KR19980086644A - 엘(+)-락테이트의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전공학적으로 재조합된 세균주 및 이 균주를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유전공학적으로 재조합된 세균주 및 이 균주의 제조방법에 관한 것이다.
발효는 최종 수소 수용체가 유기 화합물인 동안의 탄소원의 분해이다. 락트산 발효를 이용하여, 특정 세균주는 NAD+의 재생을 위하여, 두 개의 특이적 NAD-의존성 락테이트 탈수소효소를 이용하여 피루베이트를 환원시켜, 두 개의 이성질체형의 락테이트, D(-)-락테이트 및 L(+)-락테이트의 라세미 혼합물을 생산한다.
어떤 이들은 락토오스의 환원에 과민성을 보임이 공지되어 있다. 이런 락토오스의 불량한 소화는 종종 소장내 충분한 양의 β-갈락토시다아제의 부재에 인한다. 각종 연구 (Kolars et al., N. Engl. J. Med., 310, 1-3, 1984; Marteau et al., Br. J. Nutr., 64, 71-79, 1990; and Arrigoni et al., Am. J. Clin. Ntur., 60, 926-929, 1994) 로 이러한 사람들은 우유에 함유된 것보다 요구르트에 함유된 락토오스를 잘 소화시키고 내성인 사실이 실증되었다. 이런 더나은 소화 및 더나은 내성은 특히 소장이동동안 요구르트내 함유된 세균의 β-갈락토시다아제의 활성에 인한다.
D(-)-락테이트는 어린이에게서 산혈증 문제를 야기할 수 있음이 추가로 공지되어 있다. 이러한 이유로, 세계보건기구 (FAO/WHO,1967;1974) 는 D(-)-락테이트는 어린이용 식품에, 그 자체로 또는 L(+)-락테이트와의 라세미 혼합물로서 첨가하지 않도록 권장하고 있다. 또한, 성인을 위한 D(-)-락테이트의 일일 소비량한계는 바람직하게는 100mg/체중kg 을 초과하지 않는다.
단지 L(+)-락테이트만을 생산하도록 유전공학적으로 재조합된 세균주가 현재 공지되어 있다.
따라서, 티.보우믹 등 (Appl.Microbiol.Biotechnol., 432-439,1994) 의 문헌에는 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus) CNRZ32 주, 특히 단지 L(+)-락테이트만을 생산하는 락토바실러스 헬베티쿠스 CNRZ32(pSUW104) 주의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의, 위치지정 (directed) 돌연변이에의한, 단리 및 불활성을 위한 기술이 기재되어 있다. 이러한 균주는 벡터 pSA3 및 락토바실러스 헬베티쿠스의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 0.6 kb SalI-SphI 중간단편으로 이루어진 짜넣어진 벡터 pSUW104 의 전기천공으로 수득한다.
그러나, 단지 L(+)-락테이트만을 생산하도록 유전공학적으로 재조합된, 소장에서 생존하고, 소장세포에 부착하며 면역조정을 발휘하는 능력을 가진 세균주는 현재 공지되어 있지않다. 현재, 식품의 제조를 위해서는, 사람의 건강에 이로운 특성을 갖으며 L(+)-락테이트만을 생산하는, 소장에서 생존능력을 갖는 세균주를 갖어 D(-)-락테이트로 인한 역효과를 피하는 것이 매우 가치가 있을 것이다.
본 발명의 목적은 상기와 요구를 충족시키는 것이다
상기와 같은 목적을 위해, 본 발명은 단지 L(+)-락테이트만을 생산하도록 유전공학적으로 재조합된, 소장에서 생존하고, 소장세포에 부착하며 면역조정을 발휘하는 능력을 가진 세균주에 관한 것이다.
본 발명은 특히 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 불활성화된 세균주에 관한 것이다.
본 발명은 특히 락토바실러스 액시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 죤소니(Lactobacillus Johnsonii), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus) 또는 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum) 의 균주에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 CNCM I-1851 주 및 CNCM I-1852 주에 관한 것이다.
본 발명의 추가주제는 단지 L(+)-락테이트만을 생산하도록 유전공학적으로 재조합된 세균주의 제조방법에 관한 것이다.
최종적으로, 본 발명은 식품의 제조에서, 본 발명에 따른 방법을 실행하여 수득한 세균주의 이용에 관한 것이다.
-도 1 은 미국 위스콘신주 매디슨소재 프로메가사제, 벡터 pGEMT 의 접합산물인 벡터 pLL83 및 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이 서열을 보여준다.
-도 2 는 대장균의 벡터 pBlueScript SK+ (미국 캘리포니아주 라욜라소재, 스트라타진사제) 로부터 구축되고, 벡터 pNZ12 의 클로르암페니콜 (cat) 내성 유전자 (Gasson et al., J. Bacteriol., 154, 1-9, 1983) 및 플라스미드 pUC-838 (Mollet et al., J. Bacteriol., 175, 4315-4324, 1993) 으로부터 단리된 벡터 pAMβ1 (Clewell et al., J.Bacteriol., 33, 426-428, 1974) 의 내에리트로마이신 유전자의 서열의 5' 영역 상류를 함유하는 벡터 pMD14 를 보여준다.
-도 3 은 벡터 pMD14내 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이된 서열를 포함하는 벡터 pLL83 의 단편의 접합 산물인 벡터 pLL88 을 보여준다.
-도 4 는 벡터 pLL88 의 서열 및 벡터 pAMβ1 의 서열 (Clewell et al., J. Bacteriol., 33, 426-428, 1974) 을 포함하는 벡터 pLL91 을 보여준다.
명세서의 나머지 부분에서 접합성 벡터 는 라는 표현은 락트산균의 상이한 종의 두 균주사이의 접합으로 전이가능한 DNA 벡터를 나타내는데 사용할 것이다.
또한, 명세서의 나머지 부분에서, 소장에서 생존능력을 갖는 균주 라는 표현은 먹은후 대변에서 발견되는 락트산균주를 나타내는데 사용할 것이다.
마지막으로, 명세서의 나머지에서, 면역조절을 발휘하는 능력을 갖은 세균주 라는 표현은 면역계에 이로운 효과, 특히 매크로파아지의 식균작용을 증가시키는 특성을 갖는 락트산균주를 나타내는데 사용할 것이다.
그러므로 본 발명은 단지 L(+)-락테이트만을 생산하도록 유전공학적으로 재조합된, 사람 소장에서 생존하고, 소장세포에 부착하며 면역조정을 발휘하는 능력을 가진 세균주에 관한 것이다.
본 발명은 특히 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 불활성화된, 소장에서 생존하고, 사람 소장세포에 부착하며 면역조정을 발휘하는 능력을 가진 세균주에 관한 것이다.
본 발명에 따른 균주는 락토바실러스 액시도필루스, 락토바실러스 죤소니, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 아밀로보러스 또는 락토바실러스 갈리나룸의 균주일 수 있다.
단지 L(+)-락테이트만을 생산하도록 유전공학적으로 재조합된 락토바실러스 죤소니의 두균주를 특히 단리하였다. 이 균주들은 부다페스트조약하, 각각 수탁번호 CNCM I-1851 및 CNCM I-1852 로, 프랑스 에프-75724 빠리 세덱스 15 뤼 뒤 독뙤르 루 소재의 엥스띠뛰 빠스뙤르, 꼴렉시옹 나시오날르 드 뀔뛰르 드 미끄로오르가니즘므(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) 에 97 년 2 월 20 일자로 기탁하였다.
본 발명은 추가로, 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 서열을 소장에서 생존하고, 사람 소장세포에 부착하며 면역조절을 발휘하는 능력을 갖은 숙주 세균주로부터 단리하고, 위치지정 돌연변이를 이러한 서열에 행하여 변이된 서열을 수득하며, 이 변이된 서열을 접합성 벡터에 삽입하고, 이 접합성 벡터를 접합시켜 숙주세균주로 전이시키고, 이어서 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 서열을 변이된 서열과의 상동재조합으로 치환된 숙주세균을 선택하는, 상기와 같은 균주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 있어서, 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 서열은 예컨대, PCR, 클로닝 또는 상보성으로 숙주 세균주로부터 단리할 수 있다.
Gene Splicing Overlap Extension법 (Molecular Biotechnology, R.M. Horton, 1995, 3, 93-99) 으로 위치지정 돌연변이를 상기 서열에 행하여 변이된 서열을 수득할 수 있으며, 이는 하나이상의 뉴클레오티드가, 예컨대, 도입되거나 또는 결실된 유전자 서열을 발생시키는 것이다.
변이된 서열을 숙주 세균주의 공여 세균주의 접합성 벡터에 삽입하기 위해서는, 숙주세균주에서 복제능력을 갖지 않는 접합성 벡터를 함유하는 공여세균주를 선택할 수 있고, 구축물은 변이된 서열을 숙주세균의 공여 세균주에서 증식할 수 없는 제 1 벡터에 접합시켜 제조될 수 있으며, 이 구축물은 공여 세균주로 도입할 수 있으며, 이어서 제 1 벡터 및 접합성 벡터가 재조합된 공여세균을,예컨대, 선택할 수 있다.
변이된 서열을 함유하는 접합성 벡터는 그러므로 숙주 세균주로의 접합으로 옮겨진다.
이어서 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 서열이 변이된 서열과의 상동재조합으로 치환된 숙주세균을 선택한다.
접합성 벡터를 숙주세균의 게놈에 삽입시킨 숙주세균은, 예컨대, 특정 항균제를 함유하는 배지상에서 선택할 수 있다. 사실, 숙주세균 게놈으로의 접합성 벡터의 삽입을 통해, 이런 세균은 상기 벡터의 서열내 함유된 항균제 내성 유전자를 발현시킬 수 있다.
최종적으로, 변이된 서열을 제외하고, 게놈으로부터 접합성 벡터의 DNA 서열이 제거된 숙주 세균을 선택한다.
이것은 항균제에 민감한 세균, 즉, 야생형 세균 및 유전자의 변이된 서열의 단편만을 현재 함유하는 유전공학적으로 형질전환된 세균을 선택하기 위하여 항균제를 함유하는 배지에서 일차 선택을 행하여 할 수 있다.
이어서 효소색시험을 D-락테이트 탈수소효소, 테트라졸륨염 및 디아포라아제의 존재에서 실행하여 본 발명에 따른 유전공학적으로 형질전환된 세균으로부터 야생형 세균을 식별할 수 있다. 이 효소시험으로 D(-)-락테이트를 생산하지 못하는 세균은 효소 D-락테이트 탈수소효소가 배지에 첨가된 경우 D(-)-락테이트를 산화시킬 수 없으며; 따라서, 배지내 태트라졸륨염은 산화된 D-락테이트의 부재에서 효소 디아포라아제로 환원되지 않고, 상기 세균은 무색으로 남는다는 사실을 실증하는 것이 가능해졌다.
이어서 숙주 세균주에 특이적인 프라이머를 이용하여 본 발명에 따른 유전공학적으로 재조합된 숙주세균의 게놈 서열에대해 PCR 을 실행할 수 있고, 이어서 PCR 산물은 특이 제한효소의 존재하 소화시킬 수 있으며, 이런식으로 발생된 단편의 크기는, 상기의 동일한 제한효소로 소화시킨후, 야생형 숙주세균의 게놈으로부터 수득한 것과 비교할 수 있다.
최종적으로, 본 발명은 식품의 제조에서 본 발명에 따른 방법을 실행하여 수득한 세균주의 이용에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세균주의 제조방법, 및 이런 유전공학적으로 재조합된 세균주는 첨부된 도면을 참조로하여, 생화학적 및 분자분석으로 하기에 좀더 상세히 특성을 기술하였다:
I. 락토바실러스 죤소니 La1 의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자서열의 단리
락토바실러스 죤소니 La1 을 MRS 배지에서 37℃ 로 밤새워 성장시킨다. 이어서 배양물을 MRS 배지를 함유하는 튜브로 옮기고 약 1 의 OD600으로 성장시킨다.
락토바실러스 죤소니 La1 의 게놈을 문헌 DNA probe forLactobacillus delbrueckii(B. Mollet et al., Applied and Environmental Microbiology, June 1990, vol. 56(6), p. 1967-1970) 에 기재된 방법으로 단리시킨다.
이어서 락토바실러스 죤소니 La1 의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 서열을, 락토바실러스 헬베티쿠스의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 보존 영역의 서열인 하기에 기재된 SEQ ID NO : 1 및 SEQ ID NO : 2 (Eur. J. Biochem., Cloning and overexpression of Lactobacillus helveticus D-lactate dehydrogenase gene in Escherichia coli, Kochhar et al., 208, 799-805, 1992) 를 특이적 프라이머로서 이용하여 PCR 로 단리한다.
이로 890bp 단편이 수득되며, 이를 미국 위스콘신주 매디슨소재 프로메가사제의 벡터 pGEMT 로 클론시킨후 서열결정한다. 락토바실러스 죤소니 La1의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 완전한 서열을 단리하기 위하여, 이어서 써던 블롯을 상이한 제한효소로 실행하며, 사용하는 프로브는 PCR 로 미리 수득한 서열이다.
상반배향의 두 개의 개방형해독틀로 이루어진 3 kb 뉴클레오티드 서열은 이런 식으로 단리한다.
고도의 상동성이 개방형해독틀중의 하나와 락토바실러스 헬베티쿠스의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 서열사이에서 발견된다. 이 개방형해독틀의 서열은 1014 뉴클레오티드 길이를 갖고 락토바실러스 헬베티쿠스의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 서열과 85% 의 상동성 및 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus) 와 81% 의 상동성 (FEBS Lett., Bernard et al., 1991, 290, 61-64) 을 갖는다.
II. 락토바실러스 죤소니 La1 의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 서열에 대한 위치지정 돌연변이
Gene Splicing Overlap Extension 법 (Molecular Biotechnology, R.M. Horton, 1995, 3, 93-99) 으로 단리된 서열에 대해 위치지정 돌연변이를 행한다. 이 서열은 PCR 로 중아에서 11 개의 뉴클레오티드를 결실시키고 및 3 개의 뉴클레오티드를 삽입시킨다. 이런 서열 변이는 DraI 제한효소 부위를 생성시키고 EcoRV 제한효소 부위를 제거하는 효과를 갖는다. 이 두 제한효소 부위 변이는 구축의 나머지 및 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이된 서열만이 삽입된 돌연변이체의 선택에서 사용하는 상이한 벡터내, 락토바실러스 죤소니 La1 의 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이된 서열의 존재를 실증하기 위한 마커로서 이용한다.
이런식으로 변이된 유전자 서열은 338 아미노산의 폴리펩티드대신에 181 아미노산의 폴리펩티드를 코딩한다.
III. 락토바실러스 죤소니 La1 의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이된 서열의 대장균의 벡터 pGEMT 으로의 클로닝:
효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이된 서열을 대장균의 벡터 pGEMT 로 클론시킨다.
이것은 유전자의 변이된 서열을 암피실린 내성 유전자를 함유하는 벡터 pGEMT 로 접합시켜 행한다.
이어서 이 접합 혼합물을 전기천공으로 대장균 XL1-Blue 에 도입하고 양성 클론을 X-gal 및 IPTG 에서 선택한다 (Sambrook et al., Molecular cloning; a laboratory manual,2nd ed., 1989). 도 1 에 나타낸 바와 같이, 생성된 벡터는 pLL83 으로 칭한다. 이어서 벡터 pLL83 을 알칼리용해법으로 정제한다 (Sambrook et al., Molecular cloning; a laboratory manual, 2nd ed., 1989).
이어서 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이된 서열을 포함하는 단편을 상기방식으로 정제된 벡터 pLL83 으로부터 단리시킨다. 이것은 벡터 pLL83 상의 제한효소 SphI 부위에서 제한효소 SphI 로 소화시켜 실행한다. 이어서 효소 T4 폴리머라아제를 이 갈라진틈에 반응시켜 뉴클레오티드를 부가하고 평활화 말단을 수득한다. 최종적으로, 소화를 제한효소 SpeI 로 실행한다.
병행작업으로, 공여 세균주, 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 및 숙주 세균주, 락토바실러스 죤소니에서 복제할 수 없는 벡터에 대해 소화를 실행한다. 이러한 소화를 제한효소부위에서 행한후, 효소 T4 폴리머라아제를 이 갈라진틈에서 절단물에 반응시켜 뉴클레오티드를 부가하고 평활화 말단을 수득한다. 최종적으로, 소화는 제한효소 SpeI 로 실행한다. 도 2 에 기재된 벡터 pMD14 를 특히 이러한 구축물을 제조하기위하여 사용할 수 있다. 이러한 벡터 pMD14 에 대하여 제한효소 EcoRI 로 소화시킨후, 효소 T4 폴리머라아제를 반응시키고, 최종적으로 제한효소 SpeI 로 소화시키는 것이 가능하다.
이어서 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이 서열을 포함하는 벡터 pLL83 의 단편을 벡터 pMD14 에 도입한다.
이어서 접합 혼합물을 대장균 XL1-Blue 에 전기천공으로 도입한다.
이어서, 이런식으로 구축된 대장균 XL1-Blue 의 약 100 개의 콜로니를 미세여과 플레이트에 놓고, 이어서 이것을 니트로셀룰로오스막으로 전사시킨후, 이 그 자리에서 용해시키고 락토바실러스 죤소니 La1 의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 중간단편과 혼성화시킨다.
이어서 도 3 에 기재된, 벡터 pLL88 을 포함하는 3 개의 양성 클론을 선택한다. 벡터 pLL88 의 서열결정은 이 벡터는 락토바실러스 죤소니 La1 의 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이된 서열, 이서열측면의 pGEMT 의 영역 및 벡터 pMD14 를 포함하는 사실을 실증한다.
IV. 락토코커스 락티스 MG1363(pAMβ1)주로 벡터 pLL88 의 도입:
벡터 pLL88 을 전기천공으로 락토코커스 락티스 MG1363 (pAMβ1) 주로 도입한다.
이어서 이렇게 제조된 형질전환체를 클로로암페니콜을 12㎍/ml 를 함유하는 GM17 아가배지에 놓고 30℃ 에서 밤새워 보온시킨다. 벡터 pLL88 은 그람양성 세균에서 복제할 수 없다. 상동성 영역에 의해, 클로로암페니콜 내성 유전자를 함유하는 벡터 pLL88 을 도 5 에 기재된 접합성 벡터 pAMβ1 에 삽입시키는 모든 락토코커스 락티스 MG1363(pAMβ1) 를 클로로암페니콜을 함유하는 상기 배지에서 선택한다. 벡터 pLL88 의 서열 및 벡터 pAMβ1 의 서열을 포함하는 이 구축물은 이후 도 4 에 기재된 벡터 pLL91 로 칭할 것이다.
V. 접합의 조건:
벡터 pLL91 을 함유하는 락토코커스 락티스 MG1363 을 클로르암페니콜을 12 ㎍/ml 을 함유하는 GM17 배지상에서 배양하고, 락토바실러스 죤소니 La1 는 MRS 배지에서 배양한다.
이런식으로 제조된 락토바실러스 죤소니 La1 배양물의 0.2% 를 신선한 MRS 배지를 함유하는 튜브에 접종하고, 혼합물을 37℃ 에서 5 시간동안 보온한다.
이어서 락토코커스 락티스 MG1363 및 락토바실러스 죤소니 La1 배양물을 3000rpm 으로 5 분간 원심분리시키고 각각의 잔류물을 10g 의 트립티카아제, 5g 의 이스트 추출물, 3g의 트립토오스, 3g 의 K2HPO4, 3g 의 KH2PO4, 2g 의 시트르산암모늄, 5ml의 무기염강화 용액, 1g 의 Tween 80, 1g 의 아세트산나트륨, 20g 의 글루코오스 및 0.2g 의 시스테인을 함유하는 10ml 의 LCMG 배지(Efthymiou et al., An antigenic analysis of Lactobacillus scidophilus,J.Infect.Dis., 1962, 110, 258-267) 로 옮긴다.
이어서 상기방식으로 제조한 공여주 락토코커스 락티스 MG1363 의 배양물 1ml 을 상기방식으로 제조한 수용주 락토바실러스 죤소니 La1 의 배양물 10ml 과 혼합하고, 혼합물을 원심분리시킨다.
상층액은 버리고 농축된 잔류물을 5g 의 PEG6000, 15g 의 아가, 1000 ml 의 무당 LCMG 용액, 100ml 의 당함유용액 및 10ml 의 미네랄염 용액을 함유하는 PEG 아가 배지 (Takemoto et al., Agric.Biol. Chem., 1989, 53, 3333-3334) 의 플레이트에 넣는다. 이 플레이트를 잔류물이 마를때까지 실온에 방치하고, 이어서 이것이것을 7의 아가를 함유하는 10ml 의 LCMG 배지로 덮는다.
이어서 이 플레이트를 37℃ 에서 밤세워 보온시키고, 성장된 세균세포를 함유하는 아가를 절단하여 이 아가를 10ml 의 LCMG 배지를 함유하는 튜브에 넣는다.
이어서 이 튜브를 격렬하게 진탕하고 이런식으로 제조한 배양물을 1 g/l 의 트립톤 및 8.5 g/l 의 NaCl 을 함유하는 TS 배지에 희석시킨다.
이어서 희석된 배양물을 100 ㎍/ml 의 포스포마이신 및 14 ㎍/ml 의 클로르암페니콜을 함유하는 MRS 아가배지의 플레이트상에 놓고, 비호기 조건하 37℃ 에서 48 시간동안 보온한다.
VI. 벡터 pLL91 의 락토바실러스 죤소니 La1 로의 접합 및 삽입:
벡터 pLL91 를 함유하는 락토코커스 락티스 MG1363 를 락토바실러스 죤소니 La1 와 접합시킨다. 이 접합은 1.10-5내지 3.10-7형질전환체/수용세포의 빈도를 갖는다.
이어서 클로르암페니콜 및 포스포마이신에 내성인 락토바실러스 죤소니 La1 의 6 개의 콜로니를 선택하고 MRS 배지에서 37℃ 에서배양한후 45℃ 에서 몇시간배양하여 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 서열에서, 상동성 영역에 의해, 자체 게놈으로 벡터 pLL91 을 삽입시킨 락토바실러스 죤소니 La1 세균을 선택한다. 사실, 벡터 pLL91 에 함유된 벡터 pAMβ1 은 상기 42℃ 온도에서 복제할 수 없다. 따라서 클로르암페니콜에 내성이고 45℃ 에서 성장할 수 있는 모든 락토바실러스 죤소니 La1 세균은, 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 서열에서, 상동적 영역에 의해, 자체의 게놈으로 벡터 pLL91을 삽입시킨다.
그러므로 벡터 pLL91 의 락토바실러스 죤소니 La1 의 게놈으로의 도입은 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 서열의 말단 5' 영역 또는 말단 3' 영역에서 단일 유전자교환으로 수득된다.
VII. 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이된 서열의 락토바실러스 죤소니 La1 의 염색체 DNA 로의 삽입의 입증:
벡터 pLL91 의 락토바실러스 죤소니 La1 의 게놈으로의 삽입을 PCR 로 입증한다.
이는 서열이 하기에 기재된 서열 SEQ ID NO : 3 및 SEQ ID NO : 4 인 락토바실러스 죤소니 La1 의 게놈에 특이적인 프라이머, 및 서열이 하기에 기재된 서열 SEQ ID NO :5 및 SEQ ID NO :6 인 벡터 pLL91 에 특이적인 프라이머를 이용하여 행한다. 이어서 PCR 에 의해 이런식으로 증폭된 단편을 제한효소부위가 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 원서열내 위치하는 제한효소 EcoRV 및 제한효소부위가 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 변이된 서열내 위치하는 제한효소 DraI 로 소화시켜, 단일 유전자교환에의한 삽입은 유전자의 원서열의 말단 5' 영역 또는 말단 3' 영역에서 일어남을 실증한다. 유전자의 변이된 서열을 유전자의 원서열의 말단 5' 영역에 삽입하여 유전공학적으로 변이된 락토바실러스 죤소니 La1 세균, 및 유전자의 변이된 서열을 유전자의 원서열의 말단 3' 영역에 도입하여 유전공학적으로 변이된 락토바실러스 죤소니 La1 세균을 선택한다.
이어서 벡터 pLL91 의 락토바실러스 죤소니 La1 의 게놈으로의 삽입은 상기에서 선택된 두 유전공학적으로 변이된 락토바실러스 죤소니 La1 세균의 게놈을 써던 블로트하여 입증한다. 이는 제한효소 부위가 게놈내, 벡터 pLL91 및 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자 변이 서열에 위치하는 상이한 제한효소로 상기 두 세균의 게놈 DNA 를 소화시켜 행한다. 사용하는 혼성화 프로브는 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 원서열의 단편이다.
이것은 상이한 제한효소로 소화시킨후 수득한 두 개의 유전공학적으로 변이된 락토바실러스 죤소니 La1 세균의 게놈 단편은, 상기와 동일한 제한효소로 야생형 락토바실러스 죤소니 La1 의 게놈을 소화시킨후 수득한 단편과 상이한 크기이다.
VIII. 삽입의 분해
삽입은 게놈으로부터 벡터 pLL91 을 방출시킴으로써 분해된다. 벡터 pLL91 의 소실은 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 원서열의 말단 5'영역과 상기 유전자의 변이된 서열의 말단 5'영역사이의 단일 유전자교환, 또는 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 원서열의 말단 3'영역과 상기 유전자의 변이된 서열의 말단 3'영역사이의 단일 유전자교환으로 달성된다.
삽입은 벡터에 대해 허용 온도인 37℃ 에서 분해하여 게놈으로부터 벡터 pLL91 의 방출을 촉진시킨다.
효소색시험을 D-락테이트 탈수소효소, 테트라졸륨염 및 디아포라아제의 존재에서 실행하여 본 발명에 따른 유전공학적으로 형질전환된 세균으로부터 야생형 세균을 식별한다. 이 효소시험으로 효소 D-락테이트 탈수소효소를 배지에 부가하는 경우 D(-)-락테이트를 생산하지 못하는 세균은 D(-)-락테이트를 산화시키지 못하며; 따라서, 배지내 테트라졸륨염은 산화된 D-락테이트의 부재에서 효소 디아포라아제에 의해 환원되지 않아, 이런 세균은 변색없이 남는다는 사실을 실증하는 것이 가능해졌다.
하기의 실시예는 식품의 제조에서 본 발명에 따른 세균주의 용도를 설명하기 위하여 주어진 것이다. % 는 언급이 없는한 중량% 이다.
실시예 1
본 발명에 따른 방법을 실행하여 수득한 락토바실러스 죤소니 CNCM I-1851주로부터 요구르트를 제조한다.
이는 9% 재구성 탈지유분말 500ml 를 제조하고, 0.1% 의 이스트 추출물을 첨가하고 혼합물을 오토클래브에서 15 분간 121℃ 에서 살균하여 실행한다. 이어서, 5.108미생물/cm3을 함유하는, 락토바실러스 죤소니 CNCM I-1851주의 활성배양물의 10 부피% 를 도입하기전, 방치하여 40℃ 로 냉각시킨다.
상기 배합물은 40℃ 에서 4 시간동안 보온하여 약 2.5.108미생물/cm3을 함유하는 효모를 생산한다.
병행 작업으로, 약 5.108의 농후 스트렙토코커스 써모필러스 세균/cm3을 함유하는 효모를 전술한 방법으로 제조한다.
1.5% 의 지방 및 3% 의 탈지유분말을 함유하는 혼합물을 90℃ 에서 30 분간 살균한다. 1% 의 락토바실러스 죤소니 CNCM I-1851 효모 및 3% 의 스트렙토코커스 써모필러스 효모를 상기 혼합물에 첨가한다.
이어서 상기 배합물을 혼합하고 4 시간 20분 동안 40℃ 에서 보온하여 pH 4.6 의 배합물을 수득한다.
이로 락토바실러스 죤소니 CNCM I-1851의 농도가 1.108세포/cm3이고, 스트렙토코커스 써모필러스의 농도는 1.108세포/cm3인 맛좋은 조직의 요구르트가 생성된다.
실시예 2
제조된 요구르트를 살균증류수로 50% 까지 희석하여 이 배합물이 병원환경에서 장관외 영양에서 사용할 수 있도록 하는 것만 제외하고, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 절차를 반복한다.
실시예 3
발효유를 본 발명에 따른 방법을 실행하여 수득한 락토바실러스 죤소니 CNCM I-1852 주로부터 제조한다.
이는 120℃ 에서 15 분간 우유 1 l 를 가열하여 변성시켜 수행한다.
이어서 이를 37℃ 로 냉각시키고 본 발명에 따른 방법을 수행하여 수득한 5% v/v 의 락토바실러스 죤소니 CNCM I-1852 를 접종시킨다.
이런식으로 제조된 배합물을 이의 산도가 1% 값에 도달할때까지 18 내지 24 시간동안 실온에서 보온시킨다.
최종적으로, 제조된 발효유를 병에 넣어 차갑게 보관한다.
실시예 4
프로마게 프라이스 (fromage frais) 를 본 발명에 따른 방법을 실행하여 수득한 락토바실러스 죤소니 CNCM I-1852 주로부터 제조한다.
이는 1 l 의 우유를 72℃ 에서 15 분간 가열한후 19℃ 로 냉각되도록 방치하여 실행한다.
이어서 이를 락토코커스 락티스 크레모리스, 락토코커스 락티스 디아세틸락티스 및 락토바실러스 죤소니 CNCM I-1852 주를 함유하는 세균의 0.5% v/v 의 혼합물로 접종시킨다.
생성된 혼합물은 우유의 pH 가 4.6 이 될 때까지 약 20℃ 에서 보온시킨다.
이어서 이런식으로 응고된 우유는 나이론백에 붓고 제조된 프로마게 프라이스내 함유된 과잉의 물을 배수시킨다.
이어서 프로마게 프라이스를 소르브산칼륨과 같은 항진균제와 혼합하여 곰팡이를 방지한다.
최종적으로, 천천히 혼합하여 균질화시켜 부드러운 조직의 프로마게 프라이스를 수득한다.
이런 방법으로 제조한 프로마게 프라이스는 작은 항아리에 포장하여 4-5℃ 에서 4 내지 5 주간 저장시킬 수 있다.
서열목록
(1) 일반정보
(i) 출원인 :
(A) 명칭: 소시에떼 데 프로듀이 네슬레
(B) 거리: 아브뉘 네슬레 55
(C) 도시: 베베이
(D) 지방: 캔톤 오브 바우드
(E) 국가: 스위스
(F) 우편번호: 1800
(G) 전화: 021 924 34 20
(H) 팩스 : 021 924 28 80
(ii) 발명의 명칭 : L(+)-락테이트의 제조방법
(iii) 서열의 수 :6
(iv) 컴퓨터 해독형태 :
(A) 매체유형 : 플로피디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 컴패터블
(C) 작동시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0,Version #1.25 (EPO)
(2) SEQ ID NO : 1 의 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 길이 : 22bp
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄의수 : 1 본쇄
(D) 구조 : 선형
(ii) 분자의 유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열의 기재 :SEQ ID NO : 1
(2) SEQ ID NO : 2 의 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 길이 : 23bp
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄의수 : 1 본쇄
(D) 구조 : 선형
(ii) 분자의 유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열의 기재 :SEQ ID NO : 2
(2) SEQ ID NO : 3 의 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 길이 : 17bp
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄의수 : 1 본쇄
(D) 구조 : 선형
(ii) 분자의 유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열의 기재 :SEQ ID NO : 3
(2) SEQ ID NO : 4 의 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 길이 : 17bp
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄의수 : 1 본쇄
(D) 구조 : 선형
(ii) 분자의 유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열의 기재 :SEQ ID NO : 4
(2) SEQ ID NO : 5 의 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 길이 : 17bp
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄의수 : 1 본쇄
(D) 구조 : 선형
(ii) 분자의 유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열의 기재 :SEQ ID NO : 5
(2) SEQ ID NO : 6 의 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 길이 : 17bp
(B) 유형 : 핵산
(C) 쇄의수 : 1 본쇄
(D) 구조 : 선형
(ii) 분자의 유형 : DNA (게놈)
(xi) 서열의 기재 :SEQ ID NO : 6
본 발명은 단지 L(+)-락테이트만을 생산하도록 유전공학적으로 재조합된 것을 특징으로하는, 소장에서 생존하고, 인간 소장세포에 부착하며 면역조절을 발휘하는 능력을 갖은 세균주를 제공한다.
Claims (9)
- 단지 L(+)-락테이트만을 생산하도록 유전공학적으로 재조합된 것을 특징으로하는, 소장에서 생존하고, 인간 소장세포에 부착하며 면역조절을 발휘하는 능력을 갖은 세균주.
- 제 1 항에 있어서, 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 불활성화된 세균주.
- 제 1 항에 있어서, 세균주는 락토바실러스 액시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 죤소니(Lactobacillus Johnsonii), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 아밀로보러스(Lactobacillus amylovorus) 또는 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum) 의 균주인 세균주.
- 수탁번호 I-1851 로 CNCM 에 기탁된 제 1 항에 따른 세균주.
- 수탁번호 I-1852 로 CNCM 에 기탁된 제 1 항에 따른 세균주.
- 제 1 항에 따른 세균주의 제조방법 :- D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자의 서열을 소장에서 생존하고, 인간 소장세포에 부착하며 면역조절을 발휘하는 능력을 갖은 숙주 세균주로부터 단리한다;- 위치지정(directed) 돌연변이를 상기 서열에 행하여 변이된 서열을 수득한다;- 이 변이된 서열을 접합성 벡터에 삽입한다 ;- 접합성 벡터는 접합시켜 숙주 세균주로 전이시킨다;- 효소 D-락테이트 탈수소효소를 코딩하는 서열을 변이된 서열과 상동 재조합으로 치환시킨 숙주 세균을 선택한다.
- 제 6 항에 있어서, 변이된 서열을 접합성 벡터에 삽입시키기 위하여,- 숙주 세균주에서 복제능을 갖지않는 접합성 벡터를 함유하는 공여세균주를 선택하고,- 변이된 서열을 공여 균주에서 증식할 수 없는 제 1 벡터에 접합시켜 구축물을 제조하며,- 이 구축물을 공여 세균주에 도입하고,- 제 1 벡터 및 접합성 벡터가 재조합된 공여세균을 선택하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 접합성 벡터의 DNA 서열을 변이된 서열을 제외하고 게놈으로부터 제거한 숙주세균을 선택하는 방법.
- 식품의 제조에서 제 6 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 방법을 실행하여 수득한 세균주의 용도.
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