NO324916B1 - Bakteriestamme med evne til a overleve i tarmen, klebe til humane tarmceller og bevirke immunomodulering, fremgangsmate for fremstilling derav samt anvendelse derav. - Google Patents

Bakteriestamme med evne til a overleve i tarmen, klebe til humane tarmceller og bevirke immunomodulering, fremgangsmate for fremstilling derav samt anvendelse derav. Download PDF

Info

Publication number
NO324916B1
NO324916B1 NO19981774A NO981774A NO324916B1 NO 324916 B1 NO324916 B1 NO 324916B1 NO 19981774 A NO19981774 A NO 19981774A NO 981774 A NO981774 A NO 981774A NO 324916 B1 NO324916 B1 NO 324916B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
vector
sequence
bacterial strain
lactobacillus
enzyme
Prior art date
Application number
NO19981774A
Other languages
English (en)
Other versions
NO981774D0 (no
NO981774L (no
Inventor
Luciane Lapierre
Beat Mollet
Michele Delley
Jacques-Edouard Germond
Raymond David Pridmore
Original Assignee
Nestle Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nestle Sa filed Critical Nestle Sa
Publication of NO981774D0 publication Critical patent/NO981774D0/no
Publication of NO981774L publication Critical patent/NO981774L/no
Publication of NO324916B1 publication Critical patent/NO324916B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C2220/00—Biochemical treatment
    • A23C2220/20—Treatment with microorganisms
    • A23C2220/202—Genetic engineering of microorganisms used in dairy technology
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/151—Johnsonii
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører bakteriestamme med evne til å overleve i tarmen, klebe til humane tarmceller og bevirke immunomodulering. Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av disse samt anvendelse derav.
Fermentering er en nedbrytning av en karbonkilde hvorunder den endelige hydrogenakseptoren er en organisk forbindelse. Ved melkesyrefermentering produserer visse bakteriestammer en racemisk blanding av de to isomere formene av laktat, D(-) - laktat og L(+) - laktat, for regenereringen av NAD<+>, ved reduksjonen av pyruvat ved hjelp av to spesifikke NAD-avhengige laktatdehydrogenaser.
Visse individer er kjent for å vise en intoleranse overfor reduksjonen av laktose. Denne dårlige fordøyelsen av laktose skyldes ofte fraværet av en tilstrekkelig mengde B-galaktosidase i tynntarmen. Forskjellige undersøkelser (Kolars et al., N. Engl. J. Med., 310,1 - 3,1984; Marteau et al., Br. J. Nutr., 64,71 - 79,1990; og Arrigoni et al., Am. J. Clin. Nutr., 60, 926 - 929,1994) har demonstrert det faktum at disse personene nedbryter og tolererer laktosen inneholdt i yoghurter bedre enn den som er inneholdt i melk. Denne bedre fordøyelsen og bedre laktosetoleransen skyldes spesielt aktiviteten av J3-galaktosidase av bakteriene inneholdt i yoghurter under passasje igjennom tarmen.
Det er videre kjent av D(-) - laktat kan gi opphav til acidoseproblemer i barn. Av disse grunnene anbefaler verdens helseorganisasjon (FAO/WHO, 1967; 1974) at D(-) - laktat ikke bør tilsettes til barnemat, verken i seg selv eller som en racemisk blanding med L(+) - laktat. Videre bør den daglige inntaksgrensen av D(-) - laktat for voksne mennesker fortrinnsvis ikke overskride 100 mg/kg av det menneskelige legemet.
Bakteriestammer som er genetisk rekombinert slik at de produserer bare L(+) - laktat er nå kjent.
Følgelig beskriver T. Bhowmik et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 432 - 439. 1994) en teknikk for isoleringen og inaktiveringen, ved rettet mutagenese, av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase av stammen lactobacillus helveticus CNRZ32, spesielt stammen lactobacillus helveticus CNRZ32 (pSUW104), som produserer bare L(+) - laktat. Denne stammen oppnås ved elektroporering av integrerende vektor pSUW104 som innbefatter vektor pSA3 og det 0,6 kb sall-Sphl indre fragmentet av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase av Lactobacillus helveticus.
Imidlertid er bakteriestammer med evne til å overleve i tarmen, klebe til tarmcellene og bevirke immunomodulering, som er genetisk rekombinert slik at de produserer bare L(+) - laktat ikke kjente ved det nåværende tidspunkt. Det vil imidlertid være meget verdifullt, for fremstillingen av næringsmiddelprodukter, og ha slike bakteriestammer med evnen til å overleve i tarmkanalen, som har disse fordelaktige egenskapene på menneskelig helse og produserer bare L(+) - laktat, slik at man unngår de uheldige effektene på grunn av D(-) - laktat.
Taguchi et al.: "Essential role of arginine 235 in the substrate-binding of lactobacillus plantarum D-lactate dehydrogenase", J. Biochem (1994), 115(5), 930-936, Kochar et al.: "Primary structure, physicochemical properties, and chemical modification of NAD<+->dependent D-lactate dehydrogenase", J. Biol.chem. (1992) 267(12), 8499-8513 og Delcour et al.; "Génetique moléculaire des lactate-déshydrogenases des bactéries lactiques", Lait (1993) 73(2), 127-131 beskriver alle karakteirseringen av D-laktatdehydrogenase hos ulike melkesyrebakterier. Det vil imidlertid være usannsynlig at sekvensen av prober som beskrevet i disse publikasjonene vil være en god kilde for prober for å detektere genet som koder for D-LDH i andre Lactobacillus spedes enn de som er beskrevet deri.
Formålet med foreliggende oppfinnelse er å oppfylle disse behovene.
For dette formålet vedrører foreliggende oppfinnelse en bakteriestamme med evne til å overleve i tarmen, klebe til menneskelige tarmceller og bevirke immunomodulering, kjennetegnet ved at den omfatter en stamme av Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus eller Lactobacillus gallinarum, og ved at den er genetisk rekombinert slik at den nå produserer bare L(+)-laktat, idet genet som koder enzymet D-laktatdehydrogenase er inaktivert.
I den gjenværende delen av beskrivelsen vil utrykket «konjugativ vektor» anvendes for å betegne en DNA vektor som er overførbar ved konjugering mellom to stammer av forskjellige spesis av melkesyrebakterier.
Videre, i den gjenværende delen av beskrivelsen vil uttrykket «stamme med evnen til å overleve i tarmen» anvendes for å betegne en melkesyrebakteriestamme som etter inntak gjenfinnes i ekskrementene.
Endelig vil, i den gjenværende delen av beskrivelsen, uttrykket "bakteriestamme med evnen til å bevirke immunomudulering" bli anvendt for å betegne en melkesyrebakteriestamme som har en fordelaktig effekt på immunsystemet, spesielt egenskapen med å øke fagocytosén av makrofagene.
To stammer av lactobacillus johnsonii som er blitt genetisk rekombinert for å produsere bare L(+) - laktat er spesielt isolert. Disse stammene ble deponert 20/02-1997, i henhold til Budapestavtalen, ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue de Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, hvor de ble gitt henholdsvis deponeringsnummer CNCM1-1851 og deponeringsnummer CNCM1-1852.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av en stamme som omtalt ovenfor, kjennetegnet ved at: - sekvensen av genet som koder D-laktatdehydrogenase isoleres fra en vertsbakterie-stamme som har evne til å overleve i tarmen, til å klebe til humane tarmceller og bevirke immunomodulering, - rettet mutagenese gjennomføres på nevnte sekvens for derved å oppnå en modifisert sekvens,
- denne modifiserte sekvensen inkorporeres i en konjugatvektor,
- konjugatvektoren overføres ved konjugering inn i vertsbakteirestammen,
- deretter selekteres vertsbakterien hvori sekvensen som koder enzymet D-laktatdehydrogenase er erstattet med den modifiserte sekvensen ved homolog rekombinasjon.
I fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase isoleres fra vertsbakteirestammen ved f.eks. PCR, ved kloning eller ved komplimentering.
En rettet mutagenese kan utføres på denne sekvensen for å gi en modifisert sekvens ved "Gene Splicing Overlap Extension" fremgangsmåten (Molecular Biotechnology, R.M. Horton, 1995, 3,93 - 99), som består i å generere en gensekvens hvori et eller flere nukleotider f.eks innføres eller utelates.
For å integrere den modifiserte sekvensen i en konjugativ vektor av en donorbakteristamme av vertsbakteirestammen kan en donorbakteriestamme innholdende en konjugativ vektor som ikke har evnen til å replikere i vertbakteirestammen . selekteres, en konstruksjon kan produseres ved ligering av den modifiserte sekvensen i en første vektor som er ute av stand til multiplisering i donorbakteriestammen av vertsbakterien, denne konstruksjonen kan innføres i donorbakteirestammen, og deretter kan donorbakteriene, hvori den første vektoren og den konjugative vektoren er rekombinert, f.eks. selekteres.
Den konjugative vektoren inneholdende den modifiserte sekvensen overføres derfor ved konjugering inn i vertsbakteirestammen.
Vertsbakteriene hvori sekvensen som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase er erstattet ved homolog rekombinasjon med den modifiserte sekvensen selekteres deretter.
Vertsbakteriene som har integrert den konjugative vektoren i deres genom kan f.eks. selekteres på et medium innholdende antibiotika. I realiteten, ved integreringen av den konjugative vektoren i deres genom, kan disse bakteriene uttrykke de antibiotiske resistensgenene inneholdt i sekvensen av nevnte vektor.
Endelig selekteres vertsbakteriene hvori DNA sekvensene av den konjugative vektoren er fjernet fra genomet, med unntak av den modifiserte sekvensen.
Dette kan utføres ved å utføre en første seleksjon på et medium inneholdende antibiotika slik at bakteriene som er sensitive ovenfor dette antibiotikumet selekteres, det vil si f.eks. villtype bakteriene og de genetisk transformerte bakteriene som nå inneholder bare fragmentet av den modifiserte sekvensen av genet.
En enzymatisk fargetest kan deretter utføres i nærvær av D-laktatdehydrogenase,
tetrazoliumsalt og diaforase for f.eks. å differensiere villtype bakteriene fra de genetisk transformerte bakteriene ifølge foreliggende oppfinnelse. Denne enzymatiske testen gjør det mulig å demonstrere det faktum at bakteriene som ikke produserer D(-) - laktat ikke kan oksidere D(-) - laktat når enzymet D-laktatdehydrogenase tilsettes til mediet;
følgelig reduseres tetrazoliumsaltet til mediet ikke ved enzymet diaforase, i fravær av oksydert D-laktat, og disse bakteriene forblir fargeløse.
En PCR kan så utføres på de genomiske sekvensene av den genetisk rekombinerte vertsbakterien i henhold til foreliggende oppfinnelse ved å anvende primere som er spesifikke for vertsbakteriestammen, PCR produktet kan så nedbrytes i nærvær av spesifikke restriksjonsenzymer, og størrelsen av fragmentet generert på denne måten kan sammenlignes med de som oppnås f.eks. etter nedbrytning med de samme restriksjonsenzymene, fra genomet av en villtype vertsbakterie.
Endelig vedrører foreliggende oppfinnelse anvendelsen av en bakteriestamme oppnådd ved å utføre fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ved fremstilling av næringsmiddelprodukter.
Fremgangsmåten for fremstilling av bakteriestammene i henhold til foreliggende oppfinnelse, og disse genetisk rekombinerte bakteriestammene, karakteriseres i større detalj nedenfor ved hjelp av biokjemiske og molekylære analyser, med referanse til de vedlagte tegningene, hvor i;
- Figur 1 viser vektor pLL83, som er ligeringsproduktet av vektor pGEMT, markedsført av Promega, Madison, WI - USA, og den modifiserte sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenåse, - Figur 2 viser vektor pMD14, som er konstruert fra vektor pBlueScript SK+ av Escherichia coli (Stratagene, LA YOLLA, CA - USA) og som inneholder kloramfenikol (eat) resistensgenet av vektor pNZ12 (Gasson et at., J. Bacteriol., 154,1 -9,1983) og 5' regionen oppstrøm for sekvensen av erytromycinresistensgenet av vektor pAMBl (Clewell et al., J. Bacteriol., 33,426 - 428.1974), som ble isolert fra plasmid pUC-838 (Mollet et al., J. Bacteriol., 175,4315 - 4324,1993), - Figur 3 viser vektor pLL88, som er ligeringsproduktet av fragmentet av vektor pLL83 innbefattende den modifiserte sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase, i vektor pMD14, og endelig - Figur 4 viser vektor pLL91, som innbefatter sekvensen av vektor pLL88 og den av vektor pAMBl (Clewell et at., J. Bacteriol., 33,426 - 428,1974). I. Isolering av sekvensen av genet som koder for enzymet D- laktatdehvdrogenase av Lactobacillus johnsonii Lal: Lactobacillus johnsonii Lal dyrkes på et MRS medium over natten ved 37°C. Kulturen overføres deretter til et rør inneholdende et MRS medium og tillates og gro til en OD6oo på ca. 1.
Genomet av Lactobacillus johnsonii Lal isoleres ved fremgangsmåten beskrevet i artikkelen "DNA probe for Lactobacillus delbrueckii" (B. Mollet et at., Applied and Environmental Microbiology, June 1990, vol. 56(6), p. 1967 - 1970).
Sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase av Lactobacillus johnsonii Lal isoleres deretter ved PCR ved som spesifikke primere å anvende sekvensene SEQ ID nr. 1 og SEQ ID nr. 2 beskrevet nedenfor, som er sekvenser av konserverte områder av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase av Lactobacillus helveticus (Eur. J. Biochem., Cloning and overexpression of Lactobacillus helveticus D-laktatdehydrogenase gene in Escherichia coli, Kochar et al., 208, 799 - 805,1992).
Dette gir et 890 bp fragment, som klones inn i vektor pGEMT markedsført av Promega, Madison WI - USA, og sekvenseres deretter. For å isolere den fullstendige sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase av Lactobacillus johnsonii Lal utføres deretter et southern blot med forskjellige restriksjonsenzymer, hvor proben som anvendes er sekvensen som tidligere er oppnådd ved PCR.
En 3 kb nukleotid sekvens innbefattende to åpne leserammer av motsatt orientering isoleres på denne måten.
En høy grad av homologi finnes mellom en av de åpne leserammene og sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase av Lactobacillus helveticus. Sekvensen av denne åpne leserammen har en lengde på 1014 nukleotider og har en homologi på 85% med sekvensen av genet som kode for enzymet D-lakatatdehydro-genase av Lactobacillus helveticus og en homologi på 81% med den av Lactobacillus bulgaricus (FEBS Lett., Bernard et al., 1991,289,61 - 634). Denne sekvensen koder for et polypeptid på 338 aminosyrer. II. Rettet mutagenese på sekvensen som koder for enzymet D- laktatdehydrogenase av Lactobacillus johnsonii Lal: En rettet mutagenese utføres på den isolerte sekvensen ved "Gene Splicing Overlap Extension" fremgangsmåten (Molecular Biotechnology, R.M. Horton, 1995, 3, 93 - 99). Denne sekvensen underkastes ved PCR til en deletering på 11 nukleotider og en innføring av 3 nukleotider ved senteret. Disse sekvensmodifikasjonene har effekten av å skape et Dral restriksjonssete og eliminere et ECoRV restriksjonssete. Disse to restriksjonssetemodifikasjonene anvendes som en markør for å demonstrere nærværet av den modifiserte sekvensen av genet som koder for D-laktatdehydrogenasen av Lactobacillus johnsonii Lal i de forskjellige vektorene anvendt i den gjenværende delen av konstruksjonen, og i seleksjonen av mutantene som har integrert bare den modifiserte sekvensen av genet som kode for enzymet D-laktatdehydrogenase.
Gensekvensen modifisert på denne måten kodet for et polypeptid på 181 aminosyrer isteden for et polypeptid på 338 aminosyrer. III. Kloning av den modifiserte sekvensen av genet som kode for enzymet D-laktatdehvdrogenase av Lactobacillus johnsonii Lal i vektor pGEMT av Escherichia coli: Den modifiserte sekvensen av genet som kodet for enzymet D-laktatdehydrogenase klones inn i vektor pGEMT av Escherichia coli.
Dette gjøres ved ligering av den modifiserte sekvensen av genet inn i denne vektoren pGEMT inneholdende ampicillinresistensgenet.
Denne ligeringsblandingen innføres deretter i Escherichia coli XLl-blue ved elektroporering og de positive klonene selekteres i nærvær av X-gal og IPTG (Sambrook et al., "Molecular cloning: a laboratory manual" 2. utgave, 1989). Den resulterende vektoren, som vist i figur 1, betegnes pLL83.
Vektor pLL83 renses deretter ved fremgangsmåten med alkalisk lysering (Sambrock et al., "Molecular cloning: a laboratory manual", 2. utgave, 1989).
Fragmentet innbefattende den modifiserte sekvensen av genet som kodet for enzymet D-laktatdehydrogenase isoleres deretter fra vektor pLL83 renset på denne måte. Dette utføres ved å utføre en nedbrytning med restriksjonsenzymet SphI ved PphI restriksjonssetet på vektor pLL83. Enzymet T4 polymerase omsettes deretter ved denne spaltningen slik at nukleotider adderes og det oppnås et butt kutt. Endelig utføres en nedbrytning med restriksjonsenzymet Spel.
I en parallell operasjon utføres en nedbrytning på en vektor som er ute av stand til replikering i donorbakteirestammen, Lactococcus lactis, og i vertsbakteriestammen, Lactobacillus johnsonii. Denne nedbrytningen utføres ved et restriksjonssete, hvoretter enzymet T4 polymerase omsettes ved denne spaltningen og slik at det adderes nukleotider og det oppnås et butt kutt. Endelig utføres en nedbrytning med restriksjonsenzymet Spel. Vektor pMD 14, beskrevet i figur 2, kan spesielt anvendes for å produsere denne konstruksjonen. Det er mulig å utføre en nedbrytning på denne vektoren pMD14 med restriksjonsenzymet EcoRI, deretter omsette enzymet T4 polymerase og endelig utføre en nedbrytning med restriksjonsenzymet Spel.
Fragmentet av vektor pLL83 innbefattende den modifiserte sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase innføres deretter i vekt pMD14.
Ligeringsblandingen innføres deretter i Escherichia coli XLl-blue ved elektroporering.
Ca. ett hundre kolonier av Escherichia coli XLl-blue konstruert på denne måten avsettes deretter på mikrofiltreringsplater, de overføres så til en nitrocellulosemembran, de lyseres deretter in situ og en hybridisering utføres med et indre fragment av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase av Lactobacillus johnsonii Lal. 3 positive kloner inneholdende vektor pLL88, beskrevet i figur 3 utvelges følgelig. Sekvensering av vektor pLL88 demonstrerer det faktum av det innbefatter den modifiserte sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase av Lactobacillus johnsonii Lal, områdene av pGEMT som flankerer denne sekvensen, og vektor pMD 14. IV. Innføring av vektor pLL88 i stammen Lactococcus lactis MG1363 ( pAMfil) : Vektor pLL88 innføres i stammen Lactococcus lactis MG1363 (pAMfil) ved elektroporering.
Transformanten som derved fremstilles plasseres på et GM17 agarmedium inneholdende 12 ug/ml kloramfenikol og inkuberes ved 30°C over natten. Vektor pLL88 kan ikke replikere i grampositive bakterier. Alle Lactococcus lactis MG 1363 (pAMfil) bakteriene som har integrert, ved homologt område, vektor pLL88 innbefattende kloramfenikolresistensgenet i konjugativ vektor pAMfil, beskrevet i figur 5, selekteres følgelig på dette mediet inneholdende kloramfenikol. Denne konstruksjonen, innbefattende sekvensen av vektor pLL88 og den av vektro pAMfil, vil senere bli betegnet vektor pLL91, beskrevet i figur 4.
V. Betingelser for koniugering:
Lactococcus lactis MG1363 inneholdende vektor pLL91 dyrkes på et GM17 medium inneholdende 12 ug/ml kloramfenikol, og Lactobacillus johnsonii Lal dyrkes på et MRS medium.
0,2% av Lactobacillus johnsonii Lal kulturen fremstilt på denne måten inokuleres i et rør inneholdende et nytt MRS medium, og blandingen inkuberes i 5 timer 00 min. ved 37°C.
Lactococcus lactis MG1363 og Lactobacillus johnsonii Lal kulturer sentrifugeres deretter ved 3000 opm i 5 min. og hver rest overføres til 10 ml LCMG medium (Efthymiou et al., An antigenic analysis og Lactobacillus acidophilus, J. Infect. Dis., 1962,110,258 - 267) inneholdende 10 g tryptikase, 5 g gjærekstrakt, 3 g tryptose, 3 g K2HPO4, 3 g KH2PH4, 2 g ammoniumsitrat, 5 ml av oppløsning anriket på mineralsalter, 1 g "tween 80", 1 g natriumacetat, 20 g glukose og 0,2 g cystein. 1 ml kultur av donorstammen Lactococcus lactis MG1363 fremstilt på denne måten blandes deretter med 10 ml av kultur av mottagerstammen Lactobacillus johnsonii Lal fremstilt på denne måten, og blandingen sentrifugeres.
Supernatanten kastes og den konsentrerte resten avsettes på plater av PEG agar medium (Takemoto et al., Agric. Biol. Chem., 1989, 53, 3333 - 3334) inneholdende 5 g PEG6000,15 g agar, 1000 ml sukkerfri LCMG oppløsning, 100 ml sukkerholdig oppløsning og 10 ml mineralsaltoppløsning. Disse platene etterlates ved romtemperatur inntil resten er tørr, og dekkes deretter med 10 ml LCMG medium inneholdende 7 %o agar.
Disse platene inkuberes så over natten ved 37°C, de agarholdige bakteriecellene som er dyrket skjæres så ut og denne agaren avsettes i rør inneholdende 10 ml LCMG medium. Disse rørene ristes deretter kraftig og kulturene fremstilt på denne måten fortynnes i TS medium inneholdende 1 g/l trypton og 8,5 g/l NaCl.
De fortynnende kulturene avsettes så på plater av MRS agar medium inneholdende 100 u^ml fosfomycin og 14 ug/ml kloramfenikol, og inkuberes ved 37°C i 48 timer 00 min under anaerobe betingelser.
VI. Konjugering og integrering av pLL91 i Lactobacillus johnsonii Lal:
Lactococcus lactis MG1363 inneholdende vektor pLL91 konjugeres med Lactobacillus johnsonii Lal. Denne konjugeringen har en frekvens på mellom lxlO"<5> og 3xl0"<7 >transformanter/resipientceller. 6 kolonier av Lactobacillus johnsonii Lal resistente for kloramfenikol og fosfomycin selekteres deretter og dyrkes ved 37°C på et MRS medium før de overføres i få timer ved 45°C slik at det selekteres Lactobacillus johnsonii Lal bakterier som har integrert vektor pLL91 i genomet, ved homologt område, ved sekvensen som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase. I realiteten er vektor pAMfil inneholdt i vektor pLL91 ute av stand til å replikere ved en temperatur over 42°C. Følgelig har alle Lactobacillus johnsonii Lal bakteriene som er resistente overfor kloramfenikol og kan dyrkes ved 45°C integrert vekt pLL91 i sitt genom, ved homologt område, ved sekvensen som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase.
Derfor oppnås integreringen av pLL91 i genomet av Lactobacillus johnsonii Lal ved en enkelt overkrysning enten ved terminal 5' området av sekvensen av genet som koder for D-laktatdehydrogenase, eller ved det terminale 3' området av sekvensen av dette genet. VII. Verifisering av integreringen av den modifiserte sekvensen av genet som koder for enzymet D- laktatdehydrogenase i det kromosomale DNA av Lactobacillus johnsonii Lal: Integreringen av vektor pLL91 i genomet av Lactobacillus johnsonii Lal verifiseres ved hjelp av PCR.
Dette utføres ved å anvende primere som er spesifikke for genomet av Lactobacillus johnsonii Lal, hvis sekvenser er sekvensene SEQ ID nr. 3 og SEQ ID rir. 4 beskrevet nedenfor, og primere som er spesifikke for vektor pLL91, hvis sekvenser er sekvensene SEQ ID nr. 5 og SEQ ID nr. 6 beskrevet nedenfor. Fragmentene er forsterket på denne måten ved PCR nedbrytes deretter med restriksjonsenzymet EcoRV, hvis restriksjonssete er lokalisert i den opprinnelige sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase, og med restriksjonsenzymet Dral, hvis restriksjonssete er lokalisert i den modifiserte sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase, for å demonstrere det faktum at integreringen ved en enkelt overkrysning har funnet sted ved det terminale 5' området eller det terminale 3' området av den opprinnelige sekvensen av genet. En Lactobacillus johnsonii Lal bakterie genetisk modifisert ved integrering av den modifiserte sekvensen av genet inn i det terminale 5' området av den opprinnelige sekvensen av genet, og en Lactobacillus johnsonii Lal bakterie genetisk modifisert ved integrering av den modifiserte sekvensen av genet inn i det terminale 3' området av den opprinnelige sekvensen av genet, selekteres deretter.
Integreringen av pLL91 i genomet av Lactobacillus johnsonii Lal verifiseres deretter ved å bevirke en southern blot av genomet av disse to genetisk modifiserte Lactobacillus johnsonii Lal bakteriene selektert ovenfor. Dette gjøres ved nedbrytning av det genomiske DNA av disse to bakteriene med forskjellige restriksjonsenzymer hvis restriksjonsseter er lokalisert i genomet, på vektor pLL91 og på den modifiserte sekvensen av genet som koder for D-laktatdehydrogenase. Hybridiseirngsproben anvendt er et fragment av den opprinnelige sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase.
Dette demonstrerer det faktum at genomfragmentene av de to genetisk modifiserte Lactobacillus johnsonii Lal bakteriene, oppnådd etter nedbrytning med forskjellige restriksjonsenzymer, er av en forskjellig størrelse fra fragmentene oppnådd etter nedbrytning av genomet av villtype Lactobacillus johnsonii Lal bakterie med disse samme restriksjonsenzymene.
VIII. O ppløsning av integreringen:
Integreringen oppløses ved å frigi vektor pLL91 fra genomet. Tapet av vektor pLL91 oppnås enten ved en enkelt overkrysning mellom det terminale 5' området av den opprinnelige sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase og den av den modifiserte sekvensen av nevnte gen, eller ved enkelt overkrysning mellom det terminale 3' området av den opprinnelige sekvensen av genet som koder for enzymet D-laktatdehydrogenase og den av den modifiserte sekvensen av nevnte gen.
Integreringen oppløses ved 37°C, som er en tillatelig temperatur for vektoren, for å fremme frigivelsen av vektor pLL91 fra genomet.
En enzymatisk fargetest utføres i nærvær av D-laktatdehydrogenase, tetrazoliumsalt og diaforase for å differensiere villtypebakteriene fra de genetisk transformerte bakteriene ifølge foreliggende oppfinnelse. Denne enzymatiske testen gjør det mulig å demonstrere det faktum at bakteriene som ikke produserer D(-) - laktat ikke kan oksidere D(-) - laktat når enzymet D-laktatdehydrogenase tilsettes til mediet: følgelig blir tetrazoliumsaltet i mediet ikke redusert ved enzymet diaforase, i fravær av oksydert D-laktat, og disse bakteriene forblir fargeløse.
Eksemplene nedenfor er angitt for å illustrere anvendelsen av en bakteriestamme ifølge foreliggende oppfinnelse ved fremstilling av næringsmiddelprodukter. Prosentdeler er angitt ved vekt med mindre annet er angitt.
Eksempel 1
Yoghurter fremstilles fra stammen Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1851 oppnådd ved å utføre fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Dette utføres ved å preparere 500 ml av 9% rekonstituert skummet melkepulver, tilsetning av 0,1% gjærekstrakt og sterilisering av blandingen i en autoklav i 15 min. ved 121°C. Den etterlates deretter for å avkjøles til 40°C før inkorporeringen av 10 volumprosent av en aktiv kultur av stammen Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1851, inneholdende 5x10 mikroorganismer/cm .
Dette preparatet inkuberes i 4 timer 00 min. ved 40°C for å produsere en surdeig inneholdende ca 2,5xl0<8> mikroorganismer/cm<3>.
I en parallell operasjon fremstilles en surdeig inneholdende ca. 5xl0<8> fortykkede Streptococcus thermophilus bakterier/cm<3> ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor.
En blanding inneholdende 1,5% fett og 3% skummet melkepulver pasteuriseres ved 90°C i 30 min. 1% av Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1851 surdeig og 3% av Streptococcus thermophilus surdeig tilsettes deretter til denne blandingen.
Dette preparatet blandes deretter og inkuberes i 4 timer 20 min. ved 40°C for å gi et preparat av pH 4,6.
Dette gir yoghurter av behagelig tekstur hvor konsentrasjonen av Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1851 er lxl0<8> celler/cm<3> og konsentrasjonen av Streptococcus thermophilus er lxl0<8> celler/cm<3>.
Eksempel 2
Fremgangsmåten er som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at yoghurtene fremstilt fortynnes til 50% med sterilt, destillert vann slik at dette preparatet kan anvendes i parenteral ernæring i et sykehusmiljø.
Eksempel 3
En fermentert melk fremstilles fra stammen Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1852 oppnådd ved å utføre fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Dette gjøres ved å oppvarme 11 melk ved 120°C i 15 min for å denaturere denne.
Den avkjøles deretter til 37°C og inokuleres med 5% volum/volum av Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1852 oppnådd ved å utføre fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Preparatet produsert på denne måten inkuberes ved romtemperatur i 18 til 24 timer inntil dets surhetsnivå når en verdi på 1%.
Endelig fylles den produserte fermenterte melken på flasker og lagres nedkjølt.
Eksempel 4
En fromage frais fremstilles fra stammen Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1852 oppnådd ved å utføre fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Dette gjøres ved å oppvarme 11 melk ved 72°C i 15 min og deretter etterlate den for å avkjøles til 19°C.
Den inokuleres deretter med 0,5% volum/volum av en blanding av bakterier inneholdende en Lactococcus lactis cremoris, en Lactococcus lactis diacetylactis og stamme Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1852.
Den resulterende blandingen inkuberes ved ca. 20°C inntil pH av melken er 4,6.
Melken koagulert på denne måten helles så i nylonposer for å dryppe av overskuddet vann inneholdt i den fremstilte fromage frais.
Fromage fraisen blandes deretter med et antimykotisk middel, så som kaliumsorbat, for å forhindre mugg.
Endelig homogeniseres den ved langsom blanding for å gi en fromage frais av glatt tekstur.
Den ved denne fremgangsmåten fremstilte fromage frais pakkes i små beholdere, som kan lagres ved 4 - 5°C i 4 til 5 uker.

Claims (7)

1. Bakteriestamme med evne til å overleve i tarmen, klebe til humane tarmceller og bevirke immunomodulering, karakterisert ved at den omfatter en stamme av Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus eller Lactobacillus gallinarum, og ved at den er genetisk rekombinert slik at den nå produserer bare L(+)-laktat, idet genet som koder enzymet D-laktatdehydrogenase er inaktivert.
2. Stamme ifølge krav 1, karakterisert ved at den er deponert ved CNCM under nummeret 1-1851.
3. Stamme ifølge krav 1, karakterisert ved at den er deponert ved CNCM under nummeret I-1852.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av en stamme ifølge krav 1, karakterisert ved at: - sekvensen av genet som koder D-laktatdehydrogenase isoleres fra en vertsbakterie-stamme som har evne til å overleve i tarmen, til å klebe til humane tarmceller og bevirke immunomodulering, - rettet mutagenese gjennomføres på nevnte sekvens for derved å oppnå en modifisert sekvens, - denne modifiserte sekvensen inkorporeres i en konjugatvektor, - konjugatvektoren overføres ved konjugering inn i vertsbakteriestammen, - deretter selekteres vertsbakterien hvori sekvensen som koder enzymet D-laktatdehydrogenase er erstattet med den modifiserte sekvensen ved homolog rekombinasjon.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at for å inkorporere den modifiserte sekvensen i en konjugativ vektor, - selekteres en donorbakteriestamme som inneholder en konjugativ vektor som ikke har evnen til å replikere i vertsbakteriestammen, - en struktur skapes ved ligering av den modifiserte sekvensen inn i en første vektor som er ute av stand til å formeres i donorstammen, - nevnte struktur innføres i donorbakteriestammen, - deretter selekteres donorbakteriene hvori den første vektoren og den konjugative vektoren har rekombinert.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at de selekterte vertsbakteriene er de hvori DNA sekvensene av den konjugative vektoren er fjernet fra genomet, med unntak av den modifiserte sekvensen.
7. Anvendelse av en bakteriestamme oppnådd ved å utføre fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 4 til 6 ved fremstillingen av en næringsmiddelsammen-setning.
NO19981774A 1997-05-03 1998-04-21 Bakteriestamme med evne til a overleve i tarmen, klebe til humane tarmceller og bevirke immunomodulering, fremgangsmate for fremstilling derav samt anvendelse derav. NO324916B1 (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97201337A EP0875579B1 (fr) 1997-05-03 1997-05-03 Production de L(+)-Lactate

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO981774D0 NO981774D0 (no) 1998-04-21
NO981774L NO981774L (no) 1998-11-04
NO324916B1 true NO324916B1 (no) 2008-01-07

Family

ID=8228296

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19981774A NO324916B1 (no) 1997-05-03 1998-04-21 Bakteriestamme med evne til a overleve i tarmen, klebe til humane tarmceller og bevirke immunomodulering, fremgangsmate for fremstilling derav samt anvendelse derav.

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6110725A (no)
EP (1) EP0875579B1 (no)
JP (1) JPH10313884A (no)
KR (1) KR100503707B1 (no)
AR (1) AR015376A1 (no)
AT (1) ATE365805T1 (no)
AU (1) AU753558B2 (no)
CA (1) CA2230435C (no)
DE (1) DE69737853T2 (no)
DK (1) DK0875579T3 (no)
ID (1) ID20238A (no)
MY (1) MY131830A (no)
NO (1) NO324916B1 (no)
NZ (1) NZ330351A (no)
RU (1) RU2202610C2 (no)
ZA (1) ZA983697B (no)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE365805T1 (de) * 1997-05-03 2007-07-15 Nestle Sa Herstellung von l(+)-lactat
CA2474152A1 (en) * 2001-11-23 2003-06-19 Cargill Dow Llc Methods and materials for the production of organic products in cells of candida species
AU2003223971A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-20 Societe Des Produits Nestle S.A. La1 - the genome of a lactobacillus strain
EP1513923B1 (en) 2002-05-30 2007-07-18 NatureWorks LLC Methods and materials for the production of d-lactic acid in yeast
KR100449915B1 (ko) * 2002-10-30 2004-09-22 주식회사한국야쿠르트 락토바실러스 에시도필러스 케이와이1909
EP2448419A2 (en) * 2009-06-30 2012-05-09 Chr. Hansen A/S A method for producing a fermented milk product
GB0914878D0 (en) 2009-08-26 2009-09-30 Plant Bioscience Ltd Competetive exclusion compositions and methods
SG193589A1 (en) * 2011-03-29 2013-10-30 Nestec Sa Natural derivative of the lactobacilus johnsonii strain cncm i-1225, deficient in d-lactic acid production and with a further improved immune profile
WO2012130965A1 (en) * 2011-03-29 2012-10-04 Nestec S.A. Natural derivative of a well known and successful probiotic strain deficient in d-lactic acid production
MX2013011233A (es) * 2011-03-29 2013-10-17 Nestec Sa Derivado natural de la cepa de lactobacillus johnsonii cncm i-1225, deficiente en la produccion de acido d-lactico.
US9309492B2 (en) * 2011-03-29 2016-04-12 Nestec S.A. Derivative of the Lactobacilus johnsonii strain CNCM I-1225, deficient in D-lactic acid production and with an improved shelf life
RU2461619C1 (ru) * 2011-09-12 2012-09-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Горский государственный аграрный университет" Штамм lactobacillus gallinarum, используемый для производства кисломолочных продуктов
KR101295369B1 (ko) * 2011-10-14 2013-08-09 한국화학연구원 Ｌ―형 젖산 생성 변이 균주 및 이를 이용한 젖산 제조 방법
KR101438882B1 (ko) 2012-04-24 2014-09-05 씨제이제일제당 (주) 신규한 ｄ형 젖산 생산균주

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH683223A5 (fr) * 1991-10-25 1994-02-15 Nestle Sa Procédé de préparation d'un lait acidifié.
DE69227329T3 (de) * 1992-07-06 2003-01-23 Nestle Sa Milchbakterien
US5747310A (en) * 1992-07-10 1998-05-05 Meiji Milk Products Co., Ltd. Gene integration into chromosomes of lactobacillus delbrueckii species and integrants thereof
US5416020A (en) * 1992-09-29 1995-05-16 Bio-Technical Resources Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus strain and fermentation process for producing L-(+)-lactic acid
EP0638642A1 (en) * 1993-08-06 1995-02-15 Societe Des Produits Nestle S.A. Lactobacillus bulgaricus having decreased acid production and/or improved aroma and flavor production, and food composition comprising said lactobacillus bulgaricus
PH31093A (en) * 1993-08-06 1998-02-05 Nestec Ltd Lactobacillus bulgaricus having decreased acid production and/or improved aroma and flavor production and food composition comprising said lactobacillus.
ATE365805T1 (de) * 1997-05-03 2007-07-15 Nestle Sa Herstellung von l(+)-lactat

Also Published As

Publication number Publication date
NO981774D0 (no) 1998-04-21
ID20238A (id) 1998-11-05
MY131830A (en) 2007-09-28
US6110725A (en) 2000-08-29
AU6373698A (en) 1998-11-05
CA2230435A1 (en) 1998-11-03
JPH10313884A (ja) 1998-12-02
KR100503707B1 (ko) 2005-09-26
CA2230435C (en) 2010-06-08
AU753558B2 (en) 2002-10-24
NO981774L (no) 1998-11-04
EP0875579B1 (fr) 2007-06-27
RU2202610C2 (ru) 2003-04-20
KR19980086644A (ko) 1998-12-05
ATE365805T1 (de) 2007-07-15
DE69737853T2 (de) 2008-03-06
AR015376A1 (es) 2001-05-02
DE69737853D1 (de) 2007-08-09
NZ330351A (en) 1999-07-29
DK0875579T3 (da) 2007-10-22
ZA983697B (en) 1999-11-01
EP0875579A1 (fr) 1998-11-04
US6258587B1 (en) 2001-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2473058B1 (en) Lactic bacterium with modified galactokinase expression for texturizing food products by overexpression of exopolysaccharide
KR101695908B1 (ko) 파지 내성에 기초하여 선별된 식품의 텍스처 조절용 유산균
KR101609401B1 (ko) 항균성 및 면역조절성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이의 신규한 균주
AU2017242123B2 (en) Use of glucose deficient streptococcus thermophiles strains in a process for producing fermented milk products
JP3017687B2 (ja) ビフィズス菌及びその培養方法
EP3784042A1 (en) Composition and process for producing a fermented milk product comprising application of a lactose-deficient s. thermophilus strain, a lactose-deficient l. bulgaricus strain and a probioti _/ strain
NO324916B1 (no) Bakteriestamme med evne til a overleve i tarmen, klebe til humane tarmceller og bevirke immunomodulering, fremgangsmate for fremstilling derav samt anvendelse derav.
US8741622B2 (en) Stress tolerant Bifidobacteria
US20130189396A1 (en) Method for producing a fermented food containing bifidobacteria
WO2009150856A1 (ja) 酸素耐性付与遺伝子及びその利用
WO1994001574A1 (en) Method of integrating gene into chromosome of lactobacillus delbrueckii species and product of gene integration
KR20230148251A (ko) 발효제품 제조용 유산균 조성물
US6331140B1 (en) Mobile genetic elements as tools for genetic modification of L. delbrueckii or L. helveticus
KR20230004677A (ko) 개선된 당 대사를 갖는 락트산 박테리아
US11272716B2 (en) Bacteria
WO2005001068A1 (en) A BIFIDOBACTERIUM BREVE LMC520 STRAIN CONTAINING A PLASMID Pbc520, A METHOD FOR PREPARATION OF CONJUGATED FATTY ACIDS AND FERMENTED MILKS CONTAINING SUCH FATTY ACIDS USING THE SAME STRAIN, AND USE OF A PLASMID pBC520
MXPA98003427A (en) Production of l (+) - lact
CA3166489A1 (en) Nisin-permeabilized microbial cell catalysts
Jo et al. Properties of the Fusants of Lactobacillus acidophilus 88 and Lactobacillus casei subsp. casei KCTC 1121
KR20070121185A (ko) 유당분해효소 활성을 갖는 유산균과 이의 이용

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees