JP3017687B2 - ビフィズス菌及びその培養方法 - Google Patents

ビフィズス菌及びその培養方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は胆汁塩、胃酸および
酸素に対する耐性を同時に持つビフィズス菌と、並びに
酸素の存在する条件下において当該菌株を培養する方法
とに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ビフィズス菌は乳児の健常腸内菌の指標
とされている。ビフィズス菌は年齢層により菌群の種類
分布や数量が異なるが、ビフィズス菌は年齢が上がるほ
ど減少する傾向にあり、臨床試験では健康との関連性が
示されている。腐敗菌や病原菌を抑制し、腸内正常菌の
バランスを維持し、毒性アミンの生成を抑制し、ビタミ
ンＢ群を合成し、嬰児の利用に有利なＬ型乳酸を生成す
るなどの生理活性を有する。
【０００３】しかし、ビフィズス菌はその他の乳酸菌に
比べて嫌酸素性があり、このため菌体の培養及び製品の
包装において菌の活力を維持することが難しく、コスト
が増え、菌製品の応用において問題となっている。この
他、菌体が摂取された後、人体胃腸環境に耐えて腸で吸
着されるという特性があるため、有効菌株の選択は菌株
の胃酸、胆汁塩に対する耐性並びに分離源と地域性など
と関連性がある。このため酸素、酸及び胆汁塩に対する
耐性をもつ菌株の選択はビフィズス菌の開発において大
きな目標となっている。現在までに世界各地で百種類近
い関連製品が開発されているが、上記の条件に完全に符
合する菌株はまだない。すでに発表されたビフィズス菌
耐性菌株及び製造工程特許及び文献は日本が最も多く
（表１〜６を参照）、酸、酸素耐性菌株が主流で、胆汁
塩耐性菌株は少ない。
【０００４】
【表１】
【０００５】
【表２】
【０００６】
【表３】
【０００７】
【表４】
【０００８】
【表５】
【０００９】
【表６】
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】研究によれば、１ビフ
ィドバクテリアム(Bifidobacterium) sp. ATCC 15700、
ATCC 15696、ATCC 15697及びATCC 15707は0.3 ％胆汁酸
(glycocholate）存在下において２４時間培養したとこ
ろ、成長力は非常に低く、ほとんど成長していない。耐
酸性菌株も多くが菌体を酸性乳製品（pH４〜４．８）に
おいて冷蔵貯蔵した生残率に着目しており、胃酸耐性試
験を行っているものは少なく、そのpH設定も３〜３．５
又は胃液分泌初期には発生する可能性がないpH２前後と
している。
【００１１】したがって、本発明の目的は、嬰児便から
分離した１ビフィドバクテリアムロンガム（Bifidobact
erium longum）胃酸耐性菌株及び当該分離株を出発菌株
とし、突然変異菌種から胃酸、胆汁塩及び酸素に対する
耐性を持つビフィズス菌の多特性菌株を選別することで
ある。さらにもう一つの目的は簡便な当該菌株の培養方
法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
(1) 微生物突然変異株の記載 本発明は健常な嬰児の便から分離した耐酸性ビフィズス
菌菌株１ビフィドバクテリアムロンガム（Bifidobacter
ium longum） Ｙ１及びＹ２（ATCC 55813及び55814)及
び当該菌株を原始菌株として突然変異の改良を行った後
得た突然変異株ATCC 55815 、55816 、55817 、55818
に関するものである。突然変異種の前２者は原始菌株を
ATCC 55813 としたもの、後２者は原始菌株を ATCC 55
814 としたものである。本発明の菌株の特徴は胆汁塩、
酸などを含む胃腸環境耐性があり、且つ酸素耐性も高
く、工業培養に有利である。
【００１３】現在本発明菌株はすでにブタペストトリー
ティ（Budapest Treaty ）によりＡＴＣＣ（American T
ype Culture Collection）に送られており、その送付日
と整理番号は表７に示す通りである。
【００１４】
【表７】
【００１５】(2) 本発明の菌株の製造方法 本発明の新菌株の突然変異方法、選別分離の方針と手順
及び培養基の組成などは、実施例において再度詳しく述
べる。 (3) 菌株耐性の確認 胆汁塩耐性 牛胆汁（oxgall) は培養基においてヒト腸内菌を培養す
る時に一般的に使用されており、このためその効力はヒ
トの胆汁塩に類似しており、その平均濃度を０．３％
（w/v)とする。このため本発明の菌株及び原始菌株は適
当に活性化を行い、１％の接種量を取り、(1)基本培養
基ＭＲＳに０．３％の牛胆汁を添加したもの−試験群、
(2)基本培養基−対照群に接種し、２４時間の培養を行
ったあと、ＯＤ600nm 及び生菌数の測定比較を行い、胆
汁塩耐性を確認する。
【００１６】耐酸性 胃酸pH値は胃内容物の進入時間及び種類により１．５〜
４．５の範囲で異なる。平均通過時間は２時間で、試験
時はpH２を採用する。酸性の性質は塩酸に類似している
ため、塩酸を生理食塩水で調整してpH２とし、３７℃で
２時間処理して生存菌数を測定し、さらにpH７の生理食
塩水で処理した菌数と比較し、耐酸性を確認する。
【００１７】酸素耐性 変更した培養方式はすでに活性化した本発明の菌株を一
般のスパイラル試験管に接種し、酸素の存在する条件下
において静置培養したあと、２４時間後にその成長をＯ
Ｄ600nm 及び生菌数で測定し、嫌気的条件下（酸素の存
在しない条件下）において培養したものと比較する。
【００１８】生残率の測定 測定するサンプル１mlを９mlの希釈液（０．１％蛋白ペ
プトン及び０．１％ゼラチンの水溶液) と混合し、適当
な希釈濃度とする。１mlの希釈液を培養皿に取り、約２
０mlのＭＲＳ固体培養基（融解温度約45℃) を加え、振
とうして均一化したあと、静置凝固させ、完全に凝固し
たあと、嫌気缶に倒置し、３７℃で２〜３日間培養し、
取り出して生菌数を測定する。
【００１９】菌株の培養方法 本発明菌株の培養方法は脱脂乳において、酸素の存在す
る条件下において培養したところ、その他の成長促進剤
を添加する必要がなく、産業としての生産に有利であ
る。 菌株の応用 応用する場合、本発明菌株は単独で使用又はその他の乳
酸菌（例えば１Lactobacillus acidophilus, Lactococc
us lactis, Lactobacillus casei, Streptococcus ther
mophilus, Lactobacillus bulgaricus）又は酵母菌（例
えば１Candidakefyr, Saccharomyces florentinus ）及
び使用可能な菌株とともに、２種又は２種以上でスター
ターとして、液体ヨーグルト、発酵乳、冷凍ヨーグル
ト、乳酸菌発酵飲料及び発酵豆乳などの製品を生産する
ことができる。本発明菌株も食品添加物とすることがで
き、原料加工時に添加したり、発酵に参加せず発酵後期
に添加したりできる。このため広く様々な製品、例えば
牛乳、濃縮牛乳、粉ミルク、アイスクリーム、ヨーグル
ト、チーズ、リンゴジュース、豆乳、ケーキ、キャンデ
ィー、ベビーフード、食事療法製品、乳酸菌発酵飲料及
び上記の発酵製品に応用できる。各種製品の添加量は１
ｇ当たり、又は１ml当たり菌量106 〜109 cfu とする。
【００２０】このほか、もう一つの応用方法は本発明菌
株自身又はこの菌株を含む上記製品の一つで冷凍又は噴
霧乾燥粉末を生成することで、１ｇ当たりに109 個以上
の活性ビフィズス菌を含むものとする。この種の製品に
酵母粉、炭水化物又はその他の充填成分を加えて、錠剤
又はカプセルを製造し、ビフィズス菌を含む消化整腸剤
又はインスタント食品、又は食用できる菌体粉末とする
ことができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
〔実施例１〕 菌種の培養及び保存 ビフィズス菌分離株１Bifidobacterium longum ATCC 5
5813及びATCC 55814又は突然変異株をＭＲＳ培養基にて
培養する。液体培養を行う場合、嫌気型ゴム栓を持つ試
験管を容器（Bellco Glass Inc.)を使用し、Virginia P
olytechnic Institute(V.P.I.)の嫌気操作システムで菌
株の接種を行い、９０％の窒素と１０％の二酸化炭素の
混合気体を使用する。固体培養する場合は、菌株を固体
培養基に接種した後、嫌気缶に倒置し培養２る。その保
存方法は、菌体を１０％のグリセロールを含むＭＲＳ液
体培養基において−８０℃冷凍保存を行うか、又は２０
％の脱脂乳において冷凍乾燥した後４℃で保存する。
【００２２】ＭＲＳの成分は以下に示す通りである。 プロテオーゼ・ペプトン（Proteose peptone No.3) 10.0 g 牛肉抽出物 10.0 g 酵母抽出物 5.0 g ブドウ糖 20.0 g Tween 80 1.0 g クエン酸アンモニウム 2.0 g 酢酸ナトリウム 5.0 g 硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ) 0.1 g 硫酸マンガン（ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ) 0.05 g 燐酸水素カリウム（Ｋ2 ＨＰＯ4 ） 2.0 g 蒸留水 1.0 l pHを6.2 〜6.5 に調整する。 〔実施例２〕 菌種の分離選別 健常な嬰児の便を取り、ＢＬ−ＬＰＩＭ（BL agar にli
thium chloride 2g/l、metronidazole 2mg/l、sodium
iodoacetate 0.025g/l 、sodium propionate3g/lを添
加) 、及びＢＩＭ（Reinforced Clostridial Agar にna
lidixic acid0.02g/l 、polymyxin B sulfate 0.0085g/
l 、kanamycin sulfate 0.05g/l 、sodium iodoacetate
0.025g/l 、2,3,5-tri-phenyltetrazolium chloride
0.025g/l を添加）の選別培養基において、１９４株の
１Bifidobacterium spp. を分離し、再度耐酸性、胆汁
塩耐性、酸素耐性試験を行った後、２株の耐酸性株ATCC
55813及びATCC 55814を分離した。バーゲイのマニュア
ル（Bergey's Manual ）が推薦する方法で、２株は１ビ
フィドバクテリアムアロンガム（Bifidobacteriumlongu
m）であることを鑑定した。その菌特性は以下の通りで
ある。 (1) 形態学的特徴 グラム陽性菌で、顕微鏡検査では棒形桿状、Ｙ字型、ア
ーチ型、Ｖ字型を呈し、ときには膨大現象又はノード
（node）形成が見られる。ＭＲＳ固体培養基の表面にお
けるコロニー形状は円凸状、滑らかで、白色を呈し、約
１〜４mm前後である。培養基の内部におけるコロニーは
円状、ディスク状、又は星状三角形を呈し、底部のコロ
ニーは白色で、周辺部は鋸状のハロゾーン（halo zone
）代謝物で３〜８mm前後である。 (2) 培養形状の特徴 成長温度は２５〜４２℃で、最適温度は３７〜４２℃で
ある。
【００２３】成長pHは５〜９、最適pHは６．５〜７．５
である。ＭＲＳ液体培養基において嫌気的条件下の培養
を２４時間行ったところ、生成した酢酸／乳酸比は約
１．５である。 (3) 生理性質 カタラーゼ活性 (−) 、気体生成試験 (−) 、乳凝固活
性 (＋) 、ゼラチン水分解性 (−) 、硝酸塩還元活性
(−) 、インドール生成試験 (−) 、硫化水素生成試験
(−) である。 (4) 炭素源の利用性 発酵がプラス反応であったものは、キシロース（xylos
e）、メリビオース（melibiose ）、ガラクトース（gal
actose ）、グルコース（glucose ）、アラビノース（a
rabinose ）、ラクトース（lactose ）、フルクトース
（fructose）、ラフィノース（raffinose ）、マルトー
ス（maltose ）、リボース（ribose）、スクロース（su
crose ）、マンノース（mannose ）、メリジトース（me
lizitose）である。マイナス反応であったものは、マン
ニトール（mannitol）、ソルビトール（sorbitol）、セ
ロビオース（cellobiose）、トレハロース（trehalose
）、イヌリン（inulin）、グリコーゲン（glycoge
n）、でんぷん（starch）、サリシン（salicin ）、ア
ミグダリン（amygdalin ）、ラムノース（rhamnose）、
メソエリトリトール（meso-erythritol ）、グリセロー
ル（glycerol）、メソイノシトール（meso-inositol
）、グルクロン酸（glucuronic acid ）である。 〔実施例３〕 菌種の改良 (1) ＵＶ突然変異 ATCC 55813及びATCC 55814をＭＲＳ培養基において３７
℃で２回活性化した後、２％（v/v)菌液を10mlＭＲＳ培
養液に取り、１８〜２４時間培養し、菌体を集めて0.1
Ｍ硫酸マグネシウム溶液で３回洗浄した後、同じ溶液に
懸濁させる。菌液を無菌シャーレに取り、ＵＶ Strata
linkerTM 1800 (Stratagene)に置き、２５０erg ＵＶ剤
量を照射する。菌液を再度ＭＲＳ培養基に移して一晩培
養し、これが突然変異菌体となる。０．２ml菌液を選別
培養基に塗布し、３７℃で３〜４日間培養する。 (2) ＮＴＧ突然変異 ATCC 55813及びATCC 55814をＭＲＳ培養基において前述
の操作方法で菌体を集めた後、0.1 Ｍの燐酸緩衝液（pH
７．０）で菌体を２回洗浄し、再度突然変異剤ニトロソ
グアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)
、ＮＴＧ 200μg/mlを使用し３７℃で３０分間作用さ
せる。遠心分離し、上記緩衝液で２回洗浄した後、残っ
たＮＴＧを除去し、菌体をＭＲＳ培養基に懸濁させ、一
晩培養し、これが突然変異菌体となる。０．２ml突然変
異菌液を選別培養基に塗布し、３７℃で３〜４日間培養
する。 (3) 選別培養基 耐酸性株選別培養基：ＭＲＳ固体培養基を４Ｍ HClで
pH４〜５に調整。
【００２４】胆汁塩耐性選別培養基：ＭＲＳ固体培養
基に０．３％(w/v) の牛胆汁を添加。選別された耐性を
持つ可能性のある菌株を前述の確認方法で確認し、さら
に突然変異で多耐性菌株を得た。結果を表８に示す。変
異株は胆汁塩存在下において２４時間保存したところ、
108 〜109 個／mlに増えており、野生株に比べて成長が
106 〜108 倍速い。耐酸性は維持され、野生株と同程度
であった。酸処理後に菌数はlog 値が４前後減少してい
る。さらに、非嫌気的条件下の培養における成長は良好
である。
【００２５】
【表８】
【００２６】〔実施例４〕 培養のスケールアップ １ ビフィドバクテリアムロンガム（Bifidobacterium long
um）変異株 ATCC 55815 等を１０mlのＭＲＳ液体培養基
で培養し、３７℃で１８〜２４時間静置した。１％の接
種量を３００mlＭＲＳ液体培養基が入っている５００ml
三角フラスコに入れ、同様条件で１８〜２４時間培養し
た後菌株の耐性を測定する。耐性能力は表８に示す通
り、少量培養に比べてと同等又はやや優っていた。 〔実施例５〕 本発明の菌株の特徴 本発明の株と同種標準株１B.longum ATCC 15707 、１
B. bifidum ATCC 29521、１B.breve ATCC 15700、及
び１B.breve ATCC 15701などについて、胆汁塩及び酸
耐性に関する比較試験を行ったところ、結果は表９に示
す通り本発明の菌株は高い胆汁塩及び酸耐性を示した。
【００２７】
【表９】
【００２８】〔実施例６〕 菌株の培養 ２５０ml三角フラスコに１２５mlの１２％還元脱脂乳を
入れ、１１５℃で２０分間殺菌した後、２％（v/v)の本
発明の株と標準株をそれぞれ接種する。３７℃、酸素の
存在する条件下において静置培養し、経時的にサンプリ
ングして成長菌数とpH値を測定する。結果は表１０に示
す通り。本発明の菌株１B.longum ATCC 55816 は還元
脱脂乳において、成長促進剤を加える必要がなく、２２
時間の好気培養後1.14×109 cfu/mlに成長し、且つ成長
力を維持し、生存力は６８時間後でも3.49×108 cfu/ml
を有した。
【００２９】
【表１０】
【００３０】
【発明の効果】本発明によって分離した胃酸耐性菌株は
胃液に対して耐性があり、生存力が高い。突然変異の新
菌株は胆汁塩耐性、胃酸耐性及び酸素耐性を持つビフィ
ズス菌変異株であり、当該菌株の酸素耐性は培養方法を
簡素化することができ、嫌気装置と操作方法を使用する
必要がなく、培養時の窒素充填の必要がなくなるため、
産業応用においてコストの削減、製造工程の簡素化、貯
蔵生存力の向上などを提供することができる。さらに、
菌株の胃酸、胆汁塩耐性で食用後容易に腸内へ到達する
ことができ、製品の性能を高めることができる。
【００３１】さらに、本発明の胃腸環境（酸、胆汁）及
び酸素に対する耐性をもつビフィズス菌変異株及び発酵
成長の方法については、上述した発明の手順及び内容以
外の方法で行うことも可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ａ２３Ｌ 2/00 Ａ２３Ｌ 2/00 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/20 A23C 9/12 A23G 3/00 A23G 9/02 A23K 1/16 A23L 2/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 受託番号がATCC 55813であるビフィズス
    菌菌株１ビフィドバクテリアムロンガム(Bifidobacteri
    um longum) Ｙ１。
  2. 【請求項２】 受託番号がATCC 55814であるビフィズス
    菌菌株１ビフィドバクテリアムロンガム(Bifidobacteri
    um longum) Ｙ２。
  3. 【請求項３】 受託番号がATCC 55815であるビフィズス
    菌菌株１ビフィドバクテリアムロンガム(Bifidobacteri
    um longum) Ｙ１−２Ｅ−０５。
  4. 【請求項４】 受託番号がATCC 55816であるビフィズス
    菌菌株１ビフィドバクテリアムロンガム(Bifidobacteri
    um longum) Ｙ１−４Ａ−０１。
  5. 【請求項５】 受託番号がATCC 55817であるビフィズス
    菌菌株１ビフィドバクテリアムロンガム(Bifidobacteri
    um longum) Ｙ２−１Ａ−０１。
  6. 【請求項６】 受託番号がATCC 55818であるビフィズス
    菌菌株１ビフィドバクテリアムロンガム(Bifidobacteri
    um longum) Ｙ２−２Ｂ−０４。
  7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載の菌株の
    一つを、脱脂乳において、２５〜４５℃、酸素の存在す
    る条件下で培養することを特徴とする菌株の培養方法。
  8. 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載の菌株の
    一つを直接食品原料に添加して製造することを特徴とす
    る食品組成物。
  9. 【請求項９】 牛乳、濃縮牛乳、粉ミルク、アイスクリ
    ーム、ヨーグルト、チーズ、リンゴジュース、豆乳、ケ
    ーキ、キャンディー、ベビーフード、食事療法製品、液
    体ヨーグルト、発酵乳、冷凍ヨーグルト、乳酸菌発酵飲
    料及び発酵豆乳のうち、いずれか１つを食品原料として
    製造したことを特徴とする、請求項８記載の食品組成
    物。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜６のいずれかに記載の菌株
    の１つを食品を発酵させるスターターとして選ぶことを
    特徴とする食品の発酵方法。
  11. 【請求項１１】 液体ヨーグルト、発酵乳、冷凍ヨーグ
    ルト、乳酸発酵飲料及び発酵豆乳のうちのいずれか１つ
    を食品製品とすることを特徴とする請求項１０記載の食
    品の発酵方法。
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