KR20230004677A - 개선된 당 대사를 갖는 락트산 박테리아 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시키는 단계를 포함하는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 이는 최대의 락토스 소모 속도에서의 높은 백분율의 소모되는 갈락토스 및 선택적으로 락토스 소모의 마지막에서의 높은 백분율의 소모되는 갈락토스를 특징으로 한다(둘 모두 검정 I에 의해 결정되는 바와 같음). 또한, 본 발명은 이 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열 및 이의 "고 갈락토스 이용" 프로파일 둘 모두를 특징으로 하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 이러한 균주를 포함하는 배양물 및 키트-오브 파트(kit-of part), 및 식품 응용에서의 이러한 균주의 용도에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 관한 상호-참조
본 출원은 명칭이 "LACTIC ACID BACTERIA HAVING IMPROVED SUGAR METABOLISM"인, 2020년 4월 29일자 출원된 유럽 특허 출원 제20172078.6호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 모든 목적을 위하여 이들의 전체가 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2021년 4월 26일에 생성된 NB41753-WO-PCT_ST25.txt의 파일명의 파일로 제공되며, 이는 57,975 바이트 크기이다. 전자 형식의 서열 목록의 정보는 이의 전체가 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 이는 최대의 락토스 소모 속도에서의 높은 백분율의 소모되는 갈락토스 및 선택적으로 락토스 소모의 마지막에서의 높은 백분율의 소모되는 갈락토스를 특징으로 한다(둘 모두 검정 I에 의해 결정되는 바와 같음). 또한, 본 발명은 이 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열 및 이의 "고 갈락토스 이용" 프로파일 둘 모두를 특징으로 하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 이러한 균주를 포함하는 배양물 및 키트-오브 파트(kit-of part), 및 식품 응용에서의 이러한 균주의 용도에 관한 것이다.
스트렙토코커스 써모필러스 종의 대부분의 균주는 갈락토스-음성 표현형을 나타낸다(즉, 탄수화물의 단독의 공급원으로서 갈락토스에서 성장할 수 없다). 실제로, 문헌[de Vin et al. (Appl. Environ. Microbiol. 2005)]에서, 약 15%(49개 중 8개)의 에스. 써모필러스 균주가 갈락토스-양성인 것이 확인되었다. 그러나, 게놈 분석에 의해, 전부는 아니지만, 대부분의 에스. 써모필러스 균주가 명백히 온전한 갈락토스 오페론을 갖는 것이 드러났다. 갈락토스(gal) 오페론은 galR 및 galM 유전자와 회합된 클러스터 galKTE를 형성하는 3개의 유전자의 군으로 이루어지며(도 1), lacS 및 lacZ g유전자를 보유하는 락토스 오페론으로 이어진다(문헌[Vaughan et al. J. Bacteriol. 2001]; 문헌[Vaillancourt et al. J. Bacteriol. 2002]에 기재된 바와 같음). gal 오페론 및 lac 오페론은 함께 gal-lac 유전자 클러스터로서 정의된다. gal-lac 유전자 클러스터 구조 및 위치는 하기에 추가로 정의된다. gal 오페론에서 관찰되는 유전자는 전사 조절자(galR), 갈락토키나제(galK), 갈락토스 1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제(galT), UDP-글루코스 4-에피머라제(galE) 및 뮤타로타제(mutarotase)(galM)를 인코딩한다. 이 오페론 내에 인코딩되는 효소는 를루아르(Leloir) 경로를 통한 갈락토스의 이용을 가능하게 한다(도 2).
에스. 써모필러스의 갈락토스-음성 표현형은 이 종의 최근의 진화로부터 초래되었음이 추정된다(상기 언급된 문헌[Vaughan et al, 2001]). 모든 필요한 유전 물질이 이들의 게놈에 인코딩됨에 따라, 다수의 저자에 의해 기재된 바와 같은 적절한 선택 조건 하에서 갈락토스-양성 돌연변이체를 선택할 수 있는 것은 놀랍지 않다(문헌[Tinson et al., Aust. J. Dairy Technol. 1982]; 문헌[Thomas and Crow, Appl. Environ. Microbiol. 1984]; 문헌[Hutkins et al., Appl. Environ. Microbiol. 1985]; 문헌[Bentaya et al., Can. J. Microbiol. 1991]; 문헌[Vaughan et al., 2001]). 그러나, 이들 돌연변이체는 불안정하였으며, 예를 들어, 균주가 락토스 상에서 또는 사카로스 상에서 성장하는 것처럼, 선택 조건이 유지되지 않는다면, 갈락토스-양성 표현형은 신속하게 소실된다(상기 언급된 문헌[Thomas and Crow, 1984]). 더욱이, 갈락토스-양성임에도 불구하고, 이들은 락토스에서의 성장 동안 갈락토스를 여전히 배출하였다.
대부분의 균주는 락토스에서 성장하는 때 락토스의 갈락토스 모이어티를 이용한다(상기 언급된 문헌[Vaillancourt et al. 2002] 및 문헌[de Vin et al. 2005]). 2005년도에, de Vin 등은 에스. 써모필러스에 대한 4가지 유형의 갈락토스 이용의 동역학을 확인하였으며, 이를 A형에서 D형까지로 정의하였다. 일부 균주(18.4%)는 발효 프로파일 A를 나타내었으며, 발효 8.5시간 내에 배출된 갈락토스 중 어느 것도 소모하지 않았다. 대다수의 균주(65.3%)는 발효 프로파일 B를 나타내었으며, 발효 8.5시간 내에 배출된 갈락토스의 일부를 소모할 수 있을 뿐이었다. 이 그룹에 속하는 균주는 배출된 갈락토스를 다양한 속도 및 다양한 정도로 소모하였지만, 완료될 때까지 소모하지는 않았다. 그룹 A 및 B의 구성원이 배출된 갈락토스를 전부 사용하지 못하는 것은 또한, 최대 24시간의 연장된 인큐베이션 후에도 지속되었다. 다른 균주(14.3%)는 발효 프로파일 C를 나타내었으며, 발효 8.5시간 내에 배출된 갈락토스를 전부 소모하였다.
발효 프로파일 D를 갖는 (49개 중) 단일의 균주는 락토스에서의 성장 동안 갈락토스를 배출하지 않았으며, 락토스의 글루코스 및 갈락토스 모이어티를 동시에 소모하였다. 발효 프로파일 D를 갖는 이 균주(EU20으로 지칭됨)는 로디아 푸드 컬렉션(Rhodia Food Collection)(문헌[Marshall et al. Carbohydrate Research 2001] 참조)의 일부이고, 이후에, 듀폰 다니스코(DuPont Danisco) 배양물 컬렉션(culture collection)(DGCC7698)의 일부였다. DGCC7698 균주를 2018년 5월 29일에 듀폰 뉴트리션 바이오사이언스즈 에이피에스(DuPont Nutrition Biosciences ApS)에 수탁 번호 DSM32823 하에 기탁하였다. 2005년도에, EU20 균주의 gal 오페론을 진뱅크(Genbank)에 수탁 번호 AY704367.1 하에 등록하였다.
일부 유제품 응용에서, 최종 제품 내에 다량의 갈락토스가 요망되지 않기 때문에, 락토스를 함유하는 배지(예컨대, 밀크)에서 효율적인 갈락토스 이용을 갖는 에스. 써모필러스 균주를 설계하는 것이 여전히 필요하다.
SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 의해 제시된 서열을 함유하는 핵산 서열을 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 도입하는 단계를 포함하는, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법이 본원에 제공된다. 일 실시형태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO:1, 3, 4, 5 또는 6, 또는 SEQ ID NO:1, 3, 4, 5 또는 6 유도체에 의해 제시된 서열을 함유하며, 유도체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 의해 제시된 서열을 함유한다. 일 실시형태에서, 도입은 자연적 수용성(natural competence), 컨쥬게이션 또는 형질전환을 포함한다. 일 실시형태에서, 당해 방법은 핵산 서열을 도입한 후에, 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 하나 이상의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하고/거나 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양태에서, DSMZ에 2021년 4월 21일에 수탁 번호 DSM33851, DSM33852, DSM33853 또는 DSM33854 하에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 균주 또는 이의 돌연변이체가 제공된다.
또한, 하기를 포함하는, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법이 제공된다: a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계; b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체를 함유하는 단계; 및 c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 단계 b)에서 수득된 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계. 일 실시형태에서, 단계 b)는 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체를 포함하는 단계, 및 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체를 포함하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 단계 b)는 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체를 포함하는 단계이다. 일 실시형태에서, 단계 b)는 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체를 포함하는 단계이며, 특히 상기 상이한 서열의 gal 오페론은 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진다. 일 실시형태에서, 단계 b)는 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계이다. 일 실시형태에서, 단계 a)의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 갈락토스-음성이다.
일 양태에서, 본원에 제공되는 방법에 의해 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 제공되되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니다.
일 양태에서, 하기를 특징으로 하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 제공되되; 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니다: a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 함유함; 및 b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 가짐. 일 실시형태에서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터는 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 gal-lac 유전자 클러스터, 및 서열이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 gal-lac 유전자 클러스터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열은 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열은 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하며, 특히, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 gal 오페론은 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진다. 일 실시형태에서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는, 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는다. 일 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일은 적어도 적어도 70%인, 특히, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는, 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 추가로 정의된다. 일 실시형태에서, 본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는다. 일 실시형태에서, 본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 또는 b) 적어도 50% 및 70% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 70% 및 최대 80%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는다. 일 실시형태에서, SEQ ID 유도체는 상기 SEQ ID와 적어도 97% 동일성을 갖는다. 일 실시형태에서, 본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 DSM32823 균주의 게놈 서열에 대하여 최대 99.98%, 최대 99.97%, 최대 99.6% 또는 최대 99.5%인 동일성을 갖는 게놈 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, 본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하는 배양물이 제공된다. 일 실시형태에서, 배양물은 적어도 하나의 박테리아 균주 및/또는 성분(들)을 포함한다. a) 본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 b) 적어도 하나의 다른 박테리아 균주 및/또는 성분(들)을 포함하거나 이로 이루어진 키트-오브-파트가 또한 제공된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 다른 박테리아 균주는 락토코커스(Lactococcus) 및/또는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유래의 것이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 다른 박테리아 균주는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 아종 락티스, 락토코커스 락티스 아종 크레모리스(cremoris) 및/또는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)이다.
본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 또는 본원에 제공되는 키트-오브-파트 또는 배양물을 포함하는 식품 또는 사료 제품이 또한 본원에 제공된다. 일 실시형태에서, 식품 또는 사료 제품은 유제품, 육류 또는 곡물 식품 또는 사료 제품이다. 일 실시형태에서, 식품 또는 사료 제품은 발효유 식품이다.
a) 기질을 본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주 또는 본원에 제공되는 키트-오브-파트 또는 배양물로 접종하는 단계; 및 b) 단계 a)로부터 수득되는 접종된 기질을 발효시켜, 발효 제품을 수득하는 단계를 포함하는 발효 제품의 제조 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 기질은 밀크 기질이다. 일 실시형태에서, 발효 제품은 발효유 제품이다.
일 양태에서, 하기를 포함하는 파스타-필라타 치즈(pasta-filata cheese)의 제조 방법이 제공된다: a) 스트레칭(stretching)에 적합한 커드(curd)를 제공하거나 생산하는 단계로서, 상기 커드가 밀크를 본원에 제공되는 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 또는 본원에 제공되는 키트-오브-파트 또는 배양물로 접종하고 발효시킴으로써 수득되는 단계; b) 단계 a)의 커드를 스트레칭시켜, 스트레칭된 커드를 수득하는 단계; 및 c) 단계 b)의 스트레칭된 커드를 조작하여, 최종적으로 파스타-필라타 치즈를 만드는 단계. 일 실시형태에서, 스트레칭에 적합한 커드를 생산하는 단계 a)는 하기를 포함한다: a1) 밀크를 본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주 또는 본원에 제공되는 키트-오브-파트 또는 배양물로 접종하는 단계; a2) 단계 a1)의 접종된 밀크를 발효시켜, 응고유를 수득하는 단계; a3) 단계 a2)의 응고유를 절단하고, 가열하고, 교반하여, 커드 및 유청의 믹스를 수득하는 단계; 및 a4) 단계 a3)의 커드 및 유청의 믹스를 배수하여, 스트레칭에 적합한 커드를 수득하는 단계. 일 실시형태에서, 당해 방법은 밀크를 밀크 응고제로 접종하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 당해 방법은 단계 a3)에서 가열하고 교반하는 때 커드를 세척하는 단계를 추가로 포함한다.
적어도, 파스타-필라타 치즈를 제조하기 위한, 본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도가 제공된다. 또한, 적어도, 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 사용하여 생산되는 치즈 유청에 비하여 감소된 갈락토스 농도를 갖는 치즈 유청을 생산하기 위한, 본원에 제공되는, 또는 본원에 제공되는 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도가 제공된다.
본원에 기재된 각각의 양태 및 실시형태는 실시형태 또는 양태의 맥락으로부터 명시적으로 또는 명백하게 배제되지 않는 한, 함께 사용될 수 있다.
도 1은 에스. 써모필러스의 gal-lac 유전자 클러스터를 나타내는 개략도이다. 음영 막대는 유전자(전사 방향이 나타나 있음)를 나타낸다. 유전자는 하기의 단백질을 코딩한다: GalR, 추정의 전사 조절자; GalK, 갈락토키나제; GalT, 갈락토스-1-P 우리딜릴트랜스퍼라제; GalE, UDP-글루코스 4-에피머라제; GalM, 갈락토스 뮤타로타제; LacS, 락토스 수송체; LacZ, β-갈락토시다제. 종결자는 스템-루프 구조에 의해 나타나 있다. 화살표는 프로모터를 나타낸다(문헌[Vaillancourt et al., 2002]);
도 2는 를루아르 경로를 나타내는 개략도이다. 락토스는 수송체 LacS를 통해 흡수되며, B-갈락토시다제(LacZ)에 의해 글루코스 및 갈락토스로 가수분해된다. 글루코스는 포스포글루코키나제에 의해 인산화되어, 해당과정에 참여한다. 갈락토스는 하나의 락토스 분자와의 교환에 의해 LacS를 통해 배출된다. 갈락토스-양성 균주에 있어서, 락토스의 갈락토스 모이어티는 gal 오페론에 의해 인코딩되는 효소를 통해 글루코스-1-포스페이트(G1P)로 전환된다. G1P는 포스포글루코뮤타제(PGM)(문헌[Levander et al., 2001]으로부터 추출됨)를 통해 해당과정으로 재유도될 수 있다. EPS, 세포외다당류(exopolysaccharide); G6P, 글루코스 6-포스페이트; GalU, UDP 글루코스 피로포스포릴라제;
도 3은 (A) 균주 DSM33036, (B) 균주 DGCC7773 및 (C) 균주 DSM32823을 사용한 발효 시의 5 g/L(14.6 mM)의 초기 농도의 락토스를 함유하는 M17 배지 중 락토스 농도 및 갈락토스 농도(mM)의 진화를 나타낸다;
도 4는 (A) SEQ ID NO:7(DSM33036)과 SEQ ID NO:8(DGCC7773)의 비교를 위한 및 (B) SEQ ID NO:1(DSM32823)과 SEQ ID NO:7(DSM33036)의 비교를 위한, gal-lac 유전자 클러스터의 2개의 서열 간의 단일-뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 밀도의 표시[상측], 및 gal-lac 유전자 클러스터 내에 포함되는 오픈 리딩 프레임(ORF)의 규모에 따른 표시(각각의 화살표는 시작에서 정지 코돈으로 배향되고, 이의 유전자 명칭에 의해 확인된 ORF를 나타냄)[하측]이다;
도 5는 (A) 균주 DSM33036 및 (B) 균주 DGCC13139에 의한 발효 시의 1리터의 배지에 대해 정규화된, 소모되는 락토스(흑색 원) 및 소모되는 갈락토스(백색 원)의 양의 시간이 지남에 따른 진화를 나타낸다;
도 6은 (A) 균주 DSM33036 및 (B) 균주 DGCC13139에 의한 발효 시의 락토스 소모 속도(흑색 사각형) 및 시간이 지남에 따라 소모되는 락토스 가수분해로부터 초래되는 갈락토스의 백분율(백색 사각형)을 나타낸다;
도 7은 (A) DSM32823(SEQ ID NO:2) 및 DSM33036(SEQ ID NO:7)의 galR-galK 유전자간 영역의 정렬[galK 프로모터의 위치 -9 및 -14의 뉴클레오타이드는 밑줄 표시되어 있으며, 샤인-달가노 서열의 G SNP는 네모 표시되어 있음] 및 (B) DSM32823(SEQ ID NO:5) 및 DSM33036(SEQ ID NO:7)의 galR 유전자의 코딩 서열의 처음 200개 뉴클레오타이드의 정렬[DSM33036의 galR 코딩 서열에 비하여 DSM32823의 galR 코딩 서열에서 결실된 G 뉴클레오타이드가 네모 표시되어 있음]을 나타낸다. 도 8은 실시예 8에 기재된 바와 같은 피자 베이킹 후에 나타낸 바와 같은 박테리아 균주를 사용하여 제조된 피자 치즈의 L 값(명도)을 보여준다.
도 2는 를루아르 경로를 나타내는 개략도이다. 락토스는 수송체 LacS를 통해 흡수되며, B-갈락토시다제(LacZ)에 의해 글루코스 및 갈락토스로 가수분해된다. 글루코스는 포스포글루코키나제에 의해 인산화되어, 해당과정에 참여한다. 갈락토스는 하나의 락토스 분자와의 교환에 의해 LacS를 통해 배출된다. 갈락토스-양성 균주에 있어서, 락토스의 갈락토스 모이어티는 gal 오페론에 의해 인코딩되는 효소를 통해 글루코스-1-포스페이트(G1P)로 전환된다. G1P는 포스포글루코뮤타제(PGM)(문헌[Levander et al., 2001]으로부터 추출됨)를 통해 해당과정으로 재유도될 수 있다. EPS, 세포외다당류(exopolysaccharide); G6P, 글루코스 6-포스페이트; GalU, UDP 글루코스 피로포스포릴라제;
도 3은 (A) 균주 DSM33036, (B) 균주 DGCC7773 및 (C) 균주 DSM32823을 사용한 발효 시의 5 g/L(14.6 mM)의 초기 농도의 락토스를 함유하는 M17 배지 중 락토스 농도 및 갈락토스 농도(mM)의 진화를 나타낸다;
도 4는 (A) SEQ ID NO:7(DSM33036)과 SEQ ID NO:8(DGCC7773)의 비교를 위한 및 (B) SEQ ID NO:1(DSM32823)과 SEQ ID NO:7(DSM33036)의 비교를 위한, gal-lac 유전자 클러스터의 2개의 서열 간의 단일-뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 밀도의 표시[상측], 및 gal-lac 유전자 클러스터 내에 포함되는 오픈 리딩 프레임(ORF)의 규모에 따른 표시(각각의 화살표는 시작에서 정지 코돈으로 배향되고, 이의 유전자 명칭에 의해 확인된 ORF를 나타냄)[하측]이다;
도 5는 (A) 균주 DSM33036 및 (B) 균주 DGCC13139에 의한 발효 시의 1리터의 배지에 대해 정규화된, 소모되는 락토스(흑색 원) 및 소모되는 갈락토스(백색 원)의 양의 시간이 지남에 따른 진화를 나타낸다;
도 6은 (A) 균주 DSM33036 및 (B) 균주 DGCC13139에 의한 발효 시의 락토스 소모 속도(흑색 사각형) 및 시간이 지남에 따라 소모되는 락토스 가수분해로부터 초래되는 갈락토스의 백분율(백색 사각형)을 나타낸다;
도 7은 (A) DSM32823(SEQ ID NO:2) 및 DSM33036(SEQ ID NO:7)의 galR-galK 유전자간 영역의 정렬[galK 프로모터의 위치 -9 및 -14의 뉴클레오타이드는 밑줄 표시되어 있으며, 샤인-달가노 서열의 G SNP는 네모 표시되어 있음] 및 (B) DSM32823(SEQ ID NO:5) 및 DSM33036(SEQ ID NO:7)의 galR 유전자의 코딩 서열의 처음 200개 뉴클레오타이드의 정렬[DSM33036의 galR 코딩 서열에 비하여 DSM32823의 galR 코딩 서열에서 결실된 G 뉴클레오타이드가 네모 표시되어 있음]을 나타낸다. 도 8은 실시예 8에 기재된 바와 같은 피자 베이킹 후에 나타낸 바와 같은 박테리아 균주를 사용하여 제조된 피자 치즈의 L 값(명도)을 보여준다.
본 발명자들은 놀랍게도 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 갈락토스 대사가 이들 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 특정 부분을 변형시킴으로써 유리하게 변경될 수 있다는 것을 보여주었다. 본 출원에는 유리한 갈락토스 대사를 보이는 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 이들 균주의 생성 방법이 기재되며, 이 유리한 갈락토스 대사가 다양한 식품 응용에서 사용될 수 있는 방법이 예시된다.
본원에 기재된 갈락토스를 대사하는 능력을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법은 식품 산업, 예를 들어, 유제품 산업에 유용한 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 생성하는데 적합하다. 본원에 기재된 방법은 식품 생산에 가치있을 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 생성하는 이점을 갖는다. 예를 들어, 일부 경우에, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 제조 시간 및 선택적으로 유청 가치 유지의 측면에서 식품 생산자, 예를 들어, 치즈 제조업체의 요구사항과 식품 소매업자 및 소비자의 선호(예를 들어, 낮은 갈변)를 모두 충족하는 해결책을 제공한다.
본 발명은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법, 본 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 및 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주 그 자체에 관한 것이다.
의심을 피하기 위하여, 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 스트렙토코커스 살리바리어스(Streptococcus salivarius) 아종 써모필러스 균주로서 이해되어야 한다.
검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법의 맥락에서 제공되는 정의 및 특징은 이 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 스트렙토코커스 써모필러스 균주 그 자체에 동일하게 적용되며, 이는 서열(SEQ ID 및 이들의 유도체) 및 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 정의하는 특징(예컨대 갈락토스 소모의 백분율)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 숙련자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 개시내용은 본원에 개시된 예시적인 방법 및 재료에 의해 제한되지 않으며, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시형태의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있다.
본원에 제공되는 제목은 본 명세서를 전체로서 참조하여 이루어질 수 있는 본 개시내용의 다양한 양태 또는 실시형태의 제한이 아니다. 본원에 사용되는 섹션 제목은 구성 목적만을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 정의된 임의의 용어는 전체로서 명세서를 참조하여 보다 완전하게 정의된다.
용어의 정의는 명세서 전체에 걸쳐 나타날 수 있다. 본 개시내용은 기재된 특정 실시형태에 제한되지 않으며, 물론, 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어가 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 것이 아닌 것을 이해해야 한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "하나(a, an)" 및"상기(the)"는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 유의해야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하다(comprised of)"는 "포함하는(including)", "포함하다(includes)" 또는 "함유하는", "함유하다" 및 이의 문법적 변형과 동의어이며, 포괄적이거나 개방형이며, 추가적인 인용되지 않은 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하다(comprised of)", "포함하는(including)", "포함하다(includes)" 또는 "함유하는", "함유하다" 및 이의 문법적 변형은 또한 용어 "~로 이루어진"을 포함한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재 값이 하한 단위의 10분의 1까지 또한 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 임의의 언급된 값 또는 언급된 범위의 개재 값과 해당 언급된 범위의 임의의 다른 언급된 값 또는 개재 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 개시내용 내에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 배제될 수 있고, 어느 하나, 둘 모두가 아닌 또는 둘 모두의 한계가 더 작은 범위에 포함되는 각각의 범위가 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로 하여 본 개시내용 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위가 또한 본 개시내용에 포함된다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 이들의 개시에 대해서만 제공된다. 본원의 어떠한 것도 그러한 간행물이 본원에 첨부된 청구범위에 대한 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 출원에서 언급된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함한 모든 간행물은 각각의 개별 간행물이 개별적으로 참조로 포함된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물에 제시된 정의와 상반되거나 다르게는 부합하지 않는 경우, 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
"고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법
본 발명은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 그의 게놈에 갈락토스-락토스 유전자 클러스터(gal-lac 유전자 클러스터)를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 본원에 개시된 바와 같은 SEQ ID 또는 SEQ ID 유도체를 포함하는 단계; 및
c) 검정 I에 의해 시험되는 경우, 본원에 정의된 바와 같은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 단계 b)에서 수득되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계.
당해 방법의 단계 a)에서, 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 제공된다.
본 발명의 방법의 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 적어도 2가지의 하기의 특징을 특징으로 한다:
1) 균주는 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유한다
본원에 정의된 바와 같은 표현 "gal-lac 유전자 클러스터"는 5'에서 3'으로 하기의 유전자를 포함하는 널리 알려져 있는 유전자의 클러스터를 지칭한다: galR, galK, galT, galE, galM, lacS 및 lacZ(문헌[van den Bogaard et al.; System. Appl. Microbiol. 2004]). gal-lac 유전자 클러스터는 상류에서 관찰되는 유전자(추정의 트랜스포사제를 인코딩하는 ORF 및 아연-메탈로프로테아제를 인코딩하는 추가의 상류 zmpB 유전자) 및 하류에서 관찰되는 유전자(ATP-의존성 dsDNA 엑소뉴클레아제를 인코딩하는 유전자 sbcC 및 sbcD)에 기초하여, 상기 기재된 유전자 구조를 사용하여 에스. 써모필러스의 게놈에서 확인될 수 있다. 더욱 상세하게, galR 유전자는 다른 유전자 galK, galT, galE, galM, lacS 및 lacZ와 다르게 전사된다(도 1). 따라서, galR과 galK 유전자 사이에, 유전자간 영역이 관찰되며, 이는 분기하는 galR 및 galK 프로모터 둘 모두를 함유한다. galKTEM 유전자는 galK 프로모터로부터 함께 전사되는 한편, galM 유전자는 또한, galM 유전자의 상류에서 관찰되는 프로모터 영역으로부터 전사된다. lacSZ 유전자는 lacS 유전자의 상류에서 관찰되는 프로모터 영역으로부터 함께 전사된다. 본원에 개시된 SEQ ID는 모두 5'에서 3'의 동일한 방향이며, 이는 galK, galT, galE, galM, lacS 및 lacZ 유전자의 전사의 방향이며; 이에 따라, galR 유전자의 코딩 서열은 이들 SEQ ID의 일부에서 역상보물로서 나타난다(예를 들어, 이의 TAG 정지-코돈은 CTA로서 나타난다); 및
2) 균주는 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 나타낸다. 일 실시형태에서, 균주는 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는다. 최대 락토스 소모 속도에서의 및 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율은 본원에 상세히 설명된 바와 같은 검정 I에 의해 결정된다.
검정 I
시험할 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 37℃에서 12시간 동안 락토스 5g/L가 보충된 M17 브로쓰(broth)에서 연속하여 2회 사전-배양한다. 이어서, 사전-배양물을 사용하여, 락토스 5g/L가 보충된 M17 브로쓰(300 ml 배양물)에 1%(v/v)로 접종한다. 이어서, 배양물을 수조 내에서 37℃에서 인큐베이션시킨다. 30분마다, 배양물의 시료를 빼내고(5 ml), 0.2 μm 나일론(Nylon) 필터를 통해 여과하고, 2 ml HPLC 바이얼 내에 둔다. 여과된 시료를 추가의 분석까지 -20℃에 보관한다. 5 μL의 시료를 아질런트(Agilent) 1200 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 상에 주입한다. 용리를 0.7 mL/분으로 0.025N 황산 용액을 사용하여 등용매 방식으로 행한다. 당을 20분 내에 H+ 이온 교환 컬럼(ROA Rezex® 150 mm x 7.8 mm x 8 μm) 상으로 분리하고, 굴절계로 검출한다. 정량화를 외부 교정과 비교하여 수행한다. 당의 양의 계산을 크로멜레온(Chromeleon) 리프로세싱(reprocessing) 소프트웨어(써모피셔 사이언티픽(ThermoFischer Scientific))로 수행한다. 각각의 시점에서의 락토스 및 갈락토스의 정량화로부터, 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach) 및 널(null) 락토스 소모 속도(V0Lach)에서의 갈락토스 소모의 백분율은 하기와 같이 결정된다:
1. 각각의 시점에 있어서, 소모되는 락토스의 양(Lach)은 주어진 시점에서의 균주 성장 시의 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화된 락토스의 양(Lact)에 의해 마이너된(minored) 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화된 락토스의 초기 양(Laci) 간의 차이를 계산함으로써 결정된다: Lac h (mmol) = Laci(mmol) - Lact(mmol);
2. 주어진 시점에서 생성되는 갈락토스의 양(Galp)은 소모되는 락토스의 양 Lach와 등가인 것으로 결정된다: Gal p (mmol) = Lach(mmol);
3. 각각의 시점에 있어서, 소모되는 갈락토스의 양(Galc)은 주어진 시점에서의 균주 성장 시의 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화된 갈락토스의 양(Galt)에 의해 마이너된 주어진 시점에서의 균주 성장 시의 1 리터의 배지에 대하여 정규화된 생성되는 갈락토스의 양(Galp) 간의 차이를 계산함으로써 결정된다: Gal c (mmol) = Galp(mmol) - Galt(mmol);
4. 각각의 시점에 있어서, 소모되는 갈락토스의 비는 성장 동안 균주에 의해 소모되는 락토스로부터 생성되는 갈락토스의 백분율을 계산함으로써 결정된다: Gal c (%) = [Galc(mmol) / Galp(mmol)] x 100;
5. 각각의 시점에 계산된 Lach 값으로부터, 주어짐 시점에서의 락토스 소모의 속도는 2개의 시점 간의 기간으로 나눈, 2개의 시점 간의 락토스 양의 차이를 계산함으로써 결정된다: VLach(mmol/분) = dLach(mmol) /dt(분). 락토스 소모의 속도가 최대(V max Lac h )인 시점 및 락토스 소모의 속도가 0에 도달하는(즉, 락토스 소모의 마지막에서의)(V 0 Lac h ) 시점을 선택한다;
6. 락토스 소모의 속도가 최대(VmaxLach)인 시점에 상응하는 4 하에 계산된 갈락토스의 백분율[Galc(%)] 및 락토스 소모의 속도가 0에 도달하는(V0Lach) 시점에 상응하는 4 하에 계산된 갈락토스의 백분율[Galc(%)]은 이어서 각각 특정 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 대하여 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 V max Lac h 에서의 갈락토스 소모의 백분율 및 V 0 Lac h 에서의 갈락토스 소모의 백분율인 것으로 간주된다.
특정 실시형태에서, - 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 - 본 발명의 방법의 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 갈락토스-음성이다. 표현 "갈락토스-음성"이란, - 10% 갈락토스를 함유하는 M17 브로쓰 내에 1%로 접종되고, 42℃에서 6시간 동안 인큐베이션되는 때 - 상기 M17 브로쓰의 pH를 6.0 미만으로 감소시키지 않는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 의미한다. 특정 실시형태에서, - 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 - 본 발명의 방법의 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 갈락토스-양성이다. 표현 "갈락토스-양성"이란, - 10% 갈락토스를 함유하는 M17 브로쓰 내에 1%로 접종되고, 42℃에서 6시간 동안 인큐베이션되는 때 - 상기 M17 브로쓰의 pH를 6.0 미만으로 감소시키는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 의미한다.
일 실시형태에서, - 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 - 본 발명의 방법의 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 제출된 DSM32823 균주와 무관하며, 즉, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 게놈 서열은 DSM32823 균주의 게놈 서열에 대하여 최대 99.97%, 최대 99.96% 또는 최대 99.95%인 동일성을 갖는다.
당해 방법의 단계 b)에서, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열과 비교하여 서열이 상이한 gal-lac 유전자 클러스터를 수득한다. gal-lac 유전자 클러스터는 오페론의 일반적인 구성이 유지되어야 한다는 의미에서 변형(들) 후에 수득되어야 한다. 따라서, 변형 후에 수득되는 gal-lac 유전자 클러스터는 5'에서 3'으로 하기의 유전자: galR 유전자, galK 유전자, galT 유전자, galE 유전자, galM 유전자, lacS 유전자 및 lacZ 유전자를 유지하며, 원래의 전사 구성: 역방향 배향으로 전사되는 galR 유전자, 및 정방향 배향으로 전사되는 galK galT, galE, galM, lacS 및 lacZ 유전자를 유지한다. 추정의 트랜스포사제를 인코딩하는 ORF 및 아연-메탈로프로테아제를 인코딩하는 zmpB 유전자가 상류에서 관찰되고, ATP-의존성 dsDNA 엑소뉴클레아제를 인코딩하는 유전자 sbcC 및 sbcD가 하류에서 관찰되도록 단계 b) 후에 수득되는 gal-lac 유전자 클러스터가 위치되는 것이 주목할 만하다.
검정 I에 의해 시험되는 경우, 본원에 정의되는 바와 같은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 수득할 수 있게 하는, 단계 b) 후에 이에 따라 수득되는 gal-lac 유전자 클러스터는 이것이 본원에서 SEQ ID 또는 SEQ ID 유도체로 확인된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것으로서 추가로 특성화된다. 구체적인 SEQ ID(예를 들어, SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 또는 6)는, SEQ ID의 정확한 서열을 의미한다. "SEQ ID 유도체"(예를 들어, SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 또는 6 유도체)는, 상기 SEQ ID와 적어도 97%의 동일성을 갖는 서열을 의미하며, 여기서, 동일성은 2개의 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산된다. 특정 실시형태에서, 적어도 97%의 동일성은 적어도 97.5%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99% 및 적어도 99.5%로 이루어진 군으로부터 선택되는 동일성의 백분율이다. 일 실시형태에서, SEQ ID 유도체는 뉴클레오타이드 치환, 뉴클레오타이드 결실, 뉴클레오타이드 삽입 및 이들 변형 유형의 임의의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 변형에 의해 SEQ ID와 상이하다. 일 실시형태에서, SEQ ID 유도체는 뉴클레오타이드 치환에 의해 SEQ ID와 상이하다(즉, SEQ ID와 동일한 크기를 갖는다). 일 실시형태에서, SEQ ID 유도체는 1 내지 30개 뉴클레오타이드 치환에 의해 SEQ ID와 상이하다. 일 실시형태에서, SEQ ID 유도체는 1 내지 20개 뉴클레오타이드 치환에 의해 SEQ ID와 상이하다. 일 실시형태에서, SEQ ID 유도체는 1 내지 15개 뉴클레오타이드 치환에 의해 SEQ ID와 상이하다. 일 실시형태에서, SEQ ID 유도체는 1 내지 10개 뉴클레오타이드 치환에 의해 SEQ ID와 상이하다. 일 실시형태에서, SEQ ID 유도체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 다수의 치환(들)에 의해 SEQ ID와 상이하다. "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법의 맥락에서 본원에 제공되는 SEQ ID 및 SEQ ID 유도체의 정의는 당해 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 스트렙토코커스 써모필러스 균주 그 자체에 동일하게 적용된다.
당해 방법의 단계 c)에서, - gal-lac 유전자 클러스터가 단계 b)에 따라 변형된 - 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 이어서 검정 I에 의해 시험되는 경우 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것에 대해 선택된다. 표현 "고 갈락토스 이용" 프로파일은 본원에서 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의된다. 따라서, - gal-lac 유전자 클러스터가 단계 b)에 따라 변형된 - 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 단계 c)에서 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 것에 대하여 선택된다. 일 실시형태에서, 표현 "고 갈락토스 이용" 프로파일은 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율로 정의된다. 일 실시형태에서, 표현 "고 갈락토스 이용" 프로파일은 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율로 정의된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 "고 갈락토스 이용" 프로파일은 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 더하여, 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 추가로 정의된다. 따라서, "고 갈락토스 이용" 프로파일은 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 더하여, 적어도 70%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의된다. 일 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일은 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 더하여, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의된다. 일 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일은 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 더하여, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 "고 갈락토스 이용" 프로파일은 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정된 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 70%인 검정 I에 의해 결정된 바와 같은 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 "고 갈락토스 이용" 프로파일은 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정된 바와 같은 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의된다.
일 실시형태에서, (단계 c에서와 같은 또는 여기에서 스크리닝된) 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정된 바와 같은 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, (단계 c에서와 같은 또는 여기에서 스크리닝된) 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 적어도 50% 및 70% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 70% 및 최대 80%인 검정 I에 의해 결정된 바와 같은 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 특징으로 한다.
의심을 피하기 위하여, 둘 모두 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율은 반드시 최대 100%인데, 이는 균주가 락토스의 가수분해로부터 생성할 수 있는 것보다 더 많은 갈락토스를 소모할 수 없기 때문이다.
의심을 피하기 위하여, 둘 모두 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율은 반드시 최대 100%인데, 이는 균주가 락토스의 가수분해로부터 생성할 수 있는 것보다 더 많은 갈락토스를 소모할 수 없기 때문이다.
일 실시형태에서, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함한다. 따라서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열은 단계 b)에서 일단 변형되면, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체를 포함하는 단계; 및
c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 단계 b)에서 수득되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계.
SEQ ID NO:2에 정의된 바와 같은 서열은 galR과 galK 유전자 사이의 유전자간 영역, 즉, (역 상보물 상의) galR 코딩 서열의 시작 코돈(ATG)의 1번째 뉴클레오타이드와 galK 코딩 서열의 시작 코돈(ATG)의 1번째 뉴클레오타이드 사이에 위치한 서열로 이루어진다. 당업자는 이의 흔한 일반적인 지식에 기초하여, a)에서 제공되는 균주의 gal-lac 유전자 클러스터를 변형시켜, 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는, 즉, 이의 gal-lac 유전자 클러스터가 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체를 포함하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 수득하는 방법을 알고 있다. 일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, 상기 gal-lac 유전자 클러스터의 galR과 galK 유전자 사이의 유전자간 영역이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지도록 한다.
SEQ ID NO:2-기반의 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 다른 부분(들)이 또한 변형되는 것이 배제되지 않되, 단, 단계 c)에서 선택할 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 본원에 정의되는 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타낸다.
일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체를 포함하는 서열을 야기하는 변형에 더하여, 변형이 또한, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체의 바로 상류에 위치한 서열 및/또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체의 바로 하류에 위치한 서열을 포함하도록 한다. "SEQ ID의 바로 상류" 및 "SEQ ID의 바로 하류"는, 각각 고려되는 SEQ ID(본원에서, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체)의 5' 말단에 연결된 뉴클레오타이드 서열 및 고려되는 SEQ ID(본원에서, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체)의 3' 말단에 연결된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 일 실시형태에서, 변형이 SEQ ID NO:2, 및 SEQ ID NO:2의 바로 상류에 위치한 서열 및/또는 SEQ ID NO:2의 바로 하류에 위치한 서열과 관련되는 경우, 변형은 SEQ ID NO:2를 포함하는 SEQ ID NO:1의 단편을 포함하는 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다. "SEQ ID NO:를 포함하는 SEQ ID NO:1의 단편"은, 고려되는 SEQ ID(본원에서 SEQ ID NO:2)를 포함하며, 크기가, 고려되는 SEQ ID의 크기(본원에서 SEQ ID NO:2에 대하여 141개 뉴클레오타이드)에서 11,041개 뉴클레오타이드(=SEQ ID NO:1에서 1개 nt를 제함)까지의 범위인 SEQ ID NO:1의 연속 뉴클레오타이드의 단편을 의미한다. 일 실시형태에서, 단계 b)는 단계 a)의 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계이며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:1의 단편을 포함하며, 상기 SEQ ID NO:1의 단편은 SEQ ID NO:2를 포함한다.
일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체를 포함하는 서열을 야기하는 변형에 더하여, 변형이 또한, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체의 바로 상류에 위치하지 않고/거나 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체의 바로 하류에 위치하는 gal-lac 유전자 클러스터의 다른 서열(들)을 포함하도록 한다. 이(이들) 다른 변형(들)은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 이들 변형의 임의의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 단, 단계 c)에서 선택할 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타낸다. 일 실시형태에서, 이(이들) 다른 변형(들)은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 galR과 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 영역의 치환을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 galR과 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 치환이다(즉, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 의한 치환과는 다른 gal-lac 유전자 클러스터의 변형이 존재하지 않는다).
본 발명은 또한, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 관한 것이되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:2-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 변형 단계 b)는 SEQ ID NO:2를 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다.
SEQ ID NO:2를 함유하는 서열의 예는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:2를 함유하는 SEQ ID NO:1의 단편의 예는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 선택적으로 SEQ ID NO:1의 단편으로서, SEQ ID NO:2를 함유하는 서열은 SEQ ID NO:3이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단계; 및
c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 단계 b)에서 수득되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계.
본 발명은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6 중 어느 하나뿐만 아니라, 본원에 정의된 바와 같은 이들의 각각의 유도체에 기초한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 유도체, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:4 유도체, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:5 유도체, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:6 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 유도체, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:4 유도체, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:5 유도체, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:6 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단계; 및
c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 단계 b)에서 수득되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계.
일 실시형태에서, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함한다. 따라서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열은 단계 b)에서 일단 변형되면, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 유도체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 유도체를 포함하는 단계; 및
c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 단계 b)에서 수득되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계.
SEQ ID NO:3에서 정의된 바와 같은 서열은 5'에서 3'으로, galR 유전자의 일부, 및 galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역으로 이루어진다. 따라서, SEQ ID NO:3은 서열 AATTGCCACTTGATACTTTT(SEQ ID NO:17)(galR 코딩 서열의 역 상보물에서 관찰됨)로 시작하고, galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오타이드로 끝난다. 당업자는 이의 흔한 일반적인 지식에 기초하여, a)에서 제공되는 균주의 gal-lac 유전자 클러스터를 변형시켜, 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는, 즉, 이의 gal-lac 유전자 클러스터가 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체를 포함하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 수득하는 방법을 알고 있다. 일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, 서열 AATTGCCACTTGATACTTTT(SEQ ID NO:17)로 시작하고, galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오타이드로 끝나는 상기 gal-lac 유전자 클러스터의 영역이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지도록 한다.
SEQ ID NO:3-기반의 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 다른 부분(들)이 또한 변형되는 것이 배제되지 않되, 단, 단계 c)에서 선택할 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 본원에 정의되는 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타낸다.
일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체를 포함하는 서열을 야기하는 변형에 더하여, 변형이 또한, 바로 상류에 위치한 서열 및/또는 바로 하류에 위치한 서열을 포함하도록 한다. 일 실시형태에서, 변형이 SEQ ID NO:3, 및 SEQ ID NO:3의 바로 상류에 위치한 서열 및/또는 SEQ ID NO:3의 바로 하류에 위치한 서열과 관련되는 경우, 변형은 SEQ ID NO:3을 포함하는 SEQ ID NO:1의 단편을 포함하는 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다. 일 실시형태에서, 단계 b)는 단계 a)의 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계이며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:1의 단편을 포함하며, 상기 SEQ ID NO:1의 단편은 SEQ ID NO:3을 포함한다. 일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체를 포함하는 서열을 야기하는 변형에 더하여, 변형이 또한, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체의 바로 상류에 위치하지 않고/거나 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체의 바로 하류에 위치하는 gal-lac 유전자 클러스터의 다른 서열(들)을 포함하도록 한다. 이(이들) 다른 변형(들)은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 이들 변형의 임의의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 단, 단계 c)에서 선택할 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타낸다. 일 실시형태에서, 이(이들) 다른 변형(들)은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 서열 AATTGCCACTTGATACTTTT(SEQ ID NO:17)로 시작하고, galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 치환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 서열 AATTGCCACTTGATACTTTT(SEQ ID NO:17)로 시작하고, galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 치환이다(즉, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 의한 치환과는 다른 gal-lac 유전자 클러스터의 변형이 존재하지 않는다).
본 발명은 또한, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 관한 것이되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:3-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 변형 단계 b)는 SEQ ID NO:3을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다.
일 실시형태에서, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함한다. 따라서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열은 단계 b)에서 일단 변형되면, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체를 포함하는 단계; 및
c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 단계 b)에서 수득되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계.
SEQ ID NO:4에서 정의된 바와 같은 서열은 5'에서 3'으로, galR 유전자, 및 galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역으로 이루어진다. 따라서, SEQ ID NO:4는 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오타이드로 끝난다. 당업자는 이의 흔한 일반적인 지식에 기초하여, a)에서 제공되는 균주의 gal-lac 유전자 클러스터를 변형시켜, 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는, 즉, 이의 gal-lac 유전자 클러스터가 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체를 포함하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 수득하는 방법을 알고 있다. 일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오타이드로 끝나는 상기 gal-lac 유전자 클러스터의 영역이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지도록 한다.
SEQ ID NO:4-기반의 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 다른 부분(들)이 또한 변형되는 것이 배제되지 않되, 단, 단계 c)에서 선택할 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 본원에 정의되는 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타낸다.
일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체를 포함하는 서열을 야기하는 변형에 더하여, 변형이 또한, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체의 바로 하류에 위치한 서열을 포함하도록 한다. 일 실시형태에서, 변형이 SEQ ID NO:4, 및 SEQ ID NO:4의 바로 하류에 위치한 서열과 관련되는 경우, 변형은 SEQ ID NO:4를 포함하는 SEQ ID NO:1의 단편을 포함하는 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다. 일 실시형태에서, 단계 b)는 단계 a)의 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계이며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:1의 단편을 포함하며, 상기 SEQ ID NO:1의 단편은 SEQ ID NO:4를 포함한다. 일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체를 포함하는 서열을 야기하는 변형에 더하여, 변형이 또한, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체의 바로 하류에 위치하지 않은 gal-lac 유전자 클러스터의 다른 서열(들)을 포함하도록 한다. 이(이들) 다른 변형(들)은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 이들 변형의 임의의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 단, 단계 c)에서 선택할 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타낸다. 일 실시형태에서, 이(이들) 다른 변형(들)은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 치환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 치환이다(즉, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 의한 치환과는 다른 gal-lac 유전자 클러스터의 변형이 존재하지 않는다).
본 발명은 또한, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 관한 것이되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:4-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 변형 단계 b)는 SEQ ID NO:4를 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다.
일 실시형태에서, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함한다. 따라서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열은 단계 b)에서 일단 변형되면, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체를 포함하는 단계; 및
c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 단계 b)에서 수득되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계.
SEQ ID NO:5에서 정의된 바와 같은 서열은 5'에서 3'으로, galR 유전자의 일부, galR과 galK 유전자 사이의 유전자간 영역 및 galK 유전자의 일부로 이루어진다. 따라서, SEQ ID NO:5는 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로부터 389번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galK 유전자의 코딩 서열의 698번째 뉴클레오타이드로 끝난다. 의심을 피하기 위하여, galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로부터 389번째 뉴클레오타이드는 galR 유전자의 코딩 서열의 607번째 뉴클레오타이드에 상응한다. 당업자는 이의 흔한 일반적인 지식에 기초하여, a)에서 제공되는 균주의 gal-lac 유전자 클러스터를 변형시켜, 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는, 즉, 이의 gal-lac 유전자 클러스터가 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체를 포함하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 수득하는 방법을 알고 있다. 일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로부터 389번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galK 유전자의 코딩 서열의 698번째 뉴클레오타이드로 끝나는 상기 gal-lac 유전자 클러스터의 영역이 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지도록 한다.
SEQ ID NO:5-기반의 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 다른 부분(들)이 또한 변형되는 것이 배제되지 않되, 단, 단계 c)에서 선택할 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 본원에 정의되는 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타낸다.
일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체를 포함하는 서열을 야기하는 변형에 더하여, 변형이 또한, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체의 바로 상류에 위치한 서열 및/또는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체의 바로 하류에 위치한 서열을 포함하도록 한다. 일 실시형태에서, 변형이 SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:5의 바로 상류에 위치한 서열 및/또는 SEQ ID NO:5의 바로 하류에 위치한 서열과 관련되는 경우, 변형은 SEQ ID NO:5를 포함하는 SEQ ID NO:1의 단편을 포함하는 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다. 일 실시형태에서, 단계 b)는 단계 a)의 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계이며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:1의 단편을 포함하며, 상기 SEQ ID NO:1의 단편은 SEQ ID NO:5를 포함한다. 일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체를 포함하는 서열을 야기하는 변형에 더하여, 변형이 또한, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체의 바로 상류에 위치하지 않고/거나 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체의 바로 하류에 위치하는 gal-lac 유전자 클러스터의 다른 서열(들)을 포함하도록 한다. 이(이들) 다른 변형(들)은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 이들 변형의 임의의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 단, 단계 c)에서 선택할 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타낸다. 일 실시형태에서, 이(이들) 다른 변형(들)은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로부터 389번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galK 유전자의 코딩 서열의 698번째 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 치환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로부터 389번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galK 유전자의 코딩 서열의 698번째 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 치환이다(즉, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 의한 치환과는 다른 gal-lac 유전자 클러스터의 변형이 존재하지 않는다).
본 발명은 또한, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 관한 것이되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:5-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 변형 단계 b)는 SEQ ID NO:5를 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함한다. 따라서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열은 단계 b)에서 일단 변형되면, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체를 포함하는 단계; 및
c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 단계 b)에서 수득되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계.
SEQ ID NO:6에서 정의된 바와 같은 서열은 gal 오페론(즉, 5'에서 3'으로, galR, galK, galT, galE 및 galM 유전자)으로 이루어진다. 따라서, SEQ ID NO:6은 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galM 코딩 서열의 정지 코돈의 3번째 뉴클레오타이드로 끝난다.
당업자는 이의 흔한 일반적인 지식에 기초하여, a)에서 제공되는 균주의 gal-lac 유전자 클러스터를 변형시켜, 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는, 즉, 이의 gal-lac 유전자 클러스터가 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체를 포함하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 수득하는 방법을 알고 있다. 일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galM 코딩 서열의 정지 코돈의 3번째 뉴클레오타이드로 끝나는 상기 gal-lac 유전자 클러스터의 영역이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지도록 한다.
SEQ ID NO:6-기반의 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 다른 부분(들)이 또한 변형되는 것이 배제되지 않되, 단, 단계 c)에서 선택할 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 본원에 정의되는 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타낸다.
일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체를 포함하는 서열을 야기하는 변형에 더하여, 변형이 또한, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체의 바로 하류에 위치한 서열을 포함하도록 한다. 일 실시형태에서, 변형이 SEQ ID NO:6, 및 SEQ ID NO:6의 바로 하류에 위치한 서열과 관련되는 경우, 변형은 SEQ ID NO:6을 포함하는 SEQ ID NO:1의 단편을 포함하는 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다. 일 실시형태에서, 단계 b)는 단계 a)의 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계이며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:1의 단편을 포함하며, 상기 SEQ ID NO:1의 단편은 SEQ ID NO:6을 포함한다. 일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체를 포함하는 서열을 야기하는 변형에 더하여, 변형이 또한, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체의 바로 하류에 위치하지 않은 gal-lac 유전자 클러스터의 다른 서열(들)을 포함하도록 한다. 이(이들) 다른 변형(들)은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및 이들 변형의 임의의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 단, 단계 c)에서 선택할 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타낸다. 일 실시형태에서, 이(이들) 다른 변형(들)은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galM 코딩 서열의 정지 코돈의 3번째 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 치환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galM 코딩 서열의 정지 코돈의 3번째 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 치환이다(즉, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 의한 치환과는 다른 gal-lac 유전자 클러스터의 변형이 존재하지 않는다).
본 발명은 또한, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 관한 것이되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:6-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 변형 단계 b)는 SEQ ID NO:6을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다.
일 실시형태에서, 단계 a)에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하며, 상기 상이한 서열은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체로 이루어진다. 따라서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열은 단계 b)에서 일단 변형되면, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체로 이루어진다. 따라서, 본 발명은 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체로 이루어진 단계; 및
c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 단계 b)에서 수득되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계.
SEQ ID NO:1에서 정의된 바와 같은 서열은 gal-lac 유전자 클러스터로 이루어진다. 따라서, SEQ ID NO:1은 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, lacZ 코딩 서열의 정지 코돈의 3번째 뉴클레오타이드로 끝난다. 당업자는 이의 흔한 일반적인 지식에 기초하여, a)에서 제공되는 균주의 gal-lac 유전자 클러스터를 변형시켜, 본원에 정의된 바와 같은 검정 I에 따른 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는, 즉, 이의 gal-lac 유전자 클러스터가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체로 이루어진 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 수득하는 방법을 알고 있다. 일 실시형태에서, gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 단계 b)에서 변형시켜, (단계 a에서 제공되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터에 비하여) 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하여, galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, lacZ 코딩 서열의 정지 코돈의 3번째 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체로 이루어지도록 한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, a)에서 제공되는 에스. 써모필러스 균주의 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, lacZ 코딩 서열의 정지 코돈의 3번째 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터의 치환이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)는 SEQ ID NO:1에 정의되는 바와 같은 서열에 의한, a)에서 제공되는 에스. 써모필러스 균주의 galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, lacZ 코딩 서열의 정지 코돈의 3번째 뉴클레오타이드로 끝나는 gal-lac 유전자 클러스터의 치환이다.
본 발명은 또한, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 관한 것이되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체에 기초한 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:1-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 변형 단계 b)는 SEQ ID NO:1로 이루어진 gal-lac 유전자 클러스터를 야기한다.
일 양태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법이 제공되며, 당해 방법은 이의 게놈에 갈락토스-락토스 유전자 클러스터(gal-lac 유전자 클러스터)를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 선택적으로, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 제시된 서열을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체의 서열을 포함하거나, 이의 서열이다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:3 유도체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 제시된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체의 서열을 포함하거나, 이의 서열이다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:4 유도체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 제시된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체의 서열을 포함하거나, 이의 서열이다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:5 유도체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 제시된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체의 서열을 포함하거나, 이의 서열이다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:6 유도체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 제시된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체의 서열을 포함하거나, 이의 서열이다. 일 실시형태에서, SEQ ID NO:1 유도체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 제시된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산 서열을 도입하는 방법은 컨쥬게이션에 의해 이루어진다. 일 실시형태에서, 핵산 서열을 도입하는 방법은 형질전환에 의해 이루어진다. 일 실시형태에서, 핵산 서열을 도입하는 방법은 자연적 수용성에 의해 이루어진다. 일 실시형태에서, 자연적 수용성은 유도된 자연적 수용성이다. 박테리아 균주에서 자연적 수용성을 유도하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있으며, 일부 경우에, 전문이 본원에 참조로 포함되는 공개된 국제 출원 제WO 2010/149721호에 기재된 바와 같이 일반적으로 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, 전술된 단락의 방법에 의해 생성되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 선택되고/되거나 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 선택된다. 일 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 예를 들어, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 결여한 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및/또는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 다른 스트렙토코커스 써모필러스 균주로부터 단리된다. 전술된 단락의 방법이 예를 들어, gal-lac 오페론에서 유전학적으로 동일할 수 있거나, 유전학적으로 동일하지 않을 수 있고/거나 예를 들어, 검정 I에 따라 평가되는 경우 동일한 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 하나 이상의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 생성할 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 전술된 방법에 의해 생성되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 상이한 백분율의 소모되는 갈락토스 및/또는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막에서의 상이한 백분율의 소모되는 갈락토스를 나타내는 것이 가능하다. 따라서, 일부 경우에, 전술된 방법에 따라 생성되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 결여한 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및/또는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 "고 갈락토스 이용" 프로파일 및/또는 상이한 유전자형을 갖는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 다른 스트렙토코커스 써모필러스 균주로부터 선택되고/되거나 단리될 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 생성되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 절단된 GalR 단백질을 인코딩한다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 생성되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 GalR 단백질을 발현하지 못하거나, 예를 들어, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 결여한 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 비하여, 감소된 GalR 단백질의 발현을 갖거나, 또는 감소된 또는 소실된 기능을 갖는 GalR 단백질을 발현한다.
"고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주
본 발명은 또한, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 뉴클레오타이드 서열 및 검정 I에 따른 이의 프로파일 둘 모두를 특징으로 하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 본원에 정의된 바와 같은 SEQ ID 또는 SEQ ID 유도체를 포함하며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 관한 것이되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 일 실시형태에서, 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 본원에 정의된 바와 같은 SEQ ID 또는 SEQ ID 유도체를 포함하며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 적어도 70%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체를 포함하며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) galR과 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 서열이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:2-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터는 SEQ ID NO:2를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:1의 부분(본원에 정의된 바와 같은 SEQ ID NO:1의 부분)을 포함하며, 상기 SEQ ID NO:1의 부분이 SEQ ID NO:2를 포함하며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 유도체, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:4 유도체, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:5 유도체, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:6 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체로 이루어진 서열을 포함하며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:1의 부분(본원에 정의된 바와 같은 SEQ ID NO:1의 부분)을 포함하며, 상기 SEQ ID NO:1의 부분이 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체를 포함하며; b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 서열 AATTGCCACTTGATACTTTT(SEQ ID NO:17)로 시작하고, galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오타이드로 끝나는 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지며; b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:3-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터는 SEQ ID NO:3을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하며; b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galR 유전자와 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오타이드로 끝나는 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 서열이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:4-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터는 SEQ ID NO:4를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로부터 389번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galK 유전자의 코딩 서열의 698번째 뉴클레오타이드로 끝나는 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 영역의 서열이 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다[의심을 피하기 위하여, galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로부터 389번째 뉴클레오타이드는 galR 유전자의 코딩 서열의 607번째 뉴클레오타이드에 상응한다]. 상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:5-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터는 SEQ ID NO:5를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, galM 코딩 서열의 정지 코돈의 3번째 뉴클레오타이드로 끝나는 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 gal 오페론의 서열이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지며, b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 상기 기재된 임의의 SEQ ID NO:6-기반의 실시형태의 특정 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터는 SEQ ID NO:6을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체로 이루어지며; b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 바와 같이 검정 I에 의해 시험되는 경우 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 a) galR 코딩 서열의 정지 코돈의 역 상보물의 1번째 뉴클레오타이드로 시작하고, lacZ 코딩 서열의 정지 코돈의 3번째 뉴클레오타이드로 끝나는 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체로 이루어지며; b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 바와 같이 검정 I에 의해 시험되는 경우 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 것을 특징으로 하되, 단, 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 선택적으로 DSM32823 균주의 변이체가 아니다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터는 SEQ ID NO:1로 이루어진다.
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6에 정의된 바와 같은 임의의 서열이 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 균주 DSM32823 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 뉴클레오타이드 합성 또는 증폭(예컨대 PCR 증폭)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 당업자에게 알려져 있는 임의의 수단에 의해 수득될 수 있는 것이 주목할만하다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 에스. 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니다.
일 실시형태에서, 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 에스. 써모필러스 균주는 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열 및 검정 I에 따른 이의 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 특징으로 하는 것에 더하여, DSM32823 균주의 게놈 서열에 대하여 최대 99.98%, 최대 99.97%, 최대 99.96% 또는 최대 99.95%인 동일성을 갖는 게놈 서열을 추가로 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 에스. 써모필러스 균주는 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열 및 검정 I에 따른 이의 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 특징으로 하는 것에 더하여, DSM32823 균주의 게놈 서열에 대하여 최대 99.98%, 최대 99.97%, 최대 99.96% 또는 최대 99.95%인 동일성을 갖는, 및 DSM32823 균주의 게놈 서열에 대하여 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%인 동일성을 갖는 게놈 서열을 추가로 특징으로 한다.
본 출원 내에서, DSM23823의 게놈에 대한 균주의 게놈의 동일성의 백분율은 균주의 게놈에 존재하는 및 DSM32823 균주의 게놈에서 관찰되는 게놈 서열의 백분율, 또는 DSM32823의 게놈에 존재하는 및 상기 균주의 게놈 서열에서 관찰되는 서열의 백분율로 정의된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 에스. 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, DSM32823 균주의 변이체가 아니다.
본 특허 출원 내에서, 그리고 특허 출원 제PCT/EP2019/079613호 내에서, DSM32823 균주의 변이체는 DSM32823 균주를 돌연변이시켜, 돌연변이 균주(변이체)가 DSM32823 균주와 유전학적으로 비슷하도록 함으로써(자발적 또는 유도된 돌연변이 단계) 수득되는 균주로 정의되며; 이것이 유래된 균주와 게놈이 적어도 99.99%의 동일성을 갖는 균주는 변이체를 정의한다. 따라서, 게놈 서열이 (상기 정의된 바와 같은) DSM32823 균주의 게놈 서열에 대하여 최대 99.98%인 동일성을 갖는 본 발명의 에스. 써모필러스 균주는 DSM32823의 변이체가 아니다.
DSM32823 균주의 변이체는 특허 출원 제PCT/EP2019/079613호에 더욱 구체적으로 정의되어 있으며, 이들 변이체는 본 발명의 부분이 아니다. 일 실시형태에서, 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 에스. 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, 특허 출원 제PCT/EP2019/079613호에 정의된 바와 같은 DSM32823 변이체가 아니다. 일 실시형태에서, 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 에스. 써모필러스 균주는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, DSM32823 변이체가 아니고, 상기 DSM32823 변이체는 하기의 스트렙토코커스 써모필러스 균주로 정의된다:
1) DSM32823 균주에 비하여 이의 게놈에 적어도 하나의 돌연변이를 제시함; 및
2) 갈락토스 배출에 관한 하기의 이들 2가지 특징 중 적어도 하나를 충족함:
2a. 특히, 검정 2에 의해 시험되는 경우, 갈락토스 30g/L가 보충된 M17 옥소이드(oxoid) 배지 내로 1%(v/v)로 접종하고, 43℃에서 인큐베이션시키는 경우, 5시간 미만에, 5.2의 pH에 도달하는 이의 능력;
2b. 특히, 검정 3에 의해 시험되는 경우, 0.5%(w/v)의 락토스가 보충된 M17 배지 내로 1%(v/v)로 접종하고, 42℃에서 인큐베이션시키는 경우, 갈락토스를 배출하지 않는 이의 능력 또는 특히, 검정 3에 의해 시험되는 경우, 0.5%(w/v)의 락토스가 보충된 M17 배지 내로 1%(v/v)로 접종하고, 42℃에서 인큐베이션시킨 후에, 갈락토스를 배출하지만, 최대 9시간에 배출된 갈락토스를 완료까지 소모하는 이의 능력; 및
3) 이의 게놈에 관한 하기의 이들 2가지 특징 중 적어도 하나를 충족함:
3a. 변이체의 게놈 서열이 DSM32823 균주의 게놈 서열에 대하여 적어도 99.99%의 동일성을 가짐;
3b. 구체적인 다좌위 서열 형벌분석(MLST) 계획에 따라 정의된, 몇몇의 염색체 좌위의 각각의 서열이 DSM32823 균주에서의 상응하는 염색체 좌위의 서열과 최소 99%의 동일성을 가짐. 구체적인 다좌위 서열 형벌분석(MLST) 계획의 예는 특허 출원 제PCT/EP2019/079613호에 개시되어 있다.
검정 2(제PCT/EP2019/079613호에 기재된 바와 같음)는 하기와 같다:
- 갈락토스-양성(즉, 탄수화물의 단독의 공급원으로서 갈락토스를 포함하는 배지에서 성장할 수 있는 것으로 설명됨)으로 특성화된 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 수크로스 30 g/L가 보충된 M17에서 37℃에서 하룻밤 성장시키고;
- 배양물을 하기와 같이 트립톤-염 용액(트립톤 1g/L, NaCl 8.5 g/L)에서 세척하고(v/v): 배양물을 4000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고; 펠렛을 10 ml의 트립톤-염 용액 중에 재현탁화시키고;
- 세척된 배양물을 갈락토스 30 g/L가 보충된 M17 옥소이드 150 ml 내로 1%(v/v)로 접종하고;
- 접종된 배지를 43℃에서 24시간 동안 인큐베이션시키고, 이의 pH를 CINAC 시스템(얼라이언스 인스트루먼츠(Alliance Instruments), 프랑스; pH 전극 메틀러(Mettler) 405 DPAS SC, 스페인 톨레도)을 사용하여 모니터링하였으며; pH를 5분마다 측정하고 기록하였다. CINAC v2.07 소프트웨어를 사용하여, 5.2의 pH에 도달하기 위한 시간을 결정한다.
검정 3(제PCT/EP2019/079613호에 기재된 바와 같음)은 하기와 같다:
- 갈락토스-양성으로 특성화된 에스. 써모필러스 균주를 0.5%(w/v)의 락토스가 보충된 M17에서 42℃에서 12시간 성장시키고[1%(v/v) 접종]; 이 단계를 동일한 조건에서 두번째로 반복하고;
- 배양물을 0.5%(w/v)의 락토스가 보충된 M17 배지 내로 1%(v/v)로 접종하고, 접종된 배지를 42℃에서 최대 10시간 인큐베이션시키고;
- 발효 동안, 시료를 30분마다 빼내어, 갈락토스 농도를 결정하고; 시료를 14000 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 페넥스(Phenex) 나일론 0.45 μm-포어 크기 x 15 mm 직경 필터(페노메넥스(Phenomenex)®)를 통해 멸균 여과하고, 추가의 분석까지 -20℃에 보관하고; 10 μl의 각각의 시료를 아질런트(Agilent)® 1100 HPLC 상에 주입한다. 용리를 0.6 ml/분으로 순수한 H2O를 사용하여 등용매 방식으로 행한다. 당을 40분 내에 Pb2+ 이온 교환 컬럼(SP0810 쇼덱스(Shodex)TM 300 mm x 8 mm x 7 μm) 상으로 분리한다. (존재한다면) 갈락토스의 농도를 결정한다(g/L). 0.05 g/L 미만의 갈락토스의 농도는 측정 가능하지 않은 것으로 간주된다.
일 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 DSMZ에, 2021년 4월 21일에 수탁 번호 DSM33851, DSM33852, DSM33853 또는 DSM33854 하에 기탁된 것들 또는 이의 돌연변이체를 포함한다. 일 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 DSMZ에 수탁 번호 DSM33851 하에 기탁된 균주 또는 이의 돌연변이체이다. 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 DSMZ에 수탁 번호 DSM33852 하에 기탁된 균주 또는 이의 돌연변이체이다. 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 DSMZ에 수탁 번호 DSM33853 하에 기탁된 균주 또는 이의 돌연변이체이다. 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 DSMZ에 수탁 번호 DSM33854 하에 기탁된 균주 또는 이의 돌연변이체이다. 일 실시형태에서, 돌연변이체는 조작, 예를 들어, 유전자형으로 조작되지만, 예를 들어, 동일한 또는 개선된 표현형, 예를 들어, 부모의 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 유지하는 기탁된 균주로부터 유래된 균주이다. 일 실시형태에서, "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 돌연변이체는 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아니며, DSM32823 변이체가 아니다.
배양물 및 키트-오브-파트
본 발명은 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하거나 이로 이루어진 배양물에 관한 것이며; 표현 "를 포함하거나 이로 이루어진 배양물"은 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 적절한 경우, 배양물(동일한 파우치 또는 동일한 박스)을 형성하도록 다른 미생물(들) 및/또는 성분과 물리적으로 함께 혼합되는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 배양물은 순수한 배양물이며, 즉, 본 발명의 단일의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하거나 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 배양물은 혼합된 배양물이며, 즉, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 적어도 하나의 다른 미생물, 특히 적어도 하나의 다른 박테리아 균주, 특히, 적어도 하나의 다른 락트산 박테리아 균주 및/또는 성분을 포함하거나 이로 이루어진다. "적어도" 하나의 다른 (락트산) 박테리아 균주는, 1가지 이상, 특히 1, 2, 3, 4 또는 5가지의 균주를 의미한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하는 키트-오브-파트에 관한 것이며; 표현 "를 포함하거나 이로 이루어진 키트-오브-파트"는 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 다른 미생물(들) 및/또는 성분이 함께 사용되는 것으로 의도되는 것을 의미하지만, 물리적으로 분리될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 키트-오브-파트는 a) 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 b) 적어도 하나의 다른 미생물, 특히 적어도 하나의 다른 박테리아 균주, 특히, 적어도 하나의 다른 락트산 박테리아 균주를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트는 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주(들) 및 락토코커스 종, 스트렙토코커스 종, 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 포함하는 락토바실러스 종, 엔테로코커스(Enterococcus) 종, 페디오코커스(Pediococcus) 종, 류코노스톡(Leuconostoc) 종, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 종 및 오에노코커스(Oenococcus) 종 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종의 하나 이상의 추가의 락트산 박테리아를 포함하거나, 이로 이루어진다. 락토코커스 종은 락토코커스 락티스 아종 락티스, 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 및 락토코커스 락티스 아종 락티스 생물형 디아세틸락티스(diacetylactis)를 포함하는 락토코커스 락티스를 포함한다. 비피도박테리움 종은 비피도박테리움 애니멀리스( Bifidobacterium animalis), 특히 비피도박테리움 애니멀리스 아종 락티스를 포함한다. 다른 락트산 박테리아 종은 류코노스톡 종, 스트렙토코커스 써모필러스, 락토바실러스 델브루에키이 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트는 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주(들) 및 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주(들)와 상이한 적어도 하나의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및/또는 락토바실러스 종의 적어도 하나의 균주 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 이로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트는 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주(들) 및 종 락토바실러스 델브루에키이 아종 불가리쿠스의 하나의 또는 몇몇의 균주(들)를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트는 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 락토코커스 균주(들)를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 박테리아 조성물은 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주(들), 락토코커스 락티스 아종 락티스 및/또는 락토코커스 락티스 아종 크레모리스를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트는 a) 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 및 b) 락토코커스 균주(들) 및/또는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주(들)를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트는 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주(들)를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트는 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 락토코커스 균주(들) 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주(들)를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트는 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 락토코커스 균주(들), 선택적으로, 락토코커스 락티스 아종 락티스 균주(들) 및/또는 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 균주(들) 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주(들)를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트는 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 락토코커스 락티스 아종 락티스 균주(들) 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주(들)를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트는 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 균주(들) 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주(들)를 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 정의되는 특정한 임의의 실시형태에서, 배양물 및 키트-오브-파트는 성분, 예컨대 식품 성분을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 식품 성분은 식용 가능한 성분, 예컨대 당(사카로스, 트레할로스), 말토덱스트린 또는 미네랄이다.
일 실시형태에서, 그리고 어떤 이들의 조성물일지라도, 본 발명의 배양물 및 키트-오브-파트는 동결된, 건조된, 동결-건조된, 액체 또는 고체 형식, 펠렛 또는 동결된 펠렛의 형태, 또는 분말 또는 건조 분말로 존재한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 및 키트-오브-파트는 동결된 형식 또는 펠렛 또는 동결된 펠렛의 형태로 존재하며, 특히, 하나 이상의 박스 또는 샤셋(sachet) 내에 함유된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 및 키트-오브-파트는 분말 형태, 예컨대 건조된 또는 동결-건조된 분말로 존재하며, 특히, 하나 이상의 박스 또는 샤셋 내에 함유된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 다른 미생물(예컨대 박테리아) 및/또는 성분이 키트 오브 파트로서 제공되는 경우, 본 발명의 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 다른 미생물(예컨대 박테리아) 및/또는 성분은 동일한 형식 하에 존재하며, 즉, 동결된 형식, 펠렛 또는 동결된 펠렛의 형태, 분말 형태, 예컨대 건조된 또는 동결-건조된 분말로 존재한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 배양물 및 키트-오브-파트 내에서, 어떤 이들의 형식이든(동결된, 건조된, 동결-건조된, 액체 또는 고체 형식, 펠렛 또는 동결된 펠렛의 형태 또는 분말 또는 건조된 분말), 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 함유되는 키트-오브-파트의 조성물 또는 배양물 그램당 105 내지 1012 cfu(콜로니 형성 유닛)(cfu/g)의 범위로 포함되는 농도로 존재한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 배양물 및 키트-오브-파트 내의 스트렙토코커스 써모필러스 균주(들)의 농도는 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 함유되는 키트-오브-파트의 조성물 또는 배양물 그램당 107 내지 1012 cfu의 범위, 특히, 적어도 107, 적어도 108, 적어도 109, 적어도 1010 또는 적어도 1011 cfu/g이다. 일 실시형태에서, 동결된 또는 건조된 농축물의 형태의 경우, 본 발명의 배양물 및 키트-오브-파트 내의 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 농도는 108 내지 1012 cfu/g(동결된 농축물 또는 건조된 농축물)의 범위이며, 더욱 바람직하게는 적어도 108, 적어도 109, 적어도 1010, 적어도 1011 또는 적어도 1012 cfu/g(동결된 농축물 또는 건조된 농축물)이다.
본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하는 제품
본 발명은 또한, 식품 또는 사료 제품, 바람직하게는 발효유 제품을 제조하기 위한, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트의 용도를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 본 발명의 배양물 또는 키트-오브-파트를 포함하는 식품 또는 사료 제품에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 식품 또는 사료 제품은 유제품, 육류 또는 곡물 제품이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 식품은 유제품이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 식품은 발효 식품이다. 더욱 바람직하게는, 본원에 기재된 바와 같은 식품은 발효유 제품 - 예컨대 발효유, 요구르트, 크림, 숙성 크림(matured cream), 치즈, 프로마쥬 프레(fromage frais), 유음료, 가공 치즈, 크림 디저트(cream dessert), 코티지 치즈, 요구르트 음료, 유제품 잔류물(dairy product retentate) 또는 유아용 밀크이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 유제품 또는 발효유 제품은 동물 및/또는 식물 기원의 밀크를 포함한다. 밀크는 본 출원의 다른 곳에 정의된 바와 같다.
본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하는 제품의 제조 방법
본 발명은 또한, a) 기질을 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 배양물 또는 키트-오브-파트로 접종하는 단계; 및 b) 접종된 기질을 발효시켜, 발효된 제품을 수득하는 단계를 포함하는 발효 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 기질은 밀크 기질, 더욱 바람직하게는 밀크이며, 발효 제품은 발효유 제품이다. "밀크 기질"은, 동물 및/또는 식물 기원의 밀크를 의미한다. 특정 실시형태에서, 밀크 기질은 동물 기원, 특히 임의의 포유동물, 예컨대 소, 염소, 양, 물소, 얼룩말, 말, 당나귀 또는 낙타 등의 것이다. 밀크는 고유 상태, 환원유, 탈지유, 또는 박테리아의 성장을 위해 또는 발효유의 이후의 가공을 위하여 필요한 화합물이 보충된 밀크일 수 있다. 일 실시형태에서, 밀크 기질은 우유이다. 일 실시형태에서, 밀크 기질은 식물성 유액이며, 즉, 콩과 식물(대두, 병아리콩, 렌틸콩 등) 또는 지방종자(평지, 대두, 참깨, 면 등)와 같이, 처리되었거나 그렇지 않은 식물 재료의 추출물이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 발효 제품을 제조하기 위한 방법에 의해 수득되거나, 수득 가능한 발효 제품, 특히 발효유 제품에 관한 것이다.
본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 배양물 또는 키트-오브-파트는 다양한 유제품 응용에서 유리하게 이용된다(본원에 기재된 발효 제품을 제조하기 위한 방법의 특정 실시형태로서).
일 실시형태에서, 본 발명은 적어도, 파스타-필라타 치즈를 제조하기 위한, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 배양물 또는 키트-오브-파트의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 파스타-필라타 치즈의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 스트레칭에 적합한 커드를 제공하거나 생산하는 단계로서, 상기 커드가 밀크를 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 배양물 또는 키트-오브-파트로 접종하고 발효시킴으로써 수득되는 단계;
b) 단계 a)의 커드를 스트레칭시켜, 스트레칭된 커드를 수득하는 단계; 및
c) 단계 b)의 스트레칭된 커드를 조작하여, 최종적으로 파스타-필라타 치즈를 만드는 단계.
밀크는 본 출원의 다른 곳에 정의된 바와 같다.
단계 a)에서 제공되거나 생산되는 커드는 이의 스트레칭에 대한 적합성; 및 커드를 생산하기 위하여 이용되는 균주(들)를 특징으로 한다.
용어 "커드"는 본원에서 발효에 의해 수득되는 커드로 정의되며, 이에 따라, 화학적 산성화에 의해 수득되는 어떠한 커드도 배제한다. 본원에 정의된 바와 같이, 커드의 특징(예컨대, 비제한적으로, pH, 서브미셀 치수)이 스트레칭 단계에서 커드가 파스타-필라타 치즈의 섬유 특징을 채용하게 하는 경우, 커드는 "스트레칭에 적합하다". 이들 특징은 당업계에 널리 알려져 있으며, 당업자는 파스타-필라타 치즈를 제조하기 위해 이 단계에서 어떤 커드 특징이 필요한 지를 알고 있다.
일 실시형태에서, 스트레칭에 적합한 커드는 하기의 특징 중 1가지 또는 2가지를 특징으로 한다: (i) 4.9 내지 5.4, 특히 5 내지 5.3의 pH; 및/또는 (ii) 적어도 5 nm, 특히 5 내지 15 nm, 특히 5 내지 10 nm의 서브미셀 치수. 특정 실시형태에서, 스트레칭에 적합한 커드는 4.9 내지 5.4, 특히 5 내지 5.3을 포함하는 pH를 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 스트레칭에 적합한 커드는 적어도 5 nm, 특히 5 내지 15 nm, 특히 5 내지 10 nm의 서브미셀 치수를 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 스트레칭에 적합한 커드는 4.9 내지 5.4, 특히 5 내지 5.3을 포함하는 pH 및 적어도 5 nm, 특히 5 내지 15 nm, 특히 5 내지 10 nm의 서브미셀 치수를 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 단계 a)가 스트레칭에 적합한 커드를 생산하는 경우, 상기 단계 a)는 하기를 포함한다:
a1) 밀크를 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 배양물 또는 키트-오브-파트로, 및 선택적으로 밀크 응고제로 접종하는 단계;
a2) 단계 a1)의 접종된 밀크를 발효시켜, 응고유를 수득하는 단계;
a3) 단계 a2)의 응고유를 절단하고, 가열하고, 교반하여, 커드 및 유청의 믹스를 수득하는 단계;
a4) 단계 a3)의 커드 및 유청의 믹스를 배수하여, 스트레칭에 적합한 커드를 수득하는 단계.
단계 a)의 상류 또는 단계 a의 부분(특히 단계 a2)에서 커드를 생산하는 경우, 접종된 밀크를 발효시켜, 응고유를 수득한다. "발효"(또는 발효시키는)는, 접종된 밀크를 락트산 생산 및 응고유의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 유지하는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 접종된 밀크를 30 내지 42℃, 특히 35℃ 내지 39℃의 온도로 유지한다. 일 실시형태에서, 접종된 밀크를 30 내지 42℃, 특히 35 내지 39℃의 온도에서 발효시킨다.
단계 a)의 상류 또는 단계 a의 부분(특히 단계 a3)에서 커드를 생산하는 경우, 접종된 밀크를 절단하고, 가열하고, 교반하여, 커드 및 유청의 믹스를 수득한다.
일 실시형태에서, 응고유를 탱크 내에서 정육면체로, 특히 1-cm3 내지 8-cm3 정육면체로 절단한다. 일 예에서, 절단 단계는 약 10분 지속된다.
일 실시형태에서, 절단된 응고유를 탱크에서 38 내지 42℃의 온도로 교반하고 가열한다. 일 실시형태에서, 온도에 관한 이전의 것과 조합하여, 또는 이와 독립적으로, 가열 및 교반은 유청의 pH가 6.1 내지 6.3에 도달할 때까지 수행된다. 일 예로서, 가열 및 교반 단계는 10 내지 30분, 특히 15 내지 20분 지속된다.
단계 a)의 상류 또는 단계 a의 부분(특히 단계 a4)에서 커드를 생산하는 경우, 커드 및 유청의 믹스를 배수하여(즉, 유청을 제거하여), 본원에 정의된 바와 같은 스트레칭에 적합한 커드를 수득한다. 일 실시형태에서, 커드 및 유청의 믹스를 38 내지 42℃의 온도에서 배수한다. 커드 및 유청의 믹스를 전형적으로 배수 테이블(draining table) 상에서 배수한다. 일 예로서, 배수 단계는 2시간 내지 2.5시간 지속된다.
본 발명의 파스타-필라타 치즈를 제조하기 위한 방법의 단계 b)에서, (제공되는 또는 생산되는) 커드를 스트레칭시켜, 스트레칭된 커드를 수득한다. 일 실시형태에서, 커드를 온수, 유청 또는 염수 중에서 또는 직접 스팀 분사를 사용하여 스트레칭시킨다. 특정 실시형태에서, 커드의 온도가 대략 50 내지 70℃가 되도록 온도가 55 내지 85℃인 온수에서 커드를 스트레칭시킨다. 커드의 스트레칭은 커드의 열적-기계적 처리이며, 이는 전형적으로 쿠커(cooker)/스트레처(stretcher)(예컨대, 예를 들어, 비제한적으로, CMT 모차렐라(Mozzarella) 쿠커(Cooker) 스트레처(Stretcher) 모델 F94)를 사용하여 수행된다. 일 예로서, 스트레칭 단계는 5 내지 15분 지속된다.
본 발명의 파스타-필라타 치즈를 제조하기 위한 방법의 단계 c)에서, 스트레칭된 커드를 조작하여, 최종적으로 파스타-필라타 치즈를 만든다. 스트레칭 단계 후의 통상적인 단계는 몰딩(moulding)(몰드에 붓기), 염지(brining)(염수에 붓기) 및/또는 냉각 중 하나 이상을 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 파스타-필라타 치즈를 제조하기 위한 방법은 선택적으로 추가의 단계를 포함한다:
일 실시형태에서, 당해 방법은 선택적으로 가열 및 교반 단계 동안 커드를 세척하는 단계를 포함한다. 따라서, (특히, 단계 a3)에서) 커드 및 유청의 믹스를 가열하고 교반하는 경우, 탱크로부터 유청을 제거하고, 온수(예를 들어, 40℃)로 교체하여, 커드로부터 유청을 신속하게 제거한다. 일 실시형태에서, 제거되고, 온수로 교체되는 유청의 백분율은 10, 20, 30 및 40%로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 제거되고, 온수로 교체되는 유청의 백분율은 10 내지 30%의 범위이다. 일 실시형태에서, 유청의 10±3%가 제거되고, 온수로 교체된다. 일 실시형태에서, 유청의 20±5%가 제거되고, 온수로 교체된다. 일 실시형태에서, 유청의 30±5%가 제거되고, 온수로 교체된다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 파스타-필라타 치즈의 제조 방법에 관한 것이다:
a1) 밀크를 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 배양물 또는 키트-오브-파트로, 및 선택적으로 밀크 응고제로 접종하는 단계;
a2) 단계 a1)의 접종된 밀크를 발효시켜, 응고유를 수득하는 단계;
a3) 단계 a2)의 응고유를 절단하고, 가열하고, 교반하고, 커드를 세척하여, 커드 및 유청의 믹스를 수득하는 단계;
a4) 단계 a3)의 커드 및 유청의 믹스를 배수하여, 스트레칭에 적합한 커드를 수득하는 단계;
b) 커드를 스트레칭하여, 스트레칭된 커드를 수득하는 단계; 및
c) 단계 b)의 스트레칭된 커드를 조작하여, 최종적으로 파스타-필라타 치즈를 만드는 단계.
일 실시형태에서, 이전의 것과 독립적으로 또는 이와 조합하여, 파스타-필라타 치즈를 제조하기 위한 방법은 선택적으로 스트레칭 단계 이전에 커드를 스트립(strip)으로 밀링시키는 단계를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 파스타-필라타 치즈의 제조 방법에 관한 것이다:
a1) 밀크를 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 배양물 또는 키트-오브-파트로, 및 선택적으로 밀크 응고제로 접종하는 단계;
a2) 단계 a1)의 접종된 밀크를 발효시켜, 응고유를 수득하는 단계;
a3) 단계 a2)의 응고유를 절단하고, 가열하고, 교반하고, 선택적으로 커드를 세척하여, 커드 및 유청의 믹스를 수득하는 단계;
a4) 단계 a3)의 커드 및 유청의 믹스를 배수하여, 스트레칭에 적합한 커드를 수득하는 단계;
a5) 커드를 밀링시켜, 커드의 스트립을 수득하는 단계;
b) 커드의 스트립을 스트레칭하여, 스트레칭된 커드를 수득하는 단계; 및
c) 단계 b)의 스트레칭된 커드를 조작하여, 최종적으로 파스타-필라타 치즈를 만드는 단계.
본 발명은 또한, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 배양물 또는 키트-오브-파트를 포함하는 스트레칭된 커드 또는 파스타-필라타 치즈 또는 파스타-필라타 치즈 유청에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 스트레칭된 커드 또는 파스타-필라타 치즈는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 파스타-필라타 치즈의 제조 방법에 의해 수득된다. "파스타-필라타 치즈 유청"은, 특히, 본 발명의 파스타-필라타 치즈의 제조 방법을 이행하는 경우, 본 발명의 스트레칭된 커드 또는 파스타-필라타 치즈의 제조 동안 수득되는 유청을 의미한다.
본 발명은 또한, 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 사용하여 생산되는 치즈 유청에 비하여 감소된 갈락토스 농도를 갖는 치즈 유청을 생산하기 위한 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 배양물 또는 키트-오브-파트의 용도에 관한 것이다. "치즈 유청"은, 치즈의 제조 동안 수득되는 유청을 의미한다. 일 실시형태에서, 치즈 유청은 파스타-필라타 치즈 유청이다. 특정 실시형태에서, 치즈 유청은 스위스-형 치즈 유청, 예컨대 에멘탈(emmental) 유청 또는 마스담(maasdam) 유청이다. 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 사용하여 생산되는 치즈 유청은 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 사용하여 생산되는 치즈 유청의 갈락토스 농도에 비하여 감소된 갈락토스 농도를 갖는다[둘 모두의 치즈 유청은 균주를 제외하고 동일한 조건에서 생산된다]. "감소하다"는, 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 사용하여 생산되는 치즈 유청의 갈락토스 농도에 비하여 적어도 20% 감소된 갈락토스 농도(g/kg)를 의미한다. 일 실시형태에서, 갈락토스 농도(g/kg)는 적어도 25% 감소된다. 일 실시형태에서, 갈락토스 농도(g/kg)는 적어도 30% 감소된다. 일 실시형태에서, 갈락토스 농도(g/kg)는 적어도 40% 감소된다. 일 실시형태에서, 갈락토스 농도(g/kg)는 20% 내지 50%를 포함하는 범위로 감소된다. 일 실시형태에서, 갈락토스 농도(g/kg)는 30% 내지 45%를 포함하는 범위로 감소된다. 일 실시형태에서, 갈락토스 농도(g/kg)는 30% 내지 40%를 포함하는 범위로 감소된다.
기탁 및 전문가 솔루션
하기의 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라 이루어졌다.
- 듀폰 뉴트리션 바이오사이언스 에이피에스에 의해 DSMZ[독일 브라운슈바이크 D-38124 인호펜슈트라쎄 7B에 소재하는 독일 생물 자원센터]에 2018년 5월 29일에 수탁 번호 DSM32823 하에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 균주(DGCC7698)
- 듀폰 뉴트리션 바이오사이언스 에이피에스에 의해 DSMZ에 2019년 2월 12일에 수탁 번호 DSM33036 하에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 균주(DGCC715)
- 듀폰 뉴트리션 바이오사이언스 에이피에스에 의해 DSMZ에 2021년 4월 21일에 수탁 번호 DSM 33851 하에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 균주(DGCC13392)
- 듀폰 뉴트리션 바이오사이언스 에이피에스에 의해 DSMZ에 2021년 4월 21일에 수탁 번호 DSM 33852 하에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 균주(DGCC13393)
- 듀폰 뉴트리션 바이오사이언스 에이피에스에 의해 DSMZ에 2021년 4월 21일에 수탁 번호 DSM 33853 하에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 균주(DGCC13400)
- 듀폰 뉴트리션 바이오사이언스 에이피에스에 의해 DSMZ에 2021년 4월 21일에 수탁 번호 DSM 33854 하에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 균주(DGCC13401).
요청자가 지명한 전문가에게 시료를 배포하는 것에 의해서만 생물학적 물질을 이용할 수 있을 것이 요청된다. 유럽 특허가 청구된 상기 기탁에 관하여, 기탁된 미생물의 시료는 유럽 특허의 허여에 관한 의사가 공개될 때까지 또는 출원이 거절 또는 취하되거나 또는 취하 간주된 날까지, 시료를 요청한 자에 의해 지명되고, i) 출원인에 의해, 및/또는 ii) 유럽 특허청에 의해, 어느 쪽이든 적용되는 자에 의해 승인된 전문가에게 이 시료를 분양함으로써만 이용 가능하게 될 것이다. (규칙 32 EPC).
서열
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:4
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:7
예시적인 실시형태
제공되는 실시형태는 다음과 같다:
1. 하기를 포함하는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법:
a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체를 포함하는 단계; 및
c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 단계 b)에서 수득된 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계.
2. 실시형태 1에 있어서, 단계 b)가 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체를 포함하는 단계, 및 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체를 포함하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
3. 실시형태 1에 있어서, 단계 b)가 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계이며, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체를 포함하는 방법.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단계 b)가 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계이며, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체를 포함하며, 특히 상기 상이한 서열의 gal 오페론이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지는 방법.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단계 b)가 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계인 방법.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단계 a)의 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 갈락토스-음성인 방법.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 한 실시형태에 따른 방법에 의해 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주로서, 단, 균주가 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아닌 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
8. 하기:
a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고;
b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주로서,
단, 균주가 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아닌 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
9. 실시형태 8에 있어서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터가 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 gal-lac 유전자 클러스터, 및 서열이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 gal-lac 유전자 클러스터로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
10. 실시형태 8에 있어서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
11. 실시형태 8 내지 10 중 어느 한 실시형태에 있어서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하며, 특히, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 gal 오페론이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지는 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
12. 실시형태 8 내지 11 중 어느 한 실시형태에 있어서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지는 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
13. 균주가 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는, 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 실시형태 1 내지 6 중 어느 한 실시형태에 따른 방법 또는 실시형태 7 내지 12 중 어느 한 실시형태에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
14. "고 갈락토스 이용" 프로파일이 적어도 적어도 70%인, 특히, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는, 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 추가로 정의되는 실시형태 1 내지 6 중 어느 한 실시형태에 따른 방법 또는 실시형태 7 내지 12 중 어느 한 실시형태에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
15. 균주가 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 실시형태 1 내지 6 및 13 내지 14 중 어느 한 실시형태에 따른 방법 또는 실시형태 7 내지 14 중 어느 한 실시형태에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
16. 균주가 a) 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 또는 b) 적어도 50% 및 70% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 70% 및 최대 80%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 중 어느 하나에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 실시형태 1 내지 6 및 13 내지 15 중 어느 한 실시형태에 따른 방법 또는 실시형태 7 내지 15 중 어느 한 실시형태에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
17. 상기 SEQ ID 유도체가 상기 SEQ ID와 적어도 97% 동일성을 갖는 실시형태 1 내지 6 및 13 내지 16 중 어느 한 실시형태에 따른 방법 또는 실시형태 7 내지 16 중 어느 한 실시형태에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
18. 실시형태 7 내지 17 중 어느 한 실시형태에 있어서, 게놈 서열이 DSM32823 균주의 게놈 서열에 대하여 최대 99.98%, 최대 99.97%, 최대 99.6% 또는 최대 99.5%인 동일성을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
19. 실시형태 7 내지 17 중 어느 한 실시형태에 있어서, 추가로, 단, 균주가 DSM32823 균주의 변이체가 아닌, 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
20. 실시형태 7 내지 19 중 어느 한 실시형태의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 선택적으로 적어도 하나의 박테리아 균주 및/또는 성분(들)을 포함하는 배양물.
21. a) 실시형태 7 내지 19 중 어느 한 실시형태에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 b) 적어도 하나의 다른 박테리아 균주 및/또는 성분(들)을 포함하거나 이로 이루어진 키트-오브-파트.
22. 실시형태 7 내지 19 중 어느 한 실시형태의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 실시형태 20의 배양물 또는 실시형태 21의 키트-오브-파트를 포함하는 식품 또는 사료 제품, 특히, 유제품, 육류 또는 곡물 식품 또는 사료 제품, 특히 발효유 식품.
23. 하기를 포함하는 발효 제품의 제조 방법:
a) 기질, 특히 밀크 기질을 실시형태 7 내지 19 중 어느 한 실시형태의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 실시형태 20의 배양물 또는 실시형태 21의 키트-오브-파트로 접종하는 단계; 및
b) 단계 a)로부터 수득되는 접종된 기질을 발효시켜, 발효 제품, 바람직하게는 발효유 제품을 수득하는 단계.
24. 하기를 포함하는 파스타-필라타 치즈의 제조 방법:
a) 스트레칭에 적합한 커드를 제공하거나 생산하는 단계로서, 상기 커드가 밀크를 실시형태 7 내지 19 중 어느 한 실시형태의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 실시형태 20의 배양물 또는 실시형태 21의 키트-오브-파트로 접종하고 발효시킴으로써 수득되는 단계;
b) 단계 a)의 커드를 스트레칭하여, 스트레칭된 커드를 수득하는 단계; 및
c) 단계 b)의 스트레칭된 커드를 조작하여, 최종적으로 파스타-필라타 치즈를 만드는 단계.
25. 실시형태 24에 있어서, 스트레칭에 적합한 커드를 생산하는 단계 a)가 하기를 포함하는 방법:
a1) 밀크를 실시형태 7 내지 19 중 어느 한 실시형태의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 실시형태 20의 배양물 또는 실시형태 21의 키트-오브-파트로, 및 선택적으로 밀크 응고제로 접종하는 단계;
a2) 단계 a1)의 접종된 밀크를 발효시켜, 응고유를 수득하는 단계;
a3) 단계 a2)의 응고유를 절단하고, 가열하고, 교반하여, 커드 및 유청의 믹스를 수득하는 단계; 및
a4) 단계 a3)의 커드 및 유청의 믹스를 배수하여, 스트레칭에 적합한 커드를 수득하는 단계.
26. 실시형태 24 또는 25에 있어서, 단계 a3)에서 가열하고 교반하는 때 커드를 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
27. 적어도, 파스타-필라타 치즈를 제조하기 위한 실시형태 7 내지 19 중 어느 한 실시형태의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도.
28. 적어도, 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 사용하여 생산되는 치즈 유청에 비하여 감소된 갈락토스 농도를 갖는 치즈 유청을 생산하기 위한 실시형태 7 내지 19 중 어느 한 실시형태의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도.
실시예
실시예 1:
락토스의 갈락토스 모이어티를 이용하기 위한 에스. 써모필러스의 3가지 대표적인 균주의 능력
유제품 발효(치즈 및 신선한 발효유 발효)에서 수년동안 산업적으로 사용된 듀폰 균주 컬렉션으로부터의 3가지 대표적인 균주(DSM32823, DSM33036 및 DGCC7773)를 락토스 유래의 갈락토스의 이들의 이용에 대하여 시험하였다. 균주를 문헌[de Vin et al. (2005)]으로부터 야기된 조건에서 성장시켰다. 실제적으로, DSM32823, DSM33036 및 DGCC7773을 락토스 5g/L가 보충된 M17 브로쓰에서 37℃에서 12시간 동안 연속하여 2회 사전-배양하였다. 이어서, 사전-배양물을 사용하여, 락토스 5g/L가 보충된 M17 브로쓰에 1%(v/v)(300-ml 배양물)로 접종하였다. 이어서, 배양물을 수조에서 37℃에서 인큐베이션시켰다. 시간이 지남에 따른 배지 중 락토스 농도 및 갈락토스 농도를 평가하기 위하여, 30분마다 배양물의 시료를 빼내고(5 ml), 0.2 μm 나일론 필터를 통해 여과하고, 2 ml HPLC 바이얼 내에 두었다. 여과된 시료를 추가의 분석까지 -20℃에 보관하였다. 5 μL의 시료를 아질런트 1200 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 상에 주입하였다. 용리를 0.7 mL/분으로 0.025N 황산 용액으로 등용매 방식으로 행하였다. 당을 20분 내에 H+ 이온 교환 컬럼(ROA Rezex® 150 mm x 7.8 mm x 8 μm) 상으로 분리하고, 굴절계를 사용하여 검출하였다. 정량화를 외부 교정과 비교하여 수행하였다. 당의 양의 계산을 크로멜레온 리프로세싱 소프트웨어(써모피셔 사이언티픽)로 수행하고, 주어진 시점에서의 락토스의 농도(mM) 및 갈락토스의 농도(mM)를 결정한다. 0.1 g/L(0.5 mM) 미만의 갈락토스의 농도는 측정 가능하지 않은 것으로 간주된다. 시간이 지남에 따른 농도의 진화는 도 3에 나타나 있다.
결과는 도 3의 A 및 도 3의 B에서, DSM33036 및 DGCC7773 둘 모두가 8시간의 성장 이내에 락토스 가수분해로부터 비롯된 갈락토스의 오직 일부만을 소모하여, 유사하게 거동하였음이 나타났으며, 이에 따라, 문헌[de Vin at al. (2005)]에 따른 대다수의 균주와 유사하다.
실제로,
· 제1 단계에서, 락토스의 느린 소모(가수분해)에 상응하게, 균주는 갈락토스를 소모하였으며, 이는 축적되지 않았고,
· 이어서, 락토스의 신속한 소모에 상응하는 제2 단계에서, 균주는 락토스 가수분해로부터 생성되었던 모든 갈락토스를 소모할 수 없었고, 갈락토스는 배지에 축적되었고,
· 제3 및 최종 단계에서, 더 이상 락토스가 배지로부터 이용 가능하지 않는 경우, 균주는 전부는 아니지만 일부의 이용 가능한 갈락토스를 소모하였다.
대조적으로, 제1 단계 후에, DSM32823은 락토스로부터 생성되는 거의 모든 갈락토스를 소모하였으며, 락토스는 제3 단계에서 최종적으로 소진까지 신속하게 소모되었다.
실시예 2
: DSM33036, DSM32823 및 DGCC7773의 gal-lac 유전자 클러스터의 비교 유전체학
먼저, 유사한 갈락토스의 대사를 나타내는 2가지 균주(DSM33036 및 DGCC7773)의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 비교하였으며, 이들 2가지 서열 간의 뉴클레오타이드 차이를 분석하였다. 따라서, SEQ ID NO:7(DSM33036)과 SEQ ID NO:8(DGCC7773)의 서열 정렬 후에, 10-bp 증분식으로 슬라이딩된 100-bp 슬라이딩 윈도우 내에서 가변 위치의 수를 계수함으로써, SNP의 밀도를 계산하였다. 2가지 서열 간의 단일-뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 밀도를 gal-lac 유전자 클러스터 내에 포함된 오픈 리딩 프레임(ORF)의 규모에 맞는 표현과 함께 정렬하였다(도 4의 A).
2가지 서열 간의 서열 동일성은 99.46%이다. 2가지 균주의 gal-lac 유전자 클러스터가 lacS 유전자의 도처에서의 일부 미소한 가변성을 제외하고, 전체 gal-lac 유전자 클러스터에 걸쳐 낮은 가변성을 나타내는 것이 도 4의 A로부터 즉시 명백하다.
한편으로 DSM32823 균주와, 다른 한편으로 DSM33036 및 DGCC7773 균주 간의 (락토스로부터 생성되는) 갈락토스의 대사의 차이를 고려하여, DSM32823의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열(SEQ ID NO:1) 및 DSM33036의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열(SEQ ID NO:7)을 비교하였으며, 뉴클레오타이드 차이를 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 2가지 서열 간의 단일-뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 밀도를 gal-lac 유전자 클러스터 내에 포함된 오픈 리딩 프레임(ORF)의 규모에 맞는 표현과 함께 정렬하였다(도 4의 B).
2개의 서열 간의 서열 동일성은 96.25%이다. 일부 영역이 균주 DSM32823과 DSM33036 간에 고도로 가변적인 것이 도 4의 B로부터 명백하다: galR과 galK 유전자 사이에서 관찰되는 영역, galK 유전자의 코딩 서열의 일부 부분, galT 유전자의 코딩 서열의 일부 부분, galE 유전자의 코딩 서열의 가운데 부분, galE와 galM 유전자 사이의 영역, 및 lacS 유전자의 맨끝. gal-lac 오페론 유전자 클러스터의 다른 부분은 galR 유전자 및 lacZ 유전자와 같이, 낮은 가변성을 나타낸다.
종합하여, 이들 데이터는 락토스 유래의 갈락토스의 유사한 대사를 나타내는 균주가 이들의 gal-lac 유전자 클러스터 간에 거의 가변성을 제시하지 않은 반면, 락토스 유래의 갈락토스의 상이한 대사를 나타내는 균주가 gal-lac 유전자 클러스터의 일부 영역에서 유의미한 가변성을 제시하였음을 보여준다.
실시예 3
: gal-lac 유전자 클러스터가 DSM32823의 것으로 대체된 DSM33036의 유도체의 구축
DSM32823의 gal-lac 유전자 클러스터로의 DSM33036의 gal-lac 유전자 클러스터의 대체를 진행하기 위하여, 제1 단계에서, gal-lac 유전자 클러스터를 DSM33036 게놈으로부터 제거하였다. 이 목적을 위하여, Ery-D-gal-lac로 명명된 합성 DNA를 3가지 유전 요소의 어셈블리로서 생성하였다: i) Down-galR로 명명되는, (galR로부터 하류의) gal-lac 유전자 클러스터의 상류 영역에 상응하는 DSM33036으로부터의 게놈 서열, ii) EryR로 명명되는, 클로닝 벡터 pG+HOST9(라이프 사이언스(Life Science))로부터 비롯된 에리트로마이신 저항성 유전자, 및 iii) Down-lacZ로 명명되는, (lacZ로부터 하류의) gal-lac 유전자 클러스터의 하류 영역에 상응하는 DSM33036으로부터의 게놈 서열. 3개의 유전 요소의 각각을 PCR 증폭을 통해 수득하였다. EryR 요소를 주형으로서 pG+HOSTt9 플라스미드 제제 및 프라이머 pG9ery-F1(5'-TGTTCGTGCTGACTTGCAC(SEQ ID NO:9) 및 Ery-pG9-R3(5'-CCTCGAGGTCGACGGTATC(SEQ ID NO:10))을 사용하여 수득하였다. PCR 증폭을 위하여, 조건은 하기와 같았다: 98℃에서 30초에 이어서, 98℃에서 10초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 45초의 33 사이클, 그 다음, 마지막으로 72℃에서 7분 동안의 인큐베이션. 증폭을 위해 사용되는 효소는 2.5 mM의 MgCl2를 함유하는 LA-Taq PCR 완충제 II를 사용하는 LA Taq DNA 중합효소(다카라(TaKaRa))였다. Down-galR 요소를 주형으로서 DSM33036 게놈 DNA를 사용하여 수득하였다. 70 g/L의 수크로스를 함유하는 M17 중 균주의 밤샘 배양물 2 mL을 수거하고, 180 μL의 용해 완충제(리소자임 20 μg/mL, 뮤타노라이신 120 U/mL, Tris-HCl 20 mM, EDTA 2 mM, Triton-X100 0.12%) 중에 재현탁화시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 다음; DNeasy 조직 키트(퀴아젠(Qiagen), 독일)를 사용하여 제조처의 설명에 따라 DNA를 정제하였다(DNA를 100 μL의 Tris-HCl 10 mM 중에 재현탁화시켰다). PCR 증폭을 프라이머 down-galR_F1(5'- ATCGTCCAGACAATGGCATG(SEQ ID NO:11)) 및 GIB-GalR-eryR1(5'-GTGCAAGTCAGCACGAACACTGAACCATAAACCTGAATAGG (SEQ ID NO:12))을 사용하여, EryR 요소에 대하여 기재된 바와 같이 수행하였다. Down-lacZ 요소를 주형으로서 DSM33036 게놈 DNA 및 프라이머 GIB-lacZ-eryF1(5'-GATACCGTCGACCTCGAGGGTACTGATTAGCACTCCAAC(SEQ ID NO:13)) 및 down-LacZ-R1(5'-AGATTACCCTGCCTCAATTG(SEQ ID NO:14))을 사용하여 수득하였다. PCR 증폭을 EryR 요소에 대하여 기재된 바와 같이 수행하였다. Down-galR 및 Down-lacZ 요소를 개별적으로 EryR 요소에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 0.1 pmol의 각각의 요소 및 NEBuilder HiFi DNA Assembly 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 50℃에서 60분 동안 수행하였다. 이전에 기재된 PCR에 대해서와 동일한 조건 하에 down-galR-F1 및 down-LacZ-R1 프라이머를 사용하고, 하기의 조건을 사용하여, 2가지 라이게이션 생성물의 등몰 믹스를 증폭시키는 PCR에 의해 최종 Ery-D-gal-lac 합성 DNA(2,175 pb)를 수득하였다: 98℃에서 30초에 이어서, 98℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 2.25분의 33 사이클에 이어서, 72℃에서 7분 동안의 최종 인큐베이션. 최종 구축을 수득하기 위하여, 수여자 균주 DSM33036의 컴피턴트(competent) 세포를 문헌[Dandoy et al. (2011)]에 기재된 프로토콜에 따라 제조하였다. 삼백 마이크로리터의 컴피턴트 세포를 1 μM의 유도제 펩타이드 ComS17-24(순도 >95%; Peptide 2.0(미국 버지니아주 챈틀리)에 의해 공급됨)의 존재 하에 5 pmol의 Ery-D-gal-lac 합성 DNA로 형질전환시켰다. 37℃에서 5시간의 인큐베이션 후에, 형질전환 현탁액의 M17 브로쓰 중 100 μL의 단계 희석물을 5 μg/mL 에리트로마이신(시그마(Sigma), #E5389)과 함께, 5 g/L 수크로스가 보충된 M17-아가(agar)의 표면 상에 플레이팅하고, 37℃에서 48시간 동안 무산소 조건 하에 인큐베이션시켰다. 에리트로마이신 저항성 콜로니를 집어내고, gal-lac 유전자 클러스터의 적절한 제거 및 에리트로마이신 저항성 유전자에 의한 이의 대체를 보장하기 위하여 이들의 DNA 서열에 대하여, 그리고 이들의 락토스- 및 갈락토스-음성 표현형에 대하여 검증하였다. 콜로니 중 하나를 선택하고, 증식시키고, DSM33036::KOgal-lac로 명명하였다.
이어서, DSM32823으로부터의 gal-lac 유전자 클러스터를 EryR 유전자를 대체하도록 DSM33036::KOgal-lac의 게놈 내로 도입하였다. 이 목적을 위하여, DSM33036::KOgal-lac를 gal-lac 유전자 클러스터(SEQ ID NO:1)를 포함하는 DSM32823 유래의 DNA 단편으로 형질전환시켰다. 공여자 균주 유래의 게놈 DNA를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 형질전환체 DNA를 상기 열거된 프라이머 down-galR-F1 및 down-LacZ-R1을 사용하여 DSM32823로부터 gal-lac 유전자 클러스터의 PCR 증폭을 통해 수득하여, 12.3 kb 단편을 생성하였다. 하기의 PCR 조건을 적용하였다: 98℃에서 5분에 이어서, 98℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 68℃에서 13분의 33 사이클에 이어서, 72℃에서 7분 동안의 최종 신장. 팔백 마이크로리터의 컴피턴트 세포를 1 μM의 유도제 펩타이드 ComS17-24(순도 >95%; Peptide 2.0(버지니아주 챈들리)에 의해 공급됨))의 존재 하에 5.5 pmol의 gal-lac 유전자 클러스터의 앰플리콘으로 형질전환시켰다. 37℃에서 5시간의 인큐베이션 후에, 형질전환 현탁액의 M17 브로쓰 중 단계 희석액 100 μL를 5 g/L 락토스가 보충된 M17 상에 플레이팅하고, 37℃에서 48시간 동안 무산소 조건 하에 인큐베이션시켰다. 락토스 상에서 성장할 수 있는 콜로니를 집어내고, 이들의 에리트로마이신 감수성에 대하여 입증하여, 에리트로마이신 저항성 유전자가 효과적으로 제거되었음을 보장하였다. 일부 콜로니를 선택하고, 이들의 gal-lac 유전자좌를 조사하여, DSM32823 유래의 gal-lac 유전자 클러스에 의한 적절한 대체를 보장하였다. 마지막으로, DGCC13139로 명명되는 콜로니 중 하나를 추가의 조사를 위해 선택하였다.
전체적으로, DGCC13139 구축물은 gal-lac 유전자 클러스터가 동일한 위치에서 DSM32823의 gal-lac 유전자 클러스터에 의해 대체된, DSM33036 유전적 백그라운드를 갖는 균주로 존재한다. 락토스 유래의 갈락토스를 이용하는 DGCC13139의 능력을 추가로 조사하기 위하여, 정확히 동일한 실험 환경을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.
기본적으로, 5g/L의 락토스를 함유하는 M17 중에서의 균주의 37℃에서의 성장 시에 락토스 이용 및 갈락토스 생성의 동역학을 탄수화물의 HPLC 투여를 통해 조사하였다. 비교의 목적으로, 다양한 동역학 값을 HPLC 데이터로부터 결정하였다. 이들 값은 하기이다: 소모되는 락토스의 양(Lach), 생성되는 갈락토스의 양(Galp) 및 소모되는 갈락토스의 양(Galc); 모든 당의 양(mmol 단위)을 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화시킨다(당의 양의 측정을 위해 사용되는 배양 배지의 부피가 얼마이든지). 이들 값의 결정을 하기와 같이 수행하였다:
· 소모되는 락토스의 양(Lach)은 주어진 시점에서의 균주 성장 시의 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화된 락토스의 양에 의해 마이너된 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화된 락토스의 초기 양(Laci) 간의 차이를 나타낸다: Lach(mmol) = Laci(mmol) - Lact(mmol).
· 락토스 소모시에, 락토스는 글루코스 및 갈락토스로 가수분해되며, 1 mol의 락토스는 1 mol의 각각의 단당류를 생성한다. 이에 따라, 주어진 시점에서 생성되는 갈락토스의 양(Galp)은 소모되는 락토스의 양(Lach)과 등가이다: Galp(mmol) = Lach(mmol)
· 소모되는 갈락토스의 양(Galc)은 주어진 시점에서의 균주 성장 시의 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화된, 갈락토스의 양(Galt)에 의해 마이너된, 균주 성장 시의 1 리터의 배지에 대하여 정규화된 갈락토스의 양(Galp) 간의 차이를 나타낸다: Galc(mmol) = Galp(mmol) - Galt(mmol).
락토스 소모 및 갈락토스 소모에 대한 결과는 도 5(A 및 B)에 제시되어 있다. DSM33036 및 DGCC13139 둘 모두에 대한 락토스의 소모의 동역학은 유사하다(도 5, 흑색 원). 이와 반대로, 락토스로부터 비롯된 갈락토스 모이어티의 소모의 동역학은 현저하게 변경된다(도 5, 백색 원). DSM33036에 대한 갈락토스의 제한된 소모 대신에, DGCC13139는 이의 대부분을 소모한다. 이들 동역학 값으로부터, 소모되었던 갈락토스의 비를 (각각의 시점에 대하여) 성장 동안 균주에 의해 소모되는 락토스로부터 생성되는 갈락토스의 백분율로서 계산할 수 있었다: Galc(%) = [Galc(mmol) / Galp(mmol)] x 100. 발효 기간으로부터 독립적으로 부모 및 구축된 균주에 의한 갈락토스 소모에 대한 결과를 비교하기 위하여, 중요한 "시점"을 확인하고 선택한다. 선택된 "시점"은 하기와 같다:
i) 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에 상응함; 및
ii) 락토스 소진에 상응하고, 이에 따라 널 락토스 소모 속도(V0Lach)에 상응함.
주어진 시점에서의 락토스 소모의 속도를 이들 2가지 시점 사이의 기간으로 나눈 2가지 시점 사이의 락토스 양의 차이로서 계산하고, VLach(mmol/분) = dLach(mmol)/dt(분)로 표현한다. 동역학의 모든 시점(즉, 30분마다)에 락토스 소모의 속도를 계산함으로써, 락토스 소모의 속도가 최대인 시점 및 락토스의 속도가 0에 도달하는 시점을 결정한 다음, 이들 2가지 시점에 대한 (상기 정의된 바와 같은) 갈락토스 소모의 상응하는 백분율을 계산할 수 있다.
부모 DSM33036 및 구축된 균주 DGCC13139에 대한, 각각의 시점에서의, 락토스 소모의 속도(VLach) 및 소모되는 갈락토스의 백분율의 계산의 결과는 표 1에 제공되어 있으며, 그래프 표현은 도 6(A 및 B)에 제공된다.
균주 DSM33039에 있어서, 산성화의 최대 속도(VmaxLach)는 0.236 mmol/분이며, 널 락토스 소모 속도(V0Lach)는 VmaxLach 후 60분에 도달한다. 균주 DGCC13139에 있어서, 산성화의 최대 속도(VmaxLach)는 0.224 mmol/분이고, 널 락토스 소모 속도(V0Lach)는 VmaxLach 후 60분에 도달한다.
최대 속도의 락토스 소모(VmaxLach)에서의, 및 락토스 소모의 완료(V0Lach) 시의 소모되는 갈락토스의 백분율은 DSM33036에 대하여 매우 불량하며, 각각 34% 및 32%이다. 반대로, DGCC13139는 락토스 소모와 거의 동시에 갈락토스를 소모하며, 소모되는 갈락토스의 백분율은 항상 80% 초과이며, VmaxLach에서 82% 및 V0Lach에서 83%에 도달한다. 비교로서, (DSM33036 및 DGCC13139에 대해서와 동일한 조건에서 결정되는) DSM32823 균주에 대한 VmaxLach에서 소모되는 갈락토스의 백분율 및 V0Lach에서 소모되는 갈락토스의 백분율은 각각 79% 및 100%이다.
이 실험적 연구에 의해, DSM32823의 gal-lac 유전자 클러스터와 연관된 일부 특정 유전학적 특징(SEQ ID NO:1)이 단독의 탄수화물의 공급원으로서 락토스를 함유하는 배지에서 락토스의 갈락토스 모이어티의 개선된 소모의 원인이 되는 것이 입증되었다.
이들 데이터는 또한, VmaxLach에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 V0Lach에서의 소모되는 갈락토스의 백분율이 락토스-함유 배지에서 높은 수준의 갈락토스 소모를 갖는 균주를 확인하고, 불량한 수준의 갈락토스 소모를 갖는 다른 균주로부터 이들을 구분하기 위해 사용될 수 있는 2가지 매개변수임을 보여준다. 이들 2가지 매개변수를 하기 기재된 검정 I을 사용하여 계산한다:
검정 I
시험할 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 37℃에서 12시간 동안 락토스 5g/L가 보충된 M17 브로쓰에서 연속하여 2회 사전-배양한다. 이어서, 사전-배양물을 사용하여, 락토스 5g/L가 보충된 M17 브로쓰(300-ml 배양물)에 1%(v/v)로 접종한다. 이어서, 배양물을 수조내에서 37℃에서 인큐베이션시킨다. 30분마다, 배양물의 시료를 빼내고(5 ml), 0.2 μm 나일론 필터를 통해 여과하고, 2 ml HPLC 바이얼 내에 둔다. 여과된 시료를 추가의 분석까지 -20℃에 보관한다. 5 μL의 시료를 아질런트 1200 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 상에 주입한다. 용리를 0.7 mL/분으로 0.025N 황산 용액을 사용하여 등용매 방식으로 행한다. 당을 20분 내에 H+ 이온 교환 컬럼(ROA Rezex® 150 mm x 7.8 mm x 8 μm) 상으로 분리하고, 굴절계로 검출한다. 정량화를 외부 교정과 비교하여 수행한다. 당의 양의 계산을 크로멜레온 리프로세싱 소프트웨어(써모피셔 사이언티픽)로 수행한다. 각각의 시점에서의 락토스 및 갈락토스의 정량화로부터, 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach) 및 널 락토스 소모 속도(V0Lach)에서의 갈락토스 소모의 백분율을 하기와 같이 결정한다:
1. 각각의 시점에 있어서, 소모되는 락토스의 양(Lach)은 주어진 시점에서의 균주 성장 시의 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화된 락토스의 양(Lact)에 의해 마이너된 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화된 락토스의 초기 양(Laci) 간의 차이를 계산함으로써 결정된다: Lac h (mmol) = Laci(mmol) - Lact(mmol);
2. 주어진 시점에서 생성되는 갈락토스의 양(Galp)은 소모되는 락토스의 양 Lach와 등가인 것으로 결정된다: Gal p (mmol) = Lach(mmol);
3. 각각의 시점에 있어서, 소모되는 갈락토스의 양(Galc)은 주어진 시점에서의 균주 성장 시의 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화된 갈락토스의 양(Galt)에 의해 마이너된 주어진 시점에서의 균주 성장 시의 1 리터의 배양 배지에 대하여 정규화된 생성되는 갈락토스의 양(Galp) 간의 차이를 계산함으로써 결정된다: Gal c (mmol) = Galp(mmol) - Galt(mmol);
4. 각각의 시점에 있어서, 소모되는 갈락토스의 비는 성장 동안 균주에 의해 소모되는 락토스로부터 생성되는 갈락토스의 백분율을 계산함으로써 결정된다: Gal c (%) = [Galc(mmol) / Galp(mmol)] x 100;
5. 각각의 시점에 계산된 Lach 값으로부터, 주어짐 시점에서의 락토스 소모의 속도는 2개의 시점 사이의 기간으로 나눈, 2개의 시점 사이의 락토스 양의 차이를 계산함으로써 결정된다: VLach(mmol/분) = dLach(mmol) / dt(분). 락토스 소모의 속도가 최대(V max Lac h )인 시점 및 락토스 소모의 속도가 0에 도달하는(V 0 Lac h ) 시점을 선택한다;
6. 락토스 소모의 속도가 최대(VmaxLach)인 시점에 상응하는 4 하에 계산된 갈락토스의 백분율[Galc(%)] 및 락토스 소모의 속도가 0에 도달하는(V0Lach) 시점에 상응하는 4 하에 계산된 갈락토스의 백분율[Galc(%)]은 이어서 각각 특정 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 대하여 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 V max Lac h 에서의 갈락토스 소모의 백분율 및 V 0 Lac h 에서의 갈락토스 소모의 백분율인 것으로 간주된다.
실시예 4
: gal-lac 유전자 클러스터가 DSM32823의 것에 의해 대체된 DGCC7773의 유도체의 구축.
락토스의 갈락토스 모이어티의 개선된 소모가 수여 균주의 유전적 백그라운드에 좌우되지 않았음을 확인하기 위하여, 또 다른 균주, DGCC7773의 gal-lac 유전자 클러스터를 실시예 3에 대해서와 동일한 접근법을 사용하여 DSM32823의 것으로 대체하였다. 제1 단계에서, gal-lac 유전자 클러스터를 DGCC7773으로부터 제거하고, Ery-D-gal-lac 합성 단편으로 대체하여, DGCC7773::KOgal-lac를 생성하였다. 이어서, DSM32823 유래의 gal-lac 유전자 클러스터를 EryR 유전자를 대체하도록 DGCC7773::KOgal-lac의 게놈에 전달하였다. 이 목적을 위하여, DGCC7773::KOgal-lac를 gal-lac 유전자 클러스터를 포함하는 DSM32823 유래의 DNA 단편(SEQ ID NO:1)으로 형질전환시켰다. 생성되는 균주를 DGCC13142로 명명하였다.
전체적으로, DGCC13142 구축물은 gal-lac 유전자 클러스터가 동일한 위치에서 DSM32823의 gal-lac 유전자 클러스터(SEQ ID NO:1)에 의해 대체된, DGCC7773 유전적 백그라운드를 갖는 균주로 존재한다. 락토스 유래의 갈락토스를 소모하는 DGCC13142의 능력을 추가로 조사하기 위하여, 검정 I에 의해 결정되는 바와 같이 VmaxLach에서 및 V0Lach에서 소모되는 갈락토스의 백분율을 계산하고, DGCC7773의 것과 비교하였다. 결과의 종합적인 개요를 제공하는 표 2에 결과가 제공되어 있다.
DSM33036에 대해서와 같이, DGCC7773에 의한 갈락토스의 소모는 불량하며, 각각 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서 및 락토스 소모의 완료(V0Lach) 시에 46% 및 36%이다. 다시, 반대로, DGCC13142는 락토스 소모와 거의 동시에 갈락토스를 소모하고, 소모되는 갈락토스의 백분율은 VmaxLach에 79% 및 V0Lach에 90%에 도달한다.
추가의 실험 연구의 세트에 의해, 락토스의 갈락토스 모이어티의 개선된 소모의 원인이 되는 DSM32823의 gal-lac 유전자 클러스터(SEQ ID NO:1)와 연관된 특정 유전학적 특징이 균주의 유전적 백그라운드와 독립적으로 작용하며, 이에 따라, 다양한 에스. 써모필러스 균주에 광범위하게 적용될 수 있는 것이 입증되었다.
실시예 5
: gal-lac 유전자 클러스터의 다수의 단편이 DSM32823의 gal-lac 유전자 클러스터의 동등한 단편으로 대체된 DSM33036의 유도체의 구축
(실시예 3 및 4에서 행한 바와 같이) gal-lac 유전자 클러스터가 게놈으로부터 예비 제거된 균주의 고유 gal-lac 유전자 클러스터를 대신하는 DSM32823 유래의 gal-lac 유전자 클러스터의 삽입에 대하여 대안적으로, DSM32823 유래의 gal-lac 유전자 클러스터를 사용한 자연적 수용성을 통한 (고유 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하는) 야생형 균주의 형질전환이 예상될 수 있다. 균주의 이러한 유전학적 엔지니어링에서, 다수의 상이한 재조합 사건이 발생하여, 다수의 가능한 재조합 균주를 야기할 수 있다. 실제로, 교차 사건은 형질전환 DNA의 각각의 말단에서 일어나서, gal-lac 유전자 클러스터의 완전한 대체를 야기하거나, 형질전환 DNA의 상동성 서열 내의 임의의 위치에서 일어나서, gal-lac 유전자 클러스터의 일부만의 대체를 야기할 수 있다. 또한, 2개 초과, 아마도 3개 또는 4개 또는 심지어 더 많은 교차-사건이 일어날 수 있다. 따라서, gal-lac 유전자 클러스터의 다수의 부분이 대체되어, 수, 길이 및 위치가 달라질 수 있다.
실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 DSM33036의 컴피턴트 세포를 DSM32823 유래의 gal-lac 유전자 클러스터에 상응하는 DNA(SEQ ID NO:1)로 형질전환시켰다. 이 목적을 위하여, DSM32823 유래의 염색체 DNA를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하고, gal-lac 유전자 클러스터를 down-galR-F1 및 down-LacZ-R1 프라이머를 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 PCR-증폭시켰다. 800 μL의 컴피턴트 세포를 1 μM의 유도제 펩타이드 ComS17-24의 존재 하에 5.3 pmol의 PCR 증폭된 DNA와 혼합함으로써 형질전환을 수행하였다. 37℃에서 5시간의 인큐베이션 후에, 형질전환 현탁액의 M17 브로쓰 중의 희석물을 5 g/L 갈락토스가 보충된 M17 상에 플레이팅하고, 37℃에서 48시간 동안 무산소 조건 하에 인큐베이션시켰다. 갈락토스에서 성장하는 8개의 콜로니를 집어내고, 추가로 배양하였다(균주 DGCC13135, 13136, 13137, 13138, 13392, 13393, 13394 및 13395). 이어서, 선택된 균주를 검정 I에 의해 결정되는 바와 같이 VmaxLach 및 V0Lach에서 소모되는 갈락토스의 백분율에 대하여 조사하였다.
이들 8개의 균주에 대한 검정 I의 결과는 표 3에 개시되어 있다.
다시, 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서, 및 락토스 소모의 완료(V0Lach) 시의 선택된 균주에 대한 갈락토스의 소모는 부모 균주에 비하여 유의미하게 개선되며, DSM32823(즉, gal-lac 유전자 클러스터의 공여자 균주)의 값과 비슷한 또는 유사한 값에 도달한다. VmaxLach에서 및 V0Lach에서 소모되는 갈락토스의 백분율은 각각 64 내지 88% 및 73 내지 100%의 범위였다.
gal-lac 유전자좌의 다양한 섹션이 재조합 사건(들)에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 선택된 균주에서 게놈 조사를 수행하였다. 게놈 비교는, 5'에서 3'으로 중첩하는 적어도 하나의 영역, galR 유전자의 코딩 서열의 부분, galK와 galR 유전자 사이의 유전자간 영역, 및 galK 유전자의 코딩 서열의 부분이 재조합 사건에 의해 전체적으로 영향을 받는 것을 보여주었다. 모든 선택된 균주에서 관찰되는 이 영역은 SEQ ID NO:5로 정의된다. 모든 선택된 균주에 있어서, SEQ ID NO:5를 포함하는 DSM32823의 gal-lac 유전자 클러스터 유래의 영역을 DSM33036의 게놈 내로 전달하였다. 따라서, SEQ ID NO:5는 락토스 유래의 갈락토스를 소모하는 능력이 개선된 균주를 제공하는데, 필요하고, 충분한 것으로 여겨진다.
이 새로운 세트의 결과는 DSM30823의 gal-lac 유전자 클러스터와 연관된 특정 유전적 특징의 전부가 아니라 오직 부분(들)만이 락토스의 갈락토스 모이어티의 소모의 개선의 원인이 되고, 이에 충분하다는 것을 입증한다. 락토스의 갈락토스 모이어티의 개선된 소모에서의 DSM30823의 gal-lac 유전자 클러스터의 오직 부분만의 관여가 예상되어, DSM32823의 gal-lac 유전자 클러스터의 일부 부분이 다른 균주의 gal-lac 유전자 클러스터 내의 이들의 상응하는 부분과 유의미하게 상이하지 않고, 심지어 동일한 것으로 간주될 수 있다(도 4의 B 참조).
실시예 6
: 락토스 유래의 갈락토스의 소모가 개선된 DSM33036의 유도체를 구축하기 위한 SEQ ID NO:5에 상응하는 gal-lac 유전자 클러스터의 단편의 이용.
DSM32823 유래의 전체 gal-lac 유전자 클러스터에 의한 균주의 전체 gal-lac 유전자 클러스터의 대체에 대하여 대안적으로, 이의 오직 부분만의 대체가 아마도 락토스로부터 초래되는 갈락토스의 소모의 개선을 제공하는데 충분할 수 있다. 이는 실시예 2에서 이루어진 유전학적 비교에 의해, 그리고 실시예 5에서 수득된 결과에 의해 뒷받침된다. 특히, 실시예 5는 galR 유전자의 코딩 서열의 부분, galK와 galR 유전자 사이의 유전자간 영역 및 galK 유전자의 코딩 서열의 부분과 중첩되는 gal-lac 유전자 클러스터의 섹션이 갈락토스의 소모에 중요한 것을 뒷받침하였다. 이 섹션은 SEQ ID NO:5로 정의된다. DSM33036 내의 동등한 서열의 부분 또는 전부를 대체하기 위하여 SEQ ID NO:5를 사용하는 실험을 조사하였다.
실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 DSM33036의 컴피턴트 세포를 SEQ ID NO:5에 정의된 DSM32823 유래의 DNA 단편으로 형질전환시켰다. 이 목적을 위하여, DSM32823 유래의 게놈 DNA를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였으며, SEQ ID NO:5 앰플리콘을 galR-R1(5'-CAGTAGTTCCGATAAGAACG(SEQ ID NO:15)) 및 ST89PCR-10Gal-R1(5'-GTTTCACATTCAGCACGACG(SEQ ID NO:16)) 프라이머를 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 PCR-생성하였다. 300 μL의 DSM33036의 컴피턴트 세포와 2 pmol의 SEQ ID NO:5 앰플리콘을 1 μM의 유도제 펩타이드 ComS17-24의 존재 하에 혼합함으로써 형질전환을 수행하였다. 37℃에서 5시간의 인큐베이션 후에, 형질전환 현탁액의 M17 브로쓰 중의 희석물을 5 g/L 갈락토스가 보충된 M17 상에 플레이팅하고, 37℃에서 48시간 동안 무산소 조건 하에 인큐베이션시켰다. 갈락토스에서 성장하는 4개의 콜로니를 골라내고, 추가로 배양하였다(균주 DGCC13399, 13400, 13401 및 13402). 이어서, 선택된 균주를 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 VmaxLach에서 및 V0Lach에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 대하여 조사하였다. 이들 4가지 선택된 균주에 대한 검정 I의 결과는 표 4에 개시되어 있다.
다시, 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의, 그리고 락토스 소모의 완료(V0Lach) 시의 선택된 균주에 대한 갈락토스의 소모는 부모 균주에 비하여 유의미하게 개선되어, DSM32823(SEQ ID NO:5의 공여자 균주)의 것과 비슷한 또는 유사한 값에 도달한다. VmaxLach에, 그리고 V0Lach에 소모되는 갈락토스의 백분율은 각각 55 내지 67% 및 71 내지 80%의 범위였다.
DSM33036 변이체의 엔지니어링을 위해 사용되는 경우 SEQ ID NO:5의 상이한 위치에서 재조합 사건이 발생할 수 있기 때문에, 4가지 선택된 균주에서 게놈 조사를 수행하였다. 게놈 비교는, DSM32823 균주에 특이적인 하기의 독특한 사항(모두 SEQ ID NO:5 내에 위치함)이 선택된 4가지 변이체에서 관찰되는 한편, 이들이 DSM33036 균주로부터 부재하였음을 보여주었다:
1) galR과 galK 유전자 사이의 유전자간 영역이 galK 유전자의 상류의 추정의 샤인-달가노 서열(리보솜 결합 부위)에 위치한 G SNP를 보유함(도 7의 A에 네모 표시됨);
2) galR과 galK 유전자 사이의 유전자간 영역이 (전사의 제1 뉴클레오티드에 비하여) 위치 -9 및 -14에서 적어도 하나의 A 뉴클레오타이드를 특징으로 하는 galK 프로모터를 보유함(도 7의 A에서 밑줄 표시된 위치);
3) 길이가 4가지 균주 간에 달라지는 galR 코딩 서열의 시작은 항상 SEQ ID NO:7 내의 galR 유전자의 코딩 서열의 위치 175에 위치한 G 뉴클레오타이드의 결실을 함유함. 이 G 뉴클레오타이드의 결실은 galR 유전자의 코딩 서열 내의 프레임시프트 및 조기 정지 코돈의 출현을 야기하여, 절단된 GalR 단백질을 야기한다(도 7의 B에서 DSM33036의 galR 코딩 서열의 처음 200개 뉴클레오타이드와 DSM32823의 galR 코딩 서열의 처음 199개 뉴클레오타이드의 정렬 참조).
따라서, 이 비교로부터 하기로 결론지을 수 있다:
- 적어도 galK 유전자의 상류의 특정 샤인-달가노 서열(1) 및 특정 galK 프로모터(2)를 함유하는 SEQ ID NO:2로서 정의된 galR과 galK 유전자 사이의 유전자간 영역의 존재는 "고 갈락토스 이용" 프로파일(VmaxLach 및 V0Lach에서의 갈락토스 소모의 백분율 개선)을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는데 필요함; 및
- galR 유전자의 코딩 서열의 시작에서 포함되는 프레임시프트까지, 및 galR과 galK 유전자 사이의 유전자간 영역, SEQ ID NO:3으로 정의되는 서열과 중첩되는 서열의 존재는 "고 갈락토스 이용" 프로파일(VmaxLach 및 V0Lach에서의 갈락토스 소모의 백분율 개선)을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 설계하는데 필요하고, 충분함. SEQ ID NO:3은 galK 유전자의 상류의 특정 샤인-달가노 서열(1), 특정 galK 프로모터(2) 및 galR 유전자의 코딩 서열 내의 특정 프레임시프트(3)를 함유한다.
실시예 7: 피자 치즈의 생산 및 기능의 평가(유청 및 커드 내의 잔류 락토스 및 갈락토스, 피자 베이킹 후의 갈변)
시험할 배양물
하기의 상기 언급된 균주를 단독으로 또는 락토코커스 락티스 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주와 조합하여 시험한다:
- DSM32823 균주;
- DSM33036 균주;
- DGCC13392 균주;
- DGCC13393 균주;
- DGCC13400 균주;
- DGCC13401 균주;
- 락토코커스 락티스 균주(상업 제품 M70; 다니스코(Danisco) 듀폰 참조번호: 1259559) 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주와 조합하여 DSM32823 균주;
- M70 락토코커스 락티스 균주 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주와 조합하여 DSM33036 균주;
- M70 락토코커스 락티스 균주 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주와 조합하여 DGCC13392 균주;
- M70 락토코커스 락티스 균주 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주와 조합하여 DGCC13393 균주;
- M70 락토코커스 락티스 균주 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주와 조합하여 DGCC13400 균주;
- M70 락토코커스 락티스 균주 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주와 조합하여 DGCC13401 균주.
피자 치즈의 제조
피자 치즈를 하기와 같이 제조한다:
- 우유(1L의 우유에 대하여 34.25g의 지방, 34.8g의 단백질, 139.2g의 건조물 및 359 mg의 우레아)를 74℃에서 1분 동안 열-처리하고, 35℃까지 냉각시킨다
- 염화칼슘을 15g/100L(우유)의 농도로 첨가한다
- 우유의 pH를 CO2 첨가에 의해 pH 6.4로 표준화시킨다
- 우유를 3-리터 뱃(VAT)에 분배한다
- 시험할 배양물(1.1010 - 1.1011 cfu/g(동결된 펠렛)의 농도)을 상이한 뱃에서 우유에 접종한다
- 접종된 우유를 t=20분에 2200 IMC/100L의 농도의 Marzyme(다니스코 듀폰 참조번호 90667)의 접종과 함께, 35℃에서 30분 동안 발효시켜, 응고유를 수득한다
- t=1h에, 응고유를 1-1.5 cm면의 정육면체로 절단하고, 연속하여 교반한 다음, 온도를 15분 내에 39℃까지 증가시킨다
- t=2h에, 커드를 직경이 11 cm인 몰드에서 성형하고, 2분 동안 추(1 kg) 하에서 압축하고; 이 단계에서 유청의 시료를 제거하여, 잔류 당을 측정한다
- 이어서, 커드 및 유청의 믹스를 커드의 pH가 5.2에 도달할 때까지 45℃에서 추 없이 몰드를 배치함으로써 배수한다;
- 이어서, 커드를 4℃까지 냉각시킨다;
- 이어서, 스트레칭된 커드의 온도가 55℃에 도달할 때까지, 커드를 90℃에서 물과 함께 쿠커 스트레처를 사용하여 60 rpm의 속도로 스트레칭한다
- 스트레칭된 커드를 30분 동안 (300g/L의 NaCl의 용액 중에서) 염수처리한다
- 이어서, 치즈를 숙성시키고, 4℃에서 15일 동안 보관한다.
성형 후의 유청 중 잔류 당
피자 치즈의 제조 동안, 성형 후의 유청의 시료를 수득하고, 이의 함유된 잔류 락토스 및 갈락토스를 하기와 같이 결정한다: 유청 시료를 황산 용액 중에 희석하고, 액체 치즈로 균질화시키고, 원심분리한다. 상청액을 여과하고, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 상에 주입한다. 당을 H+ 이온 교환 컬럼(ROA Rezex®) 150 mm x 7.8 mm x 8 μm) 컬럼 상으로 분리하고, 굴절계로 검출한다.
단독의 또는 락토코커스 락티스 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주와 조합한 DSM32823, DGCC13392, DGCC13393, DGCC13400 및 DGCC13401 균주의 이용은 DSM33036 균주에 비하여, 유청에서의 갈락토스 농도의 중요한 감소를 보여준다.
스트레칭 후의 커드 내의 잔류 당
피자 치즈의 제조 동안 커드의 시료를 수득하고, 이의 함유된 잔류 락토스 및 갈락토스를 결정한다. 커드 시료를 황산 용액 중에 희석하고, 액체 치즈로 균질화시키고, 원심분리한다. 상청액을 여과하고, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 상에 주입한다. 당을 H+ 이온 교환 컬럼(ROA Rezex®) 150 mm x 7.8 mm x 8 μm 컬럼 상으로 분리하고, 굴절계로 검출한다.
단독의 또는 락토코커스 락티스 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주와 조합한 DSM32823, DGCC13392, DGCC13393, DGCC13400 및 DGCC13401 균주의 이용은 DSM33036 균주에 비하여, 커드 내의 갈락토스 농도의 중요한 감소를 보여준다.
갈변 및 발광 결과
피자를 하기와 같이 제조한다: 피자 치즈(호일 아래에서 4℃에서 숙성시키고 보관한 15일 지난 치즈)를 슈레딩하고, 토마토 소스로 덮인 동결된 피자 크러스트 상에 첨가한다(50g의 피자 치즈를 피자의 1/4에 첨가한다). 이어서, 피자를 자놀리(Zanolli) 컨베이어 피자 오븐에서, 250℃에서 5분 30초 동안 베이킹한다. 각각의 1/4의 피자에 대하여, 갈변 세기를 계산한다. 미놀타(Minolta) 비색계 CR-300을 사용하여, 조리 후의 피자 표면의 색을 측정한다. 3가지 수치로 색을 표현하는 CIE L*a*b 색 공간(CIELAB) - 명도에 대하여 L*, 녹색-적색 성분에 대하여 a* 및 청색-황색 성분에 대하여 b* - 을 사용한다. L 값을 사용하여, 갈변 세기, 특히 투명도의 변화를 추정한다(L 값이 낮을수록, 피자 표면은 더 어둡다). 따라서, L 값이 55 미만인 경우, 피자는 탄 것으로 간주된다.
단독의 또는 락토코커스 락티스 및 락토바실러스 헬베티쿠스 균주와 조합한 DSM32823, DGCC13392, DGCC13393, DGCC13400 및 DGCC13401의 이용은 DSM33036 균주의 이용에 비하여, 피자 베이킹 후에 갈변 감소의 유의미한 개선(L 값의 증가)을 보여준다.
실시예 8:
"
고 갈락토스 이용
"을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 사용하여 생산되는 피자 치즈의 생산 및 평가
각각의 하기의 균주를 독립적으로 시험하여, 피자 치즈 생산 및 기능에 대한 이들의 영향을 결정하였다:
- DSM32823 균주;
- DSM33036 균주;
- DGCC13392 균주;
- DGCC13393 균주;
- DGCC13400 균주;
- DGCC13401 균주.
치즈를 4℃에서 30일 동안 숙성하고 보관한 것을 제외하고, 피자 치즈의 제조를 상기 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다.
스트레칭 후의 커드 내의 잔류 당
스트레칭 후에 커드에 존재하는 잔류 갈락토스의 수준에 대한 각각의 균주의 영향을 평가하기 위하여, 피자 치즈의 제조 동안 커드의 시료를 수득하고, 잔류 갈락토스를 실시예 7에 기재된 바와 같이 정량화하였다. 표 6은 피자 치즈를 제조하는데 사용되는 박테리아 균주에 따른 스트레칭 후의 커드 내의 갈락토스의 수준을 보여준다.
DSM32823, DGCC13392, DGCC13393, DGCC13400 및 DGCC13401 균주의 이용은 DSM33036 참조 균주에 비하여 커드에서 갈락토스 농도의 적어도 2배 감소를 초래하였다.
이들 결과는 갈락토스 수준을 효과적으로 그리고 효율적으로(예를 들어, 추가의 프로세싱 시간의 필요 없이) 감소시키는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 본원에서 생성된 균주의 능력을 입증한다.
갈변 및 발광 결과
피자를 하기와 같이 제조하였다: 피자 치즈(호일 아래에서 4℃에서 숙성시키고 보관한 30일 지난 치즈)를 슈레딩하고, 토마토 소스로 덮인 동결된 피자 크러스트 상에 첨가한다(피자 도우: 30 cm/120g의 치즈). 피자를 자놀리 컨베이어 피자 오븐에서, 250℃에서 5분 30초 동안 베이킹한다. 갈변 세기를 미놀타 비색계 CR-300을 사용하여 계산하여, 조리 후에 피자 표면의 색을 측정하였다. 3가지 수치로 색을 표현하는 CIE L*a*b 색 공간(CIELAB) - 명도에 대하여 L*, 녹색-적색 성분에 대하여 a* 및 청색-황색 성분에 대하여 b* - 을 사용하였다. L 값을 사용하여, 갈변 세기 및 투명도의 변화를 추정하였다(L 값이 낮을수록, 피자 표면은 더 어둡다). 예를 들어, L 값이 55 미만인 경우, 피자는 탄 것으로 간주된다.
도 8은 시험된 각각의 균주에 대한 피자 베이킹 후의 L 값을 보여준다. DSM32823, DGCC13392, DGCC13393, DGCC13400 및 DGCC13401 균주의 이용은 DSM33036 균주의 이용에 비하여 피자 베이킹 후에 갈변의 감소(L 값의 증가)를 초래하였다.
이들 결과는 피자 치즈에서 갈락토스 함량을 감소시키고, 베이킹 후에 치즈의 갈변을 감소시키기 위한 "고 갈락토스 이용"을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 이용을 뒷받침한다.
본 발명은 예를 들어, 본 발명의 다양한 양태를 예시하기 위하여 제공되는 개시된 특정 실시형태로 범주가 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형이 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본 개시내용의 실제 범주와 목적으로부터 벗어나지 않고 실시될 수 있으며, 본 개시내용의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시형태와 관련하여 기재될 수 있지만, 청구된 바와 같은 본 발명이 이러한 특정 실시형태에 과도하게 제한되지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 분자 생물학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형이 하기의 청구범위의 범주 내인 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> DuPont Nutrition Biosciences ApS
<120> LACTIC ACID BACTERIA HAVING IMPROVED SUGAR METABOLISM
<130> NB41753-WO-PCT
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> EP20172078.6
<151> 2020-04-29
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11042
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 1
ctattttgta ctgtttctta atgttaattt tgttcctagt ttagtaagtg ttggtatttt 60
tcgaggtgct aagaattgtt tattgagaat atccatagct gttcgtccca tttcttctgt 120
atagacagtg acactagaaa gtggaggata cacttgttta gctagagttg tatcgttaaa 180
agagataatt tgaatgtcgt cagggacctt gataccattt tcctgaagtg ctctgagtgc 240
accaatagct agactatcac tagccgcaaa gtaagcatca ggtaaagtag ctccactctt 300
aatcttagaa tcaagaagtt catagccaga ttggacagtg aagtcgccag tcagaataaa 360
aagagggtca tagattccct ttttcataca gtagttccga taagaacgta aacgaggatc 420
agagatgatt tcagttgcat ctgttgtttt ttcttgccca atgagtaggc ctatattatt 480
acaaccttgt tctttaagat aacagagtgc cgattgtacg gagttttcaa aatcagtagt 540
aacacatgga tgtccttgat taagagtatc actatcaaca aagaccagag tcttttttag 600
tctttctagt ttcgcaattt gttcacgact aaattttccg atacagagta caccaacgac 660
ctcctctcct agacttgaag gaatgtcgtt gaaaaagtga agcatctcgt agtctagttc 720
ataggctctt ttttcaatac caagtctaat attataatag tagatgtcat ctaactcgtg 780
ttcttcacta acccattgaa taattgccac ttgatacttt ttttttttga attattaatt 840
gttttgtatt tagtatatcc gatttcatca gcgatagtta atatccgatg tctagtatcc 900
tctgttacgg aaagagtttc atctttatta agaacacgtg aaacagttga aatagataca 960
cctgctaagt ttgcgatatc tgttaatgta gccatagtat cctccgcata tttcagtata 1020
acataacttt tcttttttac ctatatttta ctaaaaaaat agtaaaagta ttgatttttc 1080
atgtgaaagg gattacaatt tcagtgtaaa caaaaagaat aagggagata cagcctatga 1140
atacgttaca gttaagagaa aagtttaaag aagtttttgg tgtagaagca gatcatactt 1200
tcttttcacc aggtcgtatt aatttgattg gtgagcatac ggactacaat ggaggtaacg 1260
tccttccggt agctattacc ctaggtactt acggagcggc ccgcaaacgt gatgacaaag 1320
ttttgcgttt cttctcagct aactttgaag agaagggaat catcgaagtg ccacttgaaa 1380
atcttcgttt tgaaaaagaa cacaactgga caaactatcc aaaaggtgtt cttcatttct 1440
tgcaagaagc tgggcatacg attgattcag gtatggatat ttacatctat ggtaacattc 1500
caaatggatc aggcttgtca tcatcatcat ctttggaatt gttgattggt gttattgctg 1560
aaaaacttta tgaccttaaa ttggaacgcc ttgacttggt taaaatcggt aagcaaactg 1620
aaaatgactt tatcggcgtt aactctggta tcatggacca attcgctatt ggtatgggag 1680
ctgatcaatg tgcgatttac ttggatacaa atactctaaa gtatgacttg ataccccttg 1740
accttaaaga caatgttgtt gttatcatga acactaacaa acgtcgtgaa ttggctgatt 1800
ctaaatacaa tgaacgtcgt gctgaatgtg aaacagcagt atctgaactc caagaaaaac 1860
ttgatatcca aacacttggt gaattggacc tctggacatt cgatgcatac agctacttga 1920
ttaaagataa aaatcgtatc aaacgtgcac gccatgcagt tcttgaaaat caacgtacac 1980
ttcaagcccg taaagctctt gaagcaggag atttggaagg ctttggtcgt cttatgaatg 2040
cttctcacgt atcattggaa catgattacg aagttacagg tcttgaactt gatactttgg 2100
cacacacagc atgggaacaa gaaggtgttc ttggagctcg tatgacagga gcgggatttg 2160
gtggatgtgc catcgcactt gtaaacaaag ataaagttga agatttcaaa aaagcagttg 2220
gtcaacgtta tgaagaagtc gttggttatg caccaagctt ctatatcgct gaagtagctg 2280
gcggttcacg agtacttgat taatgagaaa gaagtagaga ttatggctga aaatttagta 2340
aacacttttg taactcaggt tattgaaaat agtgattatg aggaattgga ccgtatctat 2400
ttgacaaaca aagtttttgc tttggttgga gaaggagttg ctgatgttga aacagatagc 2460
tctgaattga ttgaccttaa agaccagttg cttcaagcag gtgttaaagc tggttctgta 2520
ggtgaactta atgaagaaca agatatcatc ggtgctcaac tcatggacct gattacacca 2580
agtcctagtg ttgtaaatcg taacttttgg gatacctata aatctaatcc agaacaagct 2640
atcgctgatt tttatgctct cagtaagcgc aatgattatg ttaaggtaaa ggcaattgct 2700
caaaatatcg cctataagtc tccaacaaag tacggtgact tggaaattac gattaacctt 2760
tcaaaacctg aaaaagatcc aaaagccatc gctgcagcta aaaatgcggt agcttctgat 2820
tatccaaaat gccaactttg tatggaaaat gaaggttatc taggtcgcat caatcaccca 2880
gcacgtagta atcaccgtgt tattcgtttc caaatggaag acaaggagtg gggcttccaa 2940
tattcaccat atgcttactt taatgaacat tctattttct tttatggtaa gcacgaacca 3000
atgcacatca gtccattgac gtttggtcgt ctcctatcaa ttgttgaagc atttcctggt 3060
tactttgcag gttcaaatgc cgatcttcca attgtaggtg gttcaattct tacacacgaa 3120
cactatcaag gtggtcgcca caccttccca atggaagtag caggcattaa agaaaaagtt 3180
agctttgatg gatactctga tgttgaaact ggtattgtta attggcctat gtcagttctt 3240
cgtttaagaa gtgaagataa ggaaagactt attgctcttg caaccaaaat tttaaattgc 3300
tggcgtggtt attcagacga aaaagctggt gtcttggctg agtctgatgg acaacctcac 3360
cacaccatta ccccaattgc tcgtagaaaa gacggcaaat ttgaattgga tttggttctt 3420
cgtgacaatc aaacttctga agaacatcca gacggtatct accacccaca taaagatgtt 3480
caacatatta agaaagaaaa catcggtttg attgaagtta tgggattggc cattcttcca 3540
cctcgtttga aaacagaact taaagatgtt gaagattatc tattgggtca aggtaaccaa 3600
gttgctccaa ttcaccaaga atgggcagat gaactcaaag ctcaaaatcc gaatgttacg 3660
gctgaggaag tgacagaagt tgttcgacaa tctgttgcag atatctttgc tcgtgtacta 3720
gaagatgcag gtgtttataa gactaatagt gaaggcttgg atcagtttaa agcatttgta 3780
gattttgtaa atttagctga ttaattgttt tttctgaaga aaggagataa gaaatggcaa 3840
ttttagtatt aggtggagct ggttatatcg gttctcacat ggttgatcgc ttagttgaaa 3900
aaggtcaaga aaaagtagta gtagtagata gtttggtaac cggtcaccgt gctgccgtac 3960
atccagatgc tattttctat caaggcgatc tctctgatca agattttatg agaaaggtct 4020
tcaaagaaaa tcctgatgtt gatgccgtta ttcactttgc ggcctattca ttggttggtg 4080
aatcaatgga aaaaccactc aaatattttg ataacaatac agctggaatg gttaaattgc 4140
ttgaagttat gaacgaatgc ggtgttaaat acattgtctt ctcatcaaca gcagcaactt 4200
acggaattcc agaagaaatt ccaattcttg aaacaacacc acaaaatcct atcaacccat 4260
atggtgaaag taagttgatg atggaaacca ttatgaagtg gtctgataaa gcttatggta 4320
ttaaatatgt gccacttcgt tacttcaacg ttgctggtgc aaaacctgat ggatctatcg 4380
gtgaagacca tggtccagaa actcaccttc ttccaattat ccttcaagta gctcaaggtg 4440
ttcgtgaaaa aatcatgatc tttggggatg actacaatac tccagacggg actaacgttc 4500
gtgactatgt gcatccattc gacttggcgg acgctcacct ccttgctgtt gaatatcttc 4560
gtaaaggtaa tgaatctaca gcctttaact taggttcatc aacaggtttt tcaaaccttc 4620
aaattcttga agcagctcgt aaggtaactg gtaaagagat tccagctgaa aaagttgatc 4680
gtcgtcctgg tgatcctgat atattgattg cttcatctga aaaagcacgt acagttcttg 4740
gatggaaacc acaatttgat aacatcgaaa aaatcatcgc aagtgcttgg gcatggcatt 4800
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gtatatataa ttgttgtact tctttgtttt tttgaggaaa taatatgaaa ataagctgcg 4920
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ag 11042
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<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
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<210> 3
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<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 3
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<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
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ggaaaatgac tttattggcg ttaactctgg tatcatggac caattcgcta ttggtatggg 1680
agctgatcaa tgtgcgattt acttggacac aaatactcta aagtatgact tggtacccct 1740
tgacctcaag gataatgtcg tagtcatcat gaacactaac aaacgtcgtg aattggctga 1800
ttctaaatac aatgaacgtc gtgctgaatg tgaaacagca gtatctgaac tacaagaaaa 1860
attggatatc caaactctcg gtgaattaga cttcttgaca tttgatgcat acagctattt 1920
gattaaagat gaaaaccgta tcaaacgtgc acgccatgta gttcttgaaa atcaacgtac 1980
acttcaagct cgtaaagctc ttgaagcagg agatttggaa ggctttggac gccttatgaa 2040
tgcttctcat gtgtcattgg aatatgatta cgaagttaca ggtcttgaac ttgatacttt 2100
ggcacacaca gcttgggaac aagaaggagt attaggagcc cgcatgacag gagctggttt 2160
cggtggatgt gccattgcac ttgtaaacaa agacaaagtt gaagacttca aaaaagcagt 2220
tggtcaacgc tatgaagaag tcgttggtta tgcaccaagc ttctatattg ccgaagtaac 2280
tggtggttca cgagtacttg attaatgaga aagaagtaga gattatggct gaaaatttag 2340
taaacacttt tgtaactcag gttattgaaa atagtgatta tgaggaattg gaccgtatct 2400
atttgacaaa caaagttttt actttggttg gagaaggagt tgctgatgtt gaaacagata 2460
gctctgaatt gattgacctt aaagaccagt tgcttcaagc aggtgttaaa gctggttccg 2520
taggtgaact taacgaagaa caagatatca tcggtgctca actcatggac ttaattacac 2580
caagaccgag cgttgtcaat cgtaacttct gggatactta taaatctaac ccagagcaag 2640
caattgctga cttttatgca caaagtaaac gaaatgatta tgtgaaagtc aaagccattg 2700
cacaaaatat tgcttataaa gcaccaacta aatacggtga cttggaaatt acgattaacc 2760
tttcaaaacc tgaaaaagat cccaaagcca tcgctgcagc taaaaatgcg gtagcttctg 2820
attatccaaa atgccaactt tgtatggaaa atgaaggtta tttgggtcgc attaatcacc 2880
cagcccgcag caatcaccgt gttgttcgtt tccaaatgga agacaaggag tggggcttcc 2940
aatactcgcc ttatgcctac tttaacgaac attctatctt cttttatggt aagcacgaac 3000
caatgcacat cagtccattg acgtttggcc gtctcctaac aattgttgaa gcattccctg 3060
gttacttcgc aggttcaaat gccgatcttc caattgtagg tggttcaatt cttacacatg 3120
aacactatca aggtggtcgc cataccttcc caatggaagt agcaggcatt aaagaaaaag 3180
ttagctttga tggttactct gatgttgagg ctggcatcgt taattggcct atgtctgttc 3240
ttcgtctaag aagtgaagac aaggaaagac ttatcgctct tgcaactaaa atcctaaatt 3300
gctggcgtgg ttattcagac gaaaaagctg gggtcttggc tgagtctgat ggacaaccac 3360
accacaccat tactccaatt gctcgtagaa aagacggcaa atttgaattg gatttggttc 3420
ttcgtgacaa tcaaacttct gaagaatatc cagacggtat ctatcaccca cataaagatg 3480
ttcaacatat taagaaagaa aatattggtt tgattgaagt tatgggattg gccattcttc 3540
cacctcgttt gaaaacagaa cttaaagatg ttgaagatta tctattaggt caaggtaacc 3600
aagttgctcc aattcaccaa gaatgggcag atgaactcaa agctcaaaat ccaaatatta 3660
cggctgagga agtgacagaa gttgttcgac aatctgttgc agatatcttt gctcgtgtac 3720
tagaagatgc aggtgtttat aagactaata gtgaaggctt ggatcagttt aaagcatttg 3780
tagattttgt aaatttagct gattaattgt tttttctgaa gaaaggagat aagaaatggc 3840
aattttagta ttaggtggag ctggttatat cggttctcac atggttgatc gcttagttga 3900
aaaaggtcaa gaaaaagtag tagtagtaga tagtttggta acaggtcacc gtgctgccgt 3960
acatccagat gctattttct atcaaggcga tctttctgat caggatttta tgagaaaggt 4020
cttcaaagaa aaccctgatg ttgatgctgt tattcacttt gcggcctatt ctttggttgg 4080
tgaatcaatg gaaaaaccac tcaaatattt tgataacaac acagctggaa tggttaaatt 4140
gcttgaggtt atgaacgaat gcggtgttaa atacattgtc ttctcatcaa cagcagcaac 4200
ttacggaatt ccagaagaaa ttccaattct tgaaacaaca ccacaaaatc ctatcaaccc 4260
atatggtgaa agtaagttga tgatggaaac cattatgaag tggtcagacc aagcttacgg 4320
catcaagtat gtccctcttc gttactttaa tgtggcgggt gccaaacctg atggttcgat 4380
tggtgaggac cacgatccag aaactcacct tctaccgatt attcttcaag tagctcaagg 4440
tgttcgtgaa aaaatcatga tctttgggga tgactacaat actccagacg ggactaacgt 4500
tcgtgactat gtgcatccat tcgacttggc ggacgctcac ctccttgctg ttgaatatct 4560
tcgtaaaggt aatgaatcta cagcctttaa cttaggttca tcaacaggtt tctcaaacct 4620
tcaaattctt gaagcagctc gtaaggtaac tggtaaagag attccagctg aaaaagctga 4680
tcgtcgtcct ggtgatcctg atatattgat tgcttcatct gaaaaagcac gtacagttct 4740
tggatggaaa ccacaatttg ataacatcga aaaaatcatc gcaagtgctt gggcatggca 4800
ttctagccat ccaaaagggt acgatgatcg aggataatta aaataataaa caaaaaaaca 4860
aagagtatat ataattgttg tactctttgt tttttgagga aataatatga aaataagctg 4920
cgaaattatt ggaaaagttg attcaggcga tgtcagtaaa atttcaatgg aaaataataa 4980
tggtgttgtc atttccacac tcacaacagg tgctacactt caggagtttt tggttccaac 5040
ggaaactggt gctcttaaaa atatagtact tggtttcagt gatttcgagg attactataa 5100
gaataattta tgtgcctgcc agtccattgg tagggttgct ggaagaattg ggaaagcttc 5160
gtatactcat aatatggttc tttatagcct tcctaagaat gagggagaaa actgcttaca 5220
tggcggtcca aaaggaatgc aggtccaaaa ttggaactat gtcacaaacc tgaatgatga 5280
atatgttgag acaaaattta ttagaagact ttattcaagt gtagatggct ttcctggtga 5340
tgtgacagtc tctattagtt atagacttaa caataataac cgcttaacaa tactctttga 5400
agccttcgat gttacagagt caacagtctt taatccgaca aaccatgttt actttaatct 5460
tagcgacaaa caggatttat caagtcatga gttacaaatc tattcagact atcgtttaga 5520
gttggattct gagttaattc caacaggaca aaaaattaat gtagatgaaa cgaattatga 5580
ttttagaaag acaactgact tgctacctcg aattgaagca aataatggtt ttgatgatgc 5640
ctttgtagtt ggagggggaa cttgtgatca tgtgaaagaa gtagctattt tgcatgacaa 5700
agaaagcgga gatggtattg aaatcttctc aaacagaaat ggtttagtca tttttacgat 5760
ggatgatatc gaagataata tttactttgc aagagataaa ggcaaaatgg caaaaaggcg 5820
tgaagctatt gctatggaag ctcaaaccct tccagatgcc gttaatcaca aaggttttgg 5880
agatattatc ttagataaag gtcatagtgt aaactatgaa attggcttcc aatactttaa 5940
ttcatcaaga taaccatgta ttagtaaaat tttagtaaaa aacactgaaa ttattgactg 6000
cataaaccaa ttttcatata atgtaaacgt attcaaataa taggaggttt ccgaaatgga 6060
aaaatctaaa ggtcagatga agtctcgttt atcctacgca gctggtgctt ttggtaacga 6120
cgtcttctat gcaaccttgt caacatactt tatcatgttt gtgacaactc acttgtttaa 6180
cacaggtgat ccaaagcaaa atagtcacta cgtactatta atcactaaca ttatctctat 6240
tttgcgtatc ttggaagtat ttatcgatcc attgatcggt aatatgattg ataacactaa 6300
tactaagtat ggtaaattca aaccatgggt agttggtggt ggtatcatca gttctatcac 6360
cttgttgctt ctcttcaccg atttaggtgg tttgaataaa acaaatcctt tcttgtacct 6420
tgtacttttt ggaattatct accttgtaat ggatgtcttc tactcgatta aagatatcgg 6480
tttctggtca atgattcctg ccttgtctct tgatagtcac gaacgtgaaa aaatggcaac 6540
ttttgcccgt attggttcta cgattggtgc caatattgta ggtgttgcca tcatgccaat 6600
cgttttgttc ttctctatga cgaacaatag tggctctgga gataaatctg gatggttctg 6660
gtttgcattt atcgttgctc tcattggtgt gattacatca attgctgttg gtattggtac 6720
acgtgaagtt gagtcaaaaa ttcgtgataa taacgaaaaa actagcctta aacaagtctt 6780
taaggttctt ggtcaaaacg accaattgat gtggttatct cttggatatt ggttctatgg 6840
tcttggtatt aatacactta atgctcttca actttattat ttcacattta tccttggtga 6900
ttcaggtaaa tactcaattc tttacggatt gaatacagtt gttggtttgg tttcagtttc 6960
actcttccct accctagctg ataaattcaa ccgtaaacgt ttgttctacg gatgtattgc 7020
agtaatgctc gggggtatcg gaatatttag tattgcaggt acatcacttc caataatctt 7080
gactgcagct gaactcttct tcattccaca acctcttgtg ttccttgttg tctttatgat 7140
tatctctgac tcagtagaat atggtcaatg gaaaacggga caccgtgatg aatcacttac 7200
tttgtcagtt cgtccactta ttgataaact tggtggtgcg atgtcaaact ggcttgtttc 7260
tacatttgcc gtagctgccg gtatgacaac aggtgcctca gcatcaacaa ttacaacaca 7320
tcaacagttt atctttaagc ttggcatgtt tgctttccca gcagcaacaa tgcttatcgg 7380
tgccttcatt gttgctcgta aaatcacttt gactgaagca cgtcacgcta aaattgttga 7440
agaattggaa catcgcttta gcgtagcaac ttctgaaaat gaagttaaag ctaacgtcgt 7500
atctcttgta acccctacaa ctggttattt ggttgatctc tcaagtgtta atgatgaaca 7560
ctttgcttca ggtagcatgg gtaaaggttt cgccattaaa cctactgatg gagctgtctt 7620
tgcaccaatt agtggtacca ttcgtcaaat tcttcctact cgccatgcag ttggtattga 7680
aagtgaagat ggtgtcattg ttcttatcca cgttggcatc ggaacagtta aacttaatgg 7740
tgaaggattc attagttacg tagaacaagg tgatcatgtt gaagttggac aaaaacttct 7800
tgagttctgg tcaccaatta ttgagaaaaa tggtcttgat gacacagtac ttgtcactgt 7860
aactaattca gaaaaattca gtgctttcca tcttgaacaa aaagttggag aaaaggtaga 7920
agctttgtct gaagttatta ccttcaaaaa aggagaataa tctatgaaca tgactgaaaa 7980
aattcaaact tatttaaacg atccaaagat tgttagcgtt aatactgttg atgctcactc 8040
agatcataag tattttgaat ctcttgaaga attttctgaa ggggagatga agttaagaca 8100
atctcttaat ggaaaatgga aaattcacta tgctcagaat acaaatcagg ttttaaaaga 8160
cttttataaa acagaatttg atgaaactga tttgaatttc atcaatgtac caggtcattt 8220
agagcttcaa ggttttggtt ctccacaata tgtgaatacc caatatcctt gggatggtaa 8280
agaattcctt cgtccacctc aagttcctca agaatcaaat gctgttgcat catacgttaa 8340
acattttacc ttgaatgatg cattaaaaga taaaaaagta tttatctcat tccaaggggt 8400
tgctacttcc atctttgtat gggtcaatgg taacttcgta ggatacagtg aagattcatt 8460
tacacctagt gaatttgaaa ttagtgatta ccttgttgaa ggtgataaca agttggcggt 8520
agctgtttat cgttactcta cagcaagctg gttggaagac caagacttct ggagacttta 8580
cggtattttt agagatgttt acttgtatgc tattccaaaa gttcacgttc aagatctctt 8640
tgttaaggga gattatgatt accaaacaaa agcaggtcaa ttggatattg atttgaagac 8700
tgttggtgat tatgaagaca agaagattaa atatgttctt tcagattatg aaggcatcgt 8760
tacagaaggt gatgcatctg ttaatggtga cggtgaacta tctgtaagtc ttgaaaatct 8820
taaaatcaaa ccttggagtg ctgaaagtcc taaactttac gatttgatcc ttcatgtttt 8880
ggatgatgac caagttgttg aagtcgttcc agttaaagtt ggatttagac gctttgaaat 8940
taaagataaa cttatgcttt tgaatggtaa gagaattgtc tttaaagggg ttaacagaca 9000
cgaatttaac gctagaacag gacgttgtat cactgaagaa gatatgcttt gggatatcaa 9060
agtgatgaaa caacataaca tcaatgctgt tcgtacttca cactatccta accaaacacg 9120
ttggtatgaa ttgtgtgatg aatatggact ttatgttatc gatgaagcca accttgaaac 9180
acacggtaca tggcaaaaac ttggtctatg cgaaccttca tggaatatcc cagctagtga 9240
accagaatgg ttgcctgctt gtttggatcg tgccaataac atgttccaac gcgataagaa 9300
ccacgctagt gttatcattt ggtcttgtgg taatgaatca tatgctggta aagatattgc 9360
tgacatggct gattacttcc gtagtgttga caatactcgt ccagttcact atgaaggtgt 9420
tgcatggtgt cgtgagtttg attacattac agacatcgaa agtcgtatgt atgcgaaacc 9480
agctgatatc gaagaatacc tcacaactgg taaactagtt gatctttcaa gcgttagtga 9540
taaacacttt gcttcaggta acctaactaa caaacctcaa aaaccttata tttcatgtga 9600
atacatgcac acaatgggta actctggtgg tggattgcaa ctctacactg acttagagaa 9660
atatccagaa taccaaggtg gatttatttg ggacttcatt gaccaagcta tttacaaaac 9720
acttccaaat ggtagcgaat tcctatcata tggtggtgac tggcatgata gaccttctga 9780
ctacgaattt tgtggaaatg gtatcgtctt tgcagatcgt accctaactc caaaacttca 9840
aacagttaaa catctttact ctaatattaa gattgctgtt gatgaaaaat cagtaactat 9900
caagaatgat aatctcttcg aagatctttc tgcttatact ttcctagcta gagtttacga 9960
agatggtaga aaagttagtg aaagtgaata tcactttgat gttaaaccag gcgaagaagc 10020
aacattccca gttaactttg tagtcgaggc ttcaaattct gaacaaattt acgaagttgc 10080
ttgtgttctg agggaagcaa ctgaatgggc tcctaaaggt catgaaattg ttcgtggtca 10140
atatgttgtt gaaaagatta gcactgaaac accagttaaa gcacctttga atgttgttga 10200
aggcgacttc aacatcggta ttcaaggaca aaacttctca atcttgcttt cacgtgcaca 10260
aaatacttta gtatctgcta agtataatgg tgttgaattc attgagaaag gtcctaaact 10320
tagcttcact cgtgcttaca ctgacaacga tcgtggtgct ggatatccat tcgaaatggc 10380
aggctggaag gttgctggaa actatagtaa agttacagat actcaaattc aaatcgaaga 10440
cgactctgtt aaagtgactt atgttcatga attgccaggc ttgtctgatg tcgaagttaa 10500
ggtaacttat caagttgatt acaagggtcg aatctttgtt actgcaaact atgatggtaa 10560
agcaggtttg ccaaacttcc ctgaatttgg tctagaattt gctatcggtt cacaatttac 10620
aaaccttagc tattatggat acggtgcaga agaaagctac cgtgataaac ttcctggtgc 10680
ctatcttggt cgatatgaaa catctgttga aaagacattt gctccatatc taatgccaca 10740
agaatctggt aatcactatg gtactcgtga attcacagta tctgatgata accataatgg 10800
tcttaaattc accgcactta ataaagcatt cgaattcagt gctttgcgta acagtactga 10860
acaaattgaa aatgctcgtc accaatatga gttgcaagaa tctgatgcta catggattaa 10920
agttcttgct gctcaaatgg gtgtaggtgg tgacgacaca tggggtgctc cagttcatga 10980
cgaattcttg cttagctcag cagatagcta tcaattaagc ttcatgattg aaccactaaa 11040
ttag 11044
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 9
tgttcgtgct gacttgcac 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 10
cctcgaggtc gacggtatc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 11
atcgtccaga caatggcatg 20
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 12
gtgcaagtca gcacgaacac tgaaccataa acctgaatag g 41
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 13
gataccgtcg acctcgaggg tactgattag cactccaac 39
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 14
agattaccct gcctcaattg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 15
cagtagttcc gataagaacg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 16
gtttcacatt cagcacgacg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 17
aattgccact tgatactttt 20
Claims (34)
- 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 제시된 서열을 포함하는 핵산 서열을 도입하는 단계를 포함하는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 균주의 생성 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이 SEQ ID NO:1, 3, 4, 5 또는 6, 또는 SEQ ID NO:1, 3, 4, 5 또는 6 유도체에 의해 제시된 서열을 포함하며, 상기 유도체가 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 의해 제시된 서열을 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 도입이 자연적 수용성(natural competence), 컨쥬게이션 또는 형질전환을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열을 도입한 후에, 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 하나 이상의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하고/거나 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 2021년 4월 21일에 DSMZ에 수탁 번호 DSM33851, DSM33852, DSM33853 또는 DSM33854 하에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 균주 또는 이의 돌연변이체.
- 하기를 포함하는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 생성 방법:
a) 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 제공하는 단계;
b) 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체를 포함하는 단계; 및
c) 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 나타내는 단계 b)에서 수득되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선택하는 단계. - 제6항에 있어서, 단계 b)가 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체를 포함하는 단계, 및 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계로서, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체를 포함하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제6항에 있어서, 단계 b)가 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계이며, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체를 포함하는 방법.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, 상이한 서열을 갖는 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계이며, 상기 상이한 서열이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체를 포함하며, 특히 상기 상이한 서열의 gal 오페론이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어지는 방법.
- 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열을 변형시켜, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진 gal-lac 유전자 클러스터를 수득하는 단계인 방법.
- 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 갈락토스-음성인 방법.
- 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득 가능한 스트렙토코커스 써모필러스 균주로서, 단, 균주가 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아닌 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 하기:
a) 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하며;
b) 이것이 적어도 50%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주로서,
단, 균주가 2018년 5월 29일에 DSMZ에 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 DSM32823 균주가 아닌, 스트렙토코커스 써모필러스 균주. - 제13항에 있어서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터는 서열이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:3 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 gal-lac 유전자 클러스터, 및 서열이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:4 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 gal-lac 유전자 클러스터로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 제14항에 있어서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열을 포함하며, 특히, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 gal 오페론이 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:6 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 이의 gal-lac 유전자 클러스터의 서열이 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 유도체에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 균주가 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- "고 갈락토스 이용" 프로파일이 적어도 적어도 70%인, 특히, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 추가로 정의되는 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제11항 및 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제12항 내지 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 균주가 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제11항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 균주가 a) 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 및 적어도 85%의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 백분율 및 100%인 백분율로 이루어진 군으로부터 선택되는 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 또는 b) 적어도 50% 및 70% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 및 적어도 70% 및 최대 80%인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율 중 어느 하나에 의해 정의되는 "고 갈락토스 이용" 프로파일을 갖는 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제11항 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 상기 SEQ ID 유도체가 상기 SEQ ID와 적어도 97% 동일성을 갖는 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제11항 및 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 서열이 DSM32823 균주의 게놈 서열에 대하여 최대 99.98%, 최대 99.97%, 최대 99.6% 또는 최대 99.5%인 동일성을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로, 상기 균주가 DSM32823 균주의 변이체가 아닌, 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
- 제5항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 선택적으로 적어도 하나의 박테리아 균주 및/또는 성분(들)을 포함하는 배양물.
- a) 제5항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 및 b) 적어도 하나의 다른 박테리아 균주 및/또는 성분(들)을 포함하거나, 이로 이루어진 키트-오브-파트(kit-of-part).
- 적어도 하나의 다른 박테리아 균주가 속 락토코커스(Lactococcus) 및/또는 락토바실러스(Lactobacillus), 선택적으로, 락토코커스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis), 락토코커스 락티스 아종 크레모리스(Lactococcus lactis subsp. cremoris) 및/또는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로부터의 것인 제25항의 배양물 또는 제26항의 키트-오브-파트.
- 제5항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 제25항 또는 제27항의 배양물, 또는 제26항 또는 제27항의 키트-오브-파트를 포함하는 식품 또는 사료 제품, 특히, 유제품, 육류 또는 곡물 식품 또는 사료 제품, 특히, 발효유 식품.
- 하기를 포함하는 발효 제품의 제조 방법:
a) 기질, 특히 밀크 기질을 제5항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 제25항 또는 제27항의 배양물, 또는 제26항 또는 제27항의 키트-오브-파트로 접종하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 수득되는 접종된 기질을 발효시켜, 발효 제품, 바람직하게는 발효유 제품을 수득하는 단계. - 하기를 포함하는, 파스타-필라타 치즈(pasta-filata cheese)의 제조 방법:
a) 스트레칭에 적합한 커드(curd)를 제공하거나 생산하는 단계로서, 상기 커드는 밀크를 제5항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 제25항 또는 제27항의 배양물, 또는 제26항 또는 제27항의 키트-오브-파트로 접종하고 발효시킴으로써 수득되는 단계;
b) 단계 a)의 커드를 스트레칭시켜, 스트레칭된 커드를 수득하는 단계; 및
c) 단계 b)의 스트레칭된 커드를 조작하여, 최종적으로 파스타-필라타 치즈를 만드는 단계. - 제30항에 있어서, 스트레칭에 적합한 커드를 생산하는 단계 a)가 하기를 포함하는 방법:
a1) 밀크를 제5항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항의 스트렙토코커스 써모필러스 균주, 제25항 또는 제27항의 배양물, 또는 제26항 또는 제27항의 키트-오브-파트, 및 선택적으로 밀크 응고제로 접종하는 단계;
a2) 단계 a1)의 접종된 밀크를 발효시켜, 응고유를 수득하는 단계;
a3) 단계 a2)의 응고유를 절단하고, 가열하고, 교반하여, 커드 및 유청의 믹스를 수득하는 단계; 및
a4) 단계 a3)의 커드 및 유청의 믹스를 배수하여, 스트레칭에 적합한 커드를 수득하는 단계. - 제30항 또는 제31항에 있어서, 단계 a3)에서의 가열 및 교반시에, 상기 커드를 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 파스타-필라타 치즈를 제조하기 위한, 제5항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도.
- 이의 게놈에 gal-lac 유전자 클러스터를 보유하고, 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 바와 같은 최대 락토스 소모 속도(VmaxLach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율, 및 선택적으로 50% 미만인 검정 I에 의해 결정되는 락토스 소모의 마지막(V0Lach)에서의 소모되는 갈락토스의 백분율을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 사용하여 생산되는 치즈 유청에 비하여 감소된 갈락토스 농도를 갖는 치즈 유청을 생산하기 위한, 5항 및 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항의 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도.
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