WO2007034581A1 - 乳酸菌用プラスミド - Google Patents

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WO2007034581A1
WO2007034581A1 PCT/JP2006/303540 JP2006303540W WO2007034581A1 WO 2007034581 A1 WO2007034581 A1 WO 2007034581A1 JP 2006303540 W JP2006303540 W JP 2006303540W WO 2007034581 A1 WO2007034581 A1 WO 2007034581A1
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dna
plasmid
nucleotide sequence
region
sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/303540
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English (en)
French (fr)
Inventor
Taku Miyamoto
Hwa-Yong An
Moon-Hee Sung
Tomomitsu Sewaki
Hideaki Nariai
Shinichiro Hara
Original Assignee
Bioleaders Japan Corporation
Okayama University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioleaders Japan Corporation, Okayama University filed Critical Bioleaders Japan Corporation
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Publication of WO2007034581A1 publication Critical patent/WO2007034581A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)

Definitions

  • the present invention relates to a plasmid and vector capable of transformation of lactic acid bacteria. More specifically, the present invention is a clarification for transformation of lactic acid bacteria having a broad host range.
  • lactic acid bacteria are the target of research aimed at developing lactic acid bacteria cultures that improve the nutritional value and quality of food ingredients (SOffiUTI, GA, STEINBERG, DH: Biotechnol. Lett 25, 473-477 (2003)).
  • Lactobacillus species are resident bacteria in the gastrointestinal tract of humans and animals, and are a type of probiotic that provides beneficial effects to the host by improving its intestinal balance. Yes (Tannock, GW: Appl. Environ.
  • Lactobacillus casei (hereinafter referred to as “Lb. caseij”) is a kind of lactic acid bacteria, not only human gastrointestinal tract, but also many edible products (eg fermented products of plants, milk and meat), silage, other natural
  • Lb. casei has been used in the manufacture of new fermented dairy products with an original flavor and has required certain health benefits (G0 SALBES, MJ, VICENTE, M. , GASPAR, PM: J. Bacteriol. 131, 3928-3 934 (1999) Kyopi GASSON, MJ, DE VOS, WM: Genetics and biotechnology of lactic acid bacteria, 1st edition Blackie A.
  • Lb. casei is a “generally safe” (GRAS) organism and is used commercially as a probiotic (ISABEL, PA, G ASPAR, PM: FEMS Microbiol. Lett. 222, 123-127 (2003)).
  • Probiotics are live bacteria that are added to food to promote health.
  • probiotic microorganisms include Lactobacillus, Bifidobacteria, Streptococcus salivarius, Saccharomyces boulardii, and Escherichia coli.
  • microorganisms when taken by mouth in a viable form, are believed to provide the following benefits: adherence to the intestine; pathogen growth inhibition; carcinogen binding or degradation; Competitive elimination of other bacteria or changes in metabolism of other bacteria; production of antitumor substances; stimulation of immune function.
  • plasmids derived from lactic acid bacteria have been the focus of much research, and various shuttle vectors and integration vectors have been developed (JANG, SJ, HAM, MS, LEE, JM, CHUNG, SK, LEE, HJ, KIM, JH, CHAN, HC, LEE, JH, CHUNG, DK: FEMS Microbiol. Lett. 224, 191—195 (2003) and BIET, F., CENATIEMPO, Y., FREMAUX, C. Appl. Environ. Microbiol. 68, 6451-6456 (2002)).
  • Lactobacillus strains have one or more naturally resident plasmids of various sizes (REN, D., WANG, Y., WANG, ⁇ , CUI, J., LAN, H , ZHOU, J. Plasmid 50, 70-73 (2003)). These plasmids have various functions Has already been found. Among them are genes related to latatose metabolism, pacteriocin synthesis, exopolysaccharide (EPS) production, or DNA restriction modification.
  • EPS exopolysaccharide
  • Lactobacillus delbrueckii (hereinafter “Lb. delbrueckiij”) And Leslie (S error, P.,
  • Lactobacillus helveticus (Bhowmik, T., Steele, JL: J. Gen. Microbiol. 139, 1433-1439 (1993)), and Lactobacillus sakei (hereinafter referred to as "Lb. sakei") (Berthier, F., Zagorec, M., Marie, CV, Ehrlich, SD, Francoise, MD: Microbiology 142, 1273—1279
  • Lactobacillus-derived plasmids have been analyzed for the entire nucleotide sequence: pLA103 (from Lactobacillus acidophilus (hereinafter referred to as I Lb. acidophilusj)), Kanatani, K., Tahara, ⁇ , Oshimura, M., Sano , K., Umezawa, C .: FEMS Microbiol. Lett. 133, 127-130 (199 5)); pRV500 (from Lb.
  • Lb Lactobacillus plantarum
  • pTC82 derived from Lactobacillus reuteri: Lin, CF, Fung, ZF, Wu, CL, Chung, T .: Plasmid 36, 116-124 (1996)
  • pLC2 from L actobacillus curvatus: Klein, JR, Ulrich, C., PI ⁇ , R .: Plasm id 30, 14-29 (1993)
  • Lb. casei which is an edible lactic acid bacterium. It has been found that proliferation is enhanced, and a shuttle vector for lactic acid bacteria using the plasmid-derived essential replication region is described.
  • pSYl Japanese Patent Laid-Open No. 5-1776776
  • ⁇ specialized Japanese Patent No. 22002-25602
  • pSYl is a plasmid isolated from a strain of Lactococcu s lactis subsp.
  • lactis and can replicate in the Bacillus and Lactococcus genera, as well as in two subspecies of the Lactobacillus delbrueckii species, la ctis and bulgarius. It has the ability to convert (Japanese Patent Laid-Open No. 5 _ 1 7 6 7 7 6).
  • pMTl is Streptococcus It is a plasmid derived from thermophilus, and it has been reported that it can replicate in type 0 and can be replicated in Streptococcus thermophilus and Lactococcus lact is (Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 25 2-25 3 (No. 2 60)
  • Lb. casei and other lactic acid rods including Lactobacillus casei subsp. Alactosus, Lactobacillus gasseri (hereinafter referred to as “L b, gasserij”), Lb. acidophilus, etc.
  • L b, gasserij Lactobacillus casei subsp. Alactosus
  • Lb, gasserij Lactobacillus gasseri
  • An object of the present invention is to provide a plasmid and a vector for transformation of lactic acid bacteria having a broad host range.
  • the present invention hybridizes with a DNA region represented by the nucleotide sequence from positions 1 9 3 to 3 4 6 of SEQ ID NO: 1 or DNA having a sequence complementary to the nucleotide sequence under stringent conditions.
  • a plasmid containing a DNA region having a ⁇ -type replication ability, or a DNA region having a base sequence having one or more base substitutions, deletions or additions from the base sequence unless the function is changed. provide.
  • the present invention also provides a DNA region represented by the nucleotide sequence from positions 1 9 2 3 to 3 80 9 of SEQ ID NO: 1, or a DNA having a sequence complementary to the nucleotide sequence and hybridized under stringent conditions. And a DNA region having a ⁇ -type replication ability, or a DNA region having a base region having one or more base substitutions, deletions or additions from the base sequence unless the function is changed.
  • the present invention further provides a plasmid pLC4944 represented by the nucleotide sequence from position 1 to position 884 of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention includes a DNA region represented by a nucleotide sequence from positions 19 3 to 3 46.4 of SEQ ID NO: 1 or DNA having a sequence complementary to the nucleotide sequence under stringent conditions.
  • a DNA region containing soybean and having a replication ability of type 0, or a DNA region having a base sequence having one or more base substitutions, deletions or additions from the base sequence unless the function is changed D Recombinant vectors containing NA fragments are provided.
  • the present invention also hybridizes under stringent conditions with a DNA region represented by the nucleotide sequence from positions 1 9 3 to 3 80 9 of SEQ ID NO: 1 or a DNA having a sequence complementary to the nucleotide sequence.
  • a DNA region that is soybean and retains replication ability of type 0, or a DNA region that has a base sequence having one or more base substitutions, deletions, or additions from the base sequence unless the function is changed A recombination vector containing a DNA fragment is provided.
  • the recombination vector of the present invention further comprises an essential region for replication derived from bacteria.
  • the recombination vector of the present invention further comprises a selectable marker gene.
  • This book includes the DNA region shown by the nucleotide sequence from positions 1 3 3 to 3 4 6 4 of SEQ ID NO: 1, a replication essential region derived from E. coli, and a selectable marker gene. :
  • a recombination plasmid vector pJLE4942 is provided.
  • This effort also includes a DNA region represented by the nucleotide sequence from positions 1923 to 3464 of SEQ ID NO: 1, an E. coli-derived replication essential region, and a selectable marker gene.
  • J LE 121 A plasmid vector for recombination! J LE 121 is provided.
  • the present invention provides a method for producing a recombination vector, which comprises a DNA region represented by a nucleotide sequence from positions 1923 to 3464 of SEQ ID NO: 1, or a sequence complementary to the nucleotide sequence.
  • a recombination vector which comprises a DNA region represented by a nucleotide sequence from positions 1923 to 3464 of SEQ ID NO: 1, or a sequence complementary to the nucleotide sequence.
  • High in stringent conditions with DNA Contains a DNA region that is pre-primed and retains the replication ability of type 0, or a DNA region having a base sequence that has one or more base substitutions, deletions, or additions from the base sequence unless the function is changed.
  • the present invention also provides a method for producing a recombination vector, which comprises a DNA region represented by the nucleotide sequence from positions 19-2 to 3-809 of SEQ ID NO: 1, or A DNA region that hybridizes with DNA having a sequence complementary to the base sequence under stringent conditions and retains type 0 replication ability, or one or more bases from the base sequence unless the function is changed.
  • the method for producing the recombination vector further comprises the step of obtaining the DNA fragment from the plasmid pLC4944.
  • the above-mentioned DNA fragment is a DNA fragment containing a bacterially essential replication region.
  • the plasmid vector further comprises a selectable marker gene.
  • the present invention also provides a transformed cell containing any of the above plasmids or a recombination vector.
  • the transformed cell is a lactic acid bacterium.
  • the lactic acid bacterium is a lactobacillus selected from the group force consisting of Lb. casei, Lb. casei subsp. Al actosus, Lb. gasseri, and Lb. acidophilus force.
  • the lactic acid bacterium is Lb. casei.
  • the transformed cell is E. coli.
  • the present invention provides a method for transforming lactic acid bacteria, and the method comprises any of the above A step of introducing the recombination vector into lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacterium is a lactic acid bacterium selected from the group consisting of Lb. casei, Lb. casei subsp. Alacto sus, Lb. gasseri, and Lb. acidophilus.
  • the lactic acid bacterium is Lb. casei.
  • the introduction is performed by electroporation.
  • plasmid and vector for transformation of lactic acid bacteria having a broad host range are provided.
  • the plasmids and vectors of the present invention are also capable of stable replication in Lactobacillus.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of plasmid pLC494.
  • Figure 2 shows the position and sequence of the potential ribosome binding site (R B S), putative promoter, and repeat region (putative origin of replication) of plasmid pLC4.
  • Fig. 3 is a schematic diagram showing the construction of shuttle vector pJLE4942.
  • Fig. 4 is an electrophoretogram of plasmid DNA extracted from various Lactobacillus strains of E. coli transformed with PJLE4942.
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph of plasmid DNA extracted from Escherichia coli DH5a cells and Lb. casei L-49-4 cells transformed with pJLE4942.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the construction of shuttle vector PJLE121.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of electrical parameters on the transformation efficiency of Lb. casei L-49-4 cells. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the plasmid of the present invention has a nucleotide sequence from positions 1 9 2 3 to 3 4 6 4 of SEQ ID NO: 1. It is a plasmid containing the DNA region indicated in the column.
  • the plasmid of the present invention comprises a DNA region represented by the base sequence from positions 1 9 2 3 to 3 809 of SEQ ID NO: 1.
  • the DNA region represented by the nucleotide sequence from positions 1 9 2 3 to 3 4 6 4 of SEQ ID NO: 1 is an essential region (hereinafter referred to as “replication essential region”) in the replication of the plasmid of the present invention. Includes sequence region (presumed origin of replication) and duplicated protein gene (rep gene).
  • the plasmid replicates stably in the host containing this plasmid. It is necessary for
  • the plasmid of the present invention can be isolated from Lb. casei.
  • Lb. casei include Lb. casei derived from the human intestinal tract.
  • human intestinal Lb. cas ei strain include Lb. casei L-49 strain.
  • Lb. casei L-49 is a strain isolated from infant feces.
  • the plasmid pLC494 obtained from Lb. casei L-49 is included in the plasmid of the present invention.
  • the plasmid of the present invention can be prepared by separating from Lb. casei according to commonly used genetic engineering techniques.
  • the Lb. casei L-49 strain is cultivated, then collected, and lysed by a known method for lysing lactic acid bacteria (for example, a method using lysozyme). It can be obtained by extracting the DNA with oral formaldehyde f soamyl alcohol and separating and purifying the plasmid by a commonly used method such as centrifugation.
  • the culture may be performed according to the medium and culture conditions usually used for lactic acid bacteria.
  • MRS medium supplemented with lactose is used as the medium, and culture is performed at about 34 ° C to about 37 ° C, usually for about 1 day to about 2 days, by a culture method such as stationary culture. It is preferable to do this.
  • the obtained plasmid was cleaved with a restriction enzyme in the same manner as a known plasmid, Genetic manipulations such as ligation (ligation) by ligase can be performed.
  • the structure of the plasmid can be determined by a method according to a normal genetic engineering method. That is, various restriction enzyme digestion fragments of the plasmid of the present invention were inserted into a plasmid vector using E. coli as a host organism, and after transforming E. coli, the DNA of the plasmid vector was extracted, and this was commercially available. Use for the base sequencer (sequencer).
  • the determined base sequence can be used to create a restriction enzyme map or to compare it with known nucleic acid base sequence data using commercially available gene analysis software for personal computers. In addition, using a method such as PCR based on the sequence information described in this specification,
  • plasmid having the replication essential region of the plasmid of the present invention from Lb. casei bacteria or other microorganisms, and determining the nucleotide sequence, they have the same replication essential region as the plasmid of the present invention. It can be easily confirmed whether or not.
  • Plasmid pLC494 isolated from Lb. casei L-49 has a size of 8846 bp, and its restriction map is shown in FIG.
  • the entire DNA sequence of plasmid PLC494 is as shown in SEQ ID NO: 1 (positions 1 to 8 84 6 of SEQ ID NO: 1).
  • Plasmid pLC494 contains a DNA region represented by the nucleotide sequence from positions 1 9 2 3 to 3 4 6 4 of SEQ ID NO: 1, which is represented by BamHI to 0RF4 (repA) in the restriction enzyme map shown in FIG. It corresponds to the site before the stop codon.
  • the above region is an essential replication region, and a repetitive sequence region (positions 2 45 5 to 2 5 45 of SEQ ID NO: 1) (“repeat region” in FIG. 1), and replication protein Gene (rep gene) (positions 2 6 19 to 3 4 6 of SEQ ID NO: 1) (“0RF4 (repA)” in FIG. 1) is included.
  • the repetitive sequence is three complete 22 It is a putative origin of replication composed of a bp repeat region and one incomplete motif. In particular, from 1 9 2 3 to 2 4 of SEQ ID NO: 1 located upstream of the repeat sequence region
  • the DNA region represented by the base sequence at position 4 (corresponding to the BamH I to Bglll sites in the restriction map shown in Fig. 1) is for the plasmid to replicate stably in the host containing this plasmid. is necessary.
  • the plasmid of the present invention is considered to be a plasmid that performs theta (0) type replication. It is known that type 0 plasmids are structurally stable because replication proceeds from one replication origin via type 0 intermediate molecules. Type 0 plasmids are roughly divided into two groups. The first is a conjugation transfer plasmid with a wide host range, such as ⁇ 1, which is difficult to handle during gene manipulation because many of them are as large as around 30kb. For this reason, plasmids made small by deletion or the like are often used as vectors.
  • the second is represented by PCI305 derived from Lactococcus lactis, which is a relatively small and structurally stable plasmid with a narrow host range (Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 2-2 5 3 2 60) .
  • the plasmids of the present invention are relatively small and have a broad host range as shown to be capable of replication in Lb. casei, Lb. casei subsp. Alactosus. Lb. gasseri, and Lb. acidophilus.
  • DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from positions 1 9 2 3 to 3 4 6 4 of SEQ ID NO: 1 or positions 1 9 2 3 to 3 80 9 of SEQ ID NO: 1 and stringent A DNA fragment that hybridizes under various conditions and has a ⁇ -type replication ability can also be used as an essential replication region of the plasmid of the present invention.
  • Such a DNA fragment is obtained by capturing the nucleotide sequence from positions 1 9 3 to 3 4 6 4 of SEQ ID NO: 1 or positions 1 9 2 3 to 3 80 9 of SEQ ID NO 1 or a part thereof. It can be obtained by performing colony or plaque hybridization using the sequence as a probe.
  • the “stringent condition” is the formation of a so-called specific hybrid, A condition that prevents the formation of non-specific hybrids.
  • DNA having homology of 60% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more can be used as a condition for specifically hybridizing.
  • Stringent conditions can be appropriately determined according to a predetermined homology, and can be created by adjusting the salt concentration, temperature, etc. of the hybridization solution.
  • a hybridization procedure a library of DNA (chromosomal DNA or cDNA) obtained from the target gene source is first prepared. 'Incubate the library on a plate, transfer the grown colonies to a membrane such as nitrocellulose, and fix the DNA to the membrane by denaturation.
  • This membrane was labeled with 3 2 P or the like (in the base sequence from positions 1 3 3 to 3 4 6 4 of SEQ ID NO: 1 or from positions 1 9 2 3 to 3 8 0 9 of SEQ ID NO 1).
  • a solution containing a typical nucleotide sequence or a part thereof In a solution containing a typical nucleotide sequence or a part thereof), and hybridization is performed between DNA on the membrane and the probe. Hydration is performed under stringent conditions, for example, in a solution containing 6 XSSC, 1% SDS, lOO jug Zml salmon sperm DNA, 5 X denharz at 20 ° C for 20 hours. After hybridization, the non-specifically adsorbed probe is washed away, and clones that have hybridized with the probe are identified by autoradiography.
  • This operation is repeated until a single clone is formed.
  • the target fragment can be inserted into the clone thus obtained.
  • This fragment is an essential replication region of a plasmid is, for example, that a recombinant vector is prepared essentially based on the description in Examples 3 and 4 below or the description in Example 5 below, and transformed into Escherichia coli and lactic acid bacteria. Can be confirmed. In addition, it is within the range of normal creativity for those skilled in the art to optimize or optimize the numerical range under stringent conditions.
  • the essential replication region of the plasmid of the present invention is also 'unless it changes its function.
  • DNA containing the replication essential region of the plasmid of the present invention By using DNA containing the replication essential region of the plasmid of the present invention, a recombination vector capable of transformation into lactobacilli can be prepared. Furthermore, the DNA fragment containing the essential replication region of the plasmid of the present invention and the DNA fragment containing the essential replication region of the plasmid that can replicate autonomously in bacteria such as E. coli can be linked to allow autonomous replication in both lactic acid bacteria and E. coli. It can also be a simple shuttle vector. By using this shuttle vector, operations such as preparation of a plasmid and preparation of a recombinant plasmid incorporating a target gene can be performed using Escherichia coli.
  • the recombination vector of the present invention contains a DNA fragment containing the replication essential region of the plasmid of the present invention.
  • the DNA fragment is preferably derived from the pLC494 plasmid.
  • the remaining region of the recombination vector of the present invention may contain any DNA as long as it does not adversely affect the introduction of the vector into the host cell and the survival, proliferation, and function of the host cell into which the vector has been introduced. It may contain molecules.
  • the recombination vector of the present invention is produced by ligating a DNA fragment containing the replication essential region of the plasmid of the present invention and an arbitrary DNA fragment.
  • the above DNA fragment is ligated with any DNA fragment that does not adversely affect the survival, growth, and function of the host cell into which the vector has been introduced as well as the introduction of the vector into the host cell.
  • the DNA fragment is preferably derived from the pLC494 plasmid.
  • the DNA fragment derived from the pLC494 plasmid must have at least the nucleotide sequence from positions 1 9 2 3 to 3 4 6 4 of SEQ ID NO: 1. (BamHI to 0RF in the restriction enzyme map shown in Figure 1)
  • the recombination vector of the present invention further comprises an essential region for replication derived from bacteria.
  • an essential region for replication derived from bacteria in particular, in order to produce a shuttle vector of Escherichia coli and lactic acid bacteria, a replication-essential region of an Escherichia coli-derived plasmid capable of autonomous replication in Escherichia coli is preferable as a bacterially-required replication region.
  • coli-derived plasmids restriction mapping sequence and the known, pUC19, pJIR418, P UC18, pBR322, p BR329, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, such as P MW218, P ACYC177 Is mentioned.
  • PUC19, pUC18, pJIR418, pBR322, pACYC177 and the like are preferable in that they contain a replication initiation site and a rep gene as a replication essential region, and further include a cloning site.
  • pUC19 and PJIR418 are preferred. It is also possible to use the replication initiation region of vectors derived from Bacillus subtilis, such as pUB110, YEp24, and pVA838.
  • the recombination vector of the present invention can also be produced by ligating the above-mentioned DNA fragment and a DNA fragment containing a bacterially derived replication essential region to produce a plasmid vector.
  • a DNA fragment containing a bacterially-required replication region may be the entire bacterial-derived plasmid or a single fragment as long as it contains a replication-required region.
  • a DNA fragment containing a replication essential region of an E. coli-derived plasmid a DNA fragment containing a replication initiation site derived from pUC19, a DNA fragment containing pMBI derived from pJIR418, and the like can be mentioned.
  • the recombination vector of the present invention contains a DNA fragment containing a selection marker gene
  • detection of the transformed cell is facilitated by the phenotype of the selection marker gene in the transformed cell.
  • a marker that can be used in Lactobacillus opi E. coli. It can also be inserted into the recombination vector of the present invention by using a plasmid having the same. Marker genes that can be used in the lactic acid bacteria Op. Coli include drug resistance genes (erythromycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, kanamycin resistance gene, apicillin resistance gene, etc.).
  • genes that produce enzymes such as 3-galactosidase derived from lactic acid bacteria and extracellular proteases are preferable selectable marker genes from the viewpoint of food use.
  • complementary markers lactose metabolism or pyrimidine metabolism
  • the recombinant vector of the present invention for example, Lb. casei L - isolated the plasmid P LC494 49, appropriate restriction enzymes (eg if to obtain a fragment containing a replication-essential region, HindIII, BamHI, The resulting fragment is inserted into a plasmid carrying a marker gene that can be replicated in E. coli and is selectable in E. coli and lactic acid bacteria, amplified in E. coli, and then transformed into lactic acid bacteria. By doing so, it can be manufactured.
  • appropriate restriction enzymes eg if to obtain a fragment containing a replication-essential region, HindIII, BamHI
  • the resulting fragment is inserted into a plasmid carrying a marker gene that can be replicated in E. coli and is selectable in E. coli and lactic acid bacteria, amplified in E. coli, and then transformed into lactic acid bacteria. By doing so, it can be manufactured.
  • Such examples of the recombinant vector of the present invention thus obtained is, JLE4941 Oyopi pJLE4942 shown in FIG. 3, and a pJLE12 Oyopi P JLE121 shown in Oyopi Figure 6.
  • the plasmid and the recombination vector of the present invention can be replicated in the lactic acid bacteria O. coli.
  • it is useful as a genetic engineering tool for lactobacilli such as Lb. casei, Lb. casei subsp. A ⁇ actosus, Lb. gasseri- Lb.
  • lactobacilli such as Lb. casei, Lb. casei subsp. A ⁇ actosus, Lb. gasseri- Lb.
  • ⁇ can be expressed in the host microorganism.
  • Transformation of lactic acid bacteria and E. coli using the plasmid and recombination vector of the present invention can be performed by methods commonly used by those skilled in the art.
  • the large intestine Bacterial transformation is based on the description by Sambrook, J., Fritsch, EF, Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 jR, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY Can be implemented.
  • Electroporation techniques can be used for transformation of lactic acid bacteria, and various protocols for such techniques are known (Berthier, F. et al., Supra; Coffey: A., Harringtion, A.
  • the recombination vector of the present invention is obtained by, for example, culturing cells in MRS broth containing 1.0% glycine, washing the obtained cells with lOmM MgCl 2 buffer, and 10% glycerol elect Lb. casei can be conveniently transformed by resuspension in the mouth-poration solution and then electroporation with a capacitance of 1.75 kV, 200 ⁇ , and 25; iF.
  • the denatured DNA was taken out by centrifugation (14, OOOrpm for 15 minutes). Subsequently, the lysate was extracted with 700 ⁇ of 3% NaCl saturated phenol. After centrifugation (14, OOOrpm for 10 minutes), the aqueous phase was transferred to a new tube and DNA was extracted with 5 00 1 black mouth form--Isomil alcohol (24: 1, v / v) . Plasmid DNA was finally precipitated by adding 500 1 isopropanol at ⁇ 80 ° C. for 20 minutes, followed by centrifugation at 14, OOOrpm for 20 minutes. The plasmid DNA was then dried and resuspended in 20 1 TE buffer (containing 20 / ig / m 1 RNase).
  • Example 2 Nucleotide sequencing and analysis of plasmid pLC494 The entire nucleotide sequence of plasmid PLC494 was determined by sequencing of overlapping subclones. Of the five plasmids extracted from Lb. casei L-49 cells in Example 1, pLC494 was eluted using the Gel and PCR Clean-Up system (Promeg a Co., Madison, USA). Purified pLC494 was digested with restriction enzymes Sac I, to give two fragments of 2191bp and 6655b P. Furthermore, this 6 655 bp fragment was treated with Sphl to obtain 4 fragments.
  • the plasmid pLC494 and all 5 restriction fragments obtained by the above restriction enzyme digestion were electrophoresed in 0.8% agarose gel (Cambrex Bio Science Rockland, Inc., USA) After that, it was dyed with bromide chijumu. Each of the 5 fragments obtained was cloned into E. coli DH5 ⁇ cells using pUC19 treated with the same restriction enzymes.
  • the plasmid derived from E. coli cells was isolated by the alkaline lysis method (Sambrook et al. (Supra)). Restriction and modification enzymes were used according to the manufacturer's instructions. The general clawing procedure was performed as described by Sambrook et al. (Supra).
  • PCR was performed using universal primers M13-M4 (GTTTTC CCAGTCACGAC: SEQ ID NO: 3) and Ml 3- RV (GGMACAGCTATGACCATG: SEQ ID NO: 4).
  • DNA sequencing was performed using the ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) equipped with the ABI Prism BigDye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit according to the manufacturer's recommendations. Fram Plot program (Ish ikawa, J., Hotta, K .: FEMS Microbiol. Lett. 174, 2251—2253 (1999)) (http: // ww. Nih. Go. Jp / jun (/cgi-bn/frameplot.pi) was used.
  • the amino acid sequence of the ORF 4 translated protein is compared to the Lb. sakei-derived plasmid pRV500 (47%), Tetragenococcus halophilus-derived pUCL2 87 (45%), and Lb. plantarum-derived pMD5057 (46%). Also had significant homology.
  • the amino acid sequence of the translated protein of ORF 5 (positions 3 6 5 6 to 4 1 6 2 of SEQ ID NO: 1) shows 99% similarity to the replication protein rep B of plasmid PLA103 derived from Lb. acidophilus TK8912 And it showed 26% similarity to the replication protein rep B of pMD5057 derived from Lb. plantarum.
  • latent liposome binding site (RBS) (GGAGG) (positions 2 6 8 to 2 6 1 2 of SEQ ID NO: 1), putative promoter ((-35 region) TTA ACG (SEQ ID NO: 1 2 5 5 7 (-10 region) TATMT (positions 2 5 8 1 to 2 5 8 6 of SEQ ID NO: 1)), and repeat region (three complete 22 bp repeat regions and Comprised of one incomplete motif; putative replication origin) (positions 2 4 5 8 to 2 5 4 5 of SEQ ID NO: 1) Force was found upstream of the ATG start codon of ORF 4 ( Figure 2) . This arrangement is identical to that of pLA103.
  • plasmid P UCL287 containing region is configured de 22bp repeat sequence (origin of replication) have been identified as a novel type 0 Reburiko down family of lactic acid bacteria.
  • ⁇ -type replicons can be classified according to their dependence on the following three important components.
  • plasmid-encoded replication initiator Rep protein Required for chain opening and / or interaction with other components of the initiation complex
  • ori specific DNA structural organization Origin of replication
  • D NA polymerase I host-encoded D NA polymerase I (for nascent DNA synthesis)
  • ALPERT, CA et al. (Supra) report that the plasmids of pLA103, pRV500, and pMD5057 belong to the PUCL287 family.
  • the plasmid PLC494 belongs to the ⁇ type plasmid.
  • Example 3 Preparation of shuttle vector pJLE4942 for Escherichia coli lactic acid bacteria
  • E. coli-derived plasmid PJIR418 (Sloan, J., Warner, TA, Scott, PT, Bannam, TL, Berryman, DI, Rood, JI: Plasmid 2 7, 207-211 (1992)) was digested with Aval and gram A 4.9 kb fragment containing the positive chloramphenicol resistance gene (Cm (R)) was obtained. This 4.9 kb fragment was ligated to E.
  • coli-derived plasmid pUC19 (Bringel, F., Frey, L., Hubert, JC: Plasmid 22, 193-202 (1989)) digested with Ava I to obtain plasmid pJIRUCl. It was. The pJIRUCl fragment (4116 bp) double-digested with BamHI and Nhel was treated with Talenou fragment (TaKaRa) and then self-ligated to obtain plasmid pJIRUCll. On the other hand, pLC494 was digested with Hindlll to obtain a 2168 bp fragment, and this fragment was ligated to pUC19 treated with the same restriction enzyme to generate plasmid pLUl.
  • Plasmid LU1 contains the repeat region of repA gene of pLC494.
  • PJIRUCll double digested with Hindlll and BamHI was ligated with the 1887b P fragment of pLUl treated with the same restriction enzymes, and transformed into E. coli DH5a cells.
  • This constructed plasmid was named pJLE4941.
  • the constructed plasmid pJLE4941 was successfully introduced into E. coli and Lb. casei L-49-4 (without plasmid).
  • PJLE4941 was double digested with BamHI and Hpal and then self-ligated to obtain pJLE4942.
  • PJLE4941 and pJLE4942 are the ampicillin resistance gene (Amp (R)) and replication origin (ori) derived from pUC19; the Gram-positive chloram fluoresceol resistance gene (Cm (R)) derived from pJIR418; and the repeat region derived from pLC494 It has a hopA gene (Fig. 3).
  • Lb. casei L-49-4 (from which the plasmid was removed from Lb. casei L-49 cells), Lb. casei su bsp. Alactosus 34143, Lb. acidophilus NIAI L 54, Lb. delbruecki i sub sp. Bulgaricus 7235, Lb. gasseri JCM 1130, Leuconostoc mesenteroides (hereinafter referred to as “euc. MesenteroidesJ”) subsp. Mesenteroides OR—1-2, Enterococcus spp. Lactococcus lact is (hereinafter referred to as “Lc.
  • Lactis (“NIAI N-7”) NIAI N-7 (both from which the plasmid has been removed) and E. coli DH5 a cells were transformed.
  • the transformation of lactic acid bacteria described above can be performed according to various protocols (Berthier, F. et al., Supra; Coffey, A. et al., Supra; GASS ON, MJ et al., Supra; Serror, P. et al., Supra). This was done by electroporation.
  • E. coli transformation was performed as described by Sambrook et al. Ligated DNA and competent E. coli cells were mixed and maintained on ice for 30 seconds.
  • Cell samples to be transformed were transferred to a 0.1 cm cuvette (Bio-Rad, UK) and transformed with a gene pulser (peak voltage l. 5 kV; capacitance 25 F; resistance 200 ⁇ ; Bio-Rad).
  • a gene pulser peak voltage l. 5 kV; capacitance 25 F; resistance 200 ⁇ ; Bio-Rad.
  • the transformed E. coli cells were seeded on LB agar medium (Nacalai Testa Co., Ltd.) containing lOO g / ml ampicillin (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) and 37 ° with shaking. Incubate at C for 30 minutes to select viable cells.
  • Transformed lactic acid bacteria cells contain 10 / ig / ml chloramphee-chol (Sigma) Inoculated on MRS medium (Oxoid, Basingstoke, England) and incubated at 37 ° C for 30 minutes without shaking to select viable cells.
  • Vector PJLE4942 together are transformed into E. coli DH5 "cells, Lb. c asei L-49-4 ( 1. 3 X 10 5 (1 ⁇ transformants per ⁇ DNA)), Lb. cas ei subsp. alactosus 34143 (2. X 10 2 ), Lb. gasseri JCM 1130 ( ⁇ 10 1 ), and Lb. acidophilus NIAI L 54 (4. 9 X 10 3 ) and Figure 4 shows pJLE4942 Electrophoresis photographs of plasmid DNA extracted from Escherichia coli and various Lactobacillus transformed with E. coli Extraction of plasmid DNA from various Escherichia coli and Lactobacillus.
  • Figure 4 shows that vector PJLE4942 has been introduced into E. coli cells and various lactobacilli (lane 1: E. coli DH5a cells; lane 2: Lb. casei L-49-4; lane 3) Lb. casei subsp. Alactosus 34143; Lane 4: Lb. acidopilus NIAI L-54; Lane M is a molecular weight marker).
  • pJLE4942 transformants were not obtained from Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 7235, Leuc. mesenteroide s subsp. mesenteroides OR—1-2, Enterococcus spp., and Lc. lactis N IAI N-7 .
  • PJLE4942 was introduced into E. coli DH5 a cells and Lb. casei L-49-4 cells in the same manner as described above, and then the introduced plasmid was transferred to Otsuki Koji DH5 a cells and Lb. casei L-49. -4 cells were extracted in the same manner as in Example 1.
  • the extracted plasmid was digested with Hindlll; EcoRV and Bglll; or EcoRI. Fragments obtained by digestion with these restriction enzymes were subjected to agarose gel electrophoresis and analyzed.
  • Figure 5 shows the results of agarose gel electrophoresis of the fragments obtained by digestion with restriction enzymes (lanes 1 to 3 are E.
  • lanes 4 to 6 are Lb. casei L-49-4 cell results. Lanes 1 and 4 are treated with Hindlll; lanes 2 and 5 are treated with EcoRV and Bglll; lanes 3 and 6 are treated with EcoR I; two lanes M at both ends are 1 kb ladders). As shown in Figure 5. Restriction enzyme analysis revealed that the plasmid did not show any constitutive rearrangement.
  • PJIR418 was digested with Ndel to remove the PIP404 Ori and P IP404 Rep. This was then self-ligated to obtain a 5533 bp plasmid pJIRl.
  • pLC494 2466 bp; containing ori, repA and repB
  • This constructed vector was called pJLE12 (6297bp).
  • PJLE12 and pJLE121 includes a replication initiation site derived from pJIR418 (P MBI) and Ellis port hygromycin resistance gene (selection for both gram positive and negative bacteria markers), PLC 4 9 4-derived ori (2 2 bp repeat region) and repA.
  • Lb.casei L-49-4 cells in the MRS process supplemented with 0.2-3.0% (w / v) glycine and in MRS broth without any addition as a control experiment. Grow to about 0.2-0.3. Cells were harvested and washed with 10 mM MgCl 2 solution, resuspended in 10% glycerol electopore position solution, and then electroporated under standard conditions. Addition of 1.0% glycine to MRS broth produced the highest transformation efficiency (1.2 ⁇ 10 5 transformants per 1 zg DNA) compared to the control experiment and other concentrations tested. Therefore, in subsequent experiments, MRS Pros supplemented with 1.0% glycine was used.
  • the pJLE121 betater obtained in Example 5 was cleaved with restriction enzymes BamHI and BglII, and self-ligated to produce the betater B (HI-BglII) pJLE121 from which Bglll was deleted from BamHI as shown in FIG. did.
  • Using the deletion vector ⁇ (BamHI—Bg III) PJLE121 and the control non-deleted vector pJLE121 transform into Lb.casei L-49-4 cells in the same manner as in Example 5. were plated in MRS agar plates containing concentrations 16 mu 8 / ml of erythromycin (Sigma), and incubated for 30 min at 37 ° C for without vibration ⁇ were selected viable cells.
  • plasmids and vectors for transformation of lactic acid bacteria having a broad host range are provided.
  • the plasmid and vector of the present invention are also capable of stable replication in Lactobacillus.
  • Lb. casei and other lactic acid bacteria (particularly, lactobacilli) can be further improved by genetic manipulation to be applied industrially.
  • the plasmids and vectors of the present invention are GRAS organisms, and are commercially used as probiotics. Since it is derived from i, it is useful for the development of food opioids.

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Abstract

本発明のプラスミドおよび組換え用ベクターは、少なくとも配列番号１の１９２３位から３４６４位の塩基配列で示されるＤＮＡ領域、または該塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつθ型の複製能を保持するＤＮＡ領域、またはその機能を変更しない限り該塩基配列から１つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列を有するＤＮＡ領域を含む。本発明のプラスミドおよび組換え用ベクターは、広宿主域で安定に形質転換可能である。

Description

乳酸菌用プラスミ ド
技術分野
本発明は、 乳酸菌の形質転換が可能なプラスミドおよびべクタ一に関する。 より詳細には、 本発明は、 広宿主域を有する、 乳酸菌の形質転換のためのプ 明
ラスミドおよびベクターに関する。
田 背景技術
多くの乳酸菌の菌株が、 発酵食品の製造において必須の生体触媒機能を有 している。 ヒトは、 発酵食品の成分として、 有害な作用がもたらされること なくこれらの微生物を摂取している。 このため、 これらの微生物は、 「食品 グレード」 に分類される。 したがって、 乳酸菌は、 食品おょぴ食品成分の栄 養価や質を向上させる乳酸菌培養物を開発することを目標とした研究の標的 となっている （SOffiUTI, G. A. , STEINBERG, D. H.： Biotechnol. Lett. 25, 473-477 (2003) ) 。
Lactobacillus (乳酸桿菌） 種は、 ヒトおよび動物の胃腸管の常在菌であ り、 そしてその腸内平衡を改善することによつて宿主に対して有益な効果を 供給する一種のプロバイオテイクスである （Tannock, G. W.： Appl. Environ.
Microbiol. 70, 3189-3194 (2004) ) 。 Lactobacillus casei (以下、 「Lb. caseij という） は、 乳酸菌の一種であり、 ヒ トの胃腸管だけでなく、 多く の食用製品 （例えば、 植物、 乳および肉の発酵品） 、 サイレージ、 他の自然 環境などにおいて見られる。 近年、 Lb. caseiは、 本来の風味を有する新規 発酵乳製品の製造に使用され、 ある種の健康上の利益が要求されている （G0 SALBES, M. J.， VICENTE, M. , GASPAR, P. M.： J. Bacteriol. 131， 3928-3 934 (1999) ぉょぴ GASSON, M. J.， DE VOS, W. M.： Genetics and biotechn ology of lactic acid bacteria, 第 1版 Blackie A. & P. , London (199 4) ) 。 この理由から、 Lb. casei は、 「一般に安全な」 （GRAS) 生物であ り、 プロバイオテイクスとして商業的に使用されている （ISABEL, P. A. , G ASPAR, P. M.： FEMS Microbiol. Lett. 222, 123-127 (2003) ) 。 プロバイ ォテイクスとは、 食物に添加され、 健康を増進させる生菌である。 このよう なプロバイオテイク微生物には、 乳酸桿菌、 ビフィズス菌、 Streptococcus salivarius, Saccharomyces boulardii、 大腸菌など力 Sある。 これらの微生 物は、 生存可能な形で口から摂取されると、 以下のような利益をもたらすと 考えられている ：腸への付着；病原体の成長阻止；発癌性物質の結合または 分解；他の細菌の競合的排除または他の細菌の代謝の変化；抗腫瘍物質の生 産；免疫機能の刺激。
このグループの GMS生物に関する遺伝子操作技術を迅速に開発し、 そして それらの遺伝子構造、 遺伝子発現、 および蛋白質分泌の知識を増やすことに より、 乳酸菌は、 食物製品および医薬の新規品や改良品の開発といった新た なバイォテクノロジ一適用に対して有用となり得る （LEENHOUTS, K. , B0LHU IS, A. , VENEMA, G.， K0K, J. ： Appl. Microbiol. Biotechnol. 49， 417—42 3 (1998) ) 。 そこで、 乳酸菌に由来するプラスミドが多くの研究の焦点と なっており、 これにより種々のシャトルベクターおよび組込みベクターの開 発が行われている （JANG, S. J. , HAM, M. S. , LEE, J. M.， CHUNG, S. K.， LEE, H. J.， KIM, J. H. , CHAN, H. C.， LEE, J. H.， CHUNG, D. K.： FEMS Microbiol. Lett. 224, 191—195 (2003) および BIET, F.， CENATIEMPO, Y. , FREMAUX, C.： Appl. Environ. Microbiol. 68， 6451-6456 (2002) ) 。 多 くの Lactobacillus株は、 種々の大きさの天然に常在するプラスミドを 1つ 以上有している （REN， D. , WANG, Y. , WANG, Ζ·， CUI， J. , LAN, H. , ZHOU, J. Plasmid 50, 70-73 (2003) ) 。 これらのプラスミ ドには、 種々の機能 が既に見出されている。 その中には、 ラタトース代謝、 パクテリオシン合成、 ェキソ多糖 （E P S ) 産生、 または D NA制限修飾に関する遺伝子がある。 分子生物学の発展および Lactobacillusの機能的遺伝子解析の進行とともに、 潜在的に有用な食品グレードのベクターとしての.レプリコン自体の特徴づけ に関する関心も高まっている （ALPERT, C. A.， CRUTZ-LE COQ, A. M.， MALL ERET, C.， ZAGOREC, M.： Appl. Environ. Microbiol. 69， 5574-5584 (200 3) ) 。
Lactobacillus菌属の多くの細菌がエレクトロポレーションによって开質 転換可能であることが示されている。 したがって、 これらの細菌は、 組換え D N A技術を受けることができ、 最終的には菌株を改善することができる
(Isabel, P. A. , Manuel, Ζ. , Gaspar, P. M.： Plasmid 46, 106—116 (200 1) ) 。 レ、くつかの Lactobacillus菌種、 例えば、 Lb. easel (Chassy, B. .， Flickinger, J. L.： FEMS Microbiol. Lett. 44, 173 - 177 (1987) ) 、 Lacto bacillus delbrueckii (以下、 「Lb. delbrueckiij とレヽっリ (S error, P.，
Sasaki, T.， Ehrlich, S. D.， Maguin, E.： Appl. Environ. Microbiol. 68,
46-52 (2002) ) 、 Lactobacillus helveticus (Bhowmik, T.， Steele, J. L.： J. Gen. Microbiol. 139, 1433-1439 (1993) ) 、 および Lactobacillus sakei (以下、 「Lb. sakei」 といつ) (Berthier, F.， Zagorec, M. , Mari e, C. V. , Ehrlich, S. D.， Francoise, M. D.： Microbiology 142, 1273—1279
(1996) ) について、 エレク トロポレーシヨン技術が開発されている。 例え ば、 Lb. caseiのエレクト口ポレーシヨンに関する Chassy, B. M.ら （前出） に は、 Lb. casei菌株からプラスミ ド pLZ15を抽出し、 エレクト口ポレーシヨン で元の菌株 （Lb. casei) に形質転換することが記載されている。
遺伝子操作により乳酸菌の機能性などを向上させるために、 特にヒトへの 利用を考慮した場合に、 安全性の面から、 ベクターとして、 食経験のある乳 酸菌由来のプラスミドを用いたベクターを利用し、 乳酸菌の形質転換を行う ことが望まれている。 以下の Lactobacillus由来のプラスミドは、 全ヌクレ ォチド配列が分析されている： pLA103 (Lactobacillus acidophilus (以下 I Lb. acidophilusj とレヽつ) 由来、 Kanatani, K. , Tahara, Τ·， Oshimura, M. , Sano, K. , Umezawa, C. ： FEMS Microbiol. Lett. 133， 127-130 (199 5) ) ； pRV500 (Lb. sakei 由来、 ALPERT, C. A.ら， 前出； pMD5057 (Danie lsen, M.： Plasmid 48, 98-103 (2002) ) 、 pLP2000および pLP9000 (REN, D. ら， 目 ί出) (レヽずれも Lactobacillus plantarum (以下 「Lb. plantarum」 と いう） 由来） ； pTC82 (Lactobacillus reuteri由来： Lin， C. F. , Fung, Z. F. , Wu, C. L. , Chung, T.： Plasmid 36， 116—124 (1996) ) ；および pLC2 (L actobacillus curvatus由来： Klein, J. R. , Ulrich, C. , PI卿， R.： Plasm id 30， 14-29 (1993) ) 。 これらは、 その複製蛋白質遺伝子または機能的蛋 白質遺伝子を使用することによって、 クローユングベクターまたは発現べク ターの構築のために使用されている。 特開 2 0 0 4 - 1 4 1 0 6 5号公報に は、 食経験豊富な乳酸菌である Lb. caseiにプラスミドが存在し、 当該ブラ スミドにより菌の増殖が高められていることを見出したこと、 および当該プ ラスミド由来の複製必須領域を用いた乳酸菌用シャトルベクターが記載され ている。
また、 バイオテクノロジー適用について広範な宿主に利用可能なベクター は、 有用である。 このため、 広域の乳酸菌宿主において安定に複製可能なプ ラスミドを用いたベクターを得ることが望まれている。 このような広宿主域 プラスミドとして、 pSYl (特開平 5— 1 7 6 7 7 6号公報） および ρΜΠ (特 開 2 0 0 2— 2 5 3 2 6 0号公報） が報告されている。 pSYlは、 Lactococcu s lactis subsp. lactisの一株から分離されたプラスミドであり、 Bacillus や Lactococcus属、 さらに、 Lactobacillus delbrueckii種の 2つの亜種 la ctisと bulgariusにおいて複製が可能で、 それちの菌を形質転換させる能力 を有している （特開平 5 _ 1 7 6 7 7 6号公報） 。 pMTlは、 Streptococcus thermophilus由来のプラスミドであり、 0型の複製を行い、 Streptococcus thermophilus (サーモフィルス菌） およぴチーズ乳酸菌 (Lactococcus lact is) で複製できることが報告されている （特開 2 0 0 2— 2 5 3 2 6 0号公 報） 。
プロバイオテイクスを好適に利用するために、 ヒトへの摂取に適した微生 物の性質のさらなる向上を可能としたベクターを得ることが望ましい。 した がって、 プロバイオティク微生物として認められている種々の乳酸菌におい て安定に複製可能なプラスミドが期待されている。 特に、 Lb. caseiを初め とする乳酸棒 (他に、 Lactobacillus casei subsp. alactosus、 Lactobac illus gasseri (以下 「L b, gasserij とレヽう) 、 Lb. acidophilusなど力 S含 まれる） を安定に形質転換できるベクターが期待されている。
発明の開示
本発明は、 広宿主域を有する、 乳酸菌の形質転換のためのプラスミドおよ びベクターを提供することを目的とする。 本発明は、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位の塩基配列で示される D NA領域、 または該塩基配列に相捕的な配列を有する D N Aとストリンジ ェントな条件でハイブリダイズし、 かつ Θ型の複製能を保持する D N A領域、 またはその機能を変更しない限り該塩基配列から 1つ以上の塩基の置換、 欠 失、 または付加を有する塩基配列を有する D N A領域を含むプラスミドを提 供する。
本発明はまた、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 8 0 9位の塩基配列で示さ れる D N A領域、 または該塩基配列に相捕的な配列を有する D NAとストリ ンジヱントな条件でハイブリダィズし、 かつ Θ型の複製能を保持する D N A 領域、 またはその機能を変更しない限り該塩基配列から 1つ以上の塩基の置 換、 欠失、 または付加を有する塩基配列を有する D N A領域を含むプラスミ ドを提供する。
本発明はさらに、 配列番号 1の 1位から 8 8 4 6位の塩基配列で示される プラスミド p L C 4 9 4を提供する。
本発明は、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6.4位の塩基配列で示される D NA領域、 または該塩基配列に相補的な配列を有する D NAとスト'リンジ ェントな条件でハイプリダイズし、 かつ 0型の複製能を保持する D N A領域、 またはその機能を変更しない限り該塩基配列から 1つ以上の塩基の置換、 欠 失、 または付加を有する塩基配列を有する D N A領域を含む D NA断片を含 む、 組換え用ベクターを提供する。
本発明はまた、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 8 0 9位の塩基配列で示さ れる D NA領域、 または該塩基配列に相補的な配列を有する D NAとストリ ンジェントな条件でハイブリダイズし、 かつ 0型の複製能を保持する D N A 領域、 またはその機能を変更しない限り該塩基配列から 1つ以上の塩基の置 換、 欠失、 または付加を有する塩基配列を有する D N A領域を含む D N A断 片を含む、 組換え用ベクターを提供する。
一つの実施形態では、 本発明の組換え用ベクターは、 細菌由来の複製必須 領域をさらに含む。
さらなる実施形態では、 本発明の組換え用ベクターは、 選択マーカー遺伝 子をさらに含む。
本幾明は、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位の塩基配列で示される D NA領域、 大腸菌由来の複製必須領域、 および選択マーカー遺伝子を含み、 以下に示す制限酵素地図：
Figure imgf000009_0001
を有する、 組換え用プラスミドベクター p J LE4942を提供する。
本努明はまた、 配列番号 1の 1923位から 3464位の塩基配列で示さ れる DNA領域、 大腸菌由来の複製必須領域、 および選択マーカー遺伝子を 含み、
Figure imgf000009_0002
を有する、 組換え用プラスミドベクター!） J LE 121を提供する。
本発明は、 組換え用ベクターを作製する方法を提供し、 該方法は、 配列番 号 1の 1923位から 3464位の塩基配列で示される DN A領域、 または 該塩基配列に相捕的な配列を有する DNAとストリンジェントな条件でハイ プリダイズし、 かつ 0型の複製能を保持する D NA領域、 またはその機能を 変更しない限り該塩基配列から 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 または付加を 有する塩基配列を有する D N A領域を含む DN A断片と、 任意の D N A断片 とを連結する工程を含む。
本発明はまた、 組換え用ベクターを作製する方法を提供し、 該方法は、 配 列番号 1の 1 9—2 3位から 3 8 0 9位の塩基配列で示される D N A領域、 ま たは該塩基配列に相補的な配列を有する D NAとストリンジヱントな条件で ハイブリダィズし、 かつ 0型の複製能を保持する D N A領域、 またはその機 能を変更しない限り該塩基配列から 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 または付 加を有する塩基配列を有する D N A領域を含む D N A断片と、 任意の D NA 断片とを連結する工程を含む。
一つの実施形態では、 上記の組換え用ベクターを作製する方法は、 上記 D N A断片をプラスミド p L C 4 9 4から取得する工程をさらに含む。
別の実施形態では、 上記の組換え用ベクターを作製する方法において、 上 記任意の D NA断片は、 細菌由来の複製必須領域を含む D N A断片である。 さらなる実施形態では、 上記の組換え用ベクターを作製する方法において、 上記プラスミドベクターは、 選択マーカー遺伝子をさらに含む。
本発明はまた、 上記のいずれかのプラスミドまたは組換え用ベクターを含 む形質転換細胞を提供する。
一つの実施形態では、 上記形質転換細胞は乳酸菌である。
さらなる実施形態では、 上記乳酸菌は、 Lb. casei、 Lb. casei subsp. al actosus、 Lb. gasseri、 および Lb. acidophilus力 らなる群力 ら選択される 乳酸桿菌である。 なおさらなる実施形態では、 上記乳酸菌は Lb. caseiであ る。
別の実施形態では、 上記形質転換細胞は大腸菌である。
本発明は、 乳酸菌を形質転換する方法を提供し、 該方法は、 上記のいずれ かの組換え用ベクターを乳酸菌に導入する工程を含む。
一つの実施形態では、 上記乳酸菌は Lb. casei、 Lb. casei subsp. alacto sus、 Lb. gasseri, および Lb. acidophilusからなる群から選択される乳酸 桿菌である。 なおさらなる実施形態では、 上記乳酸菌は Lb. caseiである。 別の実施形態では、 上記の形質転換方法において、 上記導入は、 エレク ト 口ポレーションによって行われる。
本発明によれば、 広宿主域を有する、 乳酸菌の形質転換のためのプラスミ ドおよびべクタ一が提供される。 本発明のプラスミドおよびベクターはまた、 乳酸桿菌において、 安定に複製可能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 プラスミド pLC494の模式図である。
図 2は、 プラスミド pLC4 の潜在リボソーム結合部位 （R B S ) 、 推定プ 口モーター、 および反復配列領域 （推定複製起点） の位置および配列を示す 図である。
図 3は、 シャトルべクタ一 pJLE4942の構築を示す模式図である。
図 4は、 PJLE4942で形質転換された大腸菌おょぴ種々の乳酸桿菌から抽出 したプラスミド D NAの電気泳動写真である。
図 5は、 p JLE4942で形質転換された大腸菌 DH5 a細胞およぴ Lb. casei L - 4 9- 4細胞から抽出したプラスミド D N Aの電気泳動写真である。
図 6は、 シャトルベクター PJLE121の構築を示す模式図である。
図 7は、 Lb. casei L- 49-4細胞の形質転換効率に対する電気パラメーター の影響を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明のプラスミドは、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位の塩基配 列で示される D NA領域を含むプラスミドである。 あるいは、 本発明のブラ スミドは、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 8 0 9位の塩基配列で示される D N A領域を含む。 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位の塩基配列で示さ れる D N A領域は、 本発明のプラスミ ドの複製.において必須の領域 （以下 「複製必須領域」 という） であり、 反復配列領域 （推定複製起点） およぴ複 製蛋白質遺伝子 （r e p遺伝子） を含む。 特に、 上記反復配列領域の上流に 位置する配列番号 1の 1 9 2 3位から 2 4 1 4位の塩基配列で示される D N A領域は、 このプラスミ ドを含む宿主中でプラスミドが安定に複製するため に必要である。
本発明のプラスミドは、 Lb. caseiから単離し得る。 Lb. caseiとしては、 ヒト腸管由来の Lb. caseiが挙げられる。 このようなヒト腸管由来の Lb. cas ei株としては、 例えば、 Lb. casei L - 49株が挙げられる。 Lb. casei L - 49株 は、 乳幼児の糞便より単離された菌株である。 Lb. casei L- 49から得られた プラスミド pLC494は、 本発明のプラスミドに包含される。
本発明のプラスミドは、 通常用いられる遺伝子工学的手法に従って、 Lb. caseiから分離して調製することができる。 例えば、 Lb. casei L - 49株を培 養し、 次いでこれを集菌し、 乳酸菌を溶菌させるための公知の方法 例えば、 リゾチームを用いる方法） により溶菌し、 得られた溶菌物から、 例えばクロ 口ホルム一^ f ソアミルアルコールで D N Aを抽出し、 遠心分離のような通常 用いられる方法によってプラスミドを分離 ·精製することにより、 得ること ができる。
培養は、 通常乳酸菌に用いられる培地や培養条件により行えばよい。 例え ば、 培地として、 乳糖を添加した MR S培地等を用い、 静置培養等の培養法 により、 約 3 4 °C〜約 3 7 °Cの範囲で、 通常約 1日間〜約 2日間培養するの が好ましい。
得られたプラスミドは、 公知のプラスミドと同様に、 制限酵素による切断、 リガーゼによるライゲーシヨン （連結） などの遺伝子操作を行うことができ る。
プラスミ ドの構造決定は、 通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を用いる ことができる。 すなわち、 本発明のプラスミドの.各種制限酵素消化断片を、 大腸菌を宿主生物とするプラスミドベクターに揷入し、 大腸菌を形質転換し た後、 当該プラスミドベクターの D NAを抽出し、 これを市販の塩基配列決 定装置 （シーケンサー） に供する。 決定された塩基配列は、 市販のパーソナ ルコンピュータ用の遺伝子解析ソフトウェアなどを使用すれば、 制限酵素地 図の作成や既知の核酸塩基配列データとの比較検討などを行うことができる。 また、 本明細書中に記載の配列情報をもとに P C Rなどの方法を用いて、
Lb. casei菌または他の微生物から本発明のプラスミドの複製必須領域を有 するプラスミドを取得すること、 および塩基配列を決定することによってそ れらが本発明のブラスミドと同一の複製必須領域を有するか否かを容易に確 認できる。
Lb. casei L - 49から単離されたプラスミド pLC494は、 8846bpの大きさを有 し、 その制限酵素地図は図 1に示す通りである。 プラスミド PLC494の全 D N A配列は、 配列番号 1に示す通りである （配列番号 1の 1〜8 8 4 6位） 。 プラスミド pLC494は、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位の塩基配列で 示される D N A領域を含み、 これは、 図 1に示す制限酵素地図中の BamHIか ら 0RF4 (repA) の終止コドンの前までの部位に対応する。 あるいは、 配列番 号 1の 1 9 2 3位から 3 8 0 9位の塩基配列で示される D N A領域を含み、 これは、 図 1に示す制限酵素地図中の BamHIから Hindlllまでの部位に対応す る。 プラスミド pLC494においては、 上記領域が複製必須領域であり、 反復配 列領域 （配列番号 1の 2 4 5 8位〜 2 5 4 5位） （図 1中 「反復領域」 ) 、 およぴ複製蛋白質遺伝子 ( r e p遺伝子） （配列番号 1の 2 6 1 9位〜 3 4 6 4位） （図 1中 「0RF4 (repA) 」 ） を含む。 反復配列は、 3つの完全な 22 bpの反復領域と 1つの不完全なモチーフとで構成される、 推定複製起点であ る。 特に、 反復配列領域の上流に位置する配列番号 1の 1 9 2 3位から 2 4
1 4位の塩基配列で示される D N A領域 （図 1に示す制限酵素地図中の BamH Iから Bglllまでの部位に対応） は、 このプラスミ ドを含む宿主中でプラスミ ドが安定に複製するために必要である。
本発明のプラスミ ドは、 シータ （0 ) 型の複製を行うプラスミ ドであると 考えられる。 0型プラスミ ドでは、 一つの複製起点から 0型の中間体分子を 経て複製が進行し、 構造的に安定であることが知られている。 0型プラスミ ドは 2つのグループに大別される。 第 1は、 ρΑΜ 1などの広宿主域の接合伝 達プラスミ ドであり、 これらは、 30kb前後と大きいものが多いため遺伝子操 作の際の取扱いが難しい。 そのため、 欠失などによって小さくしたプラスミ ドをベクターとして用いることが多い。 第 2は、 Lactococcus lactis由来の PCI305に代表され、 比較的小さく構造的にも安定であるが宿主域が狭いプラ スミ ドである （特開 2 0 0 2— 2 5 3 2 6 0号公報） 。 本発明のプラスミ ド は、 比較的小型であり、 力つ Lb. casei、 Lb. casei subsp. alactosus. Lb. gasseri、 および Lb. acidophilusで複製可能であることが示されたように、 広宿主域を有する。
さらに、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位または配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 8 0 9位の塩基配列に相捕的な塩基配列を有する D N Aとスト リンジェントな条件でハイブリダイズし、 かつ θ型の複製能力を有する D N A断片もまた、 本発明のプラスミ ドの複製必須領域として用いることができ る。 このような D NA断片は、 上記配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位 または配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 8 0 9位の塩基配列またはその一部の 相捕配列をプローブとしてコロニーまたはプラークハイブリダイゼーシヨン を行うことにより得ることができる。 なお、 本明細書において用いる用語
「ストリンジェントな条件」 は、 いわゆる特異的なハイプリ ドが形成され、 非特異的なハイプリッドが形成されない条件をいい、 例えばある塩基配列と
6 0 %以上、 好ましくは 8 0 %以上、 さらに好ましくは 9 0 %以上の相同性 を有する D N Aのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。 ストリンジェントな条件は、 所定の相同性に応じて適宜決定され得、 ハイプ リダィゼーシヨン溶液の塩濃度、 温度などを調節することにより作り出すこ とができる。 ハイブリダィゼーシヨンの手順としては、 まず目的の遺伝子源 から得た D NA (染色体 D NAまたは c D NA) のライブラリーを作製する。' そのライブラリーをプレート上で培養し、 生育したコロニー等をニトロセル ロースなどの膜に移し取り、 変性処理により D N Aを膜に固定する。 この膜 を3 2 Pなどで標識したプロープ （上記配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4 位または配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 8 0 9位の塩基配列に相捕的な塩基 配列またはその一部） を含む溶液中で保温し、 膜上の D NAとプローブとの 間でハイブリダイゼーシヨンを行う。 ハイプリダイゼーションはストリンジ ェントな条件下、 例えば 6 X S S C、 1 % S D S、 l O O ju g Zm lのサ ケ精子 D NA、 5 Xデンハルツを含む溶液中で 6 5 °Cで 2 0時間行う。 ハイ プリダイゼーシヨン後、 非特異的に吸着したプローブを洗い流し、 オートラ ジオグラフィーなどによりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定 する。 この操作をハイプリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。 こうして得られたクローンの中には目的の断片が揷入され得る。 この断片が プラスミドの複製必須領域であることは、 例えば、 下記実施例 3および 4の 記載または下記実施例 5の記載に本質的に基づいて組換えベクターを作製し、 大腸菌および乳酸菌に形質転換することにより確認できる。 また、 ストリン ジェント条件における数値範囲の最適化または好適化を図ることは、 当業者 であれば通常の創作能力発揮の範囲内にある。
本発明のプラスミ ドの複製必須領域はまた、'その機能を変更しない限り
(例えば、 Θ型の複製能力を有する） 、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位または配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 8 0 9位の塩基配列から 1つ以上 の塩基の置換、 欠失、 または付加を有する塩基配列を有する D N Aであって あよい。
本発明のプラスミドの複製必須領域を含む D N.Aを用いることにより、 乳 酸菌に対して形質転換が可能な耝換え用ベクターを作製することができる。 さらに、 本発明のプラスミドの複製必須領域を含む D N A断片と、 大腸菌な どの細菌で自律複製可能なブラスミドの複製必須領域を含む D N A断片とを 連結し、 乳酸菌と大腸菌との双方で自律複製が可能なシャトルベクターとす ることもできる。 このシャトルベクターを利用することにより、 プラスミド の調製、 目的遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドの調製などの操作を、 大 腸菌を用いて行うことができる。
本発明の組換え用ベクターは、 本発明のプラスミドの複製必須領域を含む D NA断片を含む。 上記 D NA断片は、 好ましくは、 pLC494プラスミドに由 来する。 本発明の組換え用ベクターの残りの領域には、 ベクターの宿主細胞 への導入、 ならびにベクターが導入された宿主細胞の生存、 增殖、 および機 能に有害な影響を与えない限り、 いかなる DN A分子を含んでいてもよい。 本発明の組換え用ベクターは、 本発明のプラスミドの複製必須領域を含む D NA断片と、 任意の DN A断片とを連結することにより作製される。 すな わち、 上記 D N A断片と、 ベクターの宿主細胞への導入ならぴにベクターが 導入された宿主細胞の生存、 増殖、 および機能に有害な影響を与えない任意 の D NA断片とを連結してプラスミドベクターを作製する。 上記 D NA断片 は、 好ましくは、 pLC494プラスミドに由来する。 pLC494プラスミドに由来す る D NA断片を用いて組換え用ベクターを作製する場合、 pLC494プラスミド に由来する D N A断片は、 少なくとも、 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位の塩基配列で示される領域 （図 1に示す制限酵素地図中の BamHIから 0RF
4 (repA) の終止コドンの前までの部位に対応） または配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 8 0 9位の塩基配列で示される領域 （図 1に示す制限酵素地図中 の BamHIから Hindlllまでの部位に対応） を含み、 より長いものであってもよ い。 但し、 pLC494プラスミドに由来の D N A断片は、 ベクターの宿主細胞へ の導入または安定な複製を妨げるものであってはならない。
一つの実施形態では、 本発明の組換え用ベクターは、 細菌由来の複製必須 領域をさらに含む。 特に大腸菌と乳酸菌とのシャトルベクターを作製するた めには、 細菌由来の複製必須領域として、 大腸菌で自律複製可能である大腸 菌由来プラスミドの複製必須領域が好ましい。 大腸菌由来プラスミドとして は、 制限酵素地図、 配列などが公知の、 pUC19、 pJIR418、 PUC18、 pBR322、 p BR329、 pHSG299、 pHSG298、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010、 pMW119、 pMW118、 pMW219、 PMW218、 PACYC177などが挙げられる。 複製必須領域として、 複製開 始部位と rep遺伝子とを含み、 さらにマルチクローユングサイトを含む点で. pUC19、 pUC18、 pJIR418、 pBR322、 pACYC177などが好ましい。 特に、 pUC19お よび PJIR418が好ましい。 また、 pUB110、 YEp24、 pVA838などの、 枯草菌ゃ酵 母由来ベクターの複製開始領域などの使用も可能である。
本発明の耝換え用ベクターはまた、 上記 D N A断片と細菌由来の複製必須 領域を含む D N A断片とを連結してプラスミドべクターを作製することによ つて作製され得る。 細菌由来の複製必須領域を含む D N A断片は、 複製必須 領域を含むものであれば、 その細菌由来プラスミドの全体であってもよく、 あるいは一断片であってもよい。 例えば、 大腸菌由来プラスミドの複製必須 領域を含む D N A断片としては、 pUC19由来の複製開始部位を含む D NA断 片、 pJIR418由来の pMBIを含む D NA断片などが挙げられる。
また、 本発明の組換え用ベクターが、 選択マーカー遺伝子を含む D N A断 片を含む場合、 形質転換細胞中での選択マーカー遺伝子の表現型によって、 形質転換細胞の検出が容易となる。 乳酸菌おょぴ大腸菌に使用可能なマーカ 一遺伝子は、 大腸菌で複製可能である大腸菌複製必須領域とともにこれを保 有するプラスミドを用いることによつても、 本発明の組換え用ベクターに挿 入できる。 乳酸菌おょぴ大腸菌に使用可能なマーカー遺伝子には、 薬剤耐性 遺伝子 （エリスロマイシン耐性遺伝子、 クロラムフエニコール耐性遺伝子、 カナマイシン耐性遺伝子、 ア ピシリン耐性遣 子など） がある。 ヒ トへの 利用を考えた場合、 乳酸菌由来の )3—ガラクトシダーゼ、 菌体外プロテア一 ゼなどの酵素を産生する遺伝子などが、 食品使用という観点から好ましい選 択マーカー遺伝子である。 また、 食品用ベクターのために、 相補マーカー (乳糖代謝またはピリミジン代謝） も好ましく使用できる。
本発明の組換え用ベクターは、 例えば、 Lb. casei L - 49から単離されたプ ラスミド PLC494を、 複製必須領域を含む断片を得るのに適当な制限酵素 （例 えば、 HindIII、 BamHI、 Nhel) で切断し、 得られた断片を、 大腸菌で複製可 能でありかつ大腸菌と乳酸菌で選択可能なマーカー遺伝子を保有するプラス ミドに揷入し、 大腸菌内で増幅した後、 乳酸菌に形質転換することにより製 造することができる。
このようにして得られる本発明の組換え用ベクターの例としては、 図 3に 示す JLE4941およぴ pJLE4942、 およぴ図 6に示す pJLE12およぴ PJLE121が挙げ られる。
本発明のプラスミドおよぴ組換え用ベクターは、 乳酸菌おょぴ大腸菌中で 複製でさる。 特に、 Lb. casei、 Lb. casei subsp. a丄 actosus、 Lb. gasseri- Lb. acidophilusなどの乳酸桿菌のための遺伝子工学ツールとして有用であ る。 当業者が通常用いる方法によりこれらのプラスミドまたは組換え用べク ターのいずれかの位置に外来遺伝子を挿入し、 得られるプラスミドまたは組 換え用ベクターで宿主微生物を形質転換すれば、 その外来遺伝子の遺伝情報
■ を宿主微生物内で発現させることが可能となる。
本発明のプラスミドおよび組換え用ベクター'を用いる乳酸菌および大腸菌 の形質転換は、 当業者が通常用いる方法によって実施できる。.例えば、 大腸 菌の形質転換は、 Sambrook, J. , Fritsch, E. F.， Maniatis, T. , 1989. Mol ecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 2 jR、 Cold Spring Harbor Labor atory, Cold Spring Harbor, NYによる記載に基づいて実施できる。 乳酸菌 の形質転換のためにエレクトロポレーシヨン技術が使用可能であり、 このよ うな技術の種々のプロ トコルが公知である （Berthier, F.ら， 前出； Coffey: A.， Harringtion, A.， Kearney, K.， Daly, C.， Fitzgerald, G.： Microbi ology 140, 2263-2269 (1994) ； GASSON, M. J.ら， 前出； Serror, P.ら， 前出） 。 本発明の組換え用ベクターは、 例えば、 1. 0%グリシンを含有する MR Sブロス中で細胞を培養し、 得られた細胞を lOmM MgCl2緩衝液で洗浄し、 そ して 10%グリセロールエレクト口ポレーシヨン溶液中に再懸濁し、 次いで 1. 7 5kV、 200 Ω、 および 25 ;i Fの静電容量でエレクトロポレートすることによつ て、 Lb. caseiを好都合に形質転換できる。
以下、 実施例に基づいて本発明を説明するが、 本発明はこの実施例に制限 されない。 実施例
(実施例 1 ： Lb. casei細胞からのプラスミド PLC494の調製）
乳酸菌からのプラスミド D NAの分離は、 Andersonおよび McKay (1983) の方法 (Anderson, D. G.， McKay, L. L.： Appl. Environ. Microbiol. 6, 5 49-552 (1983) ) にいくらかの変更を加えて実施した。 より詳細には、 以下 のとおりである。
ヒト腸管由来 Lb. casei L- 49細胞 （本菌株は、 乳幼児の糞便より単離した 菌株である。 岡山大学より入手） を、 プラスミド抽出のために使用した。 遠 心分離によって細胞を採取し、 次いで l mlの TES緩衝液 （50mM Tris- HC1、 1 mM EDTA、 6. 7%スクロース、 pH8. 0) で洗浄した。 細胞を 380 μ 1の TES緩衝液 中に懸濁し、 そして 37°Cで 5分間インキュベートした。 次に、 100 のリゾ チーム （Sigma) 溶液 （1 mlの 25mM Tris- HC1緩衝液中に 50 / gリゾチームを 溶解； pH8. 0) を添加し、 そしてこの懸濁液を 37°Cで 20分間ィンキュベート した。 懸濁液を 50 1の TE緩衝液 （lOmM Tris- HC1、 ImM EDTA、 pH8. 0) およ ぴ 30 1の 20% SDS溶液 (20mM EDTAを含有する 50mM Tris- HC1中に溶解、 H8. 0) と混合し、 37°Cで 10分間インキュベートし、 30秒間ポルテックスにかけ、 そして 28 1の 3N NaOHと混合した後、 氷上で 10分間冷却した。 次に、 50 μ 1 の 2Μ Tris- HC1緩衝液 (pH7. 0) を添加し、 そしてこの懸濁液を室温で 60分間 維持した。 さらに 70 μ 1の 5M NaClを添加し、 そしてこの懸濁液を氷上で 20分 間維持した。 次いで、 遠心分離 （14, OOOrpmで 15分間） して変性した D N A を取り出した。 続いて、 700 μ ΐの 3% NaCl飽和フエノールで溶解物を抽出し た。 遠心分離 （14, OOOrpmで 10分間） 後、 水相を新たな管に移し、 D NAを 5 00 1のクロ口ホルム—-ィソァミルアルコーノレ (24： 1， v/v) で抽出した。 プラスミド D NAを、 500 1のイソプロパノールを- 80°Cで 20分間添加し、 その後 14, OOOrpmで 20分間遠心分離することにより、 最終的に沈殿させた。 次いで、 このプラスミド D NAを乾燥し、 そして 20 1の TE緩衝液 (20 /i g/m 1 RNaseを含有） 中に再懸濁した。
(実施例 2 ：プラスミド pLC494のヌクレオチド配列決定および分析） プラスミド PLC494の全ヌクレオチド配列を、 重複するサブクローンの配列 決定によって決定した。 実施例 1にて Lb. casei L - 49細胞から抽出された 5 つのプラスミドのうち、 pLC494を、 Gel and PCR Clean- Upシステム （Promeg a Co. , Madison, USA) を用いて溶出した。 精製された pLC494を制限酵素 Sac Iによって消化し、 2191bpおよび 6655bPの 2つの断片を得た。 さらに、 この 6 655bpの断片を Sphlによって処理し、 4つの断片を得た。 プラスミド pLC494 および上記制限酵素消化により得た全部で 5つの制限断片を、 0. 8%ァガロ ースゲル （Cambrex Bio Science Rockland, Inc. , USA) 中で電気泳動し、 その後臭化工チジゥムで染色した。 得られた 5つの断片のそれぞれを、 同じ 制限酵素で処理した pUC19を用いて大腸菌 DH5 α細胞中にクローニングした。 ここで、 大腸菌細胞由来のプラスミドは、 アルカリ溶解法 （Sambrookら （前 出） ） によって単離した。 製造者の指示書に従って制限酵素および修飾酵素 を使用した。 一般的なクローユングの手順は、 Sambrookら （前出） による記 載のとおりに実施した。 これらの組換えプラスミドをそれぞれ、 pLC4941 (S aclを用いて得られた 2191bp断片） 、 pLC4942 (Saclと Sphlとを用いて得られ た 1677bp断片） 、 pLC4943 (Sphlを用いて得られた 1418bp断片） 、 pLC4944 (Sphlを用いて得られた 2749bp断片） 、 および pLC4945 (Sphlと Saclとを用 いて得られた 811bp) と命名した。 これらの 5つの組換えプラスミドを铸型 として用いて配列分析を実施した。 ユニバーサルプライマー M13 - M4 (GTTTTC CCAGTCACGAC：配列番号 3 ) および Ml 3- RV (GGMACAGCTATGACCATG：配列番号 4 ) を用いて、 P C Rを行った。 ABI Prism BigDye terminator Cycle Sequ encing Ready Reaction Kitを備えた ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Ap plied Biosystems) を、 製造者の推奨書に従って用いて、 D N A配列決定を 行った。 オープンリーディングフレームの分析を、 Fram Plot program (Ish ikawa, J.， Hotta, K.： FEMS Microbiol. Lett. 174, 2251—2253 (1999) ) (http： //ww. nih. go. jp/ jun/cgi-bn/ frameplot. pi) を用 ヽることにより 実施した。 GenBank (http: //www. ncbi. nlm. nih. Nov) の現行版を用いる 配列類似性検索を、 BLASTP (Altschul, S. F.， Thomas, L. M. , Alejandro, A. S. , Jinghui, Z.， Zheng, Z.， Webb, M.， David, J. L.： Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997) ) プログラムを用いて実行した。
プラスミド PLC494の全 D N A配列を分析し、 そのプラスミドの長さを測定 したところ 8846bpであった （配列番号 1の 1位〜 8 8 4 6位） 。 このプラス ミドは、 G + C含量が 4 1 . 5 %であり、 9つの推定オープンリーディング フレーム （O R F ) を含有する （図 1 ) 。 O R F 4 (配列番号 1の 2 6 1 9位〜 3 4 6 4位） の翻訳蛋白質のァミノ 酸配列 （配列番号 2 ) は、 Lb. acidophilus TK8912由来プラスミド pLA103 (13, 913bp) の複製蛋白質 R e p A (Kanatani, K.ら， 前出） に対して 1 0 0 %の同一性を示した。 O R F 4の翻訳蛋白質のアミノ酸配列は、 Lb. sake i由来プラスミド pRV500 ( 4 7 %) 、 Tetragenococcus halophilus由来 pUCL2 87 ( 4 5 %) 、 および Lb. plantarum由来 pMD5057 ( 4 6 %) の複製蛋白質に 対してもまた有意な相同性を有した。 O R F 5 (配列番号 1の 3 6 5 6位〜 4 1 6 2位） の翻訳蛋白質のアミノ酸配列は、 Lb. acidophilus TK8912由来 プラスミド PLA103の複製蛋白質 r e p Bに対して 9 9 %の類似性を示し、 そ して Lb. plantarum由来 pMD5057の複製蛋白質 r e p Bに対しては 2 6 %の類 似性を示した。 さらに、 潜在リポソーム結合部位 （R B S ) (GGAGG) (配 列番号 1の 2 6 0 8位〜 2 6 1 2位） 、 推定プロモーター （ （- 35領域） TTA ACG (配列番号 1の 2 5 5 7位〜 2 5 6 2位） ； （-10領域） TATMT (配列番 号 1の 2 5 8 1位〜 2 5 8 6位） ） 、 および反復配列領域 （3つの完全な 22 bpの反復領域と 1つの不完全なモチーフとで構成される；推定複製起点） (配列番号 1の 2 4 5 8位〜 2 5 4 5位） 力 O R F 4の A T G開始コドン の上流において見られた （図 2 ) 。 この配置は、 pLA103の配置と同一である t Benachour, A. , Frere, J. , Novel, G.： FEMS Microbiol. Lett. 128, 16 7-175 (1995) では、 2種の r印遺伝子と 22bp反復配列 （複製起点） とで構成 される領域を含有するプラスミド PUCL287が、 乳酸菌の新規な 0型レブリコ ンファミリーであると同定されている。 Θ型レプリコンは、 以下の 3つの重 要な成分に対するそれらの依存性に従つて分類することができる。 これらの 3つの重要な成分とは、 プラスミドにコードされた複製開始因子 Rep蛋白質 (鎖の開放および/または開始複合体の他の成分との相互作用に必要） 、 特 定の D N A構造編成を伴う複製起点 （一般に 「ori」 と呼ばれる） （鎖の開 放および開始因子と蛋白質との結合のため） 、 および宿主にコードされた D NAポリメラーゼ I (新生鎖 D N A合成のため） である （ALPERT, C. A.ら， 前出） 。 ALPERT, C. A.ら （前出） は、 pLA103、 pRV500、 および pMD5057の プラスミドが PUCL287ファミリーに属することを報告している。 上述の配列 分析により、 プラスミド pLC494において見られ 、 2種の rep遺伝子と 22bp 反復配列とで構成される領域は、 PLA103の対応する領域と同様であることが 分かった。 従って、 プラスミド PLC494は、 Θ型プラスミドに属することが示 唆される。
(実施例 3 ：大腸菌おょぴ乳酸菌用シャトルベクター pJLE4942の作製） 大腸菌/乳酸菌シャトルベクターの構築のために、 プラスミド pLC494の複 製起点を使用した。 大腸菌由来プラスミ ド PJIR418 (Sloan, J. , Warner, T. A.， Scott, P. T.， Bannam, T. L. , Berryman, D. I.， Rood, J. I.： Plasmid 2 7, 207-211 (1992) ) を Avalで消化して、 グラム陽性クロラムフエ二コール 耐性遺伝子 （Cm (R) ) を含有する 4. 9kb断片を得た。 この 4. 9kb断片を、 Ava Iで消化した大腸菌由来プラスミド pUC19 (Bringel, F. , Frey, L. , Hubert, J. C.： Plasmid 22, 193-202 (1989) ) に連結して、 プラスミド pJIRUClを 得た。 BamHIと Nhelとで二重消化した pJIRUClの断片 （4116bp) をタレノウ断 片 （TaKaRa) で処理し、 次いで自己連結して、 プラスミド pJIRUCllを得た。 一方、 pLC494を Hindlllで消化して 2168bpの断片を得、 同じ制限酵素で処理 した pUC19にこの断片を連結して、 プラスミド pLUlを生成した。 プラスミドお LU1は、 pLC494の反復領域おょぴ repA遺伝子を含む。 Hindlllと BamHIとで二 重消化した pJIRUCllに、 同じ制限酵素で処理した pLUlの 1887bPの断片を連結 して、 大腸菌 DH5 a細胞に形質転換した。 この構築されたプラスミドを p JLE4 941と命名した。 構築されたプラスミド pJLE4941は、 大腸菌にも Lb. casei L-49-4 (プラスミドなし) にも首尾よく導入された。 そして、 PJLE4941を Ba mHIと Hpalとで二重消化し、 次いで自己連結して、 pJLE4942を.得た。 したが つて、 pJLE4941および pJLE4942は、 pUC19由来のアンピシリン耐性遺伝子 （A mp (R) ) および複製開始部位 （ori) ； pJIR418由来のグラム陽性クロラム フヱェコール耐性遺伝子 （Cm (R) ) ；および pLC494由来の反復領域おょぴ r epA遺伝子を有する （図 3 ) 。
(実施例 4 ： シャトルベクター PJLE4942を用いた大腸菌および乳酸菌の形 質転換） ,
実施例 3にて作製したシャトルベクター pJLE4942を用いて、 Lb. casei L- 49-4 (Lb. casei L - 49細胞からプラスミドを除去したもの） 、 Lb. casei su bsp. alactosus 34143、 Lb. acidophilus NIAI L一 54、 Lb. delbruecki i sub sp. bulgaricus 7235、 Lb. gasseri JCM 1130、 Leuconostoc mesenteroides (以下 「し euc. MesenteroidesJ と ヽう) subsp. mesenteroides OR— 1—2、 E nterococcus spp. ,およぴ Lactococcus lact is (以下 「Lc. Lactis」 とレヽ う） NIAI N - 7 (これらはいずれもプラスミドが除去されたものである） 、 ならぴに大腸菌 DH5 a細胞の形質転換を行つた。 上述した乳酸菌の形質転換 は、 種々のプロトコル （Berthier, F.ら， 前出； Coffey, A.ら， 前出； GASS ON, M. J.ら， 前出； Serror, P.ら， 前出） に従って、 エレクトロポレーシ ヨンによって行った。 大腸菌の形質転換は、 前出の Sambrookらの文献による 記載のとおりに実施した。 連結した D N Aとコンピテント大腸菌細胞とを混 合し、 これらを氷上で 30秒間維持した。 形質転換する細胞試料を 0. lcmキュ ベット （Bio - Rad, UK) に移し、 そしてジーンパルサ （ピーク電圧 l. 5kV ; 静 電容量 25 F; 抵抗 200 Ω ; Bio- Rad) で形質転換した。 次いで、 形質転換した 大腸菌細胞を、 lOO g/mlアンピシリン （Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) を含有する LB寒天培地 (ナカライテスタ株式会社) 上に播種し、 そし て振盪させながら 37°Cで 30分間インキュベートし、 生存細胞を選抜した。 形 質転換した乳酸菌細胞は、 10 /i g/mlクロラムフエ-コール （Sigma) を含有 する MRS培地 （Oxoid, Basingstoke, England) 上に播種し、 振盪せずに 37°C で 30分間ィンキュベートし、 生存細胞を選抜した。
ベクター PJLE4942は、 大腸菌 DH5 "細胞に形質転換されるとともに、 Lb. c asei L-49-4 (1. 3 X 105 ( 1 μ § D N A当たりの开質転換体数） ) 、 Lb. cas ei subsp. alactosus 34143 (2. X 102) 、 Lb. gasseri JCM 1130 ( < 101) 、 および Lb. acidophilus NIAI L 54 (4. 9 X 103) に導入された。 また、 図 4 は、 pJLE4942で形質転換された大腸菌およぴ種々の乳酸桿菌から抽出したプ ラスミド D N Aの電気泳動写真である。 形質転換された大腸菌おょぴ種々の 乳酸桿菌からのプラスミド D N Aの抽出は、 実施例 1と同様にして行った。 図 4は、 ベクター PJLE4942が大腸菌細胞および種々の乳酸桿菌に導入された ことを示す （レーン 1 ：大腸菌 DH5 a細胞； レーン 2 ： Lb. casei L-49-4； レーン 3 ·· Lb. casei subsp. alactosus 34143； レーン 4 ： Lb. acidop ilu s NIAI L-54； レーン Mは分子量マーカーである） 。 一方、 pJLE4942の形質 転渙体は、 Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 7235、 Leuc. mesenteroide s subsp. mesenteroides OR— 1—2、 Enterococcus spp.、 およぴ Lc. lactis N IAI N - 7からは得られなかった。
さらに、 PJLE4942を上記と同様にして大腸菌 DH5 a細胞おょぴ Lb. casei L-49- 4細胞に導入し、 次いでこの導入されたプラスミドを大月昜菌 DH5 a細胞 および Lb. casei L-49-4細胞の形質転換体から実施例 1と同様にして抽出し た。 抽出したプラスミドを Hindlll； EcoRVおよび Bglll；または EcoRIで消化 した。 これらの制限酵素の消化により得られた断片をァガロースゲル電気泳 動に供し、 分析した。 図 5に、.制限酵素の消化により得られた断片のァガロ ースゲル電気泳動の結果を示す （レーン 1〜3は大腸菌 DH5 CE細胞、 レーン 4〜6は Lb. casei L-49- 4細胞の結果を示す： レーン 1および 4は Hindlll 処理； レーン 2および 5は EcoRVおよび Bglll処理； レーン 3およぴ 6は EcoR I処理；両端の 2つのレーン Mは 1 k bラダーである） 。 図 5.に示すように、 制限酵素分析の結果は、 プラスミドがいかなる構成再配置も示さなかったこ とを明らかにした。
(実施例 5 ：大腸菌および乳酸菌用シャトルベクター pJLE121の作製およ びこれらのシャトルベクターを用いた大腸菌および乳酸菌の形質転換）
PJIR418を Ndelで消化して、 pIP404 Oriおよび PIP404 Repを除去した。 次 いで、 これを自己連結して、 5533bpのプラスミド pJIRlを得た。 次に、 BamHI と Nhelとで二重消化した pLC494の断片 （2466bp； ori, repAおよび repBを含 有する） を、 同じ酵素で処理した pJIRlを用いて大腸菌にクローユングした。 この構築したベクターを pJLE12 (6297bp) と称した。 最後に、 EcoRVで消化 した pJLE12の自己連結断片 （4691bp) を用いて PJLE121を構孥した （図 6 ) 。 PJLE12および pJLE121は、 pJIR418由来の複製開始部位 （PMBI) およびエリス 口マイシン耐性遺伝子 （グラム陽性菌および陰性菌の両方に対する選択マー カー） と、 pLC494由来の ori (22bp反復領域） および repAとを有する。
シャトルベクター PJLE12または pJLE121を用いたこと以外は、 実施例 4と 同様にして、 大腸菌 DH5 a細胞および Lb. casei L- 49-4の形質転換を行った。 Lb. casei L - 49- 4の形質転換は、 Berthier, F.ら （前出） の記載に従い、 大 腸菌 DH5 a細胞の形質転換は、 前出の Sambrookらの文献による記載のとおり に実施した。 電気形質転換後、 大腸菌 DH5 a細胞を最終濃度 10{^ g/mlのアン ピシリン （Sigma Chemical, USA) を含有する LB (ナカライ） 寒天プレート 上播種し、 振盪させながら 37°Cで 30分間ィンキュベートし、 生存細胞を選抜 した。 そして Lb. casei L- 49- 4細胞を最終濃度 16 μ g/mlのエリスロマイシン (Sigma) を含有する MRS寒天プレート上に播種し、 振盪させずに 37°Cで 30分 間ィンキュベートし、 生存細胞を選抜した。 シャトルベクター pJLE12および PJLE121は、 大腸菌 DH5 a細胞および Lb. casei L - 49- 4に首尾よく導入された。 (実施例 6 ： シャ トルベクター pJLE121による Lb. casei L - 49 - 4のエレク トロポレ一シヨン)
シャトルベクター PJLE121による Lb. casei L - 49- 4の形質転換効率を最適 化するために、 種々のパラメーターの影響を検討した。
Chassy, B. M.ら （前出） に記載の方法おょぴ Berthier, F.ら （前出） に記 載の方法を用いた Lb. casei L- 49- 4の形質転換効率は、 他の方法 （Serror, P.ら， 前出、 Bhowmik, T.ら， 前出） の形質転換効率よりも高かった （デー タは示さず） 。 従って、 Chassy, B. M.ら （前出） に記載の方法おょぴ Berthi er, F.ら （前出） に記載の方法に基づいて、 パラメーターを種々に変更し、 形質転換効率に対するその影響を検討した。
( 1 . 洗浄溶液およびエレクト口ポレーション Z保存溶液の組成の影響） 試験した洗浄溶液おょぴエレクトロポレーションノ保存溶液の組成を以下 の表 1に示す。
cn o cn
PJLE121 DNAによる casei L-49-4細胞の形質転換効率に対する
洗浄溶液およびエレクトロポレーシヨン/保存溶液の組成の影響
洗浄溶液 エレクト口ポレーション /保存溶液 形質転換体数
(1 jugの DMA当たり) 細 MgCI2 0.5Mスクロース/ 10%グリセロール 1.0 x 1d2
30% PEG 6000/10% グリセロール <102
10% グリセロール 1.7 x 104
0.5Mスクロース/ 10%グリセロール /3.0mM MgCI2 3.0 102 0.9 スクロース /3.0mM MgGI2 3.6 103
0.5Mスクロース/ 10%グリセロール 0.5 スクロース/ 10%グリセロール 1.0 x 10z .
0.9Mスクロース /3.0mM MgGI2 1.0 102
7mM HEPES/272mMスクロース/ 1mM gCI2 7mM HEPES/272m スクロース/ 1mM gCI2 2.7 x 103
0.9 スクロース /3.0mM MgCI2 1.9 x 103
種々の溶液で洗浄した Lb. casei L- 49-4細胞を pJLE121と混合し、 そして 標準条件 （ピーク電圧 8.75kV/cm; 静電容量 25 F；抵抗 200Ω) 下でエレク トロポレートした。 電気形質転換を Chassy, B.M.ら （前出） に記載の方法に 従って実施した場合、 細胞を 10mM MgCl2溶液で洗浄して 10%グリセ口ールェ レク ト口ポレーシヨン溶液中に再懸濁した場合に最も高く、 l gの DNA 当たり 2.7 X103の形質転換体が形成された。 電気形質転換を Berthier, F.ら (前出） に記載の方法に従って実施した場合、 細胞を lOmM MgCl2溶液で洗浄 して 10°/。グリセロールエレク トロポレーション溶液中に再懸濁した場合に、 最も高い形質転換効率を得た （1 JugのDNA当たり1.7X104の形質転換 体；表 1) 。 従って、 以下の実験は、 これらの溶液を用いて行った。
(2. 増殖段階の影響）
Lb. casei L- 49- 4の形質転換効率に対する増殖段階の影響を調べるために、 エレク ト口ポレーシヨンを行う前に、 種々の 0D6。。値 （0.25、 0.45、 0.7、 0.9、 1.26、 および 1.56) で細胞を採取した。 細胞を洗浄し、 そして 10%グリセ口 ール中で約 15〜； 16の 0D6。。値に等価な最終濃度になるように調整した。 懸濁し た細胞を PJLE121と混合し、 そして標準条件下でエレク トロポレートした。 7 2時間インキュベートした後、 最も高い形質転換効率 （l gの DNA当たり . 1.7X104の形質転換体） は、 初期の対数増殖期で得られた （0D6。。=0.25) 。 この結果は、 増殖段階が形質転換効率に対して有意に影響を与えることを示 した。
(3. 増殖培地組成の影響）
細胞壁に対するグリシンの影響を調べた。 グリシンに関しては、 以下の知 見がある。 グリシンの濃度は、 Lb. sakei (Berthier, F.ら， 前出） の形質 転換になんら効果を有さず、 一方、 Lb. delbrueckii (Serror, P.ら， 前 出） の形質転換を有意に改善しなかった。 対照的に、 Lb. helveticus subsp. jugurti (HASHIBA, H. , TAKIGUCHI, R.， ISKII, S. , AOYAMA, K.： Agric. Biol. Chern. 5 1537-1541 (1990) ) およぴ Lactobacillus plantarum (AUK RUST, T. , NES, I. F.： FEMS Microbiol. Lett. 52 127-132 (1988) ) はそ れぞれ、 1.2%のグリシンおよび 1. Q%のグリシンによつて形質転換効率が顕著 に改善された。
Lb. casei L - 49- 4細胞を、 0.2〜3.0% (w/v) グリシンを添カ卩した MRSプロ ス中で、 および対照実験として何も添加していない MRSブロス中で、 0D,が 約 0.2〜0.3になるまで増殖させた。 細胞を採取し、 そして 10mM MgCl2溶液で 洗浄して 10%グリセロールエレクト口ポレーシヨン溶液中に再懸濁して、 次 いで標準条件下でエレク トロポレートした。 1.0%グリシンを MRSブロスに添 加した場合、 対照実験および試験した他の濃度に比べて、 最も高い形質転換 効率が生じた （1 /zgの DNA当たり 1.2X105の形質転換体） 。 従って、 続 く実験では、 1.0%グリシンを添加した MRSプロスを用いた。
(4. 電気的パラメーターの影響）
形質転換効率に対する電気的パラメーターの影響を決定するために、 25μ Fの固定静電容量で、 種々の電圧 （1.25、 1.5、 1.75、 2.0、 2.25、 および 2.5 kV) およびパルスコントロール抵抗 （200、 400、 および 600 Ω) で、 細胞を エレクトロポレートした。 エレクト口ポレーシヨンのためのコンビテント細 胞を、 上記の至適条件に従って調製した。 DN Aとコンビテント細胞とを混 合し、 そしてこれらの試料を 0.2cmキュベット （Bio- Rad) に添加し、 ジーン パルサで形質転換した。 細胞を 2.5 /zFの静電容量で 1.75kVかつ 200Ωに供し た場合に、 最も高い形質転換効率 （1 jugの DNA当たり 1.5X10Sの形質転 換体） が得られた （図 7) 。
以上のように、 pJLE121を用いる Lb. casei L- 49- 4の最適な形質転換効率 は、 1. 0%グリシンを含有する MRSブロス中で培養した細胞 （0D6。。==0. 25) を、 lOmM MgCl2緩衝液で洗浄し、 そして 10%グリセロールエレクトロポレーショ ン溶液中に再懸濁し、 次いで 1. 75kV、 200 Ω、 および 25 Fの静電容量でエレ クトロポレートした場合に得られた。
(実施例 7 ： PLC494の複製必須領域の解析）
実施例 5において得られた pJLE121ベタターを制限酵素 BamHIおよび Bgl II で切断し、 自己連結して、 図 6に示す BamHIから Bglllの部分が欠失したベタ ター Δ (BamHI -Bgl II) pJLE121を作製した。 欠失体ベクター Δ (BamHI— Bg III) PJLE121および対照の欠失させていないベクター pJLE121を用いて、 実 施例 5と同様の方法で Lb. casei L-49- 4細胞へ形質転換し、 最終濃度 16 μ 8/ mlのエリスロマイシン （Sigma) を含有する MRS寒天プレート上に播種し、 振 盪させずに 37°Cで 30分間インキュベートし、 生存細胞を選抜した。 この結果、 PJLE121によって Lb. casei L - 49- 4細胞の 1 X 103の形質転換効率が得られた のに対し、 BamHIから Bglllの部分が欠失したベクター Δ (BamHI -Bglll) pj LE121ではうまく形質転換できなかった。 .以上から、 BamHIから Bglllの部分 (配列番号 1の 1 9 2 3位から 2 4 1 4位の塩基配列に対応） は、 pLC494の 複製に必要な領域であることが判明した。 産業上の利用可能性
本発明により、 広宿主域を有する、 乳酸菌の形質転換のためのプラスミド およびベクターが提供された。 本発明のプラスミドおよびべクタ一はまた、 乳酸桿菌において、 安定に複製可能である。 本発明によって、 Lb. caseiお よび他の乳酸菌 （特に、 乳酸桿菌） を遺伝子操作で改良し産業的に応用する 可能性が一段と拡がった。 また、 本発明のプラスミドおよびベクターは、 GR AS生物であり、 プロバイオテイクスとして商業的に使用されている Lb. case iに由来するので、 食品おょぴ医薬品の開発のために有用となる。

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 1の 1923位から 3464位の塩基配列で示される DN A領 域、 または該塩基配列に相補的な配列を有する DNAとストリンジヱントな 条件でハイプリダイズし、 かつ Θ型の複製能を保持する DN A領域、 または その機能を変更しない限り該塩基配列から 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 ま たは付加を有する塩基配列を有する DN A領域を含むプラスミド。
2. 配列番号 1の 1923位から 3809位の塩基配列で示される DN A領 域、 または該塩基配列に相捕的な配列を有する DNAとストリンジヱントな 条件でハイプリダイズし、 かつ 0型の複製能を保持する DN A領域、 または その機能を変更しない限り該塩基配列から 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 ま たは付加を有する塩基配列を有する DN A領域を含むプラスミド。
3. 配列番号 1の 1位から 8846位の塩基配列で示されるプラスミ ド p L C 494。
4. 配列番号 1の 1923位から 3464位の塩基配列で示される DN A領 域、 または該塩基配列に相補的な配列を有する DNAとストリンジヱントな 条件でハイブリダィズし、 かつ Θ型の複製能を保持する DN A領域、 または その機能を変更しない限り該塩基配列から 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 ま たは付加を有する塩基配列を有する D N A領域を含む D N A断片を含む、 組 換え用ベクター。
5. 配列番号 1の 1923位から 3809位の塩基配列で示される D N A領 域、 または該塩基配列に相補的な配列を有する DNAとストリンジヱントな 条件でハイプリダイズし、 かつ 0型の複製能を保持する D N A領域、 または その機能を ¾更しない限り該塩基配列から 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 ま たは付加を有する塩基配列を有する D N A領域を含む D N A断片を含む、 組 換え用ベクター。
6 . 細菌由来の複製必須領域をさらに含む、 請求項 4または 5に記載の組換 え用ベクター。
7 . 選択マーカー遺伝子をさらに含む、 請求項 4力 ら 6のいずれか一項に記 載の組換え用ベクター。
8 . 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位の塩基配列で示される D N A領 域、 大腸菌申来の複製必須領域、 および選択マーカー遺伝子を含み、 以下に 示す制限酵素地図： ·
Figure imgf000034_0001
9 . 配列番号 1の 1 9 2 3位から 3 4 6 4位の塩基配列で示される D N A領 域、 大腸菌由来の複製必須領域、 および選択マーカー遺伝子を含み、 以下に
Figure imgf000035_0001
を.有する、 耝換え用プラスミドベクター； p J L E 1 2 1。
1 0 . 組換え用ベクターを作製する方法であって、 配列番号 1の 1 9 2 3位 から 3 4 6 4位の塩基配列で示される D N A領域、 または該塩基配列に相補 的な配列を有する D NAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、 か つ 0型の複製能を保持する D N A領域、 またはその機能を変更しない限り該 塩基配列から 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 または付加を有する塩基配列を 有する D N A領域を含む D N A断片と、 任意の D N A断片とを連結する工程 を含む、 方法。
1 1 . 組換え用ベクターを作製する方法であって、 配列番号 1の 1 9 2 3位 から 3 8 0 9位の塩基配列で示される D N A領域、 または該塩基配列に相補 的な配列を有する D NAとストリンジヱントな条件でハイプリダイズし、 か つ Θ型の複製能を保持する D N A領域、 またはその機能を変更しない限り該 塩基配列から 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 または付加を有する塩基配列を 有する DN A領域を含む DN A断片と、 任意の DN A断片とを連結する工程 を含む、 方法。
1 2. '前記 DNA断片を請求項 3に記載のプラスミドから取得する工程をさ らに含む、 請求項 10または 1 1に記載の方法。
1 3. 前記任意の DN A断片が、 細菌由来の複製必須領域を含む DN A断片 である、 請求項 1 0から 1 2のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記プラスミドベクターが、 選択マーカー遺伝子をさらに含む、 請求 項 1 0から 1 3のいずれか一項に記載の方法。
1 5. 請求項 1から 3のいずれか一項に記載のプラスミドまたは請求項 4か ら 9のいずれか一項に記載の組換え用ベクターを含む形質転換細胞。
1 6. 前記形質転換細胞が乳酸菌である、 請求項 1 5に記載の形質転換細胞。
1 7. 目【JS己孚し酸菌；^、 Lactobacillus casei、 Lactobacillus casei subsp. alactosus、 Lactobacillus gasseri^ および Lactobacillus acidophilus力 らなる群から選択される乳酸桿菌である、 請求項 1 6に記載の形質転換細胞。
1 8. 前記乳酸菌が Lactobacillus caseiである、 請求項 1 6に記載の形質 転換細胞。
1 9. 前記形質転換細胞が大腸菌である、 請求項 1 5に記載の形質転換細胞。
2 0 . 乳酸菌を形質転換する方法であって、 請求項 4から 9のいずれか一項 に記載の組換え用ベクターを乳酸菌に導入する工程を含む、 方法。
2 1 . 目 ij記孚 L酸 ¾S、 Lactobacillus casei、 Lactobacillus casei subsp. alactosus、 Lactobacillus gasseri、 およぴ Lactobacillus acidophilus力 らなる群から選択される乳酸桿菌である、 請求項 2 0に記載の方法。
2 2 . 前記乳酸菌が Lactobacillus caseiである、 請求項 2 0に記載の方法,
2 3 . 前記導入がエレクト口ポレーシヨンによって行われる、 請求項 2 0に 記載の方法。
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