는 14.0 kV/cm 내지 16.0 kV/cm인 것을 특징으로 하는 단계;
를 포함하는 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환 방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)에서 프로피오니박테리움 아크네스는 24℃의 배양 온도에서 배양되는 것을 특징으로 하는 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환 방법.
제 4항에 있어서, 상기 전기천공 완충용액은 272 mM 슈크로즈(sucrose), 7 mM 인산나트륨(sodium phosphate) 및 1 mM 염화마그네슘(magnesium chloride)으로 구성된 것을 특징으로 하는 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환 방법.
제 1항에 있어서, 상기 전기장의 세기는 9.0 kV/cm 또는 15.0 kV/cm인 것을 특징으로 하는 프로피오니박테리움 아크네스의 형질전환 방법.
삭제
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Patent Citations (1)
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